JP5337483B2 - 解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査 - Google Patents
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Description
さらに、試料検査に走査型レーザ顕微鏡(LSMとも略す)を使用することが知られており、このLSMは、3次元で照らし出された画像から、共焦点検出構成(共焦点LSMのこと)または非線形の試料の相互作用(いわゆる多光子顕微鏡検査)によって、対物レンズの焦点面内にある平面だけを再現する。これにより1つの光学的断面が取得され、引き続き試料の様々な深度での複数の光学的断面を記録すれば、適切なデータ処理装置を用いて、様々な光学的断面から構成される試料の3次元画像を生成することができる。このため走査型レーザ顕微鏡検査は、厚いプレパラートの検査に適している。
本発明による手法では、それだけでなく、閾値より高い励起用放射出力で照射した後に永続的にまたは少なくともある程度の期間、励起性が明らかに低下する、または全くなくなる試料を使用する場合、(例えばSTEDまたはESAの手法の際に必要であるように)閾値より高い励起用放射出力で照明する試料領域を、前もって「標準」に励起することは、絶対に必要なわけではない。
本発明によれば、ビーム・スプリッタは、干渉によって生じたパターンの形の点群で試料を照明するように形成される。これにより、照明されたスポットで検出器機構が多点検出を行う場合、複数の点の並行照明およびこの同時に照明された点の並行走査が可能となる。その結果、深さ解像度を損なわずに、一点照明に比べて点の数だけ倍増された走査速度が得られる。規則的な点群パターンによる試料の照明(蛍光顕微鏡検査においては励起)は、本発明によれば、干渉効果を活用して行われ、そのため、照明源が準備する照明用放射線の数は、規則的なパターン内の照明スポットの数よりかなり少ない。干渉効果のためには、ビーム・スプリッタに少なくとも3つの反射性の点/透過性の孔があればよく、この点/孔に照明用放射が合焦されるので、少なくとも3つの照明用放射線が、ビーム・スプリッタでカップリングされる。この数の照明用放射線(本明細書での「放射線」の概念は、対応する放射線束と同義に使用される)は簡単に生成可能である。例えば出力放射線の場合は、2つのスプリッタ要素しか必要でない。したがって照明用放射線源は、レーザ放射線を放出するレーザと、レーザ放射線を少なくとも3つの部分放射線に分け、光学系機構によって点/孔上に合焦させるスプリッタ機構とを有することが好ましい。
点群パターン内の点の間隔は、ビーム・スプリッタでの焦点の間隔を介し、つまり円半径を介して調整し得る。
以下では、方法技術に関する説明および顕微鏡の説明において、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査のための様々な実施形態を示す。これは純粋に例として、様々な蛍光顕微鏡または蛍光顕微鏡検査方法に基づき行われる。もちろん、以下に説明する例示的実施形態、つまり方法形態および顕微鏡は、それとは別のルミネセンスを発する物質、例えばリン光を発する試料または色素にも使用可能である。以下で色素について説明する場合、これも例としてのみ理解されなければならない。もちろん、試料のプレパラート作成に使用可能な色素の代わりに、直接蛍光を発する(またはリン光を発する)物質も、試料として成立可能であり、それにより色素添加をしなくて済む。別の特性を示し、第2の状態に移せないような、追加の色素も使用可能である。さらに個々の方法形態または顕微鏡に対して説明した特徴は、説明した別の方法形態または顕微鏡にも使用可能であるので、ここでは説明していない組合せも可能である。
図9aは、説明した方法形態のそれぞれを実現可能な走査型レーザ顕微鏡を示している。方法形態1〜方法形態3用の走査型レーザ顕微鏡20は、例えば一点走査型顕微鏡として形成される。この顕微鏡は、励起モジュール21と、顕微鏡モジュール22と、検出器モジュール23とを有している。顕微鏡モジュール22では、試料24が対物レンズ25の焦点内にあり、この対物レンズの照明方向における手前に、鏡筒レンズ26が接続されている。この光学系の前には走査光学系27があり、この走査光学系によりスキャナ28と共に、試料上での焦点の変位による試料24の走査が可能となる。主カラー・スプリッタ29は、励起用放射モジュール21から顕微鏡モジュール22へと放射をカップリングさせ、試料24に受け止められた放射を、顕微鏡モジュール22から検出器モジュール23へと分離する。
図15aは、図8bに基づく方法形態を実現するための構成を示しており、この場合、走査型レーザ顕微鏡20のうち、その他の顕微鏡モジュール22は既に説明した構成を有しているので、ここでは励起モジュール21だけが示されている。光源30から、第1のビーム・スプリッタ53により、2つの部分放射線が生成され、ここでは図の面に対し垂直方向に間隔をあけている。第2のビーム・スプリッタ52は、全部で4つの平行に走る部分放射線を生成させる。図15bは、90°回転させた構成の断面を示している。全体として、同じ強度の4つの部分放射線54、55(中央の放射線が描かれている)が存在している。それぞれの図で、2つの部分放射線が同じ経路を取っているため遮られて見えていない。
試料24の蛍光特性、例えば色素の蛍光特性は既に、後の画像取得条件下での、テスト・プレパラートまたは試料の参照箇所の検査によって確定可能である。これに関し、検出される蛍光放射Fの出力は、試料のある点または領域での励起用放射Aの出力に応じて確定される。特に優れた調整のために有利なのは、(放出される蛍光放射Fの出力とは異なり)蛍光特性、つまり特性曲線17が、色素などの蛍光を発する材料の濃度に依存しない場合である。これにより、走査型顕微鏡20の制御装置35は、確定された曲線17、もしくは供給またはメモリ内に格納された曲線17から、最適な出力を自動的に確定し、適切に調整することができる。
図19は、走査型レーザ顕微鏡100を概略的に示しており、この顕微鏡は、これまでに説明したコンセプトに依存せずに使用可能である。実線は、照明用放射線経路Bを示しており、破線は、検出用放射線経路102を示している。この走査型レーザ顕微鏡は、試料103を走査しながら検出器104に結像し、その際、試料を照明源105によって照明する。
ミラー面要素123a〜dの幾何学的な構成およびそこに合焦された部分放射線Sa〜dによって、試料103上に、規則的に配置された光スポット126による点パターン128が生じる。そのため、蛍光顕微鏡検査における適用では、光スポット126で蛍光が励起される。これは、空間的にインコヒーレントに生じるので、顕微鏡106の後方の焦点面(要素106と107の間に実線で記された)を均質に満たす。これに類するものとしては、同様に画像取得のために用い得る拡散反射がある。
さらに、図19〜図22に基づく実施形態は、図4〜図18に基づく設計または方法とも組み合わせ得ることが特に有利であり、その際、特徴を1つだけ(例えばビーム・スプリッタ113を)組み合わせてもよい。
Claims (34)
- 特定のルミネセンス放射(F)を放出させるための励起用放射(A)を照射することによって試料(P、24)を励起し、ルミネセンスを発する該試料(P、24)の画像を取得する、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法であって、
ルミネセンスを発する該試料(P、24)は、励起用放射出力を上昇させることにより、該特定のルミネセンス放射(F)を放出させるための励起性が、励起用放射出力の閾値(19)にあたる最大値(18)まで上昇した第1のルミネセンス状態(5)から、該試料(P、24)の、該特定のルミネセンス放射(F)を放出するための励起性が該第1の状態(5)に比べて低減された第2のルミネセンス状態(6)に移行可能であり、その際、該試料(P、24)は、該閾値(19)より高い励起用放射出力を照射することによって該第2の状態(6)に移行可能であり、
少なくとも1つの該閾値(19)より高い出力極大および少なくとも1つの該閾値より低い局所的な出力極小(45)を有する励起用放射分布で、励起用放射(A)の照射が行われることによって、該試料(P、24)は、部分領域(B1)では該第1の状態(5)に移され、隣接する部分領域(B2)では該第2の状態(6)に移され、前記励起用放射(A)は、一つの波長のみにおいて照射され、
ルミネセンスを発する該試料(P、24)の該画像は、該第1の状態(5)にある試料領域(B1)および該第2の状態(6)にある試料領域(B2)を含んでおり、その際、ルミネセンスを発する該試料(P、24)の該画像には、主として該第1の状態(5)にある試料領域(B1)が寄与し、それにより該画像が、該励起用放射分布より高い空間解像度を有する、
方法。 - 前記第2の状態(6)に移行した後に、積極的な作用によって、または自発的に、再び前記第1の状態(5)に戻される試料(P、24)を使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記試料(P、24)を前記第2の状態(6)から前記第1の状態(5)に戻し、かつ前記励起用放射(A)とは異なる光学特性を有する、リセット用放射(R)を照射する、請求項2に記載の方法。
- 前記画像が、前記試料(P、24)をスポット・パターン、ライン・パターン、またはマルチ・スポット・パターン(58)で走査することによって取得される、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記閾値(19)より高い励起用放射出力ではルミネセンスを発せず、かつ/または前記特定のルミネセンス放射(F)とは異なる特性を有するルミネセンス放射を放出し、かつ/または変更された、減少したルミネセンスをもたらす特性を有する、試料(P、24)を使用する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記励起用放射分布が回折によって制限されている、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- トーラス形に分布する励起用放射(A)を使用する、請求項6に記載の方法。
- 前記励起用放射分布(A)が、線状または平面的な構造化された試料照明を有しており、かつ画像取得のために、位置解像された検出を使用する、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の状態(5)にある試料領域(B1)の共焦点検出(D)を実施する、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記閾値(19)より低い前記出力極小(45)および前記閾値(19)より高い前記出力極大が光軸(OA)に沿って隣接していることにより、該光軸(OA)に沿った深さ解像度の向上が行われる、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- まず焦点面を含む深度領域内に、前記閾値より高い出力の励起用放射(A)を照射し、該焦点面にリセット用放射(R)を照射し、続いて前記励起用放射分布を有する前記励起用放射(A)を照射することによって、前記光軸に沿った深さ解像度の向上を行い、前記出力極小(45)が、該焦点領域にある、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の状態(5)を有する試料領域(B1)または前記第2の状態(6)を有する試料領域(B2)において、前記励起用放射出力を基準周波数に基づいて変調し、該基準周波数を、前記ルミネセンス放射の検出時に、ロック・イン技術の過程で使用する、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 追加として、同じままの信号部分(S)から解像度の低い画像を取得する、請求項12に記載の方法。
- 蛍光を発する試料(P、24)を使用する、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- 追加として、前記閾値より低い出力極小(45)のない励起用放射分布で画像を記録し、差の生成に使用する、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 放出されるルミネセンス出力を前記励起用放射出力の関数として示すルミネセンス特性曲線(17)を評価し、かつ/またはそれから前記閾値(19)を求め、かつ/または前記励起用放射分布を該特性曲線に応じて選択する、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 画像解像度を反復的に評価しながら前記励起用放射分布を最適化する、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 励起用放射(A)を前記試料(P、24)に照射し、それにより前記試料(P、24)内で特定のルミネセンス放射(F)の放出を励起するルミネセンス励起手段(21、22)と、
ルミネセンスを発する前記試料(P、24)の画像を取得する手段(22、23)と
を備えており、
該励起手段が、少なくとも1つの閾値(19)より高い出力極大、および少なくとも1つの該閾値(19)より低い局所的な出力極小(45)を有する特定の励起用放射分布で、一つの波長のみにおいて該励起用放射(A)を照射し、
該閾値(19)が、前記試料(P、24)の2つのルミネセンス領域(5、6)を分離しており、第1の、励起用放射出力が該閾値(19)より低い場合に存在する状態領域(5)では、励起用放射出力を上昇させることにより、該特定のルミネセンス放射(F)を放出させるための励起性が、該閾値(19)で達成される最大値(18)まで上昇し、第2の、励起用放射出力が該閾値(19)より高い場合および/またはそれより後に存在する状態領域(6)では、前記試料(P、24)の該特定のルミネセンス放射(F)を放出するための励起性が該第1の領域(5)に比べて低減されており、
該画像取得手段が、該閾値(19)より低い励起用放射出力で照射された該第1の領域(5)にある試料領域(B1)、および該閾値(19)より高い励起用放射出力で照射された該第2の領域(6)にある試料領域(B2)を捕捉し、前記試料の該画像には、主として該第1の領域(5)にある試料領域(B1)が寄与し、それにより該画像が、該励起用放射分布より高い空間解像度を有するようになる、
解像度を高めた顕微鏡。 - 前記励起用放射(A)を放出する励起用放射源(30)と、該励起用放射源の後方に配置されており、前記閾値(19)より低い励起用放射出力を有する前記出力極小(45)を有するビーム・プロフィルを有する励起用放射線を放出する機構(36〜40)とを備える、請求項18に記載の顕微鏡。
- スキャナ機構(28)が、前記試料(P、24)を励起用放射(A)で走査することを特徴とする請求項18または19に記載の顕微鏡。
- 前記励起用放射分布が、少なくとも1つの回折によって制限される点像を有する、請求項20に記載の顕微鏡。
- 前記励起用放射分布が、少なくとも1つの線状または縞状または格子状の試料領域を、励起用放射(A)で照明し、その際、励起用放射出力が、該縞または該格子の一部分で前記閾値(19)より高く、該縞または該格子の一部分で前記閾値(19)より低い、請求項21に記載の顕微鏡。
- 前記励起用放射分布において、前記出力極小(45)および前記出力極小が、前記光軸(OA)に沿って隣接している、請求項18から22のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記励起用放射(A)とは異なる光学特性を有するリセット用放射(R)を放出する放射線源(41)と、該リセット用放射(R)をカップリングするための光学系(42)とを有する、前記試料(24)を前記第2の状態領域(6)から前記第1の状態領域(5)にリセットする手段(41、42)を特徴とする請求項18から23のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記励起用放射(A)の前記分布を、基準周波数によって変調する強度変調器(37、38、49、35)と、前記画像取得手段内にあるか、またはそれと接続されており、該基準周波数を評価し、背後の放射(S)を減少させるロック・イン増幅器(48)とを特徴とする請求項18から24のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 追加として解像度の低い画像を取得するために、同じままの信号出力を有する、請求項25に記載の顕微鏡。
- 請求項1から17のいずれか1項に基づく方法の1つを実施するために顕微鏡を制御する制御装置(35)を備える、請求項18から26のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記励起手段および前記画像取得手段を制御し、または読み取り、画像解像度を最適化するために前記励起用放射分布を調整する制御装置(35)を備える、請求項18から27のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 前記制御装置(35)が、前記制御装置にとってルミネセンス特性曲線(17)を使用可能にするメモリ機構またはデータ入力機構を有しており、該ルミネセンス特性曲線(17)が、放出されるルミネセンス出力を励起用放射出力の関数として記述し、前記制御装置(35)が、該ルミネセンス特性曲線(17)から前記閾値(19)を求め、かつ/または前記励起用放射分布を、該特性曲線に応じて調整する、請求項28に記載の顕微鏡。
- 前記制御装置(35)が、前記試料(P、24)の前記画像から解像度を求め、画像解像度を最適化するために、前記励起用放射分布を反復的に調整する、請求項28に記載の顕微鏡。
- 2つの走査工程の合間にリセット用放射(R)が調整される、請求項4に記載の方法。
- 前記ルミネセンス放射(F)の検出時に、トーラスの外側にある試料領域を遮蔽する、請求項7に記載の方法。
- 線状または平面的な構造化された試料照明が縞格子または十字格子に基づく、請求項8に記載の方法。
- 試料(P、24)が少なくとも1つの蛍光体を含む、請求項14に記載の方法。
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