NL1027462C2 - Werkwijze voor het lokaliseren van fluorescente markers. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het lokaliseren van fluorescente markers.

[0001] De uitvinding betreft een werkwijze voor het in een te onderzoeken preparaat lokaliseren van met straling exciteerbare markers, omvattende: 5 · het verschaffen van markers in het preparaat, • het bestralen van het preparaat met een eerste stralingsbundel waardoor in het preparaat een excitatiegebied gevormd wordt, in welk excitatiegebied markers worden geëxciteerd, • het detecteren van fluorescentiestraling afkomstig van markers in 10 responsie op de excitatie, en • het met behulp van een tweede stralingsbundel verhinderen van detectie van fluorescentiestraling in een deel van het excitatiegebied.

[0002] Tevens betreft de uitvinding een apparaat ingericht voor het uitvoeren 15 van de werkwijze.

[0003] Zo’n werkwijze is bekend uit US octrooischrift No. 6,259,104.

[0004] In de biologie en histologie bestaat de behoefte de plaats van bepaalde 20 moleculen, zoals proteïnen, antilichamen en nucleotiden in bijvoorbeeld biologische preparaten te bepalen, teneinde inzicht te krijgen waar en hoe bepaalde processen plaatsvinden in bijvoorbeeld biologische preparaten.

[0005] Fluorescentie microscopie (FM) is een algemeen gebruikte werkwijze in de biologie en histologie die dit mogelijk maakt. Hiertoe worden aan de van 25 belang zijnde moleculen zogenoemde fluorescente markers (verder kortweg ‘markers’ te noemen) gehecht. Deze markers kenmerken zich doordat ze zich heel specifiek aan bijvoorbeeld bepaalde soorten antilichamen hechten, zonder zich te hechten aan andere soorten antilichamen en andere moleculen. Verder kenmerken deze markers zich doordat ze, in responsie op 30 excitatie door bijvoorbeeld fotonen, een flux van fluorescentiestraling uitzenden.

[0006] Hiermee ontstaat de mogelijkheid de positie van bijvoorbeeld een bepaalde soort antilichaam in een preparaat te bepalen door aan dit soort 1027462 2 antilichaam markers te hechten en vervolgens, door middel van de door de marker uitgezonden fluorescentiestraling, de positie van de marker te bepalen.

5 [0007] Opgemerkt zij dat de voor FM gebruikte markers onderscheiden kunnen worden in organische markers en anorganische markers.

[0008] Organische markers bevatten i.h.a. aromatische ringen. Voorbeelden zijn FITC (fluorescein isothiocyanate), TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate) en DAPI (bisbenzimide). Vele soorten organische markers zijn 10 commercieel verkrijgbaar, elk met zijn specifieke hechtingseigenschappen. Zulke organische markers worden tegenwoordig verkocht door bijvoorbeeld de firma Molecular Probes Ine, Eugene, Oregon, USA.

[0009] Een typische eigenschap van deze organische markers is dat zij een beperkte levensduur hebben: onder invloed van fotochemische reacties zal de 15 levensduur van zo’n marker beperkt zijn tot bijvoorbeeld 105 geëmitteerde fotonen. Dit heeft gevolgen voor de tijd dat een marker geëxciteerd kan worden. Hier wordt verderop op terug gekomen. Verder wordt in deze markers de fluorescerende werking beïnvloed door omgevingsinvloeden, zoals bijvoorbeeld de zuurgraad, temperatuur, de aanwezigheid van oplosmiddelen, 20 etc, van het preparaat waarin ze zich bevinden.

[0010] Anorganische markers bevatten een nanokristal van een anorganisch materiaal, zoals CdSe, met een diameter van enkele nm’s tot enkele tientallen nm’s, welk nanokristal fluorescentie vertoont. Dit nanokristal is verbonden met organische reactieve groepen, die de marker aan het te markeren molecuul, 25 zoals een eiwit, hechten en het specifieke hechtingsgedrag van de marker bepalen. Zulke anorganische markers worden tegenwoordig verkocht door bijvoorbeeld de firma Biocrystal Ltd, Westerville, Ohio, USA.

[0011] Anorganische markers kenmerken zich door een veel langere levensduur en een kleinere gevoeligheid voor omgevingsinvloeden dan de 30 organische markers.

[0012] Bij conventionele FM wordt een preparaat waarin fluorescerende markers aanwezig zijn door een lichtbundel, zoals een gefocusseerde 1027462 3 laserbundel, belicht. Markers in het belichte gebied, het zogeheten excitatiegebied, worden daardoor geëxciteerd en zenden in responsie op deze excitatie een flux van fluorescentiestraling uit. Door te detecteren of er in responsie op de excitatie fluorescentiestraling wordt uitgezonden, wordt 5 vastgesteld of er zich in het excitatiegebied markers bevinden. De plaatsresolutie bij deze methode wordt bepaald door de grootte van het focus van de lichtbundel. Dit focus zal i.h.a. niet kleiner kunnen zijn dan de golflengte van het gebruikte licht. De gebruikte golflengte kan niet vrij gekozen worden, aangezien alleen licht binnen een gegeven bandbreedte van de 10 golflengte een bepaald type markers zal exciteren. Hierdoor is de plaatsresolutie van conventionele FM beperkt tot ca. 500 nm.

[0013] In kringen van gebruikers van FM bestaat de wens de plaatsresolutie van FM steeds verder te verkleinen tot bij voorkeur moleculaire schaal, dat is 15 enkele nm.

[0014] In het genoemde octrooischrift wordt een methode beschreven waarbij de resolutie verbeterd wordt ten opzichte van conventionele FM.

[0015] Het preparaat wordt hierbij kortstondig belicht met een eerste 20 stralingsbundel die een excitatiegebied vormt in het preparaat, waarna een tweede stralingsbundel de detectie van fluorescerende straling verhindert. De eerste stralingsbundel is een laserbundel met een kleur die geschikt is om de markers te exciteren. De tweede stralingsbundel bestaat uit één of meerdere laserbundels met een iets afwijkende (rodere) kleur die de marker de-exciteert 25 (‘quenching'). Het intensiteitsproflel van de eerste stralingsbundel dient een centraal maximum te hebben, terwijl het intensiteitsproflel van de tweede stralingsbundel een centraal minimum dient te vertonen. Het de-exciteren dient bij voorkeur binnen enkele 10-tallen picoseconden na de excitatie plaats te vinden.

30 [0016] Door markers in een deel van het excitatiegebied te de-exciteren, wordt verhinderd dat de flux van fluorescentiestraling van deze markers gedetecteerd wordt en wordt bereikt dat slechts markers uit een deel van het 1027462 4 excitatiegebied worden gedetecteerd, hetgeen resulteert in een betere plaatsresolutie.

[0017] De uitvinding beoogt een werkwijze te verschaffen waarbij een betere 5 plaatsresolutie wordt bereikt wordt met de met de in het genoemde US- octrooischrift beschreven methode.

|

[0018] Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat • de tweede stralingsbundel een gefocusseerde deeltjesbundel is die 10 over het preparaat wordt gescand, j • het focus van de deeltjesbundel een doorsnede heeft kleiner dan de ! doorsnede van het excitatiegebied, j • de energie van de deeltjes in de deeltjesbundel toereikend is om de flux van fluorescentiestraling, afkomstig van de door de deeltjes 15 getroffen markers, door beschadiging te verlagen, en • de positie van de gefocusseerde deeltjesbundel ten opzichte van het j preparaat wordt geregistreerd op het tijdstip dat de flux afneemt met ! tenminste een vooraf vastgestelde drempelwaarde.

20 [0019] In responsie op de excitatie wordt een flux van fluorescentiestraling vanuit het preparaat uitgezonden. Deze flux is afkomstig van één of meer, in het preparaat gelegen, markers die in het excitatiegebied aanwezig zijn. Als de flux in responsie op excitatie afneemt met tenminste een vooraf vastgestelde drempelwaarde, moet dit wel komen doordat een marker in het 25 excitatiegebied beschadigd is.

[0020] De uitvinding is gebaseerd op het inzicht dat, door opzettelijk een beschadiging van de marker te veroorzaken, de plaats van de marker bepaald kan worden door te bepalen waar de deeltjesbundel zich bevindt op het moment dat de ten gevolge van de beschadiging optredende vermindering 30 van flux optreedt. Zo’n opzettelijke beschadiging wordt bereikt door de marker te beschieten met een gefocusseerde deeltjesbundel.

[0021] Het voortbrengen van een gefocusseerde deeltjesbundel is een op zichzelf bekende techniek en wordt gebruikt in bijvoorbeeld Focused Ion 1027462 5

Beam (FIB) apparaten, Scanning Electron Microscope (SEM) apparaten en Environmental Scanning Electron Microscope (ESEM) apparaten. Deze apparaten kunnen een deeltjesbundel focusseren op een preparaat met een doorsnede van het bundelfocus van bijvoorbeeld 1 nm en deze deeltjesbundel 5 over het preparaat scannen. De energie van de deeltjes in de deeltjesbundel is bij deze types apparaten i.h.a. instelbaar van minder dan 200 eV tot meer dan 20 keV. Met deze apparaten kunnen dus deeltjes worden opgewekt met energieën die ruim voldoende zijn om markers te beschadigen.

10 [0022] Opgemerkt zij dat de beoogde beschadiging niet alleen kan plaatsvinden door de interactie van de markers met deeltjes van de gefocusseerde deeltjesbundel, maar dat de beschadiging ook kan optreden door interactie van de marker met secondaire deeltjes, zoals röntgenfotonen en secondaire elektronen, die door de gefocusseerde bundel in een 15 interactiegebied worden geïnduceerd. Hierdoor kan een marker al op enige afstand van de gefocusseerde deeltjesbundel beschadigd raken, wat tot een minder nauwkeurige plaatsbepaling kan leiden. Zoals aan de vakman op het gebied van elektronenmicroscopie bekend, kan door een geschikte keuze van de deeltjesenergie de grootte van het interactiegebied voldoende klein 20 worden gekozen.

[0023] In een uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding gebeurt het exciteren met een fotonenbundel.

[0024] Door belichten van het preparaat met fotonen zullen de markers 25 geëxciteerd raken, waarna de marker in responsie op deze excitatie fotonen zal uitzenden. Deze belichting kan met een gefocusseerde laserbundel plaatsvinden, maar ook met een lichtbundel met een breedbandig spectrum (“wit licht").

[0025] Opgemerkt zij dat het gebruik van wit licht met name aantrekkelijk is 30 om gelijktijdig meerdere soorten markers te detecteren, aangezien markers niet alleen kunnen verschillen in het soort molecuul, zoals een antilichaam, waaraan ze zich hechten, maar ook in de kleur licht waarmee ze geëxciteerd kunnen worden en de kleur van de uitgezonden fluorescentiestraling. Als in 1027462 6 een preparaat meerdere soorten markers aanwezig zijn, kan met de werkwijze volgens de uitvinding niet alleen de plaats, maar ook het soort marker bepaald worden. Immers: wanneer de detectie voor het detecteren van de fluorescentiestraling zó is ingericht dat per kleur, oftewel per soort 5 marker, een vermindering van de flux van fluorescentiestraling van die kleur (soort marker) kan worden bepaald, is het mogelijk niet alleen de plaats maar ook het soort marker te bepalen.

[0026] In een andere uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding is de 10 gefocusseerde deeltjesbundel een gefocusseerde elektronenbundel.

[0027] Elektronen zijn zeer effectief in het chemisch veranderen van met name organische materialen. Bij zo’n chemische verandering van bijvoorbeeld een organische marker zal de marker zó beschadigd worden, dat geen fluorescentiestraling meer wordt uitgezonden.

15

[0028] In nog een andere uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding is de gefocusseerde deeltjesbundel een bundel ionen.

[0029] Zoals de vakman bekend hebben ionen met een energie van enkele keV de eigenschap het oppervlak van een materiaal waarop zij terecht komen 20 te verwijderen (sputtering). Deze sputtering treedt zowel voor het preparaat als voor de daarin gelegen markers op. lonen zijn daarom zeer effectief voor het aanbrengen van de beoogde schade aan de markers. Een bijkomend voordeel van het gebruik van ionen is dat een aanvankelijk diep in het preparaat gelegen marker langzaam aan het oppervlak van het preparaat 25 komt, waarna deze marker beschadigd raakt en de positie bepaald wordt. Het is hiermee mogelijk een 3D positiebepaling van de markers in het preparaat te maken.

[0030] In nog weer een andere uitvoering van de werkwijze volgens de 30 uitvinding wordt tijdens de bestraling met de gefocusseerde deeltjesbundel een gas toegelaten om etsen mogelijk te maken.

[0031] Het gebruik van gassen in combinatie met een ionen- of elektronenbundel om materiaal van een preparaat te verwijderen is een op 1027462 7 zichzelf bekende techniek. Deze techniek wordt bijvoorbeeld toegepast in FIB apparaten. Door deze techniek toe te passen tijdens het bestralen van het preparaat met de gefocusseerde deeltjesbundel, wordt tijdens het scannen van de deeltjesbundel over het preparaat het oppervlak van het preparaat 5 weggeëtst. Hierdoor zal een aanvankelijk diep in het preparaat gelegen marker langzaam aan het oppervlak van het preparaat komen, waarna deze beschadigd raakt en de positie bepaald wordt. Het is hiermee mogelijk een 3D positiebepaling van de markers in het preparaat te maken.

10 [0032] De uitvinding wordt nader beschreven aan de hand van de figuren.

Hierbij toont:

Figuur 1 schematisch een apparaat voor de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding,

Figuur 2A schematisch het verloop van de flux van fluorescentiestraling 15 afkomstig van het preparaat tijdens het uitvoeren van de werkwijze, en

Figuur 2B schematisch een beeld met daarin informatie afkomstig van zowel de deeltjesdetector als de lichtdetector.

[0033]Figuur 1 toont schematisch een apparaat voorde uitvoering van de 20 werkwijze volgens de uitvinding. Een deeltjes-optische kolom 1, zoals een ionenkolom, brengt een gefocusseerde deeltjesbundel van elektrisch geladen deeltjes 3 voort. De deeltjesbundel 3 wordt op een preparaat 4, gelegen op een preparaatdrager 5, gefocusseerd. De gefocusseerde deeltjesbundel 3 wordt m.b.v. een afbuigeenheid 2 over het preparaat 4 gescand.

25 [0034] Van het preparaat afkomstige geladen deeltjes, zoals secondaire elektronen, worden door een deeltjesdetector 8, zoals een Everhardt-Thomley detector, gedetecteerd.

[0035] Het voor de gefocusseerde deeltjesbundel 3 noodzakelijke vacuüm wordt bereikt door een vacuümkamer 7 m.b.v. afdichtmiddelen 6 af te dichten 30 en vervolgens met (niet getoonde) vacuümpompen te evacueren.

[0036] Opgemerkt zij dat het voor biologische preparaten voordelig is om een kleine restdruk van waterdamp te houden, zodanig dat het preparaat niet 1027462 8 uitdroogt. Dit is een op zichzelf bekende techniek en wordt gebruikt in bijvoorbeeld ESEMs (Environmental Scanning Electron Microscope’s)

[0037] Gasinjector 9 maakt het mogelijk een etsgas in de vacuümkamer 7 toe te laten, zodat onder invloed van de gefocusseerde deeltjesbundel 3 5 materiaal van het preparaat 4 verwijderd kan worden.

[0038] De preparaatdrager 5 is van een doorzichtig materiaal, zoals glas. Om te voorkomen dat het preparaat 4 onder invloed van de bestraling met de gefocusseerde deeltjesbundel 3 opgeladen raakt, kan op het glas bijvoorbeeld een doorzichtige coating van geleidend materiaal aangebracht worden.

10 [0039] Een laser 10 produceert een lichtbundel 11 die via een halfdoorlatende spiegel 12 en een lens 13 via de doorzichtige preparaatdrager 5 op het preparaat 4 wordt gefocusseerd. De gefocusseerde deeltjesbundel 3 en de lichtbundel 11 treffen het preparaat op nagenoeg dezelfde positie 14. Fluorescentiestraling afkomstig van markers in het preparaat 4, wordt via de 15 preparaatdrager 5, de lens 13 en de halfdoorlatende spiegel 12 gedetecteerd door detector 16. Om te voorkomen dat ook strooi- en reflectielicht afkomstig van de laser 10 wordt gedetecteerd is een kleurfilter 15 geplaatst tussen de halfdoorlatende spiegel 12 en lichtdetector 16, die licht met de kleur van de laser niet doorlaat, maar fluorescentiestraling wel doorlaat. Om zoveel 20 mogelijk licht afkomstig van het preparaat 4 te kunnen detecteren wordt licht, dat in een richting geëmitteerd wordt van de detector 16 af, door een spiegel 17 naar de detector 16 gereflecteerd.

[0040] Controle-unit 20 stuurt een stuursignaal naarde afbuigspoelen 2 waarmee de deeltjesbundel 3 over het preparaat 4 wordt gescand. Hierbij is 25 de afbuiging van de deeltjesbundel i.h.a. evenredig met het stuursignaal dat aan de afbuïgeenheid wordt toegevoerd.

[0041] De op een zeker moment van deeltjesdetector 8 afkomstige signalen zijn afkomstig van die plaats op het preparaat 4 waar de deeltjesbundel 3 op dat moment het preparaat raakt. Door nu de deeltjesbundel 3 in een raster 30 over het preparaat 4 te scannen, en synchroon een beeld 22 op de monitor 21 op te bouwen waarbij de helderheid evenredig is met het signaal van de deeltjesdetector 8, wordt een beeld 22 van het gescande gebied van 1027462 9 preparaat 4 op monitor 21 zichtbaar. Ook deze beeldopbouw wordt door de controle-unit 20 gedaan.

[0042] Daarnaast bestuurt de controle-unit 20 de laser 10 en zet daarmee de lichtbundel 11 aan en uit.

5 [0043] De controle-unit 20 ontvangt tevens het signaal van de lichtdetector 16 en bepaald aan de hand van dat signaal of er een significante vermindering van de flux van fluorescentiestraling optreedt. Hierbij moet significant gelezen worden als een vermindering met tenminste een vooraf vastgestelde drempelwaarde. Op het moment dat zo’n significante vermindering optreedt is 10 de positie van de deeltjesbundel 3 bekend, omdat deze positie gecontroleerd wordt door de aansturing van de scanspoelen 2. De controle-unit 20 kan nu op het beeldscherm 21 op de overeenkomstige positie een aanduiding, zoals een heldere punt of een punt in een afwijkende kleur, veroorzaken.

[0044] Als in het gebied waarover de gefocusseerde bundel gescand wordt 15 markers aanwezig zijn, zullen deze tijdens het scannen geraakt worden door de deeltjesbundel. Hierdoor zal beschadiging van de marker optreden.

[0045] Figuur 2A toont schematisch de flux van fluorescentiestraling afkomstig van het preparaat. Bij het begin van het scannen, op tijdstip T=T0, zal een 20 aantal markers fluoresceren, in dit voorbeeld 6 stuks. Tijdens het scannen zullen deze markers stuk voor stuk beschadigen. Bij zo’n beschadiging, zal de flux afnemen. In figuur 2A is dit schematisch aangegeven op tijdstip 40-i, waarbij i de i-de marker is die beschadigd raakt. Door op het beeld 22, dat het signaal afkomstig van de deeltjesdetector 8 weergeeft, op het moment dat 25 zo’n verandering van de flux optreedt een heldere punt of een punt in een afwijkende kleur weer te geven, zal eenvoudig zichtbaar zijn waar de marker zich bevindt op het preparaat.

[0046] Opgemerkt zij dat het met de huidige computertechnieken ook mogelijk is op het beeld 22 een symbool van andere vorm aan te brengen, zoals 30 kruisjes, rechthoeken, etc, dat de plaats van de fluorescerende marker aanduidt.

1027462 10

[0047] Figuur 2B toont schematisch een beeld met daarin informatie afkomstig van zowel de deeltjesdetector 8 als de lichtdetector 16.

[0048] De deeltjesdetector 8 (een Everhardt-Thomley detector) maakt het mogelijk een beeld 22 te genereren waarin gebieden met verschillende 5 secondaire deeltjes opbrengst met verschillende helderheden (31,32) worden afgebeeld. Op dit beeld 22 wordt tevens aangegeven bij welke posities 30-i van de deeltjesbundel een significante vermindering van de flux is vastgesteld, ofwel waar een marker zich bevindt. Hierdoor is het mogelijk op eenvoudige wijze te zien waar de markers zich op het preparaat bevinden.

10

[0049] Opgemerkt zij dat uitvoeringen mogelijk zijn waarbij de lichtdetector 16 in staat is licht van verschillende markers, gekenmerkt door verschillende fluorescentie-kleuren, te onderscheiden en apart te behandelen.

[0050] Hierdoor is het mogelijk verschillende soorten markers simultaan te 15 detecteren en hiervoor op het beeld 22 bijvoorbeeld verschillend gekleurde heldere punten of symbolen te gebruiken teneinde de verschillende soorten markers te kunnen onderscheiden.

[0051] Opgemerkt zij ook dat, mocht een marker om een andere reden dan 20 ten gevolge van beschadiging met de geladen deeltjesbundel 3 ophouden fotonen uit te zenden, dit aanleiding zal geven tot het op een verkeerde plaats weergeven van die marker. Immers, de lichtdetector 16 zal detecteren dat de hoeveelheid fluorescentiestraling afneemt en de controle-unit 20 zal de marker op beeld 22 weergeven op de plaats overeenkomend met de 25 deeltjesbundel 3 op dat moment, zelfs al heeft de bundelpositie geen relatie tot de aanwezigheid van een marker op die positie.

[0052] Het is dus zeer ongewenst dat een marker door een andere oorzaak dan door beschieting met de deeltjesbundel 3 ophoudt te fluoresceren.

[0053] De levensduur van sommige markers, met name sommige organische 30 markers, is beperkt tot bijvoorbeeld 105 geëmitteerde fotonen. Het is daarom gewenst om het gehele excitatiegebied te scannen binnen het tijdsinterval waarin een marker 105 fotonen emitteert.

1027462 11

[0054] Opgemerkt zij dat het van belang is het excitatiegebied en het scangebied t.o.v. elkaar te centreren. Wanneer deze twee gebieden op elkaar gecentreerd zijn, zullen deze i.h.a. niet snel gedecentreerd raken. Deze centrering kan dus als een periodieke afregeling gedaan worden. Er zijn 5 meerdere manieren denkbaar waarop deze centrering kan worden bepaald.

[0055] Een mogelijke afregeling omvat het m.b.v. de deeltjesbundel en de deeltjesdetector afbeelden van een gat in een verschuifbaar diafragmaplaatje, waarbij het gat een diameter heeft die bij benadering gelijk is aan de diameter van het focus van de laserbundel. Het diafragmaplaatje kan nu verschoven 10 worden totdat het gecentreerd is t.o.v. het door de deeltjesbundel gescande gebied. Door nu vervolgens de laser op het diafragmaplaatje te richten en zó te richten, dat er maximale hoeveelheid licht door het gat wordt doorgelaten, zijn de beide gebieden op elkaar gecentreerd. Detectie van de hoeveelheid doorgelaten licht kan bijvoorbeeld m.b.v. een niet getekende lichtdetector in 15 de vacuümkamer plaatsvinden.

[0056] Opgemerkt zij tevens dat de belichting van het preparaat 4 met de laserbundel 11 een continue belichting kan zijn, maar dat deze ook kan bestaan uit een reeks pulsen.

20

[0057] Ook zij opgemerkt dat, alhoewel in de getoonde uitvoering van een apparaat voor het uitvoeren van de werkwijze de deeltjesbundel 3 en de laserbundel 11 het preparaat 4 vanuit tegenovergestelde richtingen raken, het ook mogelijk is het apparaat zó in te richten, dat de bundels (3,11) het 25 preparaat 4 vanuit vrijwel dezelfde richting raken. Dit is met name voordelig voor relatief dikke preparaten, waarbij de exciterende laserbundel niet het gehele preparaat kan doorstralen.

30 1027462

Claims (7)

1. Werkwijze voor het in een te onderzoeken preparaat lokaliseren van met straling exciteerbare markers, omvattende: 5. het verschaffen van markers in het preparaat, • het bestralen van het preparaat met een eerste stralingsbundel waardoor in het preparaat een excitatiegebied gevormd wordt, in welk excitatiegebied markers worden geëxciteerd, • het detecteren van de flux van fluorescentiestraling afkomstig van 10 markers in responsie op de excitatie, en • het met behulp van een tweede stralingsbundel verhinderen van detectie van fluorescentiestraling in een deel van het excitatiegebied, met het kenmerk dat • de tweede stralingsbundel een gefocusseerde deeltjesbundel is die 15 over het excitatiegebied wordt gescand, • het focus van de deeltjesbundel eéh doorsnede heeft kleiner dan de doorsnede van het excitatiegebied, • de energie van de deeltjes in de deeltjesbundel toereikend is om de flux van fluorescentiestraling, afkomstig van de door de deeltjes 20 getroffen markers, door beschadiging van de markers te verlagen, en • de positie van de gefocusseerde deeltjesbundel ten opzichte van het preparaat wordt geregistreerd op het tijdstip dat de flux afneemt met tenminste een vooraf vastgestelde drempelwaarde.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de doorsnede van de deeltjesbundel ten minste 10 maal kleiner is dan de doorsnede van het excitatiegebied.

3. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarin excitatie 30 gebeurt met een fotonenbundel.

4. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarin de gefocusseerde deeltjesbundel een gefocusseerde elektronenbundel is. 1027462 1.3

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, waarin de gefocusseerde deeltjesbundel een gefocusseerde ionenbundel is.

6. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarin tijdens het bestralen met de gefocusseerde deeltjesbundel een gas toegelaten wordt om te etsen.

7. Toestel ingericht voor het uitvoeren van de werkwijze volgens één der 10 voorgaande conclusies, omvattende: • middelen voor het voortbrengen van een eerste stralingsbundel voor het exciteren van een marker, • detectiemiddelen voor het detecteren van een flux van fluorescentie-straling afkomstig van geëxciteerde markers, 15. middelen voor het voortbrengen van een tweede stralingsbundel, met het kenmerk dat • de middelen voor het voortbrengen van de tweede stralingsbundel een gefocusseerde deeltjesbundel vóórtbrengen, welke deeltjesbundel over het preparaat gescand wordt, en 20. er registratiemiddelen aanwezig zijn om de positie van de gefocusseerde deeltjesbundel t.o.v. het preparaat vast te leggen in afhankelijkheid van een vooraf vastgestelde afname van de gedetecteerde flux. 1027462