JP2006317836A - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 スポット光の走査範囲と視野範囲との差に起因する画像が不鮮明化を防止する。
【解決手段】 光源１と、該光源１から出射された光を試料４に対して集束させる対物レンズ３と、集束された光を試料４面に沿って相対的に走査する走査機構２と、試料４からの反射光、透過光または蛍光の強度を検出する光検出器６とを備え、対物レンズ３の視野円を内包する四角形を走査範囲としたとき、視野円の内部だけに光源１からの出射光を出射させる制御手段８を備える走査型顕微鏡を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料を光で走査し、試料からの反射光または透過光を用いて得られた試料像に対する画像の精細化および解析の容易性を向上する走査型顕微鏡に関するものである。

従来、点光源を用いて試料を走査し、試料からの反射光、透過光、蛍光などを検出し画像化する走査型顕微鏡が一般的に知られており、その代表例として、共焦点走査型顕微鏡がある。共焦点走査型顕微鏡は、スポット光を用いて試料を走査するとともに、試料からの反射光や透過光のうちピンホールを通過した光のみを光検出器により電気信号に変換し、試料の画像を取り込む装置である。

このような共焦点走査型顕微鏡は、レーザ光などのスポット光とピンホールとを組み合わせ、試料をピンポイントで照明することで、測定点以外からの散乱光を抑制している。また、光検出器の前面に空間フィルタとしてのピンホールを配置し、測定点と同一面内にあるノイズ光をピンホール周辺に結像させる。さらに、光軸方向にずれた面からの光を対物レンズによってピンホールの前で広げピンホールを通過する光を抑制することにより、測定点以外からの反射光や透過光をカットして光電変換器により画像化している。

一方、画像化させるためにレーザ光などのスポット光が照射される試料はレーザ光により試料の退色が進むことになる。この問題を解決するために、従来、レーザ光などのスポット光を照射する場所を注目領域として登録し、注目領域内だけに必要な波長を持つレーザ光などのスポット光を照射することで、注目領域以外の場所の退色を防ぐ方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。さらに、注目領域以外の部分にレーザ光などのスポット光が照射されないことで、取り込まれる画像の不必要な輝度データを排除することができる。
特開２０００−３５４００号公報

しかしながら、上記方法では、試料に対して注目領域の指定やレーザ光などのスポット光を設定する必要があるため、試料が多数ある場合や注目領域の絞込みが難しい場合などには多大な労力が必要であった。さらに、上記方法は試料に特化した内容であるため、走査型顕微鏡のハードウェア部分の制限事項については考慮されていない。

走査型顕微鏡は対物レンズを利用しているため、視野範囲が対物レンズに依存するが、対物レンズの視野範囲は円となる。その一方で、走査型顕微鏡はＸ方向とＹ方向にレーザ光などのスポット光を走査することで画像を取得するため、通常は四角形の走査範囲となる。

従来の走査型顕微鏡は、視野の円に対して内接する四角形を倍率１とすることが多かった。この場合に、対物レンズの視野範囲の中で上下左右の一定範囲の画像を有効に利用できないという問題がある。この問題を解決するには、走査範囲を視野円に外接する四角形とすることで対物レンズの視野を有効に利用できる。

しかしながら、外接する四角形の画像は中央付近に必要とする画像があり、周辺には反射及び透過像ではない不要画像が取得されることになる。その結果、不要画像領域において、対物レンズ自体にレーザ光などのスポット光を走査すること等に起因して、異常輝度が発生することがあり、必要画像が不鮮明になったり、取得された画像の解析処理が複雑になったりする等の問題が考えられる。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、スポット光の走査範囲と視野範囲との差に起因する画像が不鮮明化を防止するとともに、画像取得後の解析処理を簡易にすることができる走査型顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源と、該光源から出射された光を試料に対して集束させる対物レンズと、集束された光を試料面に沿って相対的に走査する走査機構と、試料からの反射光、透過光または蛍光の強度を検出する光検出器とを備え、前記対物レンズの視野円を内包する四角形を走査範囲としたとき、視野円の内部だけに前記光源からの出射光を出射させる制御手段を備える走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、制御手段の作動により視野円内部に対応する領域のみにおいて光源からの出射光を出射させるので、視野円外の領域に出射光が照射されることがなく、視野円外における不要光の発生が未然に防止される。したがって、不要光の異常輝度によって視野円内の必要画像が不鮮明になることを防止することができる。

また、本発明は、光源と、該光源から出射された光を試料に対して集束させる対物レンズと、集束された光を試料面に沿って相対的に走査する走査機構と、試料からの反射光、透過光または蛍光の強度を検出する光検出器と、前記対物レンズの視野円を内包する四角形からなる走査範囲全域にわたり視野円内外において異なる画素値を有する２値画像を保存する２値画像保存手段と、該２値画像保存手段に保存されている２値画像と、光検出器により取得された画像とを論理積演算する演算手段とを備える走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、２値画像保存手段に予め保存しておいた２値画像と、光検出器により取得された画像とが、演算手段の作動により論理積演算される。２値画像は、視野円内外において画素値が異なっている。例えば、視野円外の画素値をゼロとし、視野円内の画素値を１としておくことにより、論理積演算の結果、視野円外の画素値はゼロとなり、視野円内のみに画素値を有する画像を取得することができる。したがって、取得された画像の解析処理を容易にすることができる。

上記発明においては、前記演算手段が、論理積演算をリアルタイムに行うことが好ましい。
演算手段が論理積演算をリアルタイムで行うことにより、画像取得中にもリアルタイムで視野円内の画像を観察することができる。

また、上記発明においては、前記光源からの出射光を前記対物レンズの視野円外だけで反射させて前記光検出器により取得した画像を２値化して前記２値画像を取得する２値画像取得手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、２値化画像取得手段の作動により、視野円外だけで反射した反射光に基づいて、視野円内外で画素値の異なる２値化画像を容易に取得することができる。

また、上記発明においては、前記対物レンズの視野円内に試料を配置することなく前記光源からの出射光を対物レンズの視野円内だけを透過させて前記光検出器により取得した画像を２値化して前記２値画像を取得する２値画像取得手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、２値化画像取得手段の作動により、視野円内だけを透過した透過光に基づいて、視野円内外で画素値の異なる２値化画像を容易に取得することができる。

本発明によれば、走査範囲より狭い視野範囲しか持たない対物レンズの視野範囲を有効に利用して画像を構築した場合や通常の対物レンズの性能を最大限に引き出すために視野円全体を利用して画像構築する場合に懸念される正確な画像情報以外の輝度データを一切排除する方法を提供できる。また、ハードウェアは従来から変更せずに手段の追加により本発明を実現できる。

以下、本発明の実施形態に係る走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。
第１、第２の実施形態ともに走査型顕微鏡の１つである共焦点走査型光学顕微鏡の光学系を使用して試料を２次元走査することにより試料形状情報を取得する例であり、第１の実施形態は試料走査範囲を限定して走査する例であり、第２の実施形態は取り込まれる画像をリアルタイムで補正する例であり、補正に利用する画像を作成する例である。

［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡について図１および図２を参照して以下に説明する。図１は、本発明を適用する共焦点走査型顕微鏡の概略構成を示している。
本実施形態に係る走査型顕微鏡は、レーザ光のようなスポット光を出射する光源１と、該光源１から出射された光を試料４に対して集束させる対物レンズ３と、集束された光を試料Ａ面に沿って相対的に走査する２次元走査用スキャナ２と、試料Ａからの蛍光の強度を検出する光検出器６と、光源１を制御するＣＰＵ（制御手段）８とを備えている。図中、符号５は試料４を搭載するステージであり、Ｚ軸方向に移動可能になっていて、試料４をスポット光の光軸方向に移動できるようになっている。

２次元走査用スキャナ２は、光源１からのスポット光を試料４上に２次元走査するためのもので、例えば、Ｘ軸方向走査用のガルバノミラーまたはレゾナントスキャナとＹ軸方向走査用のガルバノミラーとを有している。これらＸスキャナとＹスキャナをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることでスポット光を試料４上でＸＹ方向に振らせることができるようになっている。
光検出器６は、受光面の前面に図示しないピンホールを有するもので、ピンホールを介して得られる光情報を受光し、その光強度に応じた電気信号に変換するようになっている。

ＣＰＵ８は、Ａ／Ｄ変換器７を介して光検出器６に接続されている。また、ＣＰＵ８には、光源１、２次元走査スキャナ２、ステージ５の他に、メモリ９、フレームメモリ１０を介して表示部１１、記憶装置１２および入力装置１３が接続されている。
記憶装置１２は、入力装置１３により入力された後述する注目領域の位置情報を記憶している。
ＣＰＵ８は、２次元走査用スキャナを制御して、試料４に照射するスポット光の走査範囲１５を制御するとともに、光源１をＯＮ／ＯＦＦ制御して、試料４におけるスポット光の照射位置を制御するようになっている。

また、ＣＰＵ８は、Ａ／Ｄ変換器７を介して得られた蛍光強度と、２次元操作用スキャナによるスポット光の位置情報とに基づいて蛍光画像（検出画像）を構築し、フレームメモリ１０に出力するようになっている。フレームメモリ１０に出力された蛍光画像は逐次表示部１１に表示されるようになっている。

また、ＣＰＵ８は、光源１に対してレーザ波長毎のＯＮ／ＯＦＦを指示し、対物レンズ３を通って試料４に出射する光強度を調整している。
ここで、ＣＰＵ８、メモリ９、フレームメモリ１０等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。

このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡の動作について図１および図２を参照して説明する。
光源１から出射されるレーザ光は２次元走査用スキャナ２を通って対物レンズ３に到達する。この際、２次元走査用スキャナ２から出射される光３−２が対物レンズ３の視野範囲３−１を超える範囲で出射される。このとき、レーザ光が照射されることで、試料において発生した蛍光は、対物レンズ３によって集められ、２次元走査用スキャナ２を介して戻り、光検出器６により検出される。検出された光強度の情報は、Ａ／Ｄ変換器７を介してＣＰＵ８に送られ、メモリ９に展開される。展開された顕微鏡画像Ｇのイメージが図２である。

図２の画像において、顕微鏡画像Ｇにおいて有効な範囲は視野円１４内である。本実施形態に係る走査型顕微鏡においては、この有効範囲の視野円１４内だけにレーザ光を出射するために、視野円１４を注目領域として指定するが、対物レンズ３が同じで２次元走査用スキャナ２のスキャン範囲が同一の場合、注目領域は変化しないので、記憶装置１２に登録しておき、その都度呼び出して利用する。これにより簡単に図２の画像Ｇ内の視野円１４内外の範囲を設定することができる。ＣＰＵ８は、２次元走査用スキャナ２の各ガルバノミラーの位置が、視野円１４内にスポット光が照射される位置であるときにだけ、光源１にＯＮ指令を出力し、視野円１４外にスポット光が照射される位置であるときには、光源１にＯＦＦ指令を出力する。

これにより、光源１から出射されるレーザ光がＯＮ／ＯＦＦされることで、図１の２次元走査用スキャナ２から出射される光３−２を視野範囲３−１だけを通過する設定を指示することができる。したがって、図２の視野円１４内の領域ＧＡのみに輝度を有し、視野円１４外の領域ＧＢに輝度を有しない顕微鏡画像Ｇを取得することができる。

［第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡について、図１〜図５を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡の基本的な構成は、第１の実施形態と同様で、記憶装置（２値画像保存手段）１２内に２値画像Ｇ０が保存されている点、ＣＰＵ８が、記憶装置１２内に保存されている２値画像Ｇ０を用いて画像間演算することにより顕微鏡画像Ｇを取得する点において第１の実施形態と相違している。

このように構成した本実施形態に係る走査型顕微鏡の動作について説明する。
図１の記憶装置１２には、予め対物レンズの視野円１４内の画素値を１、視野円１４外の画素値を０とする２値画像Ｇ０（図３（ａ）参照。）を保存しておく。この２値画像Ｇ０は、例えば、次の方法により作成することができる。

まず、図１の構成においてステージ上５に試料４を配置しない状態で、光源１からレーザ光を照射する。試料４が存在しないので、対物レンズ３の視野範囲３−１から戻る蛍光は存在しない。一方、視野範囲３−１外では、鏡筒等において反射して戻る光が検出される。特に、光源１から出射される光の強度を上げることにより、光検出器６には視野範囲３−１外からの光が検出され、検出された光強度情報はＣＰＵ８を通してメモリ９の画像メモリ１に展開される。このとき、構築される画像は、図３（ａ）の視野円１４外のみに輝度データが存在し、視野円１４内に輝度データが存在しない。そこで、ＣＰＵ８において、この画像を処理して、図３（ｂ）に示されるように、輝度のある部分の画素値を０、輝度のない部分の画素値を１とすることにより、２値画像Ｇ０を得ることができ、その結果を記憶装置１２へ保存しておく。

そして、顕微鏡画像を取得する際には、試料４をステージ５上に配置して、レーザ光を照射し、試料４から戻る蛍光を検出して得られた蛍光画像（検出画像）Ｇ１（図４（ａ）参照。）をメモリ９に展開する。断面ＢＢに沿う蛍光画像Ｇ１の輝度分布を図４（ｂ）に示す。

ＣＰＵ８は、蛍光画像Ｇ１が得られる毎に、リアルタイムで記憶装置１２から予め用意されていた２値画像Ｇ０を読み込み、メモリ９内に展開されている蛍光画像Ｇ１と論理積計算を行う。これにより、視野円１４内の輝度情報のみを残し、視野円１４外に輝度のない顕微鏡画像Ｇを取得することができる（図５参照。）。したがって、高精細で解析が容易な顕微鏡画像Ｇを簡易に取得することができる。

なお、上記実施形態においては、落射照明系について説明したが、透過照明系の場合には、ステージ５上に試料４を配置することなく透過した光を検出することにより、上記とは逆に、視野円１４内のみに輝度を有する画像を取得することができる。したがって、取得された画像を処理して、上記とは逆に輝度のある部分の画素値を１、輝度のない部分の画素値を０とすることにより、上記とほぼ同一の２値画像を準備することができる。

本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を概略的に示す全体構成図である。 図１の走査型顕微鏡による視野範囲と走査範囲との関係を示す平面図である。 本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡の２値画像保存手段に保持される２値画像の例を示す（ａ）平面図および（ｂ）ＡＡ断面に沿う輝度分布図である。 図３の走査型顕微鏡により取得された蛍光画像例を示す（ａ）平面図および（ｂ）ＢＢ断面に沿う輝度分布図である。 図３の２値画像と図４の蛍光画像との論理積演算の結果得られた顕微鏡画像を示す（ａ）平面図および（ｂ）ＣＣ断面に沿う輝度分布図である。

符号の説明

１ 光源
２ ２次元走査スキャナ
３ 対物レンズ
４ 試料
５ ステージ
６ 光検出器
７ Ａ／Ｄ変換器
８ ＣＰＵ（演算手段：２値画像取得手段）
９ メモリ
１０ フレームメモリ
１１ 表示部
１２ 記憶装置（２値画像保存手段）
１３ 入力装置
１４ 視野円
１５ 走査範囲
Ｇ０ ２値画像
Ｇ１ 蛍光画像（検出画像）

Claims (5)

1. 光源と、
   該光源から出射された光を試料に対して集束させる対物レンズと、
   集束された光を試料面に沿って相対的に走査する走査機構と、
   試料からの反射光、透過光または蛍光の強度を検出する光検出器とを備え、
   前記対物レンズの視野円を内包する四角形を走査範囲としたとき、視野円の内部だけに前記光源からの出射光を出射させる制御手段を備える走査型顕微鏡。
2. 光源と、
   該光源から出射された光を試料に対して集束させる対物レンズと、
   集束された光を試料面に沿って相対的に走査する走査機構と、
   試料からの反射光、透過光または蛍光の強度を検出する光検出器と、
   前記対物レンズの視野円を内包する四角形からなる走査範囲全域にわたり視野円内外において異なる画素値を有する２値画像を保存する２値画像保存手段と、
   該２値画像保存手段に保存されている２値画像と光検出器により取得された検出画像とを論理積演算する演算手段とを備える走査型顕微鏡。
3. 前記演算手段が、論理積演算をリアルタイムに行う請求項２に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記光源からの出射光を前記対物レンズの視野円外だけで反射させて前記光検出器により取得した検出画像を２値化して前記２値画像を取得する２値画像取得手段を備える請求項２または請求項３に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記対物レンズの視野円内に試料を配置することなく前記光源からの出射光を対物レンズの視野円内だけを透過させて前記光検出器２より取得した検出画像を２値化して前記２値画像を取得する２値画像取得手段を備える請求項２または請求項３に記載の走査型顕微鏡。

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