JPH09229861A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 デフォーカス光を除去して、被測定物の表面
に限らず内部で発生した２次元蛍光像をもコントラスト
良く検出する。 【解決手段】 レーザ光源１０₁ 〜１０_N から出力され
た互いにインコヒーレントなＮ個の励起光Ａ₁ 〜Ａ_N そ
れぞれは、偏光ビームスプリッタ１２₁ 〜１２_Nによっ
て２分岐され、可動鏡１５および位相調整板１７₁ 〜１
７_N によってその２光束間に所定の位相差が設定された
後、被測定物４０に入射されて干渉縞を形成する。被測
定物４０中の励起光強度分布は、Ｎ個の励起光Ａ₁ 〜Ａ
_N ごとに形成された干渉縞の強度分布の総和となる。Ｎ
個の励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれについて２光束間に所定
の位相差を与えたときに発生する２種類の蛍光像それぞ
れを光検出器５２で検出し、演算部５３にてこれら蛍光
像の差の絶対値をとる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば細胞等の被
測定物に励起光を照射して、被測定物中の蛍光物質から
発生する蛍光の像を検出する蛍光顕微鏡に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】被測定物に励起光を照射すると、その被
測定物に含まれる蛍光物質から蛍光が発生する。蛍光顕
微鏡は、その蛍光像によって被測定物を観察するもので
ある。しかし、一般の蛍光顕微鏡では、観測しようとす
る焦点位置から発生した蛍光像だけでなく、種々のノイ
ズ光をも観察するので、このノイズ光がコントラスト低
下の原因となる。したがって、弱い蛍光像を観察するに
は、ノイズ光を低減してコントラストを向上させること
が重要となる。

【０００３】蛍光顕微鏡におけるノイズ光には、種々の
要因に依るものがあり、大きくは、光学系（レンズ、フ
ィルタ等）に起因するものと被測定物に起因するものと
に分けられる。更に、光学系に起因するノイズ光には、
光学材料から発生する自家蛍光とレンズ等の表面での反
射光（フレアー光）とがある。また、被測定物に起因す
るノイズ光には、励起光の散乱、蛍光標識以外の発色団
からの蛍光、および、観察面以外からのデフォーカス光
がある。

【０００４】これらノイズ光のうち特にデフォーカス光
を低減する蛍光顕微鏡として、従来より、コンフォーカ
ル蛍光顕微鏡、定在波蛍光顕微鏡および全反射蛍光顕微
鏡が知られている。

【０００５】この内、コンフォーカル蛍光顕微鏡では、
図１７に示すように、レーザ光源１から出力された励起
光Ａが、ダイクロイックミラー２で反射され対物レンズ
３で集光されて被測定物４に照射され、被測定物４中の
所定位置から発生した蛍光Ｂのみが、対物レンズ３とダ
イクロイックミラー２を経由しピンホール５の位置に結
像され光検出器６で効率よく検出される。一方、被測定
物４中の他の位置から発生した蛍光Ｃ（デフォーカス
光）は、ピンホール５の位置に結像されないので、光検
出器６によって検出される量は少ない。このようにし
て、被測定物４中の所定位置から発生した蛍光のみを高
効率に観察するものである。

【０００６】また、定在波蛍光顕微鏡は、図１８に示す
ように、レーザ光源から出力された励起光を２光束Ａ１
およびＡ２に分岐した後これらを被測定物４の位置で交
差させて干渉縞を形成し、その干渉縞Ｄの明線位置から
発生した蛍光像を検出器６で観察するものである（例え
ば、ＵＳＰ４６２１９１１、F.Lanni, "Standing-Wave
Fluorescent Microscopy", Applications of Fluoresce
nt in the BiomedicalScience, pp.505-521, 1986）。

【０００７】また、全反射蛍光顕微鏡は、被測定物表面
で励起光を全反射させ、エバネッセント光を被測定物の
表面近傍に局在させて、その表面近傍から発生した蛍光
を検出するものである（例えば、D.Axelrod, etal, "Ad
sorption Kinetics on Biological Membrances: Measur
ement by Total Internal Reflection Fluorescent",Ap
plications of Fluorescent in the Biomedical Scienc
e, pp.461-476, 1986）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら上記従来
例では下記のような問題点がある。コンフォーカル蛍光
顕微鏡（図１７）では、対物レンズ３についてのピンホ
ール５の共焦点位置から発生した蛍光のみを検出するこ
とから、被測定物４から発生した蛍光の２次元像を検出
するためには、被測定物４またはピンホール５を２次元
状に走査する必要があり、したがって、２次元蛍光像を
検出するには時間を要するという問題点がある。

【０００９】これに対して、定在波蛍光顕微鏡（図１
８）は、２次元蛍光像を一度に検出するものである。し
かし、励起光の波長をλとし、被測定物４の屈折率をｎ
とし、励起光の２光束Ａ１およびＡ２それぞれが顕微鏡
の光軸となす角度をθとすると、干渉縞Ｄの明線の周期
は、λ／（２ｎ・ｃｏｓθ）となる。したがって、励起
光の２光束Ａ１およびＡ２それぞれの入射角度によって
は、被測定物４中に干渉縞の明線が複数存在する場合も
ある。また、θの値を９０゜付近に設定すれば、被測定
物４中に干渉縞の明線を１つだけ存在させることもでき
るが、その明線の幅が太くなる。何れにしても、デフォ
ーカス光を完全には除去することができない。

【００１０】また、全反射蛍光顕微鏡も、２次元蛍光像
を一度に検出するものである。しかし、観察できるのは
被測定物の表面近傍のみであって、被測定物の内部を観
察することはできない。

【００１１】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、デフォーカス光を除去して、被測定物
の表面に限らず内部で発生した２次元蛍光像をも、コン
トラスト良く検出することができる蛍光顕微鏡を提供す
ることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光顕微鏡
は、被測定物に励起光を照射して発生した蛍光像を観察
する蛍光顕微鏡であって、(1) 互いにインコヒーレント
な２以上の所定数の励起光を発生する励起光発生手段
と、(2) 所定数の励起光それぞれを２光束に分岐する励
起光分岐手段と、(3) 所定数の励起光それぞれについ
て、励起光分岐手段によって分岐されて形成された２光
束間の位相差を調整する位相調整手段と、(4) 所定数の
励起光それぞれについて、位相調整手段によって位相調
整された２光束を互いに所定の角度で交差させて干渉さ
せ、被測定物中の所定平面に平行な干渉縞を形成する励
起光照明手段と、(5) 所定平面で発生した蛍光像を観察
する蛍光像観察手段と、を備えることを特徴とする。

【００１３】この蛍光顕微鏡は以下のように作用する。
励起光発生手段から出力された所定数の励起光それぞれ
は、励起光分岐手段によって２光束に分岐され、位相調
整手段によってその２光束間に所定の位相差が設定され
た後、励起光照明手段によって被測定物に入射されて干
渉縞を形成する。所定数の励起光の相互の間ではインコ
ヒーレントであるので、被測定物中には、所定数の励起
光ごとに干渉縞が形成され、被測定物中の励起光強度分
布は、所定数の励起光ごとに形成された干渉縞の強度分
布の総和となる。そして、位相調整手段によって所定数
の励起光それぞれについて干渉縞それぞれの明線が所定
平面の位置に調整された時に、蛍光像観察手段によって
蛍光像が観察される。

【００１４】励起光発生手段は、所定数の励起光の波長
が同一であってもよい。また、励起光照明手段は、所定
数の励起光それぞれについて２光束それぞれが所定平面
に入射する方向と所定平面の法線方向とがなす角度の余
弦値が所定の等差数列上の値であってもよく、その所定
の等差数列は、初期値が１であり、公差が−１より大き
い負数であってもよいし、初期値が０であり、公差が１
より小さい正数であってもよい。

【００１５】また、位相調整手段によって所定数の励起
光それぞれについて干渉縞それぞれの明線が所定平面の
位置に調整された時に蛍光像観察手段によって観察され
る第１の蛍光像と、位相調整手段によって所定数の励起
光それぞれについて干渉縞それぞれの暗線が所定平面の
位置に調整された時に蛍光像観察手段によって観察され
る第２の蛍光像とを入力し、第１および第２の蛍光像の
強度差の絶対値を演算する蛍光像演算手段を更に備える
と好適である。

【００１６】この場合、位相調整手段によって所定数の
励起光それぞれについて干渉縞それぞれの明線が所定平
面の位置に調整された時に、蛍光像観察手段によって第
１の蛍光像が観察される。また、位相調整手段によって
所定数の励起光それぞれについて干渉縞それぞれの暗線
が所定平面の位置に調整された時に、蛍光像観察手段に
よって第２の蛍光像が観察される。これら第１および第
２の蛍光像は、蛍光像演算手段に入力されて両者の強度
差の絶対値が演算される。このようにして、被測定物中
の所定平面の位置から発生する蛍光像のみが検出され
る。

【００１７】また、励起光発生手段は、被測定物中の蛍
光物質が２光子吸収する所定数の励起光を出力するとと
もに、蛍光像観察手段は、位相調整手段によって所定数
の励起光それぞれについて干渉縞それぞれの明線が所定
平面の位置に調整された時に、被測定物中の蛍光物質が
所定数の励起光を２光子吸収して発生した蛍光像を観察
することとしてもよい。この場合も、被測定物中の所定
平面の位置から発生する蛍光像が検出される。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。

【００１９】（第１の実施形態）先ず、第１の実施形態
について説明する。図１は、第１の実施形態に係る蛍光
顕微鏡の構成図である。

【００２０】Ｎ台のレーザ光源（励起光発生手段）１０
₁ 〜１０_N それぞれは、被測定物４０中に含まれる蛍光
物質を励起するための励起光Ａ₁ 〜Ａ_N を出力するもの
であり、並列に配置される。励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれ
は直線偏光であり、互いにインコヒーレントである。ま
た、励起光Ａ₁ 〜Ａ_N は、同一波長であってもよいが、
必ずしも同一波長である必要はなく、被測定物４０中の
蛍光物質を励起することができる波長であればよい。こ
こで、Ｎは２以上である。

【００２１】なお、この図では、簡略化の為に励起光Ａ
₁ およびＡ_N についての光学系のみ示してある。また、
励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれについての光学系は同様であ
るので、以下では第１番目の励起光Ａ₁ について主に説
明する。

【００２２】レーザ光源１０₁ から出力された励起光Ａ
₁ は、先ず１／２波長板１１₁ に入射して偏光方位が調
整されたのち、偏光ビームスプリッタ（励起光分岐手
段）１２₁ に入射する。この時、励起光Ａ₁ は、偏光ビ
ームスプリッタ１２₁ への入射面に対して４５度方向の
直線偏光とされる。したがって、励起光Ａ₁ のｓ偏光成
分（偏光方向が入射面に垂直な直線偏光）Ａ₁₁は、偏光
ビームスプリッタ１２₁で反射され、シリンドリカルレ
ンズ２０に向かう。

【００２３】一方、励起光Ａ₁ のｐ偏光成分（偏光方向
が入射面に平行な直線偏光）Ａ₁₂は、偏光ビームスプリ
ッタ１２₁ を透過する。続いて、この励起光Ａ₁₂は、偏
光ビームスプリッタ１３₁ に入射するが、ｐ偏光である
ので偏光ビームスプリッタ１３₁ を透過する。更に、励
起光Ａ₁₂は、１／４波長板１４を透過し、光軸方向に移
動可能な可動鏡１５で反射され、再び１／４波長板１４
を透過して、偏光ビームスプリッタ１３₁ に到達する。
励起光Ａ₁₂は、この往復の間に、１／４波長板１４を２
回通過するので、偏光ビームスプリッタ１３₁ に再び到
達した時にはｓ偏光となっている。したがって、励起光
Ａ₁₂は、偏光ビームスプリッタ１３₁ で反射される。そ
の後、励起光Ａ₁₂は、反射鏡１６₁ で反射され、位相調
整板１７₁ を透過して所定の位相遅延が付加され、反射
鏡１８₁ で反射されて、シリンドリカルレンズ３０に到
達する。

【００２４】ここで、可動鏡１５および位相調整板１７
₁ からなる位相調整手段は、励起光Ａ₁₁およびＡ₁₂それ
ぞれの間の位相差を調整するものである。特に、可動鏡
１５は、他の励起光とともに一括して位相差を調整する
ものであり、位相調整板１７₁ は、励起光Ａ₁₁およびＡ
₁₂の２光束間についてのみ個別に位相差を調整するもの
である。これら可動鏡１５および位相調整板１７₁ は、
微小量だけ位置変化するものであるので、例えばピエゾ
素子によって駆動される。

【００２５】以上のようにしてレーザ光源１０₁ から出
力された励起光Ａ₁ に基づいて分岐され位相調整されて
形成された２光束Ａ₁₁およびＡ₁₂それぞれは、励起光照
明手段によって被測定物４０に照射される。すなわち、
一方の励起光Ａ₁₁は、シリンドリカルレンズ２０によっ
て、ピンホール板２１に設けられたピンホール２１₁位
置に集光される。図２は、シリンドリカルレンズ２０と
ピンホール板２１とを側面から見た配置図であり、図３
は、ピンホール板２１の平面図である。なお、図３で、
符号２０Ａを付して破線で囲んだ領域は、シリンドリカ
ルレンズ２０をピンホール板２１上に投影した位置を示
すものである。

【００２６】このシリンドリカルレンズ２０は、ピンホ
ール２１₁ 〜２１_N が並んだ方向と直交する方向に曲率
を有する凸レンズであり、互いに平行に入射してきた励
起光Ａ₁₁〜Ａ_N1を入射し、その平行を維持したまま励起
光Ａ₁₁〜Ａ_N1それぞれを、ピンホール板２１に設けられ
たピンホール２１₁ 〜２１_N それぞれの位置に集光す
る。なお、これらピンホール２１₁ 〜２１_N それぞれは
所定の位置に設けられている。すなわち、ｍ番目のピン
ホール２１_m は、１番目のピンホール２１₁ の位置か
ら、ｈ_m ＝（ｆ・sinθ_m ）／βなる関係式で与えられる
距離ｈ_m の位置にある。なお、ここで、θ_m は、励起光
Ａ_m1が被測定物４０内において光軸となす角度であり、
ｆは対物レンズ２４の焦点距離であり、βはリレーレン
ズ２２の倍率である。また、励起光Ａ₁₁〜Ａ_N1それぞれ
はピンホール２１₁ 〜２１_N それぞれに入射すべく所定
の光軸上を進む。

【００２７】ピンホール２１₁ を通過した励起光Ａ
₁₁は、リレーレンズ２２を経て、ダイクロイックミラー
２３で反射され、後側焦点位置Ｐ₁ に一旦集光された
後、対物レンズ２４を経て平行光とされ、被測定物４０
に入射する。ここで、ダイクロイックミラー２３は、励
起光Ａ₁₁〜Ａ_N1を反射させ、被測定物４０中の蛍光物質
から発生する蛍光Ｂを透過させるものである。また、後
側焦点位置Ｐ₁ は、点光源とみなすことができるピンホ
ール２１₁ を透過した励起光Ａ₁₁がリレーレンズ２２に
よって再び集光される位置であり、かつ、対物レンズ２
４の焦点位置でもある。

【００２８】同様に、他方の励起光Ａ₁₂は、シリンドリ
カルレンズ３０によって、ピンホール板３１に設けられ
た所定位置のピンホールに集光される。この所定位置の
ピンホールを通過した励起光Ａ₁₂は、リレーレンズ３２
を経て、ダイクロイックミラー３３で反射され、後側焦
点位置Ｐ₂ に一旦集光された後、対物レンズ３４を経て
平行光とされ、被測定物４０に入射する。

【００２９】以上のようにして被測定物４０に入射した
励起光Ａ₁₁およびＡ₁₂は、互いに強度が等しく且つコヒ
ーレントなものであるので、被測定物４０中にコントラ
ストの良い干渉縞を形成する。

【００３０】同様にして、他のレーザ光源１０_N から出
力された励起光Ａ_N は、１／２波長板１１_N を経た後、
偏光ビームスプリッタ１２_N によって２光束Ａ_N1および
Ａ_N2に分岐され、励起光Ａ_N1は、シリンドリカルレンズ
２０、ピンホール板２１のピンホール２１_N 、リレーレ
ンズ２２、ダイクロイックミラー２３および対物レンズ
２４を経て、被測定物４０に照射され、一方、励起光Ａ
_N2は、偏光ビームスプリッタ１３_N 、１／４波長板１
４、可動鏡１５、反射鏡１６_N 、位相調整板１７_N 、反
射鏡１８_N 、シリンドリカルレンズ３０、ピンホール板
３１の所定位置のピンホール、リレーレンズ３２、ダイ
クロイックミラー３３および対物レンズ３４を経て、被
測定物４０に照射される。

【００３１】ここで、Ｎ個の励起光Ａ_m （ｍ＝１〜Ｎ）
それぞれによって形成される干渉縞を互いに平行とし、
更に、被測定物４０中の所定平面において全ての干渉縞
の明線を一致させると、その所定平面近傍に励起光Ａ₁
〜Ａ_N のエネルギが集中することになるので、その所定
平面近傍にある蛍光物質が重点的に励起されて蛍光が発
生する。

【００３２】被測定物４０内の所定平面近傍から発生し
た蛍光Ｂは、対物レンズ２４を透過し、励起光カットフ
ィルタ５０を透過し、結像レンズ５１で結像されて、光
検出器（蛍光像観察手段）５２で撮像され、撮像された
蛍光像は、演算部（蛍光像演算手段）５３に入力されて
処理される。ここで、励起光カットフィルタ５０は、蛍
光Ｂを透過させるが、励起光の散乱光を吸収するもので
ある。

【００３３】したがって、本実施形態に係る蛍光顕微鏡
は、励起光Ａ_m1およびＡ_m2（ｍ＝１〜Ｎ）それぞれの進
行方向のなす角度を比較的大きく設定する場合に好適な
ものである。

【００３４】次に、励起光Ａ₁₁〜Ａ_N1およびＡ₁₂〜Ａ_N2
が被測定物４０に入射する方向について説明するととも
に、被測定物４０内に形成される干渉縞および演算部５
３における処理の内容について更に詳しく説明する。こ
こで、図１中に示すようにｘｙｚ直交座標系を考える。
対物レンズ２４および３４の光軸の方向をｚ軸方向と
し、励起光Ａ₁₁〜Ａ_N1およびＡ₁₂〜Ａ_N2が被測定物４０
に入射する時の入射面と平行な面をｘｚ平面とし、干渉
縞と平行な面をｘｙ平面とする。

【００３５】このようなｘｙｚ直交座標系を考えると、
励起光Ａ_m が２分岐された２光束Ａ_m1およびＡ_m2（ｍ＝
１〜Ｎ）それぞれは互いにｘｙ平面に対して対称に被測
定物４０に入射することになる。図４は、励起光Ａ_m1お
よびＡ_m2（ｍ＝１〜Ｎ）それぞれの進行方向を示す図で
ある。この図に示すように、励起光Ａ_m1およびＡ_m2それ
ぞれは、ｘｚ平面に平行な面上であって、＋ｚ方向およ
び−ｚ方向それぞれと角度θ_m をなす方向に進む。

【００３６】すなわち、励起光Ａ_m1およびＡ_m2それぞれ
の電場ベクトルＥ_m1およびＥ_m2それぞれは、

【数１】

【数２】 で表される。ここで、Ｅ_m は励起光Ａ_m1およびＡ_m2それ
ぞれの電場ベクトルの振幅であり、ｉは虚数単位であ
り、ω_m は励起光Ａ_m の角周波数であり、ｔは時間変数
であり、ｒは位置ベクトルであり、φ_m1およびφ_m2は位
相を表す。また、ｋ_m1およびｋ_m2それぞれは励起光Ａ_m1
およびＡ_m2それぞれの波数ベクトルである。したがっ
て、波数ベクトルと位置ベクトルとの内積ｋ_m1・ｒおよ
びｋ_m2・ｒそれぞれは、

【数３】

【数４】 で表される。ここで、πは円周率であり、λ_m は励起光
Ａ_m の波長である。

【００３７】このような電場ベクトルで表される励起光
Ａ_m1およびＡ_m2それぞれが被測定物４０中に形成する干
渉縞の強度分布は、（１）式と（２）式との和の絶対値
の２乗で求められ、

【数５】 で表される。ここで、Δφ_m は、

【数６】 で表される励起光Ａ_m1およびＡ_m2の間の位相差である。
（５）式から判るように、励起光Ａ_m により形成される
干渉縞は、明線と暗線とがｘｙ平面に平行となる。

【００３８】したがって、Ｎ個の励起光Ａ_m （ｍ＝１〜
Ｎ）それぞれによって形成される干渉縞の全てを加算し
て得られる被測定物４０中の励起光強度分布Ｉ_T は、

【数７】 で表される。ここで、可動鏡１５の位置と位相調整板１
７₁ 〜１７_N それぞれによって与えられる位相差とを適
切に調整することによって、Δφ_m （ｍ＝１〜Ｎ）を全
て０にすれば、励起光強度分布Ｉ_T がｚ＝０の平面上で
最大強度となることが判る。

【００３９】次に、１例として、７個（Ｎ＝７）の励起
光Ａ_m （ｍ＝１〜７）の電場ベクトルの振幅Ｅ_m を全て
同一として規格化し、かつ、波長λ_m を全て同一値λと
し、更に、励起光Ａ_m の入射角度θ_m の余弦値ｃｏｓθ
_m が初期値ｃｏｓθ₁ で公差Δｃの等差数列で表される
とした場合、すなわち、

【数８】 なる関係式で表されるとした場合における励起光強度分
布Ｉ_T を計算により求めた結果について述べる。

【００４０】図５は、波長λ＝０．５μｍ、ｃｏｓθ₁
＝１、Δｃ＝−０．１、位相差Δφ_m ＝０（ｍ＝１〜
７）とした場合の励起光強度分布図である。この図から
判るように、励起光強度分布Ｉ_T は、ｚ軸方向に周期
２．５μｍの周期的な分布となり、ｚ＝０の平面上で励
起光強度Ｉ_T が最大となる。また、励起光強度のピーク
幅は０．３５μｍ程度である。さらに、励起光強度のピ
ーク幅は、励起光の数Ｎが大きいほど狭くなり、ほぼλ
／（２ＮΔｃ）で表されることが確認された。そして、
ｚ＝０の平面上での励起光強度のピーク値は、ピーク以
外の領域における励起光強度の略２倍となっている。し
たがって、蛍光発生分布は、この励起光強度分布に応じ
たものになる。

【００４１】また、図６は、Δφ_m ＝１８０゜（ｍ＝１
〜７）とした場合の励起光強度分布図である。この図に
おいて、実線は、Δφ_m ＝１８０゜の場合の励起光強度
分布を表し、破線は、Δφ_m ＝０の場合の励起光強度分
布（図５と同じ）を表す。Δφ_m ＝１８０゜の場合の励
起光強度分布は、或オフセット値を中心としてΔφ_m＝
０の場合の励起光強度分布を反転した分布となる。すな
わち、ｚ軸方向に周期２．５μｍの周期的な分布とな
り、ｚ＝０の平面上で励起光強度Ｉ_T が０となる。ま
た、ｚ＝０の平面近傍以外の領域における励起光強度
は、図５に示した対応する領域における励起光強度と略
等しい。この場合の蛍光発生分布も、この励起光強度分
布に応じたものとなる。

【００４２】以上のようなΔφ_m 値（ｍ＝１〜７）の調
整は、可動鏡１５および位相調整板１７₁ 〜１７_N から
なる位相調整手段によって行なわれる。すなわち、位相
調整板１７₁ 〜１７_N それぞれによって、全てのΔφ_m
値（ｍ＝１〜７）を０とし、励起光Ａ₁ 〜Ａ_m それぞれ
が形成する干渉縞の明線をｚ＝０に一致させる。このよ
うにすることによって、図５に示すような強度分布の励
起光が被測定物４０に照射される。そして、これに応じ
て発生した蛍光像は、光検出器５２によって撮像され、
演算部５３に入力される。

【００４３】続いて、可動鏡１５を励起光の波長の４分
の１の距離だけ移動して、全てのΔφ_m 値（ｍ＝１〜
７）を１８０゜とし、励起光Ａ₁ 〜Ａ_m それぞれが形成
する干渉縞の暗線をｚ＝０平面に一致させる。これによ
って、図６に示すような強度分布の励起光が被測定物４
０に照射される。そして、これに応じて発生した蛍光像
も、光検出器５２によって撮像され、演算部５３に入力
される。

【００４４】演算部５３では、このようにして入力され
た２つの蛍光像の差の絶対値を計算する。ここで得られ
た２つの蛍光像の差分は、図５に示される励起光強度分
布と図６に示される励起光強度分布との差の絶対値で表
される強度分布の励起光が被測定物４０に照射されて発
生した蛍光像に相当するものとなる。図７は、Δφ＝０
゜とした場合の励起光強度分布と、Δφ＝１８０゜とし
た場合の励起光強度分布との差を示す図である。

【００４５】この図から判るように、Δφ＝０゜および
Δφ＝１８０゜それぞれの場合において光検出器５２で
撮像された蛍光像それぞれの差の絶対値をとることによ
って、被測定物４０中のｚ＝０平面近傍以外の領域に含
まれる蛍光物質から発生した蛍光像はキャンセルされて
強度が弱くなり、被測定物４０中のｚ＝０平面近傍の領
域に含まれる蛍光物質から発生した蛍光の像のみが強調
されて得られることとなる。

【００４６】尚、この図では、蛍光像が強調される領域
はｚ軸方向に関して２．５μｍ間隔で周期的に現れてい
る。しかし、この間隔は、励起光Ａ_m の入射角θ_m の設
定に依存するものであり、ｃｏｓθ_m の値それぞれを小
さくすることにより、励起光強度分布におけるピーク間
隔を大きくすることができる（ｍ＝１〜Ｎ）。したがっ
て、被測定物４０中に励起光のピークを１つだけ作るこ
とができるので、被測定物４０中の一定の平面（例えば
ｚ＝０平面）の極近傍から発生した蛍光像のみを獲得す
ることができる。

【００４７】（第２の実施形態）次に、第２の実施形態
について説明する。図８は、第２の実施形態に係る蛍光
顕微鏡の構成図である。

【００４８】本実施形態において、レーザ光源１０_m か
ら出力された励起光Ａ_m が、１／２波長板１１_m 、偏光
ビームスプリッタ１２_m と１３_m 、１／４波長板１４お
よび可動鏡１５によって、２光束Ａ_m1およびＡ_m2に分岐
される光学系（ｍ＝１〜Ｎ）については、第１の実施形
態と同様である。また、被測定物４０から発生した蛍光
像が、対物レンズ５４、励起光カットフィルタ５０およ
び結像レンズ５１を経て光検出器５２に至る光学系につ
いても、第１の実施形態と同様であり、対物レンズ５４
を励起光が経由しない点とダイクロイックミラーが存在
しない点で第１の実施形態と異なるだけである。

【００４９】本実施形態が第１の実施形態と最も大きく
異なる点は以下のとおりである。すなわち、励起光Ａ_m1
およびＡ_m2は、ダイクロイックミラーや対物レンズを経
ることなく直接に被測定物４０に入射する。つまり、励
起光Ａ_m1は、反射鏡２５_m で反射された後に被測定物４
０に入射し、また、励起光Ａ_m2は、位相調整板１７_mで
位相調整され反射鏡３５_m で反射された後に被測定物４
０に入射する（ｍ＝１〜Ｎ）。

【００５０】ここで、励起光Ａ_m1およびＡ_m2それぞれ
は、これらによって形成される干渉縞が対物レンズ５４
の焦点面に平行となるように、所定の角度で被測定物４
０に入射し、被測定物４０中で交差して干渉縞を形成す
る（ｍ＝１〜Ｎ）。

【００５１】したがって、本実施形態に係る蛍光顕微鏡
は、励起光Ａ_m1およびＡ_m2（ｍ＝１〜Ｎ）それぞれの進
行方向のなす角度を比較的小さく設定する場合に好適な
ものである。

【００５２】本実施形態に係る蛍光顕微鏡において、励
起光Ａ_m それぞれについて形成される干渉縞が重畳され
て得られる励起光強度分布Ｉ_T およびその導出は、
（１）式から（７）式までと同様である。

【００５３】次に、１例として、Ｎ個の励起光Ａ_m （ｍ
＝１〜Ｎ）の電場ベクトルの振幅Ｅ_m を全て同一として
規格化し、かつ、波長λ_m を全て同一値λとし、更に、
励起光Ａ_m の入射角度θ_m の余弦値ｃｏｓθ_m が初期値
ｃｏｓθ₁ で公差Δｃの等差数列で表されるとした場
合、すなわち、（８）式で表されるとした場合における
励起光強度分布Ｉ_T を計算により求めた結果について述
べる。

【００５４】図９は、Ｎ＝６、波長λ＝０．５μｍ、ｃ
ｏｓθ₁ ＝０．１、Δｃ＝０．１とし、また、全ての位
相差Δφ_m （ｍ＝１〜６）を０および１８０゜それぞれ
とした場合の励起光強度分布図である。この図におい
て、実線は、Δφ_m ＝０の場合の励起光強度分布を表
し、破線は、Δφ_m ＝１８０゜の場合の励起光強度分布
を表す。この場合も、両者の励起光強度分布は、或オフ
セット値を中心として互いに反転した形状の分布とな
る。

【００５５】そこで、演算部５３は、Δφ_m ＝０の場合
の励起光強度分布によって被測定物４０から発生した蛍
光像と、Δφ_m ＝１８０゜の場合の励起光強度分布によ
って被測定物４０から発生した蛍光像とを入力して、こ
れら２つの蛍光像の差の絶対値をとる。ここで得られた
２つの蛍光像の差分は、図９中の実線で示される励起光
強度分布と破線で示される励起光強度分布との差の絶対
値で表される強度分布の励起光が被測定物４０に照射さ
れて発生した蛍光像に相当するものとなる。図１０は、
Δφ＝０゜とした場合の励起光強度分布と、Δφ＝１８
０゜とした場合の励起光強度分布との差の絶対値を示す
図である。このようにして、演算部５３は、被測定物４
０中のｚ＝０平面近傍から発生した蛍光像のみを検出す
ることができる。

【００５６】なお、本実施形態においても、Δφの調整
は、可動鏡１５および位相調整板１７_m （ｍ＝１〜Ｎ）
によって行なわれる。また、励起光強度分布Ｉ_T は、ｚ
軸方向に周期２．５μｍの周期的な分布となり、ｚ＝０
の平面上で励起光強度Ｉ_T が最大となる。また、励起光
強度のピーク幅は０．３５μｍ程度である。さらに、励
起光強度のピーク幅は、励起光の数Ｎが大きいほど狭く
なり、ほぼλ／（２ＮΔｃ）で表されることが確認され
た。また、本実施形態においても、励起光強度分布の周
期的は、励起光の入射角θ_m （ｍ＝１〜Ｎ）の設定に依
存するものである。

【００５７】次に、他の計算例について説明する。図１
１は、Ｎ＝７、波長λ＝０．５μｍ、ｃｏｓθ₁ ＝０、
Δｃ＝０．１とし、また、全ての位相差Δφ_m （ｍ＝１
〜６）を０および１８０゜それぞれとした場合の励起光
強度分布図である。この図において、実線は、Δφ_m ＝
０の場合の励起光強度分布を表し、破線は、Δφ_m ＝１
８０゜の場合の励起光強度分布を表す。この場合も、両
者の励起光強度分布は、或オフセット値を中心として互
いに反転した形状の分布となる。したがって、Δφ＝０
゜とした場合の励起光強度分布と、Δφ＝１８０゜とし
た場合の励起光強度分布との差は、図１２に示す図のよ
うになる。

【００５８】この計算例における条件は、前述の図９お
よび図１０の場合の計算例における条件と比較して、入
射角θ＝０の２つの励起光を追加した点のみである。こ
の２つの励起光が形成する干渉パターンは、縞形状とな
ることはなく、Δφ＝０゜の場合には、ｚ座標に依存せ
ず一様に明線となり、Δφ＝１８０゜の場合には、ｚ座
標に依存せず一様に暗線となる。

【００５９】この入射角θ＝０の２つの励起光が追加さ
れた場合におけるΔφ＝０゜および１８０゜それぞれの
励起光強度分布の差（図１２）は、それがない場合にお
けるΔφ＝０゜および１８０゜それぞれの励起光強度分
布の差（図１０）と比較して、最大ピークにおける強度
が大きくなり、且つ、最大ピークの近くにある第２ピー
クにおける強度が小さくなっている。したがって、この
場合の方が、より励起光を局在させることができたこと
に相当し、よりボケのないシャープな蛍光像を検出する
ことができる。

【００６０】（第３の実施形態）次に、第３の実施形態
について説明する。図１３は、第３の実施形態に係る蛍
光顕微鏡の構成図である。

【００６１】本実施形態においても、互いにインコヒー
レントな励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれを出力するＮ台（Ｎ
≧２）のレーザ光源１０₁ 〜１０_N が備えられる。以下
でも、レーザ光源１０₁ から出力された励起光Ａ₁ につ
いて主に説明する。レーザ光源１０₁ から出力された励
起光Ａ₁ は、ビームスプリッタ１９₁ で一部が反射され
残部が透過する。反射された励起光Ａ₁₁は、第１の実施
形態の場合と同様に、シリンドリカルレンズ２０、ピン
ホール板２１、リレーレンズ２２、ダイクロイックミラ
ー２３および対物レンズ２４を経て、被測定物４０に照
射される。ビームスプリッタ１９₁ を透過した励起光Ａ
₁₂は、位相調整板１７₁ 、反射鏡１６₁、シリンドリカ
ルレンズ３０、ピンホール板３１、リレーレンズ３２、
ダイクロイックミラー３３および対物レンズ３４を経
て、被測定物４０に照射される。被測定物４０に入射し
た励起光Ａ₁₁とＡ₁₂とは、コヒーレントであるので被測
定物４０中に干渉縞を形成する。他の励起光Ａ_m （ｍ＝
２〜Ｎ）も同様である。

【００６２】そして、位相調整板１７₁ 〜１７_N それぞ
れを調整して、励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれが被測定物４
０中に形成する干渉縞の明線の平面を一致させる。被測
定物４０で発生した蛍光Ｂは、対物レンズ２４、ダイク
ロイックミラー２３、励起光カットフィルタ５０および
結像レンズ５１を経て、光検出器５２で検出される。

【００６３】ここで、レーザ光源１０₁ 〜１０_N それぞ
れは、被測定物４０に含まれる蛍光物質が２光子吸収し
て蛍光を発生するような波長の励起光Ａ₁ 〜Ａ_N を出力
する。この場合、被測定物４０から発生する蛍光Ｂの強
度は励起光強度の二乗に比例する。図１４は、被測定物
４０中に蛍光物質が均一に存在すると仮定して、（８）
式でＮ＝７、波長λ＝１．０μｍ、ｃｏｓθ₁ ＝１、Δ
ｃ＝−０．１、位相差Δφ_m ＝０（ｍ＝１〜７）とした
場合に２光子吸収に伴って発生する蛍光の強度分布図で
ある。

【００６４】この図に示すように、蛍光強度は、ｚ＝０
平面上で最大となり、そのピーク値はピーク以外の領域
における蛍光強度の略４倍となっている。したがって、
このようにｚ＝０平面近傍において２光子吸収に伴って
発生する蛍光を測定する場合には、第１の実施形態のよ
うに明線と暗線とを反転した場合それぞれの蛍光像を求
める必要はなく、被測定物４０中の所定平面で明線を一
致させた場合の蛍光像のみを求めればよい。

【００６５】（第４の実施形態）次に、第４の実施形態
について説明する。図１５は、第４の実施形態に係る蛍
光顕微鏡の構成図である。

【００６６】本実施形態においても、互いにインコヒー
レントな励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれを出力するＮ台（Ｎ
≧２）のレーザ光源１０₁ 〜１０_N が備えられる。以下
でも、レーザ光源１０₁ から出力された励起光Ａ₁ につ
いて主に説明する。レーザ光源１０₁ から出力された励
起光Ａ₁ は、ビームスプリッタ１９₁ で一部が反射され
残部が透過する。反射された励起光Ａ₁₁は、第２の実施
形態の場合と同様に、反射鏡２５₁ で反射されて被測定
物４０に照射される。ビームスプリッタ１９₁を透過し
た励起光Ａ₁₂は、反射鏡１６₁ で反射され、位相調整板
１７₁ を経て、反射鏡３５₁ で反射されて被測定物４０
に照射される。被測定物４０に入射した励起光Ａ₁₁とＡ
₁₂とは、コヒーレントであるので被測定物４０中に干渉
縞を形成する。他の励起光Ａ_m （ｍ＝２〜Ｎ）も同様で
ある。

【００６７】そして、位相調整板１７₁ 〜１７_N それぞ
れを調整して、励起光Ａ₁ 〜Ａ_N それぞれが被測定物４
０中に形成する干渉縞の明線の平面を一致させる。被測
定物４０で発生した蛍光Ｂは、対物レンズ５４、励起光
カットフィルタ５０および結像レンズ５１を経て、光検
出器５２で検出される。

【００６８】本実施形態においても第３の実施形態と同
様に、レーザ光源１０₁ 〜１０_N それぞれは、被測定物
４０に含まれる蛍光物質が２光子吸収して蛍光を発生す
るような波長の励起光Ａ₁ 〜Ａ_N を出力して、被測定物
４０から発生する蛍光Ｂの強度は励起光強度の二乗に比
例する。図１６は、被測定物４０中に蛍光物質が均一に
存在すると仮定して、（８）式でＮ＝６、波長λ＝１．
０μｍ、ｃｏｓθ₁ ＝０．１、Δｃ＝０．１、位相差Δ
φ_m ＝０（ｍ＝１〜６）とした場合に２光子吸収に伴っ
て発生する蛍光の強度分布図である。

【００６９】この図に示すように、本実施形態において
も、蛍光強度は、ｚ＝０平面上で最大となり、そのピー
ク値はピーク以外の領域における蛍光強度の略４倍とな
っている。したがって、このようにｚ＝０平面近傍にお
いて２光子吸収に伴って発生する蛍光を測定する場合に
は、第１の実施形態のように明線と暗線とを反転した場
合それぞれの蛍光像を求める必要はなく、被測定物４０
中の所定平面で明線を一致させた場合の蛍光像のみを求
めればよい。

【００７０】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、励起光Ａ_m1
およびＡ_m2それぞれの電場ベクトルの振幅Ｅ_m1およびＥ
_m2は、必ずしも上記実施形態で説明したようにｍ値に依
らず全て同一値とする必要はなく、入射角θ_m も、必ず
しも（８）式で表されるように等差数列上の値である必
要はなく、また、励起光Ａ_m それぞれの波長λ_m も全て
同一の波長とする必要もない（ｍ＝１〜Ｎ）。

【００７１】また、本実施形態では、全ての励起光Ａ_m1
およびＡ_m2（ｍ＝１〜Ｎ）が同一入射面で被測定物４０
に入射することとしたが、その必要もなく、励起光Ａ_m
毎に異なる入射面でも構わない。

【００７２】要は、被測定物４０に含まれる蛍光物質を
励起して蛍光を発生させ得る波長の励起光Ａ_m を出力
し、対物レンズの焦点平面上に全ての励起光Ａ_m につい
て形成される干渉縞の明線を一致させ或いは暗線を一致
させ、それぞれの場合において蛍光像を検出して両者の
差の絶対値を計算することにより、焦点平面上から発生
した蛍光像を強調して検出することである。

【００７３】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、励起光発生手段から互いにインコヒーレントな所
定数の励起光が出力され、その所定数の励起光それぞれ
は、励起光分岐手段によって２光束に分岐され、位相調
整手段によってその２光束間に所定の位相差が設定され
た後、励起光照明手段によって被測定物に入射されて干
渉縞を形成する。所定数の励起光の相互の間ではインコ
ヒーレントであるので、被測定物中には、所定数の励起
光ごとに干渉縞が形成され、被測定物中の励起光強度分
布は、所定数の励起光ごとに形成された干渉縞の強度分
布の総和となる。そして、位相調整手段によって所定数
の励起光それぞれについて干渉縞それぞれの明線が所定
平面の位置に調整された時に、蛍光像観察手段によって
第１の蛍光像が観察される。また、位相調整手段によっ
て所定数の励起光それぞれについて干渉縞それぞれの暗
線が所定平面の位置に調整された時に、蛍光像観察手段
によって第２の蛍光像が観察される。これら第１および
第２の蛍光像は、蛍光像演算手段に入力されて両者の強
度差の絶対値が演算される。

【００７４】このようにして蛍光像観察手段によって観
察された第１の蛍光像は、所定平面の位置における強度
が所定平面近傍以外の強度の２倍であるような強度分布
を有する励起光が照射された時に発生する蛍光像であ
り、また、第２の蛍光像は、所定平面の位置における強
度が０であって所定平面以外の強度が第１の蛍光像を観
察したときの励起光強度に略等しいような強度分布を有
する励起光が照射された時に発生した蛍光像である。

【００７５】したがって、蛍光像演算手段によって第１
および第２の蛍光像の強度差の絶対値を得ることによ
り、被測定物中の所定平面の位置から発生する蛍光像の
みが検出される。しかも、第１および第２の蛍光像の差
の絶対値を算出することによって得られた蛍光像は、被
測定物の所定平面近傍の狭い領域に局在した励起光照射
によって発生した蛍光に相当するものであるので、デフ
ォーカス光の影響が低減され、シャープでボケがなく、
コントラストが優れた蛍光像を検出することができる。

【００７６】また、励起光による干渉縞は被測定物の表
面近傍に限らず内部にも形成されるので、被測定物中の
任意平面から発生した２次元蛍光像を観察することがで
きる。さらに、被測定物中において干渉縞を形成する位
置を移動させれば、被測定物内のあらゆる位置から発生
した蛍光を観察することができるので、３次元蛍光像を
も観察することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施形態に係る蛍光顕微鏡の構成図であ
る。

【図２】シリンドリカルレンズとピンホール板との配置
図である。

【図３】ピンホール板の平面図である。

【図４】励起光それぞれの進行方向を示す図である。

【図５】第１の実施形態に係る蛍光顕微鏡においてΔφ
＝０゜とした場合の励起光強度分布図である。

【図６】第１の実施形態に係る蛍光顕微鏡においてΔφ
＝１８０゜とした場合の励起光強度分布図である。

【図７】第１の実施形態に係る蛍光顕微鏡において、Δ
φ＝０゜とした場合の励起光強度分布と、Δφ＝１８０
゜とした場合の励起光強度分布との差を示す図である。

【図８】第２の実施形態に係る蛍光顕微鏡の構成図であ
る。

【図９】第２の実施形態に係る蛍光顕微鏡において、Ｎ
＝６として、Δφ＝０゜および１８０゜それぞれの場合
の励起光強度分布図である。

【図１０】第２の実施形態に係る蛍光顕微鏡において、
Ｎ＝６として、Δφ＝０゜とした場合の励起光強度分布
と、Δφ＝１８０゜とした場合の励起光強度分布との差
を示す図である。

【図１１】第２の実施形態に係る蛍光顕微鏡において、
Ｎ＝７として、Δφ＝０゜および１８０゜それぞれの場
合の励起光強度分布図である。

【図１２】第２の実施形態に係る蛍光顕微鏡において、
Ｎ＝７として、Δφ＝０゜とした場合の励起光強度分布
と、Δφ＝１８０゜とした場合の励起光強度分布との差
を示す図である。

【図１３】第３の実施形態に係る蛍光顕微鏡の構成図で
ある。

【図１４】第３の実施形態に係る蛍光顕微鏡においてΔ
φ＝０゜とした場合に２光子吸収に伴って発生する励起
光の強度分布図である。

【図１５】第４の実施形態に係る蛍光顕微鏡の構成図で
ある。

【図１６】第４の実施形態に係る蛍光顕微鏡においてΔ
φ＝０゜とした場合に２光子吸収に伴って発生する励起
光の強度分布図である。

【図１７】コンフォーカル蛍光顕微鏡の原理図である。

【図１８】定在波蛍光顕微鏡の原理図である。

【符号の説明】

１０₁ ，１０_N …レーザ光源、１１₁ ，１１_N …１／２
波長板、１２₁ ，１２_N ，１３₁ ，１３_N …偏光ビーム
スプリッタ、１４…１／４波長板、１５…可動鏡、１６
₁ ，１６_N …反射鏡、１７₁ ，１７_N …位相調整板、１
８₁ ，１８_N …反射鏡、１９₁ ，１９_N …ビームスプリ
ッタ、２０…シリンドリカルレンズ、２１…ピンホール
板、２２…リレーレンズ、２３…ダイクロイックミラ
ー、２４…対物レンズ、２５₁ ，２５_N …反射鏡、３０
…シリンドリカルレンズ、３１…ピンホール板、３２…
リレーレンズ、３３…ダイクロイックミラー、３４…対
物レンズ、３５₁ ，３５_N …反射鏡、４０…被測定物、
５０…励起光カットフィルタ、５１…結像レンズ、５２
…光検出器、５３…演算部、５４…対物レンズ、Ａ₁，
Ａ₁₁，Ａ₁₂，Ａ_N ，Ａ_N1，Ａ_N2…励起光、Ｂ…蛍光。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物に励起光を照射して発生した蛍
   光像を観察する蛍光顕微鏡であって、 互いにインコヒーレントな２以上の所定数の励起光を発
   生する励起光発生手段と、 前記所定数の励起光それぞれを２光束に分岐する励起光
   分岐手段と、 前記所定数の励起光それぞれについて、前記励起光分岐
   手段によって分岐されて形成された前記２光束間の位相
   差を調整する位相調整手段と、 前記所定数の励起光それぞれについて、前記位相調整手
   段によって位相調整された前記２光束を互いに所定の角
   度で交差させて干渉させ、前記被測定物中の所定平面に
   平行な干渉縞を形成する励起光照明手段と、 前記所定平面で発生した蛍光像を観察する蛍光像観察手
   段と、 を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記励起光発生手段は、前記所定数の励
   起光の波長が同一である、ことを特徴とする請求項１記
   載の蛍光顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記励起光照明手段は、前記所定数の励
   起光それぞれについて前記２光束それぞれが前記所定平
   面に入射する方向と前記所定平面の法線方向とがなす角
   度の余弦値が所定の等差数列上の値である、 ことを特徴とする請求項２記載の蛍光顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記励起光照明手段は、前記所定の等差
   数列の初期値が１であり、公差が−１より大きい負数で
   ある、ことを特徴とする請求項３記載の蛍光顕微鏡。
5. 【請求項５】 前記励起光照明手段は、前記所定の等差
   数列の初期値が０であり、公差が１より小さい正数であ
   る、ことを特徴とする請求項３記載の蛍光顕微鏡。
6. 【請求項６】 前記位相調整手段によって前記所定数の
   励起光それぞれについて前記干渉縞それぞれの明線が前
   記所定平面の位置に調整された時に前記蛍光像観察手段
   によって観察される第１の蛍光像と、前記位相調整手段
   によって前記所定数の励起光それぞれについて前記干渉
   縞それぞれの暗線が前記所定平面の位置に調整された時
   に前記蛍光像観察手段によって観察される第２の蛍光像
   とを入力し、前記第１および前記第２の蛍光像の強度差
   の絶対値を演算する蛍光像演算手段を更に備える、こと
   を特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
7. 【請求項７】 前記励起光発生手段は、前記被測定物中
   の蛍光物質が２光子吸収する前記所定数の励起光を出力
   するとともに、 前記蛍光像観察手段は、前記位相調整手段によって前記
   所定数の励起光それぞれについて前記干渉縞それぞれの
   明線が前記所定平面の位置に調整された時に、前記被測
   定物中の蛍光物質が前記所定数の励起光を２光子吸収し
   て発生した蛍光像を観察する、 ことを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。