JP2017078855A - 定在波干渉顕微鏡 - Google Patents

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Abstract

【課題】広視野干渉顕微鏡及びその使用方法を提供する。
【解決手段】広視野干渉顕微鏡は、解析位置で標本を保持する標本ホルダと、入力放射線を標本に照射して該標本に蛍光を放たせる照明器と、解析位置の両側に配置され、蛍光の少なくとも一部分を集め、対応する一対の光ビームを光結合要素の夫々の入力対に方向付け、光結合要素で光ビームが光学的に干渉するようにする一対の投射システムと、光結合要素からの出力光を試験する検出器配置とを有する。照明器は、解析位置で入力放射線の定在波を生じさせるよう構成される。検出器配置は、厳密に２つの干渉検出ブランチを有する。
【選択図】図３

Description

本発明は、
解析位置で標本を保持する標本ホルダと、
入力放射線を前記標本に照射して、該標本に蛍光を放たせる照明器と、
前記解析位置の両側に配置され、前記蛍光の少なくとも一部分を集め、対応する一対の光ビームを光結合要素の夫々の入力対に方向付け、該光結合要素で前記一対の光ビームが光学的に干渉するようにする一対の投射システムと、
前記光結合要素からの出力光を試験する検出器配置と
を有する広視野干渉顕微鏡に関する。
本発明はまた、そのような顕微鏡を使用する方法に関する。
上記のような顕微鏡は、例えば、干渉型ＰＡＬＭ（Photo-Activated Localization Microscopy）（ｉＰＡＬＭ）の分野から知られており、例えば、次の参考資料
http://www.pnas.org/content/106/9/3125.full
http://www.mechanobio.info/topics/methods/super-resolution-microscopy-intro
において、より詳細に説明されている。ｉＰＡＬＭ技術は、言い換えると、従来の（非干渉型）ＰＡＬＭの改良版と見なされ得る。これによって、前者は、軸方向に且つ横方向に解像度／画像再構成を実施する能力を後者に増補する。
これは、次のように理解され得る：
−ＰＡＬＭでは、横方向の超解像は、標本における対象（光励起性フルオロフォア）の空間的に疎なサブセットを順次に励起し、それらの異なるサブセットからの蛍光放射の時間分離を引き起こすことによって達成される。それらの疎なサブセットの夫々の中の対象の分解性は、標本全体が１回で撮像された場合よりも大きい。本質的に、解像度を制限する回折は、同時に撮像しようと試みた場合に、対象の密な組が、該組を、順次に撮像される疎なサブセットの累積的な集合体として代わりに見なすことによって、回避されると期待されることをもたらす。光励起性フルオロフォアは、２ステッププロセスにおいて蛍光を発せさせられる。これによって：
・予備的なステップでは、いわゆる“活性化波長（activating wavelength）”（又は“活性化波長（activation wavelength）”）が、フルオロフォアを非放射状態から放射状態にならしめるために使用される；
・続くステップでは、いわゆる“励起波長（exciting wavelength）”（又は“励起波長（excitation wavelength）”）が、活性化されたフルオロフォアの放射“緩和（relaxation）” （蛍光励起）を引き起こすために使用される。
例えば、このプロセスに関する更なる情報については、次の参考資料：
http://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/619251/
を参照されたい。
−ｉＰＡＬＭでは、ＰＡＬＭで達成された横方向（ＸＹ）の超解像は、細かい軸／深さ（Ｚ）解像度を更に可能にするメカニズムを導入することによって、更に一歩進められる。これは、光結合要素（具体的に、三相ビームスプリッタ）へ供給されて光学的に干渉する出力ビームを有する一対の相対して配置された投射システム（対物レンズ、鏡筒）を通じて標本（におけるフルオロフォア）を撮像することによって、達成される。結果として現れる干渉フリンジパターンは、撮像される対象（フルオロフォア）の軸（深さ）位置に（極めて）敏感である。これは、軸位置が干渉ビームの相対経路長さに影響を及ぼすためである。結合要素からの相分離出力を選択的に観察するために複数の検出器（例えば、ＣＣＤ）を有する検出器配置を使用することによって、推定された軸方向の対象位置へと所与のフリンジパターンを有効に（数学的に）“移動（translate）”することが可能である。ｉＰＡＬＭでは、結合要素からの３つの別個の出力（相互に１２０°で位相シフトされている。）が、３つの異なる検出器（カメラ）を用いて観測され、これにより、それらのカメラにより観測される出力の相対強度は、軸方向のフルオロフォア位置に応じて予測可能な形で変化する。
たとえｉＰＡＬＭは有効な技術であるとしても、それは欠点を抱えている。より具体的には、それは、比較的複雑な光学／検出アーキテクチャに依存する。特に：
−用いられる三相ビームスプリッタは、製造するのが困難である高価且つ脆弱なコンポーネントである。その性能は、温度変動及び機械振動に敏感であり、それは、乱された後に、比較的長い設定時間を要する。更には、それは、任意にアライメント／調整することが困難である。
−用いられる三相ビームスプリッタはまた、例えば、（口径食によらずに）カメラをより大きい視野と適合するために、機械的にサイズを大きくすることが困難である。これに関連した制限要因は、ビームスプリッタの平面オプティクスにおける許容誤差と、蛍光のコヒーレンス特性とを含む。
−検出機構は、３つの検出器／カメラの使用を必要とする。これは、体積を増やし／利用可能な空間を狭め、且つ、費用を増大させる。
良い注文のために、ＰＡＬＭ／ｉＰＡＬＭに加えて、例えば、ＳＴＯＲＭ及びｄＳＴＯＲＭのような、様々な他のタイプの蛍光顕微鏡も使用されることが知られる。これに関連した更なる情報は、例えば、次の参考資料：
https://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy
から収集され得る。
平面イメージング波を用いるものとして見なされ得る広視野顕微鏡と、例えば、点に焦点を合わせられ、このようにして撮像対象にわたって（必然的に）走査されるイメージングビームを使用する点走査顕微鏡（独語：“Rastermikroscop”）との間の違いに留意されたい。本発明は、前者（広視野）に関係がある。後者（点走査）の例は、例えば、欧州特許出願公開第０４９１２８９（Ａ１）号明細書及びS.W. Hell et al.による学術論文， Enhancing the axial resolution in far-field light microscopy: two-photon 4Pi confocal fluorescence microscopy，J. Modern Optics 41(4)，pp.675-681（１９９４年）において説明されている。
本発明の目的は、上記の課題に対処することである。特に、本発明の目的は、根本的に異なった照射／検出構成を利用する代替の深さ分解局在化顕微鏡（depth-resolved localization microscopy）技術を提供することである。より具体的には、本発明の目的は、三相ビームスプリッタの使用を必要としないことである。
それら及び他の目的は、最初の段落で特定された顕微鏡であって、
前記照明器は、前記解析位置で入力放射線の定在波を生じさせるよう構成される光学キャビティを有し、
前記検出器配置は、厳密に２つの干渉検出ブランチを有する
ことを特徴する広視野干渉顕微鏡において達成される。
本発明の以下の態様は、メリットを明示的に示す：
（ｉ）ここで暗に示される定在波、“活性化”入力光又は“励起”入力光を用いて生成されてよく、解析位置での（局所的な）光軸に沿った方向において延在する。
（ｉｉ）この定在波は、標本に照射する入力放射線の（正弦波）変調を生成し、そして、それは、例えば、それが生成される光学キャビティの“長さ”を調整することによって、チューニングされ得る位相を有する。
（ｉｉｉ）態様（ｉｉ）は、従来のｉＰＡＬＭ検出機構において使用される３つの１２０°位相シフトされたビームの（少なくとも）１つの代替を提供するために用いられ得る。３つの検出ビームはこのようにして不必要にならしめられるので、厄介な三相ビームスプリッタ及び関連する３つのカメラを使用することはもはや必要とされない。代わりに、よりずっと安価であり、脆弱でなく、容易に製造され（、且つ、より大きいサイズにされ）る ２方向ビームスプリッタで十分であることができる。
（ｉｖ）定在波における空間変調された強度分布は、標本におけるフルオロフォアを活性化／励起する革新的な方法を可能にし、これは、新しい高価及び利点の基礎となり得る。
本発明のそれらの態様は、以下で更に説明される。
本発明は、次のものと区別される点に留意されたい：
−例えば、米国特許出願公開第２００５／０００６５９７（Ａ１）号明細書及び欧州特許出願公開第０４９１２８９（Ａ１）号明細書で示されるような、ただ１つの検出器（ブランチ／チャネル）しかし要しない検出器配置。そのような機構では、干渉画像を観測することはできるが、検出された強度を有意味に解釈することができない。例えば、平均を上回る強度値が建設的干渉（constructive interference）効果に起因するか、あるいは、代わりに、比較的高い放射率を持ったフルオロフォアに、又はその両方の組み合わせに起因するどうかは分からない。１つよりも多いチャネルを使用することは、強度比の試験を可能にして、この問題を軽減する。
−例えば、上述／後述されるような、且つ、米国特許出願公開第２００６／０２９１０４３（Ａ１）号明細書（この特許文献では、干渉イメージングは行われず、３つの用いられるカメラは、異なる波長を検出するためにのみ使用される点に留意されたい。）において示されるような、３つの検出器（ブランチ／チャネル）を使用する検出器配置。
本発明によって使用されるタイプの照明器を実現／構成する様々な方法がある。特定の実施形態において、前記照明器は、
単一のソース（例えば、レーザ）から一対のコヒーレントビームを生成するビームスプリッタと、
前記一対のコヒーレントビームの夫々を前記一対の投射システムの組の夫々１つに通す一対の反射体と
を有し、
これによって、前記光学キャビティは、前記ビームスプリッタ及び前記一対の反射体を有する。そのような機構の例は、例えば、図１で表されている。そのような構成は、定在波が２つの逆方向性の入力ビームを用いて生成されるので、“デュアル・インサーション（dual-insertion）”アーキテクチャと見なされ得る。
前の段落で示されたものに対する代替の実施形態において、前記照明器は、
前記解析位置の第１の側に位置し、入力ビームを前記一対の投射システムの共通光軸に沿って第１の方向において前記標本に通すレーザと、
前記解析位置の第２の反対の側に位置し、前記共通光軸に垂直に配置され、前記入力ビームを反射して第２の反対の方向において前記標本に通す可動ミラーと
を有する。そのような機構の例は、例えば、図２で表されている。そのような構成は、定在波が、単一の入力ビームであるが、前記可動ミラーによって反射し返される入力ビームを用いて生成されるので、“シングル・インサーション（single-insertion）”アーキテクチャと見なされ得る。この場合に、定在波キャビティは、前記可動ミラー及び前記レーザにおけるレーザキャビティ（lasing cavity）によって形成される。一般に、可動ミラーは、関連するコリメーションオプティクスを有する。
前の段落で記載された機構の改良版において、前記照明器は、前記レーザと前記可動ミラーとの間に設けられた光ダイオード又は５０：５０プレートビームスプリッタ（例えば）を任意に有することができる。そのような実施形態は、レーザキャビティにおけるフィードバック効果を軽減する働きをする。
今しがた論じられたシングル・インサーション実施形態において、前記可動ミラーの軸位置を（局所的な光軸に沿って）調整することは、（解析位置での）定在波の位相が変更されることを可能にする。同様の効果は、先の“デュアル・インサーション”実施形態において、例えば：
−２つの入力ビームのうちの少なくとも１つの経路において調整可能な光学遅延要素を組み入れること（図１及び３を参照）；及び／又は
−一対の反射体の（少なくとも）１つを動かし（必要ならば、ビームスプリッタを同時に動かし）、反射体の軸分離を調整すること
によって達成され得る。
上述されたように、本発明において利用される定在波は、活性化光源（例えば、４０５ｎｍの波長を有するレーザ）又は励起光源（例えば、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６３９ｎｍ又は７５０ｎｍの波長を有するレーザ）を用いて生成されてよい。そのような態様は、発明の顕微鏡の照明アーキテクチャに関係がある。照明オプティクスに加えて、本発明は、顕微鏡の検出オプティクスにも関係がある。それに関連して、本発明の特定の実施形態は、用いられる光結合要素（ＯＣＥ；optical combining element）が（既に先で暗に示されたように）２方向ビームスプリッタを有することを特徴する。これは、ＯＣＥからの２つの相互に位相シフトされた出力を観察する２つのカメラを有する検出器配置とともに使用され得る。例えば、図３を参照されたい。以下では、本発明において生成された定在波がなぜ／どのようにしてｉＰＡＬＭ（及び同様の技術）よりも複雑でないＯＣＥ及び複雑でない検出器配置を可能にするのかが説明される。
これより図４Ａを参照すると、これは、図３に示されるような機構において検出器（カメラ）Ｄａ（強度Ｉｉｎ１を記録する。）及びＤｂ（強度Ｉｉｎ２を記録する。）によって測定される標本Ｓ（の蛍光放射部分）の軸位置（Ｚ）に対する測定された強度（Ｉｉｎ）のグラフを示す（これによって、添え字“ｉｎ”は“干渉（interference）”を表す。）。Ｉｉｎ１及びＩｉｎ２は、Ｚに対して正弦依存性を示す。所与の検出器における強度Ｉｉｎは、ビームＢ１及びＢ２（に沿った移動）に夫々関連する電磁場ＥＢ１及びＥＢ２の和／差によって決定される。これにより：

Ｉｉｎ１＝（ＥＢ１＋ＥＢ２）２
Ｉｉｎ２＝（ＥＢ１−ＥＢ２）２

キャビティの放射ビーム経路は、Ｉｉｎ１及びＩｉｎ２の間でπの位相シフトを生じさせる。この特定の事例における蛍光波長は５３０ｎｍであり、強度信号Ｉｉｎ１（Ｚ）及びＩｉｎ２（Ｚ）の関連する周期は、よって、５３０ｎｍ／４＝１３２．５ｎｍである。なお、それらの特定の値は、現在の議論に制限されない。対応する方法において、図４Ｂは、Ｚの関数として、いわゆる正規化微分強度（Normalized Differential Intensity）（Ｑｉｎ）を示す。これにより：

Ｑｉｎ＝（Ｉｉｎ１−Ｉｉｎ２）／（Ｉｉｎ１＋Ｉｉｎ２）

図４Ｂは、用いられる検出器配置のための“較正曲線”とも時々呼ばれる。この較正曲線の傾きは、曲線の極大及び極小に夫々対応するｒ１及びｒ２のような区間において有意に小さくなることが知られる。そのような“無効（dud）”区間ｒ１、ｒ２では、従って、検出感度が相応に低下する。結果として、所与のＺ値で／その近くで、Ｑｉｎの値が極値であるか又は極値に近い場合に（ｒ１、ｒ２のような区間に対応する。）、問題となっているＺ値を正確に決定することは困難である。これは、好ましくない状況である。この問題は、種々の方法において扱われ得る：
−（ａ）従来のｉＰＡＬＭでは、根本的な問題は、１２０°／２４０°だけ相互に位相シフトされている３つの検出チャネルを使用することによって対処される。結果として、所与のＺ値及び所与の一対のチャネルについての正規化微分強度（ＮＤＩ）が無効区間に入る場合に、（同じＺ値について）（必然的に）無効区間の外にある別の一対のチャネルに基づくＮＤＩを代わりに使用することができる。
−（ｂ）対照的に、本発明は、そのような第３のチャネルに依存する必要はなく、代わりに、全く別の方法で無効区間の問題を解決する。これに関して、図５Ａ及び５Ｂを参照されたい。これらの図は、本発明の革新的な定在波機構に関係がある（これにより、添え字“ｓｗ”は“定在波（standing wave）”を表す。）。この特定の事例において、問題となっている定在波は、４８８ｎｍの照明波長を用いて生成されるが、それは本議論に制限されない。図５Ａは、軸位置（Ｚ）の関数として第１の定在波の強度（Ｉｓｗ１）を示し、更には、軸位置（Ｚ）の関数として第２の軸方向にずらされた定在波の強度（Ｉｓｗ２）を示す。これにより、それらの第１及び第２の定在波の間には位相差Δφ＝πが存在する。図５Ｂは、図５Ａに対応する較正曲線を示す［Ｑｓｗ＝（Ｉｓｗ１−Ｉｓｗ２）／（Ｉｓｗ１＋Ｉｓｗ２）としてＱｓｗ対Ｚ］。最大感度に対応する、曲線の傾きが最大である“側面（flank）”区間ｒ３、ｒ４に注目されたい。位相シフトδをＩｓｗ１／Ｉｓｗ２に加えることによって（例えば、図１又は３において遅延要素Ｒを適切に動かすことによる。）、図５Ｂの較正曲線、従って、側面区間ｒ３、ｒ４の位置をＺに沿ってシフトさせることができる。特に、図５Ｂの較正曲線をＺ方向にシフトすることが可能であり、それにより、その側面区間の１つ（ｒ３、ｒ４、すなわち、最大感度）は図４Ｂの較正曲線の無効区間（ｒ１、ｒ２、すなわち、最小感度）に対応する。本質的に、４つの測定を有効に行うことが可能である。すなわち：
−第１の定在波位相値ΔφでのＩｉｎ１、Ｉｉｎ２；
−第２の定在波位相値δ＋ΔφでのＩｉｎ１’、Ｉｉｎ２’
これにより、観測される蛍光フルオロフォアの量子効率（放射輝度）は、測定プロセスの間に（有意に）変化すべきでない（それにより、観測される強度変化は、フルオロフォアの固有輝度の変化よりむしろ有効に定在波の位相シフトに原因があり得る。）。これは、通常は、例えば、約１〜１００ｍｓのオーダーの露光時間を暗示する。それらの測定から、標本の観測される部分（蛍光フルオロフォア）のＺ位置は決定され得る。これは、測定された強度値を、テスト標本（例えば、金ナノ粒子）がＺに沿って意図的に動かされるにつれてテスト標本からの強度信号が記録される（以前に実施された）較正セッションにおいて得られた基準Ｑ対Ｚグラフに“フィッティング”することによって、行われ得る。これに関した更なる情報については、以下、実施形態４を参照されたい。
上述されたように、本発明は、革新的な照明機構を使用する。この機構は、革新的な検出器光が用いられることを相応に可能にする。本発明の更なる態様では、
前記定在波は、第１のタイプの放射線を用いて生成され、
選択されたフルオロフォアは、前記定在波の極大に近接した前記標本の深領域において活性化される。
そのようなシナリオは、本発明に従う照明器において生成される定在波が、標本を通じて軸方向に延在する極大及び極小を本質的に有し、この効果が、定在波の周期に対して比較的薄い深領域においてフルオロフォアを活性するために利用され得るという事実を用いる。
本発明の特定の態様において、波面変更手段（wavefront modifying means）は、光結合要素に入る光において非点収差を生じさせるために使用される。このために、例えば、顕微鏡の２つの検出ブランチの少なくとも一方／望ましくは両方において、円柱レンズ又はミラーが用いられてよく、あるいは、平面ミラー（例えば、折り畳みミラー）に円筒ストレスが導入されてよい。このようにして非点収差（より一般的に、軸位置において極性が変化する波面変更）を導入することは、関連する点広がり関数（ＰＳＦ；Point Spread Function）に、Ｙに沿った細長さからＸに沿って細長い円形へと変化する、等、Ｚに応じた楕円率の“振動”を示させる。所与の軸位置でこのＰＳＦの形状を観測することは、次いで、その位置のＺ値を決定するのを助けるために使用され得る。より具体的に、それは、既知の振幅のＺ座標の“符号”の検査の役目を果たす。
フルオロフォア及び蛍光顕微鏡におけるそれらの使用に関するいくつかの更なる情報について、次のソース：
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を参照されたい。
本発明は、これより、例となる実施形態及び添付の図面に基づき、より詳細に説明される。
本発明に従う顕微鏡の実施形態の部分の長手方向断面図を表す。 本発明に従う顕微鏡の他の実施形態の部分の長手方向断面図を表す。 本発明に従う顕微鏡の特定の実施形態の長手方向断面図を表す。 光結合要素における２つの干渉する光ビームについて軸位置（Ｚ）の関数として強度（Ｉｉｎ）のグラフを示す。 光結合要素における２つの干渉する光ビームについて軸位置（Ｚ）の関数として正規化微分強度（Ｑｉｎ）のグラフを示す。 本発明に従う照明器において生成される２つの位相シフトされた定在波について軸位置（Ｚ）の関数として強度（Ｉｓｗ）のグラフを示す。 本発明に従う照明器において生成される２つの位相シフトされた定在波について軸位置（Ｚ）の関数として正規化微分強度（Ｑｓｗ）のグラフを示す。 図４Ｂ及び図５Ｂにおけるような曲線が結合／重ね合わせされたグラフを表す。 図において、必要に応じて、対応する部分は、対応する参照符号を用いて示されてよい。
図１は、本発明に従う顕微鏡（Ｍ）の実施形態の部分の長手方向断面図を表す。特に、それは、そのような顕微鏡のための照明器ＩＬの実施形態を表す。図において、レーザＬは、“入力放射線”のビーム１を生成する。本発明に関連して、ビーム１は、蛍光顕微鏡におけるフルオロフォアを活性化／励起するための活性化ビーム又は励起ビームであって良い。このビーム１は、解析位置Ａで標本ホルダＨにおいて保持されている標本Ｓ（におけるフルオロフォアの集合）に照射する（それらを活性化／及び励起する）働きをし、（最終的に）標本Ｓ（の部分）に蛍光を放たせる。解析位置Ａは、一対の相対して位置付けられた投射システムＰ１、Ｐ２によって挟まれている。投射システムＰ１、Ｐ２は、この蛍光を集め、それを検出器配置Ｄ（図３に関連して説明される。）の上に方向付ける働きをする。差し当たり、本議論は、照明器ＩＬの構造／機能に専念する。
ビーム１は、２方向ビームスプリッタ３にぶつかる。ビームスプリッタ３は、ビーム１を、ビームスプリッタ３におけるビーム分割面３’から出る２つの異なった“ブランチ”又は“アーム”に夫々位置する一対のコヒーレント光ビーム５ａ、５ｂに分ける。ビーム５ａ、５ｂは、その後に、夫々の反射体（例えば、ミラー）の対７ａ、７ｂに衝突する。反射体７ａ、７ｂは、ビーム５ａ、５ｂを共線投射システムＰ１、Ｐ２の共通光軸Ｏの上へ（又はほぼその上へ）と方向転換する。このようにして、方向転換されたビーム５ａは、Ｏに沿ってＰ１を通って解析領域Ａを横断し、一方、方向転換されたビーム５ｂは、Ｏに沿ってＰ２を通って解析領域Ａを横断する。そして、それらの２つの方向転換されたビームは、位置Ａで（及び経路／光学キャビティＡ、７ａ、３、７ｂ、Ａにおいて別な場所で）（縦方向／軸方向の）定在波を生成する。図３において図式的に表されているように、そのような定在波は、Ｏに平行に延在する（表されているデカルト座標系Ｘ、Ｙ、Ｚの）軸Ｚに沿って配置された交互の極大及び極小を有する。
オプティクス９、１１も、対称的に／一般的に示されている。オプティクス９、１１は、例えば、ビーム５ａ、５ｂをフォーカス／コリメートする働きをする。更には、ここで表されているように、調整可能な遅延要素Ｒは、上記の“ブランチ”のうちの１つにおいて位置して、生成された定在波３１の位相が調整されることを可能にする。これに対する代替案又は補足として、反射体７ａ、７ｂの（少なくとも）１つを更にシフトすることが可能であり、例えば、反射体７ａの上に矢印シンボルによって示されるように、反射体７ａはシフトされてよい。
図２は、本発明に従う顕微鏡の他の実施形態の長手方向断面図を表す。特に、それは、そのような顕微鏡の照明器ＩＬの実施形態を表す。図１でも存在する図１の特定の部分は、必ずしもここで説明されない。代わりに、以下の議論は、２つの図の間の違いに焦点を合わせる。
図２において、傾けられたミラー１７（任意）は、解析位置Ａの第１の側（“Ｐ２側”又は“上流”）に位置する。これは、レーザＬからの入力ビームを投射システムＰ２、Ｐ１の共通光軸Ｏに沿って第１の方向（＋Ｚ）において標本Ｓを通すために使用される。可動ミラー（反射体）１３も使用される。可動ミラー１３は、光軸Ｏに実質的に垂直に配置される。可動ミラー１３は、制御可能な方法でＯに沿って移動可能であり、解析位置Ａの第２の反対の側（“Ｐ１側”又は“下流”）に位置付けられる。これは、入力ビームを自身で反射し返して、第２の反対の方向（−Ｚ）において標本Ｓを通す働きをする。Ｌからの出射（＋Ｚ）及び戻り（−Ｚ）ビームは、（とりわけＡで）定在波を生成するよう相互に作用する。軸Ｏに沿ったミラー１３の移動は、この定在波の位相が調整されることを可能にする。また、オプティクス１９、２１が対称的に／一般的に示されている。これらは、例えば、フォーマシング／コリメーション機能を果たす。
任意に、図２には、光ダイオード１５（例えば、ファラデーアイソレータ）又は５０：５０プレートビームスプリッタのようなデバイス１５が存在する。
図３は、本発明に従う顕微鏡Ｍの特定の実施形態の長手方向断面図を表す。表されている顕微鏡Ｍは、（とりわけ）照明部分（軸Ｏの右側）及び検出部分（軸Ｏの左側）を有する。照明部分は、本質的には、図１に示されている機構に対応する（しかし、図２に示されている機構に同じように容易に基づいてよい。）。従って、不必要な繰り返しを避けるために、以下の議論は、検出部分に焦点を当てる。
上述されたように、標本Ｓ（におけるフルオロフォアの集合）の照明は、適切に選択された活性化及び励起波長を用いて、それらのフルオロフォア（の特定の一部）に蛍光を放たせる。蛍光は、投射システムＰ１、Ｐ２によって（部分的に）集められる。傾けられたダイクロイックミラー（反射体）２３、２５（軸Ｏ上に位置する。）を用いると、Ｐ１及びＰ２によって集められた光は、夫々ビームＢ１、Ｂ２として光結合要素（ＯＣＥ）Ｃ（の入力面の夫々の対）に向けられる。光結合要素Ｃは、本発明では、（より複雑な）三相ビームスプリッタ（結合器）よりむしろ、（比較的単純な）２方向ビームスプリッタ（結合器）であることができる。ＯＣＥ Ｃ内で、ビームＢ１及びＢ２は、光学的に干渉し、干渉パターン（図示せず。）を生成する。検出器配置Ｄは、ここでは２つの検出器Ｄａ、Ｄｂを有し、２つの異なった（相互に位相シフトされた）“チャネル”に沿ってこの干渉パターンを同時に観察することによって、干渉パターンを試験するために使用される。例えば、図４Ａを参照されたい。また、図３には、一般的オプティクス２７、２９が少々的に示されている。これらは、例えば、フォーマシング／コリメーション機能を果たす。理想的には、ＯＣＥ Ｃのビーム分割面Ｃ’は、標本Ｓと同じ面に位置する。その場合に、ビームＢ１及びＢ２の蛍光放射の位相は、ビームスプリッタ位置に対して“平衡状態（balanced）”である。
図４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂに関して既に与えられた説明を参照して、これより、図３で表されているような発明の顕微鏡が如何にして使用され得るかに関して、補足説明が与えられる。特に、以下の議論は、検出信号の解析／処理／解釈の特定の態様に焦点を当てる。
図６は、図４Ｂ及び５Ｂにおける様な曲線が結合／重ね合わせされているグラフを表す。成分曲線は（Ｚに応じた）異なる周波数を有するので、それらは、必然的にある点で、例えば、表されている区間ｒ５、ｒ６において、互いに交差する。そのような区間では、測定感度は、比較的低い傾向がある。
この問題は、ｉＰＡＬＭでも用いられている技術により対処され得る。ＯＣＥ Ｃに到達する蛍光の波面が、例えば、図３における折り畳みミラー２３、２５の一方／望ましくは両方に意図的に機械的にストレスを加えることによって、非点収差（astigmatism）を導入するように意図的に変形される場合に、関連する点広がり関数（ＰＳＦ）３３は、Ｙに沿った細長さからＸに沿って細長い円形へと変化する、等、Ｚに応じて楕円率の“振動”を示す。所与の位置でＰＳＦ３３の形状を観測することは、次いで、その位置のＺ値を推定するために使用され得る。これは、横軸に沿ってＺ軸の関数として例となるＰＳＦを表すことによって、図６において図式的に表されている。
本発明に従う顕微鏡における干渉パターンの基本的な数学的解析は、ｉＰＡＬＭに関係があるものと同様である。これに関する更なる情報については、参照により本願に援用される米国特許第７９２４４３２号明細書における数学的議論を（例えば、）参照されたい。
１ ビーム（入力放射線）
３ ２方向ビームスプリッタ
５ａ，５ｂ コヒーレント光ビーム
７ａ、７ｂ 反射体（ミラー）
１３，１７ ミラー
２３、２５ ダイクロイックミラー
３１ 定在波
Ａ 解析位置
Ｃ 光結合要素
Ｄ 検出器配置
Ｄａ，Ｄｂ 検出器（カメラ）
Ｈ 標本ホルダ
ＩＬ 照明器
Ｌ レーザ
Ｍ 顕微鏡
Ｏ 共通光軸
Ｐ１，Ｐ２ 投射システム
Ｒ 調整可能な遅延要素
Ｓ 標本

Claims (10)

  1. 解析位置で標本を保持する標本ホルダと、
    入力放射線を前記標本に照射して、該標本に蛍光を放たせる照明器と、
    前記解析位置の両側に配置され、前記蛍光の少なくとも一部分を集め、対応する一対の光ビームを光結合要素の夫々の入力対に方向付け、該光結合要素で前記一対の光ビームが光学的に干渉するようにする一対の投射システムと、
    前記光結合要素からの出力光を試験する検出器配置と
    を有する広視野干渉顕微鏡であって、
    前記照明器は、前記解析位置で入力放射線の定在波を生じさせるよう構成される光学キャビティを有し、
    前記検出器配置は、厳密に２つの干渉検出ブランチを有する、
    広視野干渉顕微鏡。
  2. 前記照明器は、
    単一のソースから一対のコヒーレントビームを生成するビームスプリッタと、
    前記一対のコヒーレントビームの夫々を前記一対の投射システムの組の夫々１つに通す一対の反射体と
    を有し、
    これによって、前記光学キャビティは、前記ビームスプリッタ及び前記一対の反射体を有する、
    請求項１に記載の広視野干渉顕微鏡。
  3. 前記照明器は、前記コヒーレントビームの少なくとも１つの経路に配置される調整可能な光学遅延要素を有する、
    請求項２に記載の広視野干渉顕微鏡。
  4. 前記照明器は、
    前記解析位置の第１の側に位置し、入力ビームを前記一対の投射システムの共通光軸に沿って第１の方向において前記標本に通すレーザと、
    前記解析位置の第２の反対の側に位置し、前記共通光軸に垂直に配置され、前記入力ビームを反射して第２の反対の方向において前記標本に通す可動ミラーと
    を有する、
    請求項１に記載の広視野干渉顕微鏡。
  5. 前記光結合要素は、２方向ビームスプリッタを有する、
    請求項１乃至４のうちいずれか一項に記載の広視野干渉顕微鏡。
  6. 前記入力放射線は、
    選択されたフルオロフォアを前記標本において活性化する第１のタイプの放射線と、
    活性化されたフルオロフォアの組を、結果として起こる蛍光の放射により励起する第２のタイプの放射線と
    を有し、
    前記定在波は、前記第１のタイプ又は前記第２のタイプのいずれか一方の放射線を用いて生成される、
    請求項１乃至５のうちいずれか一項に記載の広視野干渉顕微鏡。
  7. 前記定在波は、前記第１のタイプの放射線を用いて生成され、
    前記選択されたフルオロフォアは、前記定在波の極大に近接した前記標本の深領域において活性化される、
    請求項６に記載の広視野干渉顕微鏡。
  8. 前記光結合要素に入る光において非点収差を生じさせる波面変更手段を有する
    請求項１乃至７のうちいずれか一項に記載の広視野干渉顕微鏡。
  9. 解析位置で標本を保持する標本ホルダと、
    入力放射線を前記標本の一範囲に照射して、該範囲における少なくとも１つのフルオロフォアに蛍光を放たせる照明器と、
    前記解析位置の両側に配置され、前記蛍光の少なくとも一部分を集め、対応する一対の光ビームを光結合要素の夫々の入力対に方向付け、該光結合要素で前記一対の光ビームが光学的に干渉して干渉パターンを生成するようにする一対の投射システムと、
    前記光結合要素からの出力光を試験する検出器配置と
    を有する広視野干渉顕微鏡を使用する方法であって、
    （Ｉ）前記照明器を用いて、前記解析位置で入力放射線の定在波を生じさせるステップと、
    （ＩＩ）前記検出器配置を用いて、厳密に２つの異なったチャネルに沿って前記干渉パターンの強度分布を記録するステップと、
    （ＩＩＩ）前記定在波の位相を変更し、この位相を変更された波についてステップ（ＩＩ）を繰り返すステップと、
    （ＩＶ）ステップ（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において記録された前記強度分布を用いて、前記一対の投射システムの共通光軸に対して前記フルオロフォアの軸位置を導出するステップと
    を有する方法。
  10. 波面変更手段が、前記光結合要素に入る光において非点収差を生じさせるために使用される、
    請求項９に記載の方法。
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