CN107014786A - 驻波干涉显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种宽场干涉显微镜，其包括：—样品保持器，用于在分析位置处保持样品；—照明器，用于用输入辐射来照射样品，从而促使其发射荧光；—一对投影系统，布置在所述分析位置的相对侧处，以收集所述荧光的至少一部分并将相应的一对光束指引到光学组合元件的各对输入，其在那里进行光学干涉；—检测器装置，用于检查来自所述组合元件的输出光，其中：—照明器被配置成在分析位置处产生输入辐射的驻波；—所述检测器装置恰好包括两个干涉检测分支。

Description

驻波干涉显微镜
本发明涉及一种宽场干涉显微镜，其包括：
—样品保持器，用于在分析位置处保持样品；
—照明器，用于用输入辐射来照射样品，从而促使其发射荧光；
—一对投影系统，布置在所述分析位置的相对侧处，以收集所述荧光的至少一部分并将相应的一对光束指引到光学组合元件的各对输入，其在那里进行光学干涉；
—检测器装置，用于检查从所述组合元件输出的光。
本发明还涉及一种使用此类显微镜的方法。
例如从例如在以下参考文献中更详细地阐述的干涉光激活局部化显微术（iPALM）的领域知道如上文所阐述的显微镜：
http://www.pnas.org/content/106/9/3125.full
http://www.mechanobio.info/topics/methods/super-resolution-microscopy- intro
iPALM技术进而可以被视为常规（非干涉）PALM技术的改进，由此，前者为后者增加了轴向地以及横向地执行分辨率/图像重构的能力。
这可以理解如下：
—在PALM中，通过连续地激励样品中的对象（光可激活荧光团）的空间稀疏子集，引起来自这些不同子集的荧光发射的时间分离来实现横向超分辨率。这些稀疏子集中的每一个内的对象的可分辨性比在整个样品将被一下子成像的情况下大。本质上，通过替代地将集合视为被连续地成像的稀疏子集的累计集体来规避在要尝试同时地对对象的稠密子集进行成像的情况下将预期的分辨率限制衍射效应。促使光可激活荧光团在两步过程中发荧光，由此：
▪ 在预备步骤中，使用所谓的“激活的波长”（或“激活波长”）来促进荧光团从非发射至发射状态；
▪ 在后续步骤中，所谓的“激励的波长”（或“激励波长”）被用来引起已激活荧光团（荧光激励）的辐射“放松”。
针对关于此过程的更多信息，参见例如以下参考文献：
http://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/619251/
在iPALM中，通过引入还将允许细轴向/深度（Z）分辨率的机制来使在PALM中实现的横向（XY）超分辨率更进一步。这是通过经由一对相对设置的投影系统（物镜、光学柱）对样品（中的荧光团）进行成像而实现的，所述投影系统（物镜、光学柱）的输出射束被馈送到光学组合元件（具体地，三相射束分离器）中，在那里其进行光学干涉。结果得到的干涉条纹图案将对被成像的对象（荧光团）的轴向（深度）位置（非常）敏感，因为这将影响干涉射束的相对路径长度。通过使用包括用以选择性地着眼于来自组合元件的相位分离输出的多个检测器（例如CCD）的检测器装置，可以有效地将给定条纹图案（以算术方式）“转化”成推导的轴向对象位置；在iPALM中，使用三个不同的检测器（相机）来观察来自组合元件的三个不同输出（相互相移达120°），由此，由这些相机观察到的输出的相对强度将作为轴向荧光团位置的函数以可预测方式改变。
虽然iPALM是有用的技术，但其确实遭受缺点的影响。更具体地，其依赖于相对复杂的光学/检测架构。特别地：
—采用的三相射束分离器是难以制造的昂贵且易碎的组件。其性能对温度波动和机械振动敏感，并且其在被干扰之后具有相对长的建立时间（settling time）。此外，其难以以光学方式对准/调整。
—采用的三相射束分离器还难以在尺寸方面进行机械缩放，例如以匹配具有较大视场的相机（在没有渐晕（vignetting）的情况下）。关于这方面的限制性因素包括射束分离器的平面光学件上的公差以及荧光的相干特性。
—检测机构（set-up）要求使用三个检测器/相机，其增加体积/减小可用空间，并且增加费用。
在正常情况下，应注意的是除PALM/iPALM之外，使用中还存在各种其它类型的荧光显微术（例如，诸如STORM和dSTORM）。可以例如从以下参考文献收集关于这方面的更多信息：
https://en.wikipedia.org/wiki/Super-resolution_microscopy
应注意的是可以将宽场显微镜（可以将其视为采用平面成像波）和例如点扫描显微镜（德语：“Rastermikroscop”）（其使用被聚焦到一点的成像射束，并且因此（必须）在要成像的对象上扫描）之间的区别。本发明涉及前者（宽场）。例如在EP 0 491 289 A1和S.W. Hell等人的期刊文章“Enhancing the axial resolution in far-field light microscopy: two-photon 4Pi confocal fluorescence microscopy”, J. Modern Optics 41(4), pp.675-681 (1994)中阐述了后者（点扫描）的示例。）。
本发明的目的是解决这些问题。特别地，本发明的目的是提供一种利用根本不同的照明/检测配置的可替换深度分辨局部化显微技术。更具体地，本发明的目的是不要求使用三相射束分离器。
在如在上文的开头段落中所指定的显微镜中实现了这些及其它目的，其特征在于：
—照明器包括光学腔体，其被配置成在分析位置处产生输入辐射的驻波；
—所述检测器装置恰好包括两个干涉检测分支。
本发明的以下方面值得明确的提及：
（i）可使用“激活”输入光或“激励”输入光来产生在这里提到的驻波，并且其将在分析位置处在沿着（局部）光轴的方向上延伸。
（ii）此驻波产生照射样品的输入辐射的（正弦）调制，并且其具有相位，可以例如通过调整在其中生成该驻波的光学腔体的“长度：来调谐该相位。
（iii）可以利用方面（ii）来提供用于在常规iPALM检测机构中使用的三个120°度相移射束中的（至少）一个的可替换方式；由于因此致使三个检测射束成为不必要的，所以不再需要使用麻烦的三相射束分离器和相关联的三个一组的相机，替代地，用常规的双向射束分离器可以足够，该常规双向射束分离器廉价得多、不那么易碎，并且更容易制造（并且被缩放至较大的尺寸）。
（iv）驻波中的空间调制强度分布允许有在样品中激活/激励荧光团的创新方式，这可以充当用于新的效果和优点的基础。
本发明的这些方面将进一步接收以下查明。
请注意，本发明根据以下各项被区别开：
—使用仅一个检测器（分支/通道）的检测器装置，例如如在US 2005/0006597 A1和EP0 491 289 A1中阐述的。在此类机构中，虽然可以观察到干涉图像，但不能有意义地解释检测到的强度；例如，不知道平均值以上强度值是由相长干涉效应引起的还是替代地由具有相对高的反射速率的荧光团而引起的，还是两者的组合。使用不止一个通道允许检查强度比，从而缓解此问题。
—使用三个检测器（分支/通道）的检测器装置，例如上文/下面所述，并且如在US2006/0291043 A1中所阐述的（其中，应注意的是干涉成像未完成：采用的三个相机仅被用来检测不同的波长）。
存在将实现/配置本发明所使用的类型的照明器的各种方式。在特定实施例中，照明器包括：
—射束分离器，将从单个源（例如激光器）产生一对相干射束；
—一对反射器，用以指引所述一对相干射束中的每一个通过所采用的成对投影系统中的相应的一个，
由此，所述光学腔体包括所述射束分离器和所述一对反射器。例如，在图1中描绘了此类机构的示例。此类配置可以被视为“双插入”架构。因为驻波是使用两个相反方向的输入射束生成的。
在前面段落中阐述的实施例的可替换实施例中，照明器包括：
—激光器，其位于所述分析位置的第一侧处，用以将输入射束沿着所述一对投影系统的公共光轴指引且在第一方向上通过所述样品；
—可移动反射镜，位于所述分析位置的第二、相对侧且被垂直于所述公共光轴布置，用以将所述输入射束本身反射回去并在第二、相反方向上通过所述样品。
例如，在图2中描绘了此类机构的示例。此类配置可以被视为“单插入”架构，因为驻波是使用单个输入射束来生成的，然而，其本身被所采用的可移动反射镜反射回去；在这种情况下，由激光器中的激光腔体和所述可移动反射镜形成驻波腔体。一般地，可移动反射镜将具有相关联的准直光学件。
在前一段中描述的机构的改进中，照明器可以可选地包括在所述激光器与所述可移动反射镜之间提供的（例如）光学二极管或50:50板射束分离器。此类实施例用于缓解激光腔体中的反馈效应。
在刚刚讨论的单插入实施例中，调整可移动反射镜的轴向位置（沿着局部光轴）允许修改驻波（在分析位置处）的相位。用例如以下各项可以在前述“双插入”实施例中实现类似的效果：
—在两个输入射束（如图1和3中所示）中的至少一个的路径中结合可调整光学延迟器元件；或/和
—移动成对反射器中的（至少）一个（并且在必要时共同移动射束分离器），从而调整反射器的轴向间隔。
如上面已经陈述的，可使用来自激活光源（例如具有405nm的波长的激光器）或激励光源（例如具有488nm、561nm、639nm或750nm的波长的激光器）的光来生成在本发明中利用的驻波；此类方面涉及本发明性显微镜的照明架构。除照明光学件之外，本发明还涉及显微镜的检测光学件。在那方面，本发明的特定实施例的特征在于所采用的光学组合元件（OCE）包括双向射束分离器（如上文已提到的）。这可以结合包括两个相机的检测器装置而使用，所述两个相机着眼于来自（OCE）的两个相互相移的输出：例如参见图3。下面将解释在本发明中生成的驻波为什么/如何允许与在iPALM（和类似技术）中相比不那么麻烦的OCE和不那么麻烦的检测器装置。
现在参考图4A，这示出了由诸如图3中所示的机构（由此，后缀“in”表示“干涉”）中的检测器（相机）Da（其寄存强度Iin1）和Db（其寄存强度Iin2）所测量的样品S（的荧光部分）的测量强度（Iin）对比轴向位置（Z）的图表。应注意的是Iin1和Iin2证明对Z的正弦相关性。给定检测器上的强度Iin由分别地与射束B1和B2相关联（沿着其行进）的电磁场EB1和EB2的和/差来确定给定检测器，由此：
Iin1 = (EB1 + EB2)2 Iin2 = (EB1 ‒ EB2)2。
腔体的发射射束路径在Iin1与Iin2之间产生π的相移。本特定情况下的荧光波长是530nm，并且强度信号Iin1（Z）和Iin2（Z）的关联周期因此是530nm/4＝132.5nm；然而，这些特定值对当前讨论并非限制。以相应方式，图4B示出了作为Z的函数的所谓归一化差分强度（Qin），由此：
Qin = (Iin1‒Iin2)/(Iin1+Iin2)。
图4B有时也称为用于所采用检测器装置的“校准曲线”。应注意的是此校准曲线的斜率在诸如r1和r2之类的区域中明显减小，该r1和r2分别地对应于曲线的局部最大值和局部最小值；在这些“dud”区域r1、r2中，因此存在相应地降低的检测灵敏度。结果，如果在给定Z值处/附近Qin的值是极值或接近于极值（对应于诸如r1、r2之类的区域），则将难以准确地确定正在讨论中的Z值，这是不期望的情况。可以用不同的方式来处理此问题：
—（a）在常规iPALM中，通过使用相互相移120°/240°的三个检测通道来解决底层问题；结果，如果用于给定Z值和给定的一对通道的归一化差分强度（NDI）落在dud区域中，则可以替代地使用基于不同的一对通道的NDI，其（针对同一Z值）将（必要地）落在dud区域外面。
—（b）相反地，本发明不需要依赖于此类第三通道，并且替代地以完全不同的方式解决dud区域的问题。在这方面，对涉及本发明的创新中驻波机构（由此，后缀“sw”表示“驻波”）的图5A和5B进行参考。在此特定情况下，使用488nm的照明波长来生成正在讨论中的驻波，但是其对当前讨论并不是限制性的。图5A示出了作为轴向位置（Z）的函数的第一驻波的强度（Isw1），并且还示出了作为轴向位置（Z）的函数的第二、轴向移位驻波的强度（Isw2），由此，在所述第一驻波和第二驻波之间存在∆＝π的相位差。图5B示出了对应于图5A的校准曲线【Qsw对比Z，其中Qsw = (Isw1‒Isw2)/(Isw1+Isw2)】。请注意，其中曲线的斜率为最大的“侧面”区域r3、r4，对应于最大灵敏度。通过向Isw1/Isw2添加相移δ（例如通过适当地移动图1或3中的延迟元件R ），可以促使图5B的校准曲线（和因此侧面区域r3、r4的位置）沿着Z移位。特别地，可以对图5B的校准曲线进行Z移位，使得其侧面区域（r3、r4；最大灵敏度）中的一个对应于图4B的校准曲线的dud区域（r1、r2；最小灵敏度）。本质上，有效地获取四个测量结果，即：
—第一驻波相位值∆下的Iin1、Iin2；
—第二驻波相位值δ + ∆下的Iin1'、Iin2'，
由此，观察到的发荧光荧光团的量子效率（发射亮度）在测量过程期间不应（显著地）改变（使得观察到的强度变化可以有效地归因于驻波相移而不是荧光团的本征亮度的变化）；这通常将暗示例如1—100ms左右的曝光时间。根据这些测量，可以确定样品的被观察部分（发荧光荧光团）的Z位置。这可以通过将测量强度值拟合到在（先前执行的）校准会话中获得的参考Q对比Z图表，其中随着测试样品被故意地沿着Z移动而对来自测试样品（诸如金纳米颗粒）的强度信号进行配准。下面针对在这方面的更多信息对实施例4进行参考。
如上文所阐述的，本发明使用创新照明机构，其相应地允许采用创新检测机构。在本发明的另一方面，
—使用所述第一类型的辐射来产生所述驻波；
—所述选定荧光团在接近于所述驻波的局部最大值的样品的深度区域中被激活。
这种情形利用这样的事实，即根据本发明在照明器中生成的驻波将固有地具有轴向地延伸通过样品的局部化最大值和最小值，并且可以利用此效应来激活相对于驻波的周期而言相对细的深度区域中的荧光团。
在本发明的特定方面中，使用波前修改部件来产生进入光学组合元件中的光的散光。为此，可以例如采用圆筒形透镜或反射镜，并且在显微镜的双检测分支中的至少一个/优选地两者中向平面反射镜（诸如折叠反射镜）中引入（圆筒形）应力。以这种方式引入散光（更一般地：在极性方面作为轴向位置的函数而改变的波前修改）促使相关联的点扩散函数（PSF）证明作为Z的函数的椭圆率“振荡”—从沿着Y的伸长变成圆形、沿着X伸长等。观察给定轴向位置处的此PSF的形式然后可以用来帮助确定用于该位置的Z值，更具体地，其充当对已知振幅的Z坐标的“符号”的检查。
针对关于荧光团及其在荧光显微术中的使用的某些其它信息，对以下来源进行参考：
https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore
J. Lippincott-Schwartz & G. Patterson, Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging, Trends in CellBiology 19 (11), pp. 555-565, Elsevier Ltd., 2009。
现在将基于示例性实施例和所附示意图来更详细地阐述本发明，在所述所附示意图中：
图1图示出根据本发明的显微镜的实施例的一部分的纵向横截面视图。
图2图示出根据本发明的显微镜的另一实施例的一部分的纵向横截面视图。
图3图示出根据本发明的显微镜的特定实施例的纵向横截面视图。
图4A和4B分别示出用于光学组合元件中的两个干涉光束的作为轴向位置（Z）的函数的强度（Iin）和归一化差分强度（Qin）的图表。
图5A和5B分别示出了用于在根据本发明的照明器中产生的两个相移驻波的作为轴向位置（Z）的函数的强度（Isw）和归一化差分强度（Qsw）的图表。
图6图示出其中诸如图4B和5B中的曲线之类的曲线已被组合/叠加的图表。
在附图中，在相关的情况下，可使用相应附图标记来指示对应部分。
实施例1
图1图示出根据本发明的显微镜（M）的实施例的一部分的纵向横截面视图。更特别地，其图示出用于此类显微镜的照明器IL的实施例。在本图中，激光器L产生“输入辐射”的射束1，其在本发明的背景下可以是用于分别地在荧光显微术中激活/激励荧光团的激活射束或激励射束。此射束1用于照射（激活和/或激励）在分析位置A处被保持在样品保持器H上的样品S（中的许多荧光团），（最终）促使样品S（的一部分）发射荧光。分析位置A被一对相对地定位的投影系统P1、P2跨坐，其将用于收集此荧光并将其指引到检测器装置D（将在图3的背景下讨论）上；现在，本讨论将集中于照明器IL的结构/运行。
射束1遇到双向射束分离器3，其将射束1划分成一对相干光束5a、5b，其分别地位于源自于项目3中的射束分离表面3'的两个不同“分支”或“臂”中。射束5a、5b随后撞击在各对反射器（例如反射镜）7a、7b上，其使射束5a、5b转向到（或近似到）共线投影系统P1、P2的公共光轴O上；这样，转向射束5a沿着O通过P1穿过分析区域A，由此，转向射束5b沿着O通过P2穿过分析区域A，并且这两个转向射束在位置A处（并且在路径/光学腔体A、7a、3、7b、A中的别处）产生（纵向/轴向）驻波。如在图3中示意性地示出的，此类驻波31将具有沿着平行于O延伸的（所示笛卡尔坐标系X、Y、Z的）轴Z布置的交替最大值和最小值。
象征性地/一般地示出的还有光学件9、11，其例如用于使射束5a、5b聚焦/准直。此外，如这里描绘的，可调整延迟元件R位于上述“分支”中的一个中，因此允许调整生成的驻波31的相位。作为其可替换方式或补充，还可以使反射器7a、7b中的（至少）一个移位，例如使反射器7a如在其旁边的箭头符号所示地移位。
实施例2
图2图示出根据本发明的显微镜的另一实施例的一部分的纵向横截面视图；更特别地，其图示出用于此类显微镜的照明器IL的实施例。在这里将不会不必要地讨论在图1中还存在的图2的某些部分；替代地，以下讨论将集中于两个图之间的差别。
在图2中，倾斜反射镜17（可选）位于分析位置A的第一侧（“P2侧”或“上游”）处；这被用来将输入射束从激光器L沿着投影系统P2、P1的公共光轴O引导并在第一方向（+Z）上通过样品S。还使用可移动反射镜（反射器）13，其被布置成基本上垂直于光轴O，可以以受控方式沿着O移位，并且位于分析位置A的第二、相对侧（“P1侧”或“下游”）；这用于将所述输入射束本身反射回去并在第二、相反方向（-Z）上通过样品S。从L的出发（+Z）和返回（-Z）的射束相互作用而产生驻波（特别地在A处）。反射镜13沿着轴O的移位允许调整此驻波的相位。象征性地/一般地示出的还有光学件19、21，其例如用于聚焦/准直功能。
在图2中以光学方式存在的是装置15，诸如光学二极管15（例如法拉第绝缘体）或50:50板射束分离器。
实施例3
图3图示出根据本发明的显微镜M的特定实施例的纵向横截面视图。所示的显微镜M（尤其）包括照明部分（在轴O右侧）和检测部分（在轴O左侧）。所述照明部分本质上对应于图1的中所示的机构（但是可以仅容易地基于图2中所示的机构）；因此，从而避免不必要的重复，以下讨论将集中于所述检测部分。
如上文所阐述的，样品S（中的许多荧光团）的照明（使用适当选择的激活和激励波长）将促使那些荧光团（中的某些）发射荧光，其（部分地）被投影系统P1、P2收集。使用倾斜二向色反射镜（反射器）23、25（位于轴O上），由P1和P2收集的光分别地作为射束B1、B2被引导到光学组合元件（OCE）C（的各对输入面）中，所述光学组合元件在本发明中可以是（相对简单的）二相射束分离器（组合器）而不是（更加复杂的）三相射束分离器（组合器）；在OCE C内，射束B1和B2进行光学干涉并产生干涉图（未描绘）。检测器装置D（其在这里包括两个检测器Da、Db）被用来通过同时地沿着两个不同的（相互相移的）“通道”着眼于此干涉图来检查此干涉图，例如参见图4A。图3中还象征性地示出的是一般光学件27、29，其例如用于聚焦/准直功能。理想地，OCE C的射束分离表面C'位于与样品S相同的平面中；在那种情况下，射束B1和B2的荧光发射的相位相对于射束分离器位置是“平衡的”。
实施例4
参考上文已关于图4A、4B、5A和5B给出的说明，现在将给出关于如何可以使用诸如在图3中描绘的发明性显微镜的补充描述。更特别地，以下讨论将集中于检测信号分析/处理/解释的某些方面。
图6图示出其中诸如图4B和5B中的曲线之类的曲线已被组合/叠加的图表。由于分量曲线具有不同的频率（作为Z的函数），其将不可避免地在某些点处（诸如在描绘的区域r5、r6中）相互交叉。在此类区域中，测量灵敏度将趋向于是相对低的。
可以使用在iPALM中也利用的技术来解决这个问题。如果故意地使到达OCE C的荧光的波前变形，从而引入散光（例如通过故意地以机械方式对图3中的折叠式反射镜23、25中的一个/优选地两者施加应力）则关联的点扩散函数（PSF）33将证明作为Z的函数的椭圆率“振荡”—从沿着Y的伸长变成圆形、沿着X伸长等。然后可以使用观察给定位置处的PSF33的形式来推断用于该位置的Z值。这在图6中通过图示作为沿着横轴的Z的函数的示例性PSF形式来示意性地描绘。
根据本发明的显微镜中的干涉图的基本数学分析类似于关于iPALM的分析。对于在这方面的更多信息，（例如）对美国专利US 7,924,432中的数学讨论进行参考，其被通过引用结合到本文中。

Claims (10)

1.一种宽场干涉显微镜，包括：
—样品保持器，用于在分析位置处保持样品；
—照明器，用于用输入辐射来照射样品，从而促使其发射荧光；
—一对投影系统，布置在所述分析位置的相对侧处，以收集所述荧光的至少一部分并将相应的一对光束指引到光学组合元件的各对输入，其在那里进行光学干涉；
—检测器装置，用于检查来自所述组合元件的输出光，
其特征在于：
—照明器包括光学腔体，其被配置成在分析位置处产生输入辐射的驻波；
—所述检测器装置恰好包括两个干涉检测分支。
2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述照明器包括：
—射束分离器，用以从单个源产生一对相干射束；
—一对反射器，用以指引所述一对相干射束中的每一个通过所述成对投影系统中的相应的一个，
由此，所述光学腔体包括所述射束分离器和所述一对反射器。
3.根据权利要求2所述的显微镜，其中，所述照明器包括布置在所述相干射束中的至少一个的路径中的可调整光学延迟元件。
4.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述照明器包括：
—激光器，位于所述分析位置的第一侧处，用以将输入射束沿着所述一对投影系统的公共光轴指引且在第一方向上通过所述样品；
—可移动反射镜，位于所述分析位置的第二、相对侧且被垂直于所述公共光轴布置，用以将所述输入射束本身反射回去并在第二、相反方向上通过所述样品。
5.根据权利要求1—4中的任一项所述的显微镜，其中，所述光学组合元件包括双向射束分离器。
6.根据权利要求1—5中的任一项所述的显微镜，其中，所述输入辐射包括：
—第一类型的辐射，用于激活样品中的选定荧光团；
—第二类型的辐射，用于激励一组已激活荧光团，具有荧光的结果产生的发射，
并且其中，使用所述第一类型或所述第二类型的辐射来产生所述驻波。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其中：
—使用所述第一类型的辐射来产生所述驻波；
—所述选定荧光团在接近于所述驻波的局部最大值的样品的深度区域中被激活。
8.根据权利要求1—7中的任一项所述的显微镜，包括用于产生进入光学组合元件的光中的散光的波前修改部件。
9.一种使用宽场干涉显微镜的方法，包括：
—样品保持器，用于在分析位置处保持样品；
—照明器，用于用输入辐射来照射样品的一区域，从而促使所述区域中的至少一个荧光团发射荧光；
—一对投影系统，布置在所述分析位置的相对侧处，以收集所述荧光的至少一部分并将相应的一对光束指引到光学组合元件的各对输入，所述一对光束在光学组合元件的各对输入处进行光学干涉而产生干涉图；
—检测器装置，用于检查来自所述组合元件的输出光，
其特征在于通过以下步骤以检查来自所述组合元件的输出光：
（I）使用照明器来在分析位置处产生输入辐射的驻波；
（II）使用检测器装置来记录所述干涉图沿着精确地两个不同通道的强度分布；
（III）改变所述驻波的相位，并针对此相位改变波重复步骤（II）；
（IV）使用在步骤（II）和（III）中记录的强度分布来导出所述荧光团相对于所述一对投影系统的公共光轴的轴向位置。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述波前修改部件被用来产生进入光学组合元件的光中的散光。
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