WO2013146365A1 - 蛍光検出装置 - Google Patents

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WO2013146365A1
WO2013146365A1 PCT/JP2013/057463 JP2013057463W WO2013146365A1 WO 2013146365 A1 WO2013146365 A1 WO 2013146365A1 JP 2013057463 W JP2013057463 W JP 2013057463W WO 2013146365 A1 WO2013146365 A1 WO 2013146365A1
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fluorescence
light
sample
spectroscopic element
signal
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PCT/JP2013/057463
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謙司 永冨
中谷　将也
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三洋電機株式会社
パナソニック株式会社
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    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus that irradiates a sample prepared by fluorescently labeling a specimen such as a cell with excitation light and detects fluorescence generated from the sample.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2001-238664 proposes a DNA disk using an existing optical disk technology.
  • a series of spots are formed on the disk so as to be arranged in a spiral, and a track is formed along the arrangement of the spots, and an address mark is formed on this track.
  • light is scanned along the track, and fluorescence generated from the spot by this light is detected by the photodetector.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2001-238664 discloses a configuration for removing fluorescence generated outside the spot, so-called out-of-region fluorescence and autofluorescence.
  • out-of-region fluorescence or autofluorescence occurs.
  • autofluorescence is incident on the photodetector, the detection accuracy of the fluorescence generated from the sample present in the spot may be reduced.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2001-238664 discloses a configuration for removing fluorescence generated outside the spot, so-called out-of-region fluorescence and autofluorescence.
  • 2001-238673 discloses an aperture disposed in front of a photodetector, and the fluorescence generated by the sample is converged at the aperture of the aperture, thereby causing out-of-region fluorescence, autofluorescence, etc. A configuration for removing unnecessary fluorescence is provided.
  • the present invention has been made in view of the above points, and a fluorescence detection device capable of effectively removing unnecessary fluorescence such as autofluorescence and out-of-region fluorescence generated from other than a target sample with a simple configuration.
  • the purpose is to provide.
  • the main aspect of the present invention relates to a fluorescence detection apparatus that irradiates a sample holding carrier that holds a fluorescently labeled sample with irradiation light and detects fluorescence generated from the sample by irradiation of the irradiation light.
  • the fluorescence detection apparatus includes a light source that emits the irradiation light, an objective lens that converges the irradiation light onto the sample on the sample holding carrier, and the objective lens that is incident on the objective lens from the sample holding carrier.
  • an astigmatism element that introduces astigmatism into the fluorescence transmitted through the lens, a spectroscopic element that separates the fluorescence into a plurality of light fluxes, and a photodetector that receives the light flux separated by the spectroscopic element.
  • the spectroscopic element is configured so that the fluorescence generated from the position of the sample is separated from the fluorescence generated from a predetermined depth position other than the position of the sample on the light receiving surface of the photodetector.
  • Spectroscopy fluorescence The light detector is arranged in a region where the fluorescence generated from the position of the sample is irradiated and the fluorescence generated from a depth position other than the position of the sample is not irradiated.
  • the fluorescence generated from the position of the sample and the fluorescence generated from a depth position other than the position of the sample overlap on the light receiving surface of the photodetector.
  • the fluorescence generated from the position of the sample can be received by the light receiving unit arranged in the region irradiated only with the fluorescence generated from the position of the sample. This makes it possible to accurately detect the fluorescence generated from the position of the sample while removing the autofluorescence with a simple configuration.
  • the astigmatism element generates a first focal line by the convergence of the fluorescence in the first direction, and in the second direction perpendicular to the first direction.
  • a second focal line is generated by the convergence of the fluorescence, and the spectroscopic element separates the four light fluxes from the fluorescence, and is parallel to the first direction and the second direction and crosses each other 2
  • the four regions of the fluorescence divided by the two straight lines may include the four light beams.
  • the fluorescence generated from the sample and the fluorescence generated from a depth position other than the sample are detected by the photodetector. Above, they can be separated so as not to overlap each other.
  • the spectroscopic element has a structure that changes the traveling directions of the four light beams so that the four light beams are irradiated onto the four apex angles of the square on the photodetector, respectively. May be configured. In this way, the area irradiated only with the fluorescence generated from the position of the sample can be made compact, and the layout configuration of the light receiving unit can be simplified.
  • the astigmatism element generates a first focal line by the convergence of the fluorescence in the first direction, and a second perpendicular to the first direction.
  • a second focal line is generated by the convergence of the fluorescence in the direction, and the spectroscopic element separates the two light fluxes from the fluorescence and aligns a straight line parallel to the first direction with the optical axis of the fluorescence. Then, the two regions of the fluorescence divided by the straight line may be configured to include the two light fluxes, respectively.
  • the spectroscopic element is arranged closer to the objective lens than the focal line on the objective lens side among the two focal lines generated by the fluorescence generated from the position of the sample being converged by the astigmatism element. Is done.
  • the fluorescence generated from the sample and the fluorescence generated from a depth position other than the sample are detected by the photodetector. Above, they can be separated so as not to overlap each other. Further, according to this configuration, the configuration of the spectroscopic element can be simplified as compared with the case where the number of light beams to be dispersed is four.
  • the spectroscopic element may be configured to have a structure that changes the traveling directions of the two light beams so that the two light beams are separated from each other in the second direction. In this way, the area irradiated only with the fluorescence generated from the position of the sample can be made compact, and the layout configuration of the light receiving unit can be simplified.
  • the sample holding carrier is disposed closer to the irradiation light incident side than the sample storage unit, and reflects a part of the irradiation light. And a reflective surface.
  • the spectroscopic element is configured by a wavelength-selective diffractive element, and the spectroscopic element receives the fluorescence and the reflected light of the irradiation light reflected by the reflection surface, and the fluorescence and the Based on the difference in wavelength with the reflected light, the fluorescence and the reflected light may be further imparted to the fluorescence with a diffractive action that separates the fluorescent light and the reflected light from each other.
  • the single light detector can receive the fluorescence and the reflected light of the irradiation light reflected by the reflecting surface, it is possible to reduce the number of components and simplify the configuration.
  • FIG. 1 is a perspective view schematically showing an external configuration of a biosensor substrate according to Example 1, a cross-sectional view when the biosensor substrate is cut along a plane perpendicular to the surface, and a partially enlarged view of a cross section of the biosensor substrate.
  • . 1 is a diagram illustrating a configuration of a fluorescence detection device according to Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining a focal depth of excitation light according to the first embodiment.
  • 1 is a diagram illustrating a circuit configuration of a signal arithmetic circuit according to a first embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a fluorescence convergence state according to the technical principle of Example 1 and a schematic diagram showing a configuration of an anamorphic lens. It is a figure explaining the distribution state of the light beam area
  • FIG. It is a figure explaining distribution of the signal light based on the technical principle of Example 1, and stray light. It is a figure which shows the vector provided to the advancing direction of the fluorescence based on the technical principle of Example 1, and a figure which shows the irradiation area
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration example of a spectroscopic element according to Example 1 and a diagram illustrating a configuration example of a sensor disposed on a light receiving surface of a fluorescence detector. It is a figure explaining the convergence state of the fluorescence which concerns on the technical principle of Example 2, the schematic diagram which shows the structure of an anamorphic lens, the perspective view which shows the shape of a spectroscopic element, and the figure which shows the spectroscopic element seen from the light-incidence side.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing a state of a fluorescent light flux region according to Example 2, a diagram showing the light flux regions in the case of a comparative example, and a diagram showing a fluorescent light flux region on a light receiving surface.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a modification example of a fluorescent light flux region on a light receiving surface of a fluorescence detector according to a second embodiment. It is a figure which shows the other structural example of the well which concerns on embodiment. It is a figure which shows the state which has arrange
  • FIG. 1A is a perspective view schematically showing an external configuration of the biosensor substrate 10 used in this embodiment.
  • the biosensor substrate 10 is used, for example, for detecting red blood cells infected with malaria parasites in human blood.
  • the biosensor substrate 10 has a disk shape like an optical disk (CD, DVD, etc.), and a circular hole 10a is formed at the center.
  • the biosensor substrate 10 has a structure in which a well layer 12 is laminated on the upper surface of a base substrate 11. As shown in the enlarged view at the right end of FIG. 1A, the well layer 12 has a plurality of minute wells 13 formed of cylindrical depressions. The wells 13 are arranged concentrically or spirally from the inner periphery to the outer periphery of the biosensor substrate 10.
  • the well 13 has a bottom surface portion 13a that is one step lower than the top surface of the well layer 12, and the diameter and height are set so that the sample can be accommodated when the sample is dropped.
  • FIG. 1B is a cross-sectional view of the biosensor substrate 10 taken along a plane perpendicular to the surface
  • FIG. 1C is an enlarged view of a broken line portion of FIG.
  • a reflective film 14 is disposed between the base substrate 11 and the well layer 12. By reflecting the reflective film 14 on the upper surface of the base substrate 11, a reflective surface 11 a that is an interface between the reflective film 14 and the base substrate 11 is formed on the upper surface of the base substrate 11.
  • the well 13 is formed on the upper surface side of the well layer 12 with a predetermined interval. The bottom surface portion 13a of the well 13 is positioned slightly above the reflective film 14, and the bottom surface portion 13a of the well 13 and the top surface of the reflective film 14 are separated from each other.
  • the diameter and height of the well 13 are d1 and d2, respectively, the distance between the bottom surface portion 13a and the reflecting surface 11a is d3, the distance between the wells 13 is d4, and the thickness of the base substrate 11 is d5.
  • the track pitch of the surface 11a is d6.
  • the diameter d1 and the height d2 are set to 100 ⁇ m and 50 ⁇ m, respectively, the intervals d3 and d4 are set to 2 ⁇ m and 300 ⁇ m, respectively, and the thickness d5 is set to 0.6 mm.
  • the track pitch d6 is set to 1 ⁇ m.
  • the reflectance of the reflective film 14 with respect to excitation light (described later) is set to 3 to 4%.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of the fluorescence detection apparatus 1 according to the present embodiment.
  • the fluorescence detection device 1 is used, for example, to determine whether red blood cells contained in the well 13 of the biosensor substrate 10 are infected with malaria parasites.
  • a sample prepared by fluorescently labeling a subject is stored in the well 13 of the biosensor substrate 10 in advance.
  • a red blood cell having a diameter of about 10 ⁇ m and a thickness of about 2 ⁇ m is infected with malaria parasite, the inside thereof is fluorescently labeled, and both infected red blood cells and uninfected red blood cells are both.
  • a plurality of parallel arrangements are provided on the bottom surface portion 13a of the well 13 having a diameter of 100 ⁇ m.
  • the optical system of the fluorescence detection apparatus 1 includes a semiconductor laser 101, a polarization beam splitter (PBS) 102, a collimator lens 103, a quarter wavelength plate 104, a dichroic prism 105, an objective lens 106, an anamorphic lens 107, A photodetector 108, an anamorphic lens 109, a spectroscopic element 110, a fluorescence detector 111, and an aperture 112 are provided.
  • the fluorescence detection device 1 includes a holder 121, an objective lens actuator 122, a rotation device 123, a signal calculation circuit 201, a servo circuit 202, a reproduction circuit 203, and a signal amplification circuit 204.
  • the controller 205 is provided.
  • the semiconductor laser 101 emits laser light having a wavelength of about 405 nm (hereinafter referred to as “excitation light”).
  • the excitation light in this Embodiment is an example of the irradiation light as described in a claim.
  • the excitation light guided to the biosensor substrate 10 that is, the excitation light passing through the aperture 112 is indicated by a broken line.
  • a circular opening having a predetermined aperture is formed in the aperture 112, and the aperture 112 restricts the aperture of the excitation light.
  • the position of the semiconductor laser 101 is adjusted so that the excitation light emitted from the semiconductor laser 101 is S-polarized with respect to the PBS 102.
  • the excitation light emitted from the semiconductor laser 101 is reflected by the PBS 102 after entering the collimator lens 103 after the aperture is limited by the aperture 112.
  • the collimator lens 103 converts excitation light incident from the PBS 102 side into parallel light. Thereby, the excitation light that has passed through the collimator lens 103 becomes parallel light having a predetermined diameter.
  • the quarter-wave plate 104 converts the excitation light incident from the collimator lens 103 side into circularly polarized light, and is orthogonal to the polarization direction when the excitation light incident from the dichroic prism 105 side is incident from the collimator lens 103 side. Convert to linearly polarized light. Thereby, the excitation light incident on the PBS 102 from the collimator lens 103 side passes through the PBS 102.
  • the dichroic prism 105 is configured to reflect laser light having a wavelength of about 405 nm and transmit laser light having a wavelength of about 450 to 540 nm. As a result, the excitation light incident from the 1 ⁇ 4 wavelength plate 104 side is reflected by the dichroic prism 105 and enters the objective lens 106.
  • the objective lens 106 is configured to appropriately converge the excitation light with respect to the biosensor substrate 10. Specifically, the objective lens 106 is configured such that excitation light incident from the dichroic prism 105 side converges with a predetermined NA (numerical aperture, here 0.34). The diameter of the excitation light incident on the objective lens 106 is determined by the diameter of the aperture 112. The focal depth of the excitation light converged by the objective lens 106 is determined by the NA of the excitation light. The depth of focus of the excitation light will be described later with reference to FIGS. 3 (a) and 3 (b).
  • the objective lens 106 is driven in the focus direction (direction perpendicular to the biosensor substrate 10) and the tracking direction (radial direction of the biosensor substrate 10) by the objective lens actuator 122 while being held by the holder 121. That is, the objective lens 106 is driven so that the excitation light follows the track composed of the pit row in a state where the excitation light is focused on the reflection surface 11 a of the biosensor substrate 10. A part of the excitation light focused on the reflection surface 11a is reflected by the reflection surface 11a, and most of the excitation light is transmitted through the reflection surface 11a.
  • the excitation light reflected by the reflecting surface 11a is referred to as “reflection excitation light”.
  • a servo signal for driving the objective lens 106 in the focus direction and the tracking direction is generated based on the reflected excitation light (see FIG. 4).
  • 3 (a) and 3 (b) are diagrams for explaining the focal depth of the excitation light.
  • the wavelength of the excitation light is 405 nm
  • the NA (numerical aperture) of the excitation light is 0.34.
  • the depth of focus can be calculated by the wavelength / (NA ⁇ NA). Therefore, the focal depth of the excitation light in this embodiment is about 3.5 ⁇ m.
  • the distance d3 between the bottom surface portion 13a and the reflecting surface 11a is set to be smaller than the focal depth of the excitation light, and is set to 2.0 ⁇ m here.
  • the spot diameter at the focal position is about 1 ⁇ m.
  • the track pitch interval d6 shown in FIG. 1C is set to 1 ⁇ m so as to be substantially the same as the spot diameter.
  • FIG. 3A shows a state in which the lowest point in the range of the focal depth of the excitation light coincides with the reflective film 14, and FIG. 3B shows the state where the highest point in the range of the focal depth of the excitation light is the bottom surface.
  • the state which corresponds with the part 13a is shown.
  • the range of the focal depth of the excitation light can be set to any of the states shown in FIGS. 3A and 3B by adjusting the offset voltage output from the servo circuit 202 to the objective lens actuator 122.
  • the distance d3 between the bottom surface portion 13a of the well 13 and the reflecting surface 11a is 2 ⁇ m, and the focal depth of the excitation light is 3.5 ⁇ m.
  • Both the bottom surface portion 13a and the reflection surface 11a are included in the range corresponding to the depth. Accordingly, when the focus position of the excitation light is positioned on the reflection surface 11a by the focus servo, the sample placed on the bottom surface portion 13a is also focused.
  • the reflected excitation light reflected by the reflecting surface 11 a is reflected by the dichroic prism 105 and is changed to linearly polarized light by the quarter wavelength plate 104.
  • the collimator lens 103 provides convergent light. The reflected excitation light that enters the PBS 102 from the collimator lens 103 side passes through the PBS 102 as described above.
  • the anamorphic lens 107 introduces astigmatism into the reflected excitation light incident from the PBS 102 side.
  • the reflected excitation light that has passed through the anamorphic lens 107 enters the photodetector 108.
  • the photodetector 108 has a four-divided sensor for receiving reflected excitation light on the light receiving surface.
  • a detection signal of the photodetector 108 is input to the signal calculation circuit 201.
  • the excitation light transmitted through the reflection surface 11 a reaches the bottom surface portion 13 a of the well 13.
  • fluorescence is generated from the malaria protozoa.
  • Such fluorescence has a NA (numerical aperture) larger than the NA of the excitation light, as indicated by the alternate long and short dash line in FIG.
  • NA of fluorescence is, for example, 0.65.
  • the wavelength of the fluorescence is different from the wavelength of the excitation light, and is 450 to 540 nm in this embodiment.
  • red blood cells that are not infected with Plasmodium do not generate fluorescence because they are not fluorescently labeled. In this way, it is possible to distinguish between red blood cells infected with malaria parasites and non-infected red blood cells.
  • Fluorescence incident on the dichroic prism 105 from the objective lens 106 side passes through the dichroic prism 105.
  • the anamorphic lens 109 introduces astigmatism into the fluorescence incident from the dichroic prism 105 side.
  • the spectroscopic element 110 changes the traveling direction of the fluorescence in which astigmatism is introduced by the anamorphic lens 109.
  • the fluorescence detector 111 has a sensor for receiving fluorescence whose traveling direction has been changed by the spectroscopic element 110.
  • the detection signal of the fluorescence detector 111 is input to the signal amplification circuit 204.
  • the anamorphic lens 109, the spectroscopic element 110, and the sensors on the light receiving surface of the fluorescence detector 111 will be described later with reference to FIGS. 5 (a) to 9 (f).
  • the signal arithmetic circuit 201 generates a focus error signal FE and a tracking error signal TE, which will be described later, from the detection signal of the photodetector 108, and generates a reproduction RF signal, which will be described later, from the detection signal of the photodetector 108.
  • the servo circuit 202 controls driving of the objective lens actuator 122 using the focus error signal FE and the tracking error signal TE output from the signal calculation circuit 201.
  • the servo circuit 202 controls the rotation device 123 so that the biosensor substrate 10 is rotated at a constant linear velocity, using the reproduced RF signal output from the signal calculation circuit 201.
  • the reproduction circuit 203 demodulates the reproduction RF signal output from the signal arithmetic circuit 201 to generate reproduction data.
  • the signal amplification circuit 204 amplifies the detection signal of the fluorescence detector 111.
  • the controller 205 controls each part of the fluorescence detection apparatus 1 in addition to the signal calculation circuit 201, the servo circuit 202, and the reproduction circuit 203. In addition, the controller 205 determines the position of the well 13 in which the fluorescence is detected on the biosensor substrate 10 based on the reproduction data (address information) output from the reproduction circuit 203 and the signal output from the signal amplification circuit 204. The address information corresponding to the well 13 in which fluorescence is detected is held in the internal memory.
  • FIG. 4 is a diagram showing a circuit configuration of the signal arithmetic circuit 201.
  • the photodetector 108 has a quadrant sensor for receiving the reflected excitation light on the light receiving surface, and the upper left, upper right, lower right, and lower left sensors of the quadrant sensor respectively received light. Detection signals S1 to S4 are output based on the beam spot of the reflected excitation light. On the light receiving surface of the photodetector 108 in FIG. 4, the direction corresponding to the radial direction (radial direction) of the disk is the left-right direction. Further, the focus error signal FE and the tracking error signal TE are generated according to the astigmatism method and the one-beam push-pull method used in the existing optical disc apparatus.
  • the signal operation circuit 201 includes adders 301 to 304 and 307 and subtractors 305 and 306.
  • the adder 301 outputs a signal obtained by adding the detection signals S1 and S3 to the subtractor 305
  • the adder 302 outputs a signal obtained by adding the detection signals S2 and S4 to the subtractor 305.
  • the adder 303 outputs a signal obtained by adding the detection signals S1 and S4 to the subtracter 306 and the adder 307
  • the adder 304 outputs a signal obtained by adding the detection signals S2 and S3 to the subtracter 306 and the adder 307. To do.
  • the subtracter 305 subtracts the output signals of the adders 301 and 302 and outputs a focus error signal FE.
  • the subtracter 306 subtracts the output signals from the adders 303 and 304 and outputs a tracking error signal TE.
  • the adder 307 adds the output signals of the adders 303 and 304 and outputs a reproduction RF signal. That is, the focus error signal FE, the tracking error signal TE, and the reproduction RF signal can be obtained by the calculations of the following equations (1) to (3), respectively.
  • the fluorescence incident on the fluorescence detector 111 is not necessarily limited to the fluorescence generated by the sample. . That is, so-called autofluorescence generated from a position shifted in the optical axis direction with respect to the sample also enters the fluorescence detector 111. Such autofluorescence is generated when the excitation light passes through an optical component such as the objective lens 106 or the biosensor substrate 10 or from a sample existing at a position other than the convergence position of the excitation light. When autofluorescence enters the fluorescence detector 111, there arises a problem that the detection accuracy of the fluorescence detector 111 is lowered.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining the convergence state of fluorescence.
  • FIG. 5A shows fluorescence generated from the sample (hereinafter referred to as “signal light”), fluorescence generated from a position deeper than the sample in the optical axis direction (hereinafter referred to as “stray light 1”), and from the sample in the optical axis direction.
  • the convergence state of fluorescence (hereinafter referred to as “stray light 2”) generated from a shallow position is also shown.
  • FIG. 5B is a schematic diagram showing the configuration of the anamorphic lens 109.
  • the anamorphic lens 109 imparts a converging effect to the curved surface direction and the planar direction for fluorescence incident in parallel to the lens optical axis.
  • the curved surface direction and the planar direction are orthogonal to each other.
  • the curved surface direction has a smaller radius of curvature than the planar direction, and has a great effect of converging the fluorescence incident on the anamorphic lens 109.
  • the signal light converged by the anamorphic lens 109 forms focal lines at different positions due to convergence in the curved surface direction and the planar direction.
  • the focal line position (P02) due to convergence in the curved surface direction is closer to the anamorphic lens 109 than the focal line position (P03) due to convergence in the planar direction, and the convergence position (P01) of the signal light is in the curved surface direction and planar direction. It becomes an intermediate position between the focal line positions (P02) and (P03) due to convergence.
  • the signal light beam becomes a circle of least confusion at the convergence position (P01).
  • the light receiving surface of the fluorescence detector 111 is arranged so as to be perpendicular to the optical axis of the fluorescence incident on the anamorphic lens 109.
  • the focal line position (P12) due to convergence in the curved surface direction is closer to the anamorphic lens 109 than the focal line position (P13) due to convergence in the planar direction.
  • the anamorphic lens 109 is designed so that the focal line position (P13) due to the convergence of the stray light 1 in the planar direction is closer to the anamorphic lens 109 than the convergence position (P01) of the signal light.
  • the focal line position (P22) due to convergence in the curved surface direction is closer to the anamorphic lens 109 than the focal line position (P23) due to convergence in the planar direction.
  • the anamorphic lens 109 is designed so that the focal line position (P22) due to convergence of the stray light 2 in the curved surface direction is farther from the anamorphic lens 109 than the convergence position (P01) of the signal light.
  • FIG. 6A is a diagram showing four light beam regions f1 to f4 set for fluorescence incident on the anamorphic lens 109.
  • FIG. FIG. 6A is a diagram when the fluorescence is seen in the traveling direction incident on the anamorphic lens 109.
  • the signal light passing through the light flux regions f1 to f4 is distributed as shown in FIG. 6B on the light receiving surface. Further, the stray light 1 passing through the light flux regions f1 to f4 is distributed as shown in FIG. 6C on the light receiving surface. The stray light 2 passing through the light flux regions f1 to f4 is distributed on the light receiving surface as shown in FIG. In FIGS. 6B to 6D, a circle indicating the size of the beam diameter of the signal light is indicated by a solid line, and as shown in FIGS. 6C and 6D, the stray light 1, 2 is greatly expanded compared to the signal light.
  • the signal light can be extracted by dispersing the light passing through the light flux regions f1 to f4 and separating them on the light receiving surface.
  • the present embodiment is based on this principle.
  • FIG. 8A is a diagram showing a vector to be given in the traveling direction of the fluorescence passing through each light flux region in order to separate the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) passing through the light flux regions f1 to f4 on the plane P0. It is.
  • the traveling direction of the fluorescence passing through the light beam regions f1 to f4 changes by applying the vectors V1 to V4, respectively.
  • the directions of the vectors V1 to V4 have an inclination of 45 degrees with respect to the plane direction and the curved surface direction, respectively, and are all different.
  • the vectors V1 to V4 are all the same size.
  • the magnitudes of the vectors V1 to V4 are defined as angles with respect to the direction of travel of fluorescence before the vectors are applied (the direction of travel when the anamorphic lens 109 is incident).
  • the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) passing through the light flux regions f1 to f4 is reflected on the light receiving surface as shown in FIG. 8B. Irradiated.
  • the signal light and the stray lights 1 and 2 passing through the respective light flux regions can be distributed on the light receiving surface as shown in FIG. 8B.
  • the irradiation area of the fluorescence (signal light) passing through the light beam areas f1 to f4 is positioned at the apex angle of a rectangular (signal light area) where only these four irradiation areas exist.
  • FIGS. 9A to 9C are diagrams showing a configuration example of the spectroscopic element 110.
  • FIG. FIG. 9A shows a configuration example in the case where the spectroscopic element 110 is configured by a hologram element having a diffraction pattern
  • FIGS. 9B and 9C show the case where the spectroscopic element 110 is configured by a polyhedral prism. The example of a structure is shown.
  • 9A and 9C are plan views when the spectroscopic element 110 is viewed from the anamorphic lens 109 side.
  • the spectroscopic element 110 is formed of a transparent plate having a square outline, and a blazed diffraction pattern (diffraction hologram) is formed on the light incident surface.
  • the light incident surface of the spectroscopic element 110 is divided into four diffraction regions H11 to H14.
  • the spectroscopic element 110 is arranged so that the fluorescence passing through the light beam regions f1 to f4 in FIG. 8A is incident on the diffraction regions H11 to H14, respectively.
  • the diffraction regions H11 to H14 generate + 1st order diffracted light by the diffracting action from the fluorescence incident on each diffraction region.
  • Fluorescent + 1st order diffracted light incident on the diffraction regions H11 to H14 is diffracted in the directions of solid arrows (V1 to V4). Further, the directions and magnitudes of diffraction imparted to the fluorescence by the diffraction regions H11 to H14 are indicated by vectors V1 to V4.
  • the traveling direction of the + 1st order diffracted light generated by the diffraction regions H11 to H14 is obtained by adding the vectors V1 to V4 to the traveling direction of the fluorescence before entering the diffraction regions.
  • the directions of the vectors V1 to V4 are set according to the direction of the diffraction pattern set in each diffraction area, and the sizes of the vectors V1 to V4 are set according to the pitch of the diffraction pattern set in each diffraction area.
  • the diffraction efficiencies of the diffraction regions H11 to H14 are the same.
  • the spectroscopic element 110 is a transparent body whose light emission surface is flat and whose light incident surfaces are inclined in different directions on the four inclined surfaces L11 to L14. (Polyhedral prism).
  • the traveling direction of the fluorescence incident on the inclined surfaces L11 to L14 is a vector in the traveling direction of the fluorescence before incident on each inclined surface, as in the case of FIG. 9A, due to the refracting action when entering each inclined surface. V1 to V4 are added.
  • FIGS. 9D to 9F are diagrams showing a configuration example of a sensor arranged on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • FIG. 9D to 9F are diagrams showing a configuration example of a sensor arranged on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • the controller 205 determines whether or not the malaria parasite is positioned at the spot position of the excitation light based on the addition signal obtained by adding the detection signals of the sensors S11 to S14.
  • a sensor S15 having a rectangular shape substantially the same as the shape of the signal light region shown in FIG. 8 (b) and having a hole S15a near the center is arranged in the signal light region. Is done.
  • a sensor S16 having a rectangular shape substantially the same as the shape of the signal light region is arranged in the signal light region.
  • the controller 205 determines whether or not the malaria parasite is positioned at the spot position of the excitation light based on the detection signal of the sensor.
  • the irradiation areas of the fluorescence are positioned on the light receiving surface of the fluorescence detector 111 as shown in FIG. 8B, the signal light formed by these irradiation areas.
  • the sensor By disposing the sensor in the region as shown in FIGS. 9D to 9F, it is possible to receive only the fluorescence (signal light) generated by the sample. Thereby, it is possible to accurately measure the sample while suppressing the influence of autofluorescence to a low level.
  • the focal line position (P13) due to the convergence of the stray light 1 in the plane direction is closer to the anamorphic lens 109 than the convergence position (P01) of the signal light.
  • the focal line position (P22) due to the convergence of the stray light 2 in the curved surface direction is at a position farther from the anamorphic lens 109 than the signal light convergence position (P01). That is, if this relationship is satisfied, the distribution of the signal light and the stray lights 1 and 2 is in the state shown in FIG. 8B, and the signal light and the stray lights 1 and 2 overlap on the light receiving surface of the fluorescence detector 111. You can make it not fit.
  • the focal line position (P13) is closer to the light receiving surface than the focal line position (P02), or the focal line position (P22) is more than the focal line position (P03). Even if approaches the light receiving surface, the effect based on the above principle can be achieved.
  • the convergence position (P11) in FIG. , P21) approaches the convergence position (P01).
  • the focal line position (P13) is more than the convergence position (P01) as described above. Also, it is only necessary that the position is close to the anamorphic lens 109 and the focal line position (P22) is away from the convergence position (P01).
  • Example 2 In the first embodiment, the spectroscopic element 110 shown in FIGS. 9A and 9C is used. However, in this embodiment, the spectroscopic element 113 is used instead of the spectroscopic element 110. Hereinafter, the technical principle when the spectroscopic element 113 is used will be described with reference to FIGS. 10 (a) to 11 (d).
  • FIG. 10A is a diagram for explaining the convergence state of fluorescence.
  • FIG. 10A shows the spectroscopic element 113 of this embodiment in the same convergence state as in FIG.
  • the spectroscopic element 113 is disposed between the focal line position (P13) due to the convergence of the stray light 1 in the plane direction and the focal line position (P02) due to the convergence of the signal light in the curved surface direction.
  • the anamorphic lens 109 shown in FIG. 10B is used as in the above embodiment.
  • the focal line position (P13) of the stray light 1 changes in the optical axis direction depending on the depth position of the autofluorescence in the optical axis direction. For this reason, it is desirable to arrange the spectroscopic element 113 as close as possible to the focal position (P02) of the signal light.
  • the focal line position (P13) of the stray light 1 is closer to the convergence position (P01) than the focal line position (P02) of the signal light, the signal light cannot be separated from the stray light in this embodiment.
  • the present embodiment exhibits the stray light removing action when the focal line position (P13) of the stray light 1 is in a direction away from the convergence position (P01) with respect to the focal line position (P02) of the signal light. It is. Therefore, the range of the stray light to be removed is limited as compared with the first embodiment.
  • FIG. 10C is a perspective view showing the shape of the spectroscopic element 113
  • FIG. 10D is a diagram showing the spectroscopic element 113 as viewed from the light incident side.
  • the spectroscopic element 113 is formed of a transparent body (polyhedral prism) whose light emission surface is flat and whose light incident surface is inclined in different directions on the two inclined surfaces L21 and L22.
  • the boundary between the inclined surfaces L21 and L22 is a straight line parallel to the plane direction when viewed from the light incident side.
  • the traveling direction of the fluorescence incident on the inclined surfaces L21 and L22 is obtained by adding the vectors Va and Vb to the traveling direction of the fluorescence before entering the inclined surfaces by the refraction action when entering the inclined surfaces.
  • the directions of the vectors Va and Vb are parallel to the curved surface direction and are different from each other.
  • the magnitudes of the vectors Va and Vb are the same.
  • the magnitudes of the vectors Va and Vb are defined as an angle with respect to the traveling direction of the fluorescence before the vectors are applied (the traveling direction when the anamorphic lens 109 is incident).
  • FIG. 11A is a diagram schematically showing the state of the fluorescent light flux region at each position of the anamorphic lens 109, the spectroscopic element 113, and the fluorescence detector 111.
  • FIG. Here, as shown in (0) of FIG. 11A, for the sake of convenience, out of the luminous flux regions of the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) when entering the anamorphic lens 109, 2 straight lines parallel to the plane direction. When divided, the upper left light beam region and the lower right light beam region are referred to as a light beam region A and a light beam region B, respectively.
  • (1) to (9) of FIG. 11A how light flux areas A and B set in fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) are reflected in the spectroscopic element 113 and the fluorescence detector 111. The distribution is shown.
  • Fluorescent light (stray light 1) is converged in the order of the curved surface direction and the planar direction until it enters the spectroscopic element 113 after passing through the anamorphic lens 109 and forms a focal line.
  • the focal lines at this time are elongated in the plane direction and the curved surface direction, respectively.
  • the light flux areas A and B of the stray light 1 shown in (0) of FIG. 11A pass through the focal line position (P12) shown in FIG. 10A, and then a straight line parallel to the plane direction is symmetric. Inverted as axis. Subsequently, the light flux areas A and B of the stray light 1 pass through the focal line position (P13) shown in FIG.
  • the states of the light flux areas A and B of the stray light 1 do not change. Therefore, the light flux regions A and B of the stray light 1 in the spectroscopic element 113 are in the state shown in (1) of FIG.
  • Fluorescence (signal light) does not form a focal line in both the plane direction and the curved surface direction after passing through the anamorphic lens 109 and before entering the spectroscopic element 113. Therefore, the light flux regions A and B of the signal light in the spectroscopic element 113 are in the state shown in (2) of FIG. 11 (a), similarly to the state shown in (0) of FIG. 11 (a).
  • Fluorescent light (stray light 2), like the signal light, does not form a focal line in both the plane direction and the curved surface direction after passing through the anamorphic lens 109 and before entering the spectroscopic element 113. Accordingly, the light flux areas A and B of the stray light 2 in the spectroscopic element 113 are in the state shown in (3) of FIG. 11 (a), similarly to the state shown in (0) of FIG. 11 (a).
  • fluorescence signal light and stray light 1 and 2
  • fluorescence detector 111 The state in which the light is incident will be described.
  • Fluorescence (stray light 1) does not form a focal line in both the plane direction and the curved surface direction after passing through the spectroscopic element 113 and before entering the fluorescence detector 111. Therefore, the light flux regions A and B of the stray light 1 in the fluorescence detector 111 are in the state shown in (4) of FIG. 11 (a), similarly to the state shown in (1) of FIG. 11 (a).
  • Fluorescence (signal light) forms a focal line in the curved surface direction after passing through the spectroscopic element 113 and before entering the fluorescence detector 111, but does not form a focal line in the planar direction.
  • the light flux areas A and B of the signal light shown in (2) of FIG. 11A pass through the focal line position (P02) shown in FIG. Inverted as axis. Therefore, the light flux regions A and B of the signal light in the fluorescence detector 111 are in the state shown in (5) of FIG.
  • Fluorescence (stray light 2) does not form a focal line in both the plane direction and the curved surface direction after passing through the spectroscopic element 113 and before entering the fluorescence detector 111. Therefore, the light flux areas A and B of the stray light 2 in the fluorescence detector 111 are in the state shown in (6) of FIG. 11 (a), similarly to the state shown in (3) of FIG. 11 (a).
  • the distribution of the light flux areas A and B of the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) in the fluorescence detector 111 can be considered as follows.
  • FIGS. 11B and 11C are diagrams showing the light flux regions of the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) in the fluorescence detector 111 in the case of the comparative example.
  • FIG. 11B is a diagram showing a distribution of only fluorescence passing through the upper left light beam region when entering the spectroscopic element 113
  • FIG. 11C shows the lower right side when entering the spectroscopic element 113. It is a figure which shows distribution of only the fluorescence which passed the light beam area
  • the light beam region B of the stray light 1, the light beam region A of the stray light 2, and the light beam region A of the signal light are all in the direction of the vector Va (upper left) by the spectral action of the spectroscopic element 113.
  • the light flux region A of the stray light 1, the light flux region B of the stray light 2, and the light flux region B of the signal light are all in the direction of the vector Vb due to the spectral action of the spectroscopic element 113. (To the lower right).
  • the fluorescent light flux region thus moved is in the state shown in FIG.
  • a signal light region in which only the light beam regions A and B of the signal light are distributed can be provided near the center of the fluorescence detector 111.
  • FIG. 12A shows another configuration example of the spectroscopic element 113.
  • the spectroscopic element 113 is formed of a transparent plate having a square outline, and a blazed diffraction pattern (diffraction hologram) is formed on the light incident surface.
  • the light incident surface of the spectroscopic element 113 is divided into two diffraction regions H21 and H22.
  • the light flux areas A and B of the fluorescence (signal light and stray light 1 and 2) as shown in FIG. Can be distributed.
  • FIG. 12 (b) and 12 (c) are diagrams showing a configuration example of a sensor arranged on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • FIG. 12 (b) and 12 (c) are diagrams showing a configuration example of a sensor arranged on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • the two sensors S21 and S22 having a triangular shape are arranged so as to receive the signal light positioned in the signal light region shown in FIG.
  • the controller 205 determines whether or not the malaria parasite is positioned at the spot position of the excitation light based on the addition signal obtained by adding the detection signals of the sensors S21 and S22.
  • a sensor S23 having a rectangular shape substantially the same as the shape of the signal light region shown in FIG. 11D is arranged in the signal light region.
  • the controller 205 determines whether or not a malaria parasite is positioned at the spot position of the excitation light based on the detection signal of the sensor S23.
  • the fluorescent light flux region in the fluorescence detector 111 in the comparative example has an upper left direction and a lower right direction, that is, , And moved in the directions of vectors Va and Vb due to the spectral action of the spectroscopic element 113.
  • the light flux region was positioned as shown in FIG. 13 (c-1).
  • the directions of the vectors Va and Vb are not limited to the upper left direction and the lower right direction, but may be the left direction and the right direction as shown in FIGS. 13 (a-2) and (b-2). 3) As shown in (b-3), it may be upward and downward. Also in these cases, as shown in FIGS. 13C-2 and 13C-3, a rectangular signal light region in which only the light beam regions A and B of the signal light are distributed can be provided near the center.
  • the directions of the vectors Va and Vb are both parallel to the plane direction or the curved surface direction, and the sizes of the vectors Va and Vb may be different from each other.
  • one of the inclined surfaces L21 and L22 of the spectroscopic element 113 shown in FIG. 10D is a flat surface having no inclination, and the fluorescent light incident on the spectroscopic element 113 is incident on the inclined surfaces L21 and L22. A refracting action may act only on any incident fluorescence.
  • the spectroscopic element 113 may be configured such that the stray light 1 and 2 are not applied to the signal light on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • red blood cells are contained in the well 13 and the red blood cells are infected with the malaria parasite, but the sample to be contained in the well 13 and the event to be determined are Not limited.
  • a cell expressing a specific gene or a cell in which biological substances such as nucleic acids, proteins, lipids, and sugars are excessive or deficient than usual is detected as a specific cell from various cell groups. May be. Or, conversely, a normal functioning cell may be detected from the cell group as a specific cell. This is used, for example, for the purpose of detecting normally differentiated cells in the induction of iPS cells or ES cells from an undifferentiated state to a differentiated state.
  • Such specific cells may be cells that exist in nature or may be cells that have been subjected to artificial treatment.
  • the artificial treatment is not particularly limited, and examples thereof include physical treatment (eg, electromagnetic wave irradiation), chemical treatment (eg: drug treatment), genetic engineering treatment (eg: gene recombination treatment) and the like.
  • a treatment that has a known effect on cells can be applied to the cell group, and a cell that does not show the effect or a cell that shows the effect more strongly can be detected as a specific cell.
  • a cell that are resistant or highly sensitive to drug treatment can be detected as specific cells.
  • the type of cell group is not particularly limited.
  • a group of cells derived from a multicellular organism may be used.
  • cells derived from multicellular organisms include cells obtained from normal tissues or pathological tissues of organisms, cultured cells derived from these cells, and the like.
  • the organism from which these cells are obtained is not particularly limited.
  • it may be a cell collected from an animal or a cell collected from a plant. More specifically, for example, cells collected from vertebrates (especially mammals and birds), cells collected from insects, plant culture cells, etc. can be mentioned as the cells to be detected, but the cells to be detected are limited to these. Is not to be done.
  • the group in which multiple types of cells are mixed may be sufficient.
  • a lid may be provided on the upper portion of the well 13. Thereby, undesired outflow (unintentional outflow), evaporation or movement of the sample from the well 13 can be prevented.
  • the well layer 12 disposed on the reflective film 14 is provided with the well 13 having the bottom surface portion 13 a.
  • the bottom surface portion 13 a of the well 13 is the upper surface of the reflective film 14. It is good also as a structure. That is, as shown in FIG. 14A, the well 13 is formed by a through hole of the well layer 12 and is formed on the reflective film 14.
  • the sample may be fixed on the reflective film 14 as shown in FIG. 14B without using the well 13, and formed on the reflective film 14 as shown in FIG. 14C.
  • a configuration in which the sample is fixed on the layer 15 may be employed.
  • a structure having some kind of adsorption action can be provided at the location to be fixed. For example, the adsorption of the sample is promoted by forming a molecular layer rich in hydroxyl (OH) groups on the reflective film 14 in the case of FIG. 14B and on the layer 15 in the case of FIG. 14C.
  • OH hydroxyl
  • the excitation light is converged on the samples arranged in parallel to the bottom surface portion 13a of the well 13, and the fluorescence from these samples is detected.
  • the layers other than the layer of the sample in contact with the bottom surface portion 13a one layer above
  • the fluorescence from the sample in that layer may be detected separately from the fluorescence from the sample in the other layer.
  • the fluorescence detection device 1 is provided with a lens actuator 120 that supports the anamorphic lens 109 and that allows the anamorphic lens 109 to move in the optical axis direction.
  • the lens actuator 120 is provided with a motor 120 a for driving the anamorphic lens 109.
  • the lens actuator 120 By controlling the lens actuator 120 to shift the anamorphic lens 109 in the optical axis direction, it is possible to adjust only the focal position on the fluorescence detector 111 side while keeping the focal position of the excitation light on the biosensor substrate 10 as it is. For example, from the state where the fluorescence (signal light) from the depth position DP1 is applied to the signal light region on the light receiving surface of the fluorescence detector 111 as shown in FIG. When displaced to the position, the fluorescence (signal light) from the depth position DP2 deeper than the depth position DP1 is irradiated to the signal light region on the light receiving surface of the fluorescence detector 111. When the anamorphic lens 109 is displaced from the state of FIG.
  • the fluorescence (signal light) from a position shallower than the depth position DP1 becomes a signal on the light receiving surface of the fluorescence detector 111.
  • the light region is irradiated.
  • the PBS 102 and the quarter wavelength plate 104 are used.
  • the quarter wavelength plate 104 may be omitted, and a beam splitter (BS) may be provided instead of the PBS 102.
  • BS beam splitter
  • the excitation light emitted from one semiconductor laser 101 is applied to the reflective film 14 to generate a servo signal for controlling the objective lens 106, and the sample is irradiated with fluorescence.
  • a semiconductor laser that emits laser light for generating a servo signal and a semiconductor laser that emits excitation light for generating fluorescence may be separately arranged in the fluorescence detection apparatus 1. good.
  • the spectroscopic element 110 is disposed between the anamorphic lens 109 and the fluorescence detector 111, but may be disposed between the dichroic prism 105 and the anamorphic lens 109. Further, when the spectroscopic element 110 is provided with wavelength selectivity that imparts the spectroscopic action only to the fluorescence without giving the spectroscopic action to the excitation light, the spectroscopic element 110 includes the objective lens 106 and the dichroic prism 105. It may be arranged between.
  • the signal light irradiation areas are separated from each other on the light receiving surface, but they are not necessarily separated from each other and may overlap each other.
  • a blazed diffraction pattern is formed on the light incident surface of the spectroscopic element 110.
  • the present invention is not limited to this, and a step-type diffraction pattern may be formed.
  • the + 1st order diffracted light and the ⁇ 1st order diffracted light are generated from the fluorescence incident on each diffraction region by the diffraction action of the diffraction regions H11 to H14.
  • one of the + 1st order diffracted light and the ⁇ 1st order diffracted light of the signal light is included in the signal light region, and the other is guided outside the signal light region.
  • the amount of light received by the fluorescence sensor generated by the sample is half that of the first embodiment. Therefore, it is desirable that the diffraction pattern formed on the spectroscopic element 110 be a blaze type as in the first embodiment from the viewpoint of the amount of received fluorescence light.
  • the spectroscopic element 113 is installed between the focal line position (P13) due to convergence of the stray light 1 in the plane direction and the focal line position (P02) due to convergence of the signal light in the curved surface direction.
  • the spectroscopic element 113 may be disposed between the focal line position (P12) due to convergence of the stray light 1 in the curved surface direction and the focal line position (P13) due to convergence of the stray light 1 in the plane direction. In this case, unlike the case of FIG.
  • the reflected excitation light and the fluorescence from the biosensor substrate 10 are separated by the dichroic prism 105, but the reflected excitation light and the fluorescence may be separated by other methods.
  • FIG. 16 is a diagram showing a configuration of the fluorescence detection apparatus 2 when the reflected excitation light and fluorescence are separated by another method.
  • PBS 131 is arranged instead of PBS 102
  • a reflection mirror 132 is arranged instead of the dichroic prism 105
  • a photodetector 133 is arranged instead of the photodetector 108
  • the anamorphic lens 107 and the fluorescence detector 111 are arranged. Is omitted.
  • the spectroscopic element 110 or the spectroscopic element 113 of the above embodiment is omitted, and the spectroscopic element 134 is disposed between the anamorphic lens 109 and the photodetector 133.
  • the aperture 112 is omitted, and the holder 121 is provided with a circular aperture 135 on the reflection mirror 132 side of the objective lens 106.
  • the PBS 131 is composed of a wavelength selective PBS that acts on excitation light and does not act on fluorescence. That is, the excitation light is transmitted or reflected through the PBS 131 according to the polarization direction, and all the fluorescence is transmitted through the PBS 131 regardless of the polarization direction.
  • the aperture 135 also has wavelength selectivity, shields a predetermined peripheral portion from the excitation light, and transmits all the fluorescence.
  • the excitation light emitted from the semiconductor laser 101 is reflected by the PBS 131, and the reflected excitation light incident on the PBS 131 from the collimator lens 103 side passes through the PBS 131.
  • Excitation light that enters the aperture 135 from the reflection mirror 132 side has a predetermined diameter due to the aperture 135.
  • Fluorescence incident on the aperture 135 from the objective lens 106 side passes through the aperture 135 and enters the reflection mirror 132.
  • the fluorescence incident on the reflection mirror 132 is reflected by the reflection mirror 132 and passes through the quarter-wave plate 104, the collimator lens 103, the PBS 131, and the anamorphic lens 109.
  • the spectroscopic element 134 has a wavelength dependency that does not impart a diffractive action to reflected excitation light, but imparts a diffractive action only to fluorescence.
  • the spectroscopic element 134 imparts the same spectral action to the fluorescent light as the spectroscopic element 110 of the first embodiment or the spectroscopic element 113 of the second embodiment, and further reflects incident excitation light by dispersing the incident fluorescent light upward in FIG. A spectral action that separates from light is imparted to the fluorescence.
  • the spectroscopic element 134 has a lens action (diffraction action) that absorbs the defocus in addition to the above-described spectroscopic action. That is, the spectroscopic element 134 imparts a lens action to the fluorescence so that the convergence position of the fluorescence from the sample (P01: see FIGS. 5A and 10A) coincides with the light receiving surface of the photodetector 133. .
  • an irradiation region similar to that in FIG. 8B or a light flux region similar to FIG. 11D is located above the irradiation position of the reflected excitation light in FIG. Positioned.
  • the light receiving surface of the photodetector 133 to receive the signal light similar to that of the above embodiment in the four-divided sensor as shown in FIG. 4 and upward of FIG. 16 from the four-divided sensor. Sensors are positioned.
  • the photodetector 133 outputs a detection signal based on the reflected excitation light to the signal calculation circuit 201 and outputs a detection signal based on the fluorescence to the signal amplification circuit 204.
  • a sample can be measured with high accuracy while suppressing the influence of autofluorescence low as in the above-described embodiment.
  • an aperture 135 for defining the beam diameter of the excitation light is installed in the holder 121.
  • an aperture is installed on the exit side of the collimator lens 103, and the aperture is arranged in this aperture.
  • Polarization selectivity and wavelength selectivity may be provided. If the aperture is arranged on the exit side of the collimator lens 103 in this way, the luminous flux of the excitation light toward the objective lens 106 is fixed. Therefore, when the objective lens 106 is displaced in the tracking direction in tracking control or the like, the excitation light May deviate from the center of the objective lens 106, and the optical characteristics of the excitation light may deteriorate. Therefore, in order to avoid this problem, it is desirable to arrange the aperture 135 on the incident side of the objective lens 106 and move the aperture 135 and the objective lens 106 integrally as shown in FIG.
  • the sample is held on the disk-shaped carrier.
  • the carrier for holding the sample is not limited to this.
  • the sample is held on a card-like carrier having a rectangular outline. May be.
  • the card is configured such that the well and the track are arranged in a straight line in one direction, and the fluorescence detection device uses the excitation light while moving the card relative to the objective lens 106 in the direction parallel to the track. Configured to scan the track.
  • Fluorescence detection device 10 ... Biosensor substrate (sample holding carrier) 11a: Reflecting surface 13: Well (sample container) 101 ... Semiconductor laser (light source) 106 ... objective lens 109 ... anamorphic lens (astigmatism element) 110, 113, 134... Spectroscopic element 111... Fluorescence detector (photodetector) 133... Photodetector S11 to S16, S21 to S23... Sensor (light receiving unit)

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Abstract

【課題】簡素な構成にて効果的に自家蛍光を除去し得る蛍光検出装置を提供する。 【解決手段】蛍光検出装置（１）は、励起光を出射する半導体レーザ（１０１）と、励起光をバイオセンサ基板（１０）上の試料に収束させる対物レンズ（１０６）と、バイオセンサ基板（１０）から対物レンズ（１０６）に入射し対物レンズ（１０６）を透過した蛍光に非点収差を導入するアナモレンズ（１０９）と、蛍光を複数の光束に分離する分光素子（１１０）と、分光素子（１１０）によって分離された光束を受光する蛍光検出器（１１１）と、を備える。分光素子（１１０）は、蛍光検出器（１１１）の受光面上において、試料の位置から生じた蛍光が、試料の位置以外の所定の深さ位置から生じた蛍光から分離されるよう、蛍光を分光する。蛍光検出器（１１１）は、試料の位置から生じた蛍光が照射され、且つ、試料の位置以外の深さ位置から生じた蛍光が照射されない領域に、センサが配置されている。

Description

蛍光検出装置
　本発明は、細胞等の被検体を蛍光標識することにより調整された試料に対して励起光を照射し、試料から生じる蛍光を検出する蛍光検出装置に関する。
　近年、蛍光標識された試料の検出を自動化する技術が種々提案されている。たとえば、特開２００１－２３８６７４号公報には、既存の光ディスクの技術を用いたＤＮＡディスクが提案されている。ここでは、ディスク上に、一連のスポットが螺旋状に並ぶように形成され、さらに、スポットの配列に沿ってトラックが形成され、このトラックにアドレスマークが形成される。そして、トラックに沿って光が走査され、この光によってスポットから生じた蛍光が光検出器によって検出される。
　また、特開２００１－２３８６７４号公報には、スポット以外において生じる蛍光、いわゆる領域外蛍光や自家蛍光を除去する構成が開示されている。ディスク基板や他の光学部材等を光が通過する際に、領域外蛍光あるいは自家蛍光が生じる。かかる自家蛍光が光検出器に入射すると、スポット内に存在している試料から生じる蛍光の検出精度が低下する惧れがある。かかる問題を抑制するため、特開２００１－２３８６７４号公報では、光検出器の前段にアパーチャを配置し、試料によって生じた蛍光をアパーチャの開口部に収束させることにより、領域外蛍光や自家蛍光などの不要な蛍光を除去する構成が設けられている。
特開２００１－２３８６７４号公報
　しかしながら、上記特開２００１－２３８６７４号公報によれば、試料によって生じた蛍光の収束位置に開口部を正確に位置づける必要があるため、開口部の位置調整作業が困難になるとの課題が生じる。また、位置調整作業を容易にするために開口部のサイズを大きくすると、自家蛍光が開口部を通過する割合が増加し、自家蛍光による検出精度の低下を効果的に抑制できなくなる。さらに目的の試料が存在する位置以外から生じる蛍光、すなわち領域外蛍光も生じることになり、この結果、目的試料から生じた蛍光の検出精度が低下する。
　本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、簡素な構成にて効果的に目的の試料以外から生じる自家蛍光や領域外蛍光などの不要な蛍光を除去し得る蛍光検出装置を提供することを目的とする。
　本発明の主たる態様は、蛍光標識が施された試料を保持する試料保持担体に対し照射光を照射するとともに、当該照射光の照射により試料から生じる蛍光を検出する蛍光検出装置に関する。この態様に係る蛍光検出装置は、前記照射光を出射する光源と、前記照射光を前記試料保持担体上の前記試料に収束させる対物レンズと、前記試料保持担体から前記対物レンズに入射し前記対物レンズを透過した蛍光に非点収差を導入する非点収差素子と、前記蛍光を複数の光束に分離する分光素子と、前記分光素子によって分離された前記光束を受光する光検出器と、を備える。ここで、前記分光素子は、前記光検出器の受光面上において、前記試料の位置から生じた蛍光が、前記試料の位置以外の所定の深さ位置から生じた蛍光から分離されるよう、前記蛍光を分光する。前記光検出器は、前記試料の位置から生じた蛍光が照射され、且つ、前記試料の位置以外の深さ位置から生じた蛍光が照射されない領域に、受光部が配置されている。
　本態様に係る蛍光検出装置によれば、光検出器の受光面上において、試料の位置から生じた蛍光と、その試料の位置以外の深さ位置から生じた蛍光（いわゆる自家蛍光）とが重ならず、試料の位置から生じた蛍光のみが照射される領域に配置された受光部により、試料の位置から生じた蛍光のみを受光することができる。これにより、簡素な構成にて自家蛍光を除去しながら、試料の位置から生じた蛍光を精度良く検出することが可能となる。
　本態様に係る蛍光検出装置において、前記非点収差素子は、第１の方向における前記蛍光の収束により第１の焦線を生成し、且つ、前記第１の方向に垂直な第２の方向における前記蛍光の収束により第２の焦線を生成し、前記分光素子は、前記蛍光から４つの前記光束を分離し、前記第１の方向と前記第２の方向にそれぞれ平行で且つ互いにクロスする２つの直線の交点を前記蛍光の光軸に整合させたとき、前記２つの直線によって区分される前記蛍光の４つの領域に、４つの前記光束がそれぞれ含まれるよう構成され得る。このように、非点収差の方向との関係から、分光素子により分光される領域を設定することにより、試料から生じた蛍光と、試料以外の深さ位置から生じた蛍光とを、光検出器上において、互いに重ならないよう、分離することができる。
　この場合に、前記分光素子は、４つの前記光束を、それぞれ、前記光検出器上において、正方形の４つの頂角の位置に照射させるよう、４つの前記光束の進行方向を変化させる構造を備えるよう構成され得る。こうすると、試料の位置から生じた蛍光のみが照射される領域をコンパクトにすることができ、受光部のレイアウト構成を簡素にすることができる。
　また、本態様に係る蛍光検出装置において、前記非点収差素子は、第１の方向における前記蛍光の収束により第１の焦線を生成し、且つ、前記第１の方向に垂直な第２の方向における前記蛍光の収束により第２の焦線を生成し、前記分光素子は、前記蛍光から２つの前記光束を分離し、前記第１の方向に平行な直線を前記蛍光の光軸に整合させたとき、前記直線によって区分される前記蛍光の２つの領域に、２つの前記光束がそれぞれ含まれるよう構成され得る。この場合、前記分光素子は、前記試料の位置から生じた蛍光が前記非点収差素子によって収束されることにより生じる２つの焦線のうち前記対物レンズ側の焦線よりも前記対物レンズ側に配置される。このように、非点収差の方向との関係から、分光素子により分光される領域を設定することにより、試料から生じた蛍光と、試料以外の深さ位置から生じた蛍光とを、光検出器上において、互いに重ならないよう、分離することができる。また、この構成によれば、分光する光束が４つである場合に比べ、分光素子の構成を簡素化することができる。
　この場合、前記分光素子は、２つの前記光束を前記第２の方向に互いに離間させるよう、２つの前記光束の進行方向を変化させる構造を備えるよう構成され得る。こうすると、試料の位置から生じた蛍光のみが照射される領域をコンパクトにすることができ、受光部のレイアウト構成を簡素にすることができる。
　また、本態様に係る蛍光検出装置において、前記試料保持担体は、前記試料を収容する試料収容部と、前記試料収容部よりも前記照射光の入射側に配置され照射光の一部を反射する反射面と、を備えるよう構成され得る。ここで、前記分光素子は、波長選択性の回折素子により構成され、前記分光素子は、前記蛍光と前記反射面によって反射された前記照射光の反射光とが入射されるとともに、前記蛍光と前記反射光との波長の差異に基づき、前記蛍光と前記反射光を互いに分離させる回折作用を、前記蛍光にさらに付与するよう構成され得る。こうすると、一つの光検出器により、蛍光と反射面によって反射された照射光の反射光とを受光することができるため、部品点数の削減と、構成の簡素化を図ることができる。
　本発明によれば、簡素な構成にて効果的に自家蛍光を除去し得る蛍光検出装置を提供することができる。
　本発明の効果ないし意義は、以下に示す実施の形態の説明により更に明らかとなろう。ただし、以下の実施の形態は、あくまでも、本発明を実施する際の一つの例示であって、本発明は、以下の実施の形態によって何ら制限されるものではない。
実施例１に係るバイオセンサ基板の外観の構成を模式的に示す斜視図、バイオセンサ基板を面に垂直な平面で切断したときの断面図、およびバイオセンサ基板の断面の一部拡大図である。 実施例１に係る蛍光検出装置の構成を示す図である。 実施例１に係る励起光の焦点深度を説明するための図である。 実施例１に係る信号演算回路の回路構成を示す図である。 実施例１の技術原理に係る蛍光の収束状態を説明する図およびアナモレンズの構成を示す模式図である。 実施例１の技術原理に係る光束領域の分布状態を説明する図である。 実施例１の技術原理に係る信号光と迷光の分布を説明する図である。 実施例１の技術原理に係る蛍光の進行方向に付与するベクトルを示す図および受光面上における蛍光の照射領域を示す図である。 実施例１に係る分光素子の構成例を示す図および蛍光検出器の受光面上に配されるセンサの構成例を示す図である。 実施例２の技術原理に係る蛍光の収束状態を説明する図、アナモレンズの構成を示す模式図、分光素子の形状を示す斜視図、および光入射側から見た分光素子を示す図である。 実施例２に係る蛍光の光束領域の状態を模式的に示す図、比較例の場合の光束領域を重ねて示す図、および受光面上における蛍光の光束領域を示す図である。 実施例２に係る分光素子の他の構成例を示す図および蛍光検出器の受光面上に配されるセンサの構成例を示す図である。 実施例２に係る蛍光検出器の受光面上における蛍光の光束領域の変更例を示す図である。 実施の形態に係るウエルの他の構成例を示す図である。 実施の形態に係るウエル内に試料が多重に重なって配されている状態を示す図および蛍光の検出位置を調整させる方法を説明する図である。 実施の形態に係る蛍光検出装置の他の構成を示す図である。
　以下、本発明の実施例につき図面を参照して説明する。
　＜実施例１＞
　図１（ａ）は、本実施例で用いるバイオセンサ基板１０の外観の構成を模式的に示す斜視図である。バイオセンサ基板１０は、たとえば、人の血液中においてマラリア原虫に感染した赤血球を検出するために用いられる。
　バイオセンサ基板１０は、光ディスク（ＣＤやＤＶＤ等）と同様に円盤形状を有しており、中心に円形状の孔１０ａが形成されている。また、バイオセンサ基板１０は、ベース基板１１の上面にウエル層１２が積層された構造となっている。ウエル層１２には、図１（ａ）の右端の拡大図に示すように、円柱形状の窪みからなる微小なウエル１３が複数形成されている。ウエル１３は、バイオセンサ基板１０の内周から外周に向かって同心円状または螺旋状に並んでいる。ウエル１３は、ウエル層１２の上面よりも一段低い底面部１３ａを有しており、試料が滴下されたときにその試料を収容することができるよう直径と高さが設定されている。
　図１（ｂ）は、バイオセンサ基板１０を面に垂直な平面で切断したときの断面図であり、図１（ｃ）は、図１（ｂ）の破線部分の拡大図である。
　ベース基板１１の上側（ウエル層１２側）には、光ディスクと同様の螺旋状のトラック（ピット列）が形成されている。ピットは、バイオセンサ基板１０の面上の位置を特定するためのアドレス情報を保持している。ＣＤやＤＶＤと同様、線速度一定でトラックが励起光（後述）により走査されることにより、アドレス情報が再生される。ベース基板１１とウエル層１２との間には、反射膜１４が配されている。ベース基板１１の上面に反射膜１４が積層されることにより、ベース基板１１の上面に、反射膜１４とベース基板１１との界面である反射面１１ａが形成される。ウエル１３は、ウエル層１２の上面側に所定の間隔を開けて形成されている。ウエル１３の底面部１３ａは、反射膜１４よりも僅かに上側に位置付けられており、ウエル１３の底面部１３ａと反射膜１４の上面とは離間している。
　ここで、ウエル１３の直径と高さを、それぞれｄ１、ｄ２とし、底面部１３ａと反射面１１ａとの間隔をｄ３とし、ウエル１３の間隔をｄ４とし、ベース基板１１の厚みをｄ５とし、反射面１１ａのトラックピッチをｄ６とする。本実施例では、直径ｄ１と、高さｄ２は、それぞれ、１００μｍと５０μｍに設定されており、間隔ｄ３、ｄ４は、それぞれ、２μｍと３００μｍに設定されており、厚みｄ５は０．６ｍｍに設定されており、トラックピッチｄ６は、１μｍに設定されている。また、反射膜１４の励起光（後述）に対する反射率は、３～４％に設定されている。
　図２は、本実施例に係る蛍光検出装置１の構成を示す図である。蛍光検出装置１は、たとえば、上記バイオセンサ基板１０のウエル１３に収容された赤血球がマラリア原虫に感染しているかを判定するために用いられる。
　なお、蛍光検出装置１を使用する際、予め、被検体を蛍光標識することにより作成した試料を、バイオセンサ基板１０のウエル１３に収容させておく。本実施例では、被検体である直径約１０μｍ、厚さ約２μｍの赤血球がマラリア原虫に感染していた場合にその内部が蛍光標識され、感染している赤血球と感染していない赤血球とが共に直径１００μｍのウエル１３の底面部１３ａに並列的に複数配される。このように試料が収容されたバイオセンサ基板１０の孔１０ａ（図１（ａ）参照）が、蛍光検出装置１の回転装置１２３（ターンテーブル）にセットされ、測定が開始される。
　蛍光検出装置１の光学系は、半導体レーザ１０１と、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）１０２と、コリメータレンズ１０３と、１／４波長板１０４と、ダイクロイックプリズム１０５と、対物レンズ１０６と、アナモレンズ１０７と、光検出器１０８と、アナモレンズ１０９と、分光素子１１０と、蛍光検出器１１１と、アパーチャ１１２を備えている。また、蛍光検出装置１は、上記光学系の他、ホルダ１２１と、対物レンズアクチュエータ１２２と、回転装置１２３と、信号演算回路２０１と、サーボ回路２０２と、再生回路２０３と、信号増幅回路２０４と、コントローラ２０５を備えている。
　半導体レーザ１０１は、波長４０５ｎｍ程度のレーザ光（以下、「励起光」という）を出射する。なお、本実施の形態における励起光は、特許請求の範囲に記載の照射光の一例である。図２には、半導体レーザ１０１から出射される励起光のうち、バイオセンサ基板１０に導かれる励起光、すなわち、アパーチャ１１２を通過する励起光が、破線で示されている。アパーチャ１１２には、所定の口径を有する円形の開口が形成されており、このアパーチャ１１２により励起光の口径が制限される。また、半導体レーザ１０１の位置は、半導体レーザ１０１から出射される励起光がＰＢＳ１０２に対してＳ偏光となるよう調整されている。これにより、半導体レーザ１０１から出射された励起光は、アパーチャ１１２により口径を制限された後、ＰＢＳ１０２によって反射され、コリメータレンズ１０３に入射する。
　コリメータレンズ１０３は、ＰＢＳ１０２側から入射する励起光を平行光に変換する。これにより、コリメータレンズ１０３を通過した励起光は、所定径の平行光となる。１／４波長板１０４は、コリメータレンズ１０３側から入射する励起光を円偏光に変換するとともに、ダイクロイックプリズム１０５側から入射する励起光を、コリメータレンズ１０３側から入射する際の偏光方向に直交する直線偏光に変換する。これにより、コリメータレンズ１０３側からＰＢＳ１０２に入射する励起光は、ＰＢＳ１０２を透過する。
　ダイクロイックプリズム１０５は、波長４０５ｎｍ程度のレーザ光を反射し、波長４５０～５４０ｎｍ程度のレーザ光を透過するよう構成されている。これにより、１／４波長板１０４側から入射する励起光は、ダイクロイックプリズム１０５によって反射され、対物レンズ１０６に入射する。
　対物レンズ１０６は、励起光をバイオセンサ基板１０に対して適正に収束させるよう構成されている。具体的には、対物レンズ１０６は、ダイクロイックプリズム１０５側から入射する励起光が所定のＮＡ（開口数、ここでは、０．３４）で収束するよう構成されている。対物レンズ１０６に対する励起光の入射口径は、アパーチャ１１２の口径によって決められる。対物レンズ１０６により収束される励起光の焦点深度は、励起光のＮＡによって決まる。励起光の焦点深度については、追って、図３（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。
　対物レンズ１０６は、ホルダ１２１に保持された状態で、対物レンズアクチュエータ１２２により、フォーカス方向（バイオセンサ基板１０に垂直な方向）とトラッキング方向（バイオセンサ基板１０の径方向）に駆動される。すなわち、対物レンズ１０６は、励起光が、バイオセンサ基板１０の反射面１１ａに合焦された状態で、ピット列からなるトラックを追従するよう、駆動される。反射面１１ａに合焦された励起光は、一部が反射面１１ａによって反射され、大部分が反射面１１ａを透過する。以下、反射面１１ａによって反射された励起光を「反射励起光」という。後述のように、この反射励起光に基づいて、対物レンズ１０６をフォーカス方向とトラッキング方向に駆動するためのサーボ信号が生成される（図４参照）。
　図３（ａ）、（ｂ）は、励起光の焦点深度を説明するための図である。
　上述したように、励起光の波長は４０５ｎｍであり、励起光のＮＡ（開口数）は０．３４である。また、一般に焦点深度は、波長／（ＮＡ×ＮＡ）により算出することができる。よって、本実施例の励起光の焦点深度は、約３．５μｍとなる。底面部１３ａと反射面１１ａとの間隔ｄ３は、励起光の焦点深度よりも小さくなるよう設定され、ここでは、２．０μｍに設定されている。
　上記のように、励起光のＮＡが設定されると、焦点位置におけるスポット径は約１μｍとなる。図１（ｃ）に示すトラックピッチの間隔ｄ６は、かかるスポット径と略同じとなるよう、１μｍに設定されている。
　図３（ａ）は、励起光の焦点深度の範囲の最下点が反射膜１４と一致している状態を示し、図３（ｂ）は、励起光の焦点深度の範囲の最上点が底面部１３ａと一致している状態を示している。なお、サーボ回路２０２から対物レンズアクチュエータ１２２に出力されるオフセット電圧を調整することで、励起光の焦点深度の範囲を図３（ａ）、（ｂ）の何れの状態とすることもできる。
　図３（ａ）、（ｂ）の状態のとき、ウエル１３の底面部１３ａと反射面１１ａとの間隔ｄ３は２μｍであり、励起光の焦点深度は３．５μｍであるため、励起光の焦点深度に対応する範囲に、底面部１３ａと反射面１１ａの両方が含まれるようになる。したがって、フォーカスサーボにより、励起光の焦点位置を反射面１１ａに位置付けると、底面部１３ａに配されている試料にも焦点が合わせられることとなる。
　図２に戻り、バイオセンサ基板１０に照射された励起光のうち、反射面１１ａによって反射された反射励起光は、ダイクロイックプリズム１０５によって反射され、１／４波長板１０４により直線偏光に変更され、コリメータレンズ１０３により収束光となる。そして、コリメータレンズ１０３側からＰＢＳ１０２に入射する反射励起光は、上述したようにＰＢＳ１０２を透過する。
　アナモレンズ１０７は、ＰＢＳ１０２側から入射する反射励起光に非点収差を導入する。アナモレンズ１０７を透過した反射励起光は、光検出器１０８に入射する。光検出器１０８は、受光面上に反射励起光を受光するための４分割センサを有している。光検出器１０８の検出信号は、信号演算回路２０１に入力される。
　バイオセンサ基板１０に照射された励起光のうち、反射面１１ａを透過した励起光は、ウエル１３の底面部１３ａに到達する。底面部１３ａに並列的に配されている蛍光標識されたマラリア原虫に感染している赤血球に励起光が照射されると、マラリア原虫から蛍光が発生する。かかる蛍光は、図２において一点鎖線で示されるように、ＮＡ（開口数）が励起光のＮＡよりも大きい。このため、対物レンズ１０６とダイクロイックプリズム１０５との間において、蛍光のビーム径は励起光のビーム径よりも大きくなっている。蛍光のＮＡは、たとえば、０．６５である。また、蛍光の波長は励起光の波長と異なっており、本実施例では４５０～５４０ｎｍとなっている。
一方でマラリア原虫に感染していない赤血球は蛍光標識されていないので蛍光を発生しない。このようにして、マラリア原虫に感染している赤血球と感染していない赤血球とを区別することができる。
　対物レンズ１０６側からダイクロイックプリズム１０５に入射する蛍光は、ダイクロイックプリズム１０５を透過する。アナモレンズ１０９は、ダイクロイックプリズム１０５側から入射する蛍光に非点収差を導入する。分光素子１１０は、アナモレンズ１０９によって非点収差が導入された蛍光の進行方向を変更させる。蛍光検出器１１１は、分光素子１１０によって進行方向が変更された蛍光を受光するためのセンサを有している。蛍光検出器１１１の検出信号は、信号増幅回路２０４に入力される。アナモレンズ１０９と、分光素子１１０と、蛍光検出器１１１の受光面上のセンサについては、追って図５（ａ）～図９（ｆ）を参照して説明する。
　信号演算回路２０１は、光検出器１０８の検出信号から、後述するフォーカスエラー信号ＦＥとトラッキングエラー信号ＴＥを生成し、光検出器１０８の検出信号から、後述する再生ＲＦ信号を生成する。サーボ回路２０２は、信号演算回路２０１から出力されたフォーカスエラー信号ＦＥとトラッキングエラー信号ＴＥを用いて、対物レンズアクチュエータ１２２の駆動を制御する。また、サーボ回路２０２は、信号演算回路２０１から出力された再生ＲＦ信号を用いて、線速度一定でバイオセンサ基板１０が回転されるよう、回転装置１２３を制御する。再生回路２０３は、信号演算回路２０１から出力された再生ＲＦ信号を復調して再生データを生成する。信号増幅回路２０４は、蛍光検出器１１１の検出信号を増幅する。
　コントローラ２０５は、信号演算回路２０１と、サーボ回路２０２と、再生回路２０３の他、蛍光検出装置１の各部を制御する。また、コントローラ２０５は、再生回路２０３から出力される再生データ（アドレス情報）と、信号増幅回路２０４から出力された信号に基づいて、蛍光を検出したウエル１３がバイオセンサ基板１０のどの位置にあるかを判定し、蛍光を検出したウエル１３に対応するアドレス情報を内部メモリに保持する。
　図４は、信号演算回路２０１の回路構成を示す図である。
　光検出器１０８は、上述したように受光面上に反射励起光を受光するための４分割センサを有しており、４分割センサの左上、右上、右下、左下のセンサは、それぞれ受光した反射励起光のビームスポットに基づいて検出信号Ｓ１～Ｓ４を出力する。なお、図４の光検出器１０８の受光面上において、ディスクのラジアル方向（径方向）に対応する方向は、左右方向である。また、フォーカスエラー信号ＦＥとトラッキングエラー信号ＴＥは、既存の光ディスク装置において用いられる非点収差法と１ビームプッシュプル法に従って生成される。
　信号演算回路２０１は、加算器３０１～３０４、３０７と、減算器３０５、３０６を備えている。加算器３０１は、検出信号Ｓ１、Ｓ３を加算した信号を減算器３０５に出力し、加算器３０２は、検出信号Ｓ２、Ｓ４を加算した信号を減算器３０５に出力する。加算器３０３は、検出信号Ｓ１、Ｓ４を加算した信号を減算器３０６と加算器３０７に出力し、加算器３０４は、検出信号Ｓ２、Ｓ３を加算した信号を減算器３０６と加算器３０７に出力する。
　減算器３０５は、加算器３０１、３０２の出力信号を減算して、フォーカスエラー信号ＦＥを出力する。減算器３０６は、加算器３０３、３０４の出力信号を減算して、トラッキングエラー信号ＴＥを出力する。加算器３０７は、加算器３０３、３０４の出力信号を加算して、再生ＲＦ信号を出力する。すなわち、フォーカスエラー信号ＦＥと、トラッキングエラー信号ＴＥと、再生ＲＦ信号は、それぞれ以下の式（１）～（３）の演算により取得することができる。
　ＦＥ＝（Ｓ１＋Ｓ３）－（Ｓ２＋Ｓ４）　…（１）
　ＴＥ＝（Ｓ１＋Ｓ４）－（Ｓ２＋Ｓ３）　…（２）
　ＲＦ＝（Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４）　…（３）
　対物レンズ１０６の焦点位置が反射面１１ａに位置付けられているとき、光検出器１０８の４分割センサ上のビームスポットは最小錯乱円となり、上記式（１）のフォーカスエラー信号ＦＥの値が０となる。また、対物レンズ１０６の焦点位置が反射面１１ａのトラック（ピット）の真上に位置付けられているとき、光検出器１０８の４分割センサ上のビームスポットは、左側の２つのセンサと右側の２つのセンサに対して等しく掛かり、上記式（２）のトラッキングエラー信号ＴＥの値が０となる。
　ここで、図３（ａ）、（ｂ）に示すように対物レンズ１０６の焦点位置に試料が位置付けられていても、蛍光検出器１１１に入射する蛍光は、必ずしも試料により生じる蛍光だけに限らない。すなわち、試料に対して光軸方向にずれた位置から生じる、いわゆる自家蛍光も、蛍光検出器１１１に入射する。かかる自家蛍光は、励起光が対物レンズ１０６やバイオセンサ基板１０などの光学部品を通過する際や、励起光の収束位置以外の位置に存在する試料から生じる。自家蛍光が蛍光検出器１１１に入射すると、蛍光検出器１１１の検出精度が低下するとの問題が生じる。
　そこで、本実施例では、アナモレンズ１０９と分光素子１１０を用いて、蛍光検出器１１１に入射する蛍光から励起光の収束位置の試料により生じる蛍光のみを取り出している。以下、図５（ａ）～図８（ｂ）を参照して、かかる技術的原理について説明する。
　図５（ａ）は、蛍光の収束状態を説明する図である。図５（ａ）には、試料から生じる蛍光（以下、「信号光」という）、光軸方向において試料よりも深い位置から生じる蛍光（以下、「迷光１」という）、光軸方向において試料よりも浅い位置から生じる蛍光（以下、「迷光２」という）の収束状態が示されている。
　図５（ｂ）は、アナモレンズ１０９の構成を示す模式図である。アナモレンズ１０９は、レンズ光軸に平行に入射する蛍光に対し、曲面方向と平面方向に収束作用を付与する。ここで、曲面方向と平面方向は、互いに直交している。また、曲面方向は、平面方向に比べ曲率半径が小さく、アナモレンズ１０９に入射する蛍光を収束させる効果が大きい。
　なお、ここでは、アナモレンズ１０９における非点収差作用を簡単に説明するために、便宜上、“曲面方向”と“平面方向”と表現しているが、実際には、レンズ光軸上の互いに異なる位置に焦線を結ぶ作用がアナモレンズ１０９によって生じれば良く、図５（ｂ）中の“平面方向”におけるアナモレンズの形状は平面として図示されていない。なお、本実施例では、アナモレンズ１０９に対して蛍光が平行光で入射することが想定されているが、アナモレンズ１０９に収束状態で蛍光が入射する場合には、“平面方向”におけるアナモレンズ１０９の形状は直線状（曲率半径＝∞）であっても良い。また、アナモレンズ１０９は、たとえば、シリンドリカルレンズと集光レンズなどの複数のレンズにて構成されても良い。
　図５（ａ）を参照して、アナモレンズ１０９によって収束させられた信号光は、曲面方向および平面方向の収束により、それぞれ異なる位置で焦線を結ぶ。曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ０２）は、平面方向の収束による焦線位置（Ｐ０３）よりも、アナモレンズ１０９に近い位置となり、信号光の収束位置（Ｐ０１）は、曲面方向および平面方向の収束による焦線位置（Ｐ０２）、（Ｐ０３）の中間位置となる。励起光が合焦状態にあるとき、信号光のビームは、収束位置（Ｐ０１）において最小錯乱円となる。この収束位置（Ｐ０１）に、蛍光検出器１１１の受光面が、アナモレンズ１０９に入射する蛍光の光軸に垂直になるよう配されている。
　アナモレンズ１０９によって収束させられた迷光１についても同様に、曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ１２）は、平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）よりも、アナモレンズ１０９に近い位置となる。アナモレンズ１０９は、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）が、信号光の収束位置（Ｐ０１）よりも、アナモレンズ１０９に近い位置となるよう設計されている。
　アナモレンズ１０９によって収束させられた迷光２についても同様に、曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ２２）は、平面方向の収束による焦線位置（Ｐ２３）よりも、アナモレンズ１０９に近い位置となる。アナモレンズ１０９は、迷光２の曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ２２）が、信号光の収束位置（Ｐ０１）よりも、アナモレンズ１０９から遠い位置となるよう設計されている。
　以上を考慮して、蛍光検出器１１１の受光面上における信号光および迷光１、２の光束領域の関係について説明する。
　図６（ａ）は、アナモレンズ１０９に入射する蛍光に設定された４つの光束領域ｆ１～ｆ４を示す図である。なお、図６（ａ）は、アナモレンズ１０９に入射する進行方向に蛍光を見た場合の図である。
　この場合、光束領域ｆ１～ｆ４を通る信号光は、受光面上において、図６（ｂ）のように分布する。また、光束領域ｆ１～ｆ４を通る迷光１は、受光面上において、図６（ｃ）のように分布する。光束領域ｆ１～ｆ４を通る迷光２は、受光面上において、図６（ｄ）のように分布する。なお、図６（ｂ）～（ｄ）には、信号光のビーム径の大きさを示す円が実線で示されており、図６（ｃ）、（ｄ）に示すように、迷光１、２は信号光に比べて大きく広がっている。
　ここで、蛍光検出器１１１の受光面上における信号光と迷光１、２を光束領域毎に取り出すと、各光の分布は、図７（ａ）～（ｄ）のようになる。この場合、各光束領域を通る信号光には、同じ光束領域を通る迷光１および迷光２の何れも重ならない。このため、各光束領域を通る信号光と迷光１、２を異なる方向に離散させた後に、信号光のみをセンサにて受光するように構成すると、対応するセンサには信号光のみが入射し、迷光の入射を抑止することができる。これにより、迷光による検出信号の劣化を回避することができる。
　このように、光束領域ｆ１～ｆ４を通る光を分散させて受光面上において離間させることにより、信号光のみを取り出すことができる。本実施例は、この原理を基盤とするものである。
　図８（ａ）は、光束領域ｆ１～ｆ４を通る蛍光（信号光と迷光１、２）を面Ｐ０上において離間させるために、各光束領域を通る蛍光の進行方向に付与するベクトルを示す図である。
　光束領域ｆ１～ｆ４を通る蛍光の進行方向は、それぞれ、ベクトルＶ１～Ｖ４が付与されることにより変化する。ベクトルＶ１～Ｖ４の方向は、平面方向と曲面方向に対して、それぞれ、４５度の傾きを持っており、且つ全て異なっている。ベクトルＶ１～Ｖ４の大きさは、全て同じである。ベクトルＶ１～Ｖ４の大きさは、これらベクトルが付与される前の蛍光の進行方向（アナモレンズ１０９入射時の進行方向）に対する角度として規定される。
　図８（ａ）に示すように進行方向が変化されると、光束領域ｆ１～ｆ４を通る蛍光（信号光と迷光１、２）は、受光面上において、図８（ｂ）に示すように照射される。ベクトルＶ１～Ｖ４を調節することにより、受光面上において、図８（ｂ）に示すように各光束領域を通る信号光と迷光１、２を分布させることができる。この場合、光束領域ｆ１～ｆ４を通る蛍光（信号光）の照射領域は、これら４つの照射領域のみが存在する直方形（信号光領域）の頂角に位置付けられる。
　このように、図５（ａ）～図８（ｂ）に示す原理に基づけば、蛍光検出器１１１の受光面上に蛍光（信号光）の照射領域のみが存在する信号光領域を設けることができる。よって、この領域に蛍光（信号光）を受光するためのセンサを配置すれば、試料によって生じた蛍光のみを受光することができる。
　図９（ａ）～（ｃ）は、分光素子１１０の構成例を示す図である。図９（ａ）は、回折パターンを有するホログラム素子によって分光素子１１０を構成する場合の構成例を示しており、図９（ｂ）、（ｃ）は、多面プリズムによって分光素子１１０を構成する場合の構成例を示している。なお、図９（ａ）、（ｃ）は、分光素子１１０をアナモレンズ１０９側から見たときの平面図である。
　図９（ａ）に示す構成例の場合、分光素子１１０は、正方形の輪郭を有する透明板にて形成され、光入射面にブレーズ型の回折パターン（回折ホログラム）が形成されている。分光素子１１０の光入射面は、４つの回折領域Ｈ１１～Ｈ１４に区分されている。これら回折領域Ｈ１１～Ｈ１４に、それぞれ、図８（ａ）の光束領域ｆ１～ｆ４を通る蛍光が入射するよう、分光素子１１０が配される。
　回折領域Ｈ１１～Ｈ１４は、各回折領域に入射する蛍光から、回折作用により＋１次回折光を生じさせる。回折領域Ｈ１１～Ｈ１４に入射する蛍光の＋１次回折光は、実線の矢印（Ｖ１～Ｖ４）の方向に回折される。また、回折領域Ｈ１１～Ｈ１４により蛍光に付与される回折の方向と大きさが、ベクトルＶ１～Ｖ４で示されている。回折領域Ｈ１１～Ｈ１４により生じる＋１次回折光の進行方向は、各回折領域に入射する前の蛍光の進行方向にベクトルＶ１～Ｖ４を付与したものとなる。
　なお、ベクトルＶ１～Ｖ４の方向は、各回折領域に設定される回折パターンの向きによって設定され、ベクトルＶ１～Ｖ４の大きさは、各回折領域に設定される回折パターンのピッチによって設定される。また、回折領域Ｈ１１～Ｈ１４の回折効率は互いに同じである。
　図９（ｂ）、（ｃ）に示す構成例の場合、分光素子１１０は、光出射面が平坦で、且つ、光入射面が４つの傾斜面Ｌ１１～Ｌ１４において互いに異なる方向に傾斜する透明体（多面プリズム）によって形成されている。傾斜面Ｌ１１～Ｌ１４に入射する蛍光の進行方向は、各傾斜面に入射する際の屈折作用により、図９（ａ）の場合と同様、各傾斜面に入射する前の蛍光の進行方向にベクトルＶ１～Ｖ４を付与したものとなる。
　図９（ｄ）～（ｆ）は、蛍光検出器１１１の受光面上に配されるセンサの構成例を示す図である。
　図９（ｄ）に示す構成例の場合、三角形状を有する４つのセンサＳ１１～Ｓ１４が、図８（ｂ）に示す信号光領域内に位置付けられた各信号光を受光するように配される。コントローラ２０５は、センサＳ１１～Ｓ１４の検出信号を加算した加算信号に基づいて、励起光のスポット位置にマラリア原虫が位置付けられているかを判定する。
　図９（ｅ）に示す構成例の場合、図８（ｂ）に示す信号光領域の形状と略同じ矩形形状を有すると共に、中心付近に穴Ｓ１５ａを有するセンサＳ１５が、信号光領域内に配される。また、図９（ｆ）に示す構成例の場合、信号光領域の形状と略同じ矩形形状を有するセンサＳ１６が、信号光領域内に配される。図９（ｅ）、（ｆ）の構成例においても、コントローラ２０５は、センサの検出信号に基づいて励起光のスポット位置にマラリア原虫が位置付けられているかを判定する。
　以上、本実施例によれば、蛍光検出器１１１の受光面上に、図８（ｂ）に示すように蛍光（信号光）の照射領域が位置付けられるため、これら照射領域によって形成される信号光領域に図９（ｄ）～（ｆ）に示すようにセンサを配置することにより、試料によって生じた蛍光（信号光）のみを受光することができる。これにより、自家蛍光の影響を低く抑えながら、精度良く試料を測定することができる。
　なお、上記原理による効果は、図５（ａ）に示すように、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）が、信号光の収束位置（Ｐ０１）よりもアナモレンズ１０９に接近した位置にあり、且つ、迷光２の曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ２２）が、信号光の収束位置（Ｐ０１）よりもアナモレンズ１０９から離れた位置にあるときに奏され得るものである。すなわち、この関係が満たされていれば、信号光と迷光１、２の分布は上記図８（ｂ）に示す状態となり、蛍光検出器１１１の受光面において、信号光と迷光１、２が重なり合わないようにすることができる。換言すれば、この関係が満たされる限り、たとえ、焦線位置（Ｐ０２）よりも焦線位置（Ｐ１３）が受光面に接近し、あるいは、焦線位置（Ｐ０３）よりも焦線位置（Ｐ２２）が受光面に接近したとしても、上記原理に基づく効果は奏され得る。
　たとえば、バイオセンサ基板１０に入射する励起光の光軸方向において、自家蛍光（迷光１、２）が生じる位置が、蛍光を発する試料の位置に近づくと、図５（ａ）において収束位置（Ｐ１１、Ｐ２１）が、収束位置（Ｐ０１）に近づくことになる。この場合、図８（ｂ）に示すように信号光領域の外側に自家蛍光（迷光１、２）が位置付けられるためには、上述したように焦線位置（Ｐ１３）が収束位置（Ｐ０１）よりもアナモレンズ１０９に接近した位置にあり、焦線位置（Ｐ２２）が収束位置（Ｐ０１）から離れた位置にあれば良い。
　＜実施例２＞
　上記実施例１では、図９（ａ）、（ｃ）に示す分光素子１１０が用いられたが、本実施例では、分光素子１１０に替えて分光素子１１３が用いられる。以下、図１０（ａ）～図１１（ｄ）を参照して、分光素子１１３を用いる場合の技術的原理について説明する。
　図１０（ａ）は、蛍光の収束状態を説明する図である。図１０（ａ）には、図５（ａ）と同様の収束状態に、本実施例の分光素子１１３が併せて示されている。分光素子１１３は、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）と、信号光の曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ０２）の間に配置される。本実施例においても、上記実施例と同様、図１０（ｂ）に示すアナモレンズ１０９が用いられる。
　なお、上記のとおり、迷光１の焦線位置（Ｐ１３）は、光軸方向における自家蛍光の深さ位置によって光軸方向に変化する。このため、分光素子１１３は、なるべく信号光の焦線位置（Ｐ０２）に接近させて配置するのが望ましい。なお、迷光１の焦線位置（Ｐ１３）が信号光の焦線位置（Ｐ０２）よりも収束位置（Ｐ０１）側に有る場合、本実施例では、信号光を迷光から分離することができない。すなわち、本実施例は、迷光１の焦線位置（Ｐ１３）が信号光の焦線位置（Ｐ０２）に対して収束位置（Ｐ０１）から離れる方向に有る場合に、迷光の除去作用を発揮するものである。したがって、除去される迷光の範囲が、上記実施例１よりも制限される。
　図１０（ｃ）は、分光素子１１３の形状を示す斜視図であり、図１０（ｄ）は、光入射側から見た、分光素子１１３を示す図である。分光素子１１３は、光出射面が平坦で、且つ、光入射面が２つの傾斜面Ｌ２１、Ｌ２２において互いに異なる方向に傾斜する透明体（多面プリズム）によって形成されている。
　傾斜面Ｌ２１、Ｌ２２の境界は、光入射側から見た場合、平面方向に平行な直線となっている。傾斜面Ｌ２１、Ｌ２２に入射する蛍光の進行方向は、各傾斜面に入射する際の屈折作用により、各傾斜面に入射する前の蛍光の進行方向にベクトルＶａ、Ｖｂを付与したものとなる。ベクトルＶａ、Ｖｂの方向は曲面方向に平行であり、互いに異なっている。ベクトルＶａ、Ｖｂの大きさは同じである。ベクトルＶａ、Ｖｂの大きさは、これらベクトルが付与される前の蛍光の進行方向（アナモレンズ１０９入射時の進行方向）に対する角度として規定される。
　図１１（ａ）は、アナモレンズ１０９、分光素子１１３、蛍光検出器１１１の各位置における蛍光の光束領域の状態を模式的に示す図である。ここでは、図１１（ａ）の（０）に示すように、便宜上、アナモレンズ１０９に入射する際の蛍光（信号光と迷光１、２）の光束領域のうち、平面方向に平行な直線で２分割したときの、左上の光束領域と右下の光束領域を、それぞれ、光束領域Ａと光束領域Ｂと称する。図１１（ａ）の（１）～（９）には、蛍光（信号光と迷光１、２）に設定された光束領域Ａ、Ｂが、分光素子１１３と蛍光検出器１１１において、どのように分布するかが示されている。
　以下、図１１（ａ）とともに図１０（ａ）の蛍光の収束状態を参照しながら、各位置における光束領域の状態を説明する。
　まず、蛍光（信号光と迷光１、２）が分光素子１１３に入射するときの光束領域の状態について説明する。
　蛍光（迷光１）は、アナモレンズ１０９の透過後、分光素子１１３に入射するまでの間に、曲面方向、平面方向の順に収束され焦線を結ぶ。このときの焦線は、それぞれ平面方向、曲面方向に細長い形状となる。これにより、図１１（ａ）の（０）に示す迷光１の光束領域Ａ、Ｂは、図１０（ａ）に示す焦線位置（Ｐ１２）を通過した後、平面方向に平行な直線を対称軸として反転される。続いて、迷光１の光束領域Ａ、Ｂは、図１０（ａ）に示す焦線位置（Ｐ１３）を通過した後、曲面方向に平行な直線を対称軸として反転される。このとき、迷光１の光束領域Ａ、Ｂの状態は変化しない。よって、分光素子１１３での迷光１の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（１）に示す状態となる。
　蛍光（信号光）は、アナモレンズ１０９の透過後、分光素子１１３に入射するまでの間に、平面方向と曲面方向ともに焦線を結ばない。よって、分光素子１１３での信号光の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（０）に示す状態と同様、図１１（ａ）の（２）に示す状態となる。
　蛍光（迷光２）は、信号光と同様、アナモレンズ１０９の透過後、分光素子１１３に入射するまでの間に、平面方向と曲面方向ともに焦線を結ばない。よって、分光素子１１３での迷光２の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（０）に示す状態と同様、図１１（ａ）の（３）に示す状態となる。
　ここで、分光素子１１３の機能および作用を説明するために、まず、分光素子１１３が配されていない場合（比較例）に、蛍光（信号光と迷光１、２）が、蛍光検出器１１１にどのような状態で入射するかについて説明する。
　蛍光（迷光１）は、分光素子１１３の通過後、蛍光検出器１１１に入射するまでの間に、平面方向および曲面方向ともに焦線を結ばない。よって、蛍光検出器１１１での迷光１の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（１）に示す状態と同様、図１１（ａ）の（４）に示す状態となる。
　蛍光（信号光）は、分光素子１１３の通過後、蛍光検出器１１１に入射するまでの間に、曲面方向に焦線を結ぶが、平面方向に焦線を結ばない。これにより、図１１（ａ）の（２）に示す信号光の光束領域Ａ、Ｂは、図１０（ａ）に示す焦線位置（Ｐ０２）を通過した後、平面方向に平行な直線を対称軸として反転される。よって、蛍光検出器１１１での信号光の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（５）に示す状態となる。
　蛍光（迷光２）は、分光素子１１３の通過後、蛍光検出器１１１に入射するまでの間に、平面方向と曲面方向ともに焦線を結ばない。よって、蛍光検出器１１１での迷光２の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（３）に示す状態と同様、図１１（ａ）の（６）に示す状態となる。
　次に、本実施例のように、分光素子１１３が配されている場合に、蛍光（信号光と迷光１、２）が、蛍光検出器１１１にどのような状態で入射するかについて説明する。この場合、分光素子１１３に入射する際の左上の光束領域と右下の光束領域を通る蛍光（信号光と迷光１、２）の進行方向には、図１０（ｄ）に示す分光素子１１３の分光作用により、それぞれ、左上方向と右下方向の成分が加えられる。
　図１１（ａ）の（１）に示す光束領域Ａ、Ｂを通る迷光１の進行方向には、それぞれ、右下方向と左上方向の成分が加えられる。これにより、蛍光検出器１１１での迷光１の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（４）に示す比較例の状態から、それぞれ、右下方向と左上方向に移動され、図１１（ａ）の（７）に示す状態となる。
　図１１（ａ）の（２）に示す光束領域Ａ、Ｂを通る信号光の進行方向には、それぞれ、左上方向と右下方向の成分が加えられる。これにより、蛍光検出器１１１での信号光の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（５）に示す比較例の状態から、それぞれ、左上方向と右下方向に移動され、図１１（ａ）の（８）に示す状態となる。
　図１１（ａ）の（３）に示す光束領域Ａ、Ｂを通る迷光２の進行方向には、それぞれ、左上方向と右下方向の成分が加えられる。これにより、蛍光検出器１１１での迷光２の光束領域Ａ、Ｂは、図１１（ａ）の（６）に示す比較例の状態から、それぞれ、左上方向と右下方向に移動され、図１１（ａ）の（９）に示す状態となる。
　なお、蛍光検出器１１１での蛍光（信号光と迷光１、２）の光束領域Ａ、Ｂの分布については、以下のように考えることもできる。
　図１１（ｂ）、（ｃ）は、比較例の場合に、蛍光検出器１１１での蛍光（信号光と迷光１、２）の光束領域を重ねて示す図である。図１１（ｂ）は、分光素子１１３に入射する際に左上の光束領域を通った蛍光のみの分布を示す図であり、図１１（ｃ）は、分光素子１１３に入射する際に右下の光束領域を通った蛍光のみの分布を示す図である。
　図１１（ｂ）に示すように、迷光１の光束領域Ｂと、迷光２の光束領域Ａと、信号光の光束領域Ａは、分光素子１１３の分光作用により、何れもベクトルＶａの方向（左上方向）に移動される。また、図１１（ｃ）に示すように、迷光１の光束領域Ａと、迷光２の光束領域Ｂと、信号光の光束領域Ｂは、分光素子１１３の分光作用により、何れもベクトルＶｂの方向に（右下方向）に移動させられる。
　こうして、移動させられた蛍光の光束領域は、図１１（ｄ）に示す状態となる。このとき、蛍光検出器１１１の中心近傍には、信号光の光束領域Ａ、Ｂのみが分布する信号光領域を設けることができる。
　図１２（ａ）は、分光素子１１３の他の構成例である。この場合の分光素子１１３は、正方形の輪郭を有する透明板にて構成され、光入射面にブレーズ型の回折パターン（回折ホログラム）が形成されている。分光素子１１３の光入射面は、２つの回折領域Ｈ２１、Ｈ２２に区分されている。この場合も、図１０（ｃ）、（ｄ）に示した分光素子１１３の構成例と同様、図１１（ｄ）に示すように蛍光（信号光と迷光１、２）の光束領域Ａ、Ｂを分布させることができる。
　図１２（ｂ）、（ｃ）は、蛍光検出器１１１の受光面上に配されるセンサの構成例を示す図である。
　図１２（ｂ）に示す構成例の場合、三角形状を有する２つのセンサＳ２１、Ｓ２２が、図１１（ｄ）に示す信号光領域内に位置付けられた信号光を受光するように配される。この場合、コントローラ２０５は、センサＳ２１、Ｓ２２の検出信号を加算した加算信号に基づいて、励起光のスポット位置にマラリア原虫が位置付けられているかを判定する。図１２（ｃ）に示す構成例の場合、図１１（ｄ）に示す信号光領域の形状と略同じ矩形形状を有するセンサＳ２３が、信号光領域内に配される。この場合、コントローラ２０５は、センサＳ２３の検出信号に基づいて、励起光のスポット位置にマラリア原虫が位置付けられているかを判定する。このようにセンサＳ２１、Ｓ２２、Ｓ２３を配置することにより、本実施例においても、試料によって生じた蛍光（信号光）のみを受光することができる。このため、自家蛍光などの影響を低く抑えながら、精度良く試料を測定することができる。
　なお、本実施例では、図１３（ａ－１）、（ｂ－１）に示すように、比較例の場合の蛍光検出器１１１での蛍光の光束領域が、左上方向と右下方向、すなわち、分光素子１１３の分光作用によるベクトルＶａ、Ｖｂの方向に移動させられた。これにより、本実施例では、図１３（ｃ－１）に示すように光束領域が位置付けられた。
　しかしながら、ベクトルＶａ、Ｖｂの方向は、左上方向と右下方向に限らず、図１３（ａ－２）、（ｂ－２）に示すように左方向と右方向でも良く、図１３（ａ－３）、（ｂ－３）に示すように上方向と下方向であっても良い。これらの場合も、図１３（ｃ－２）、（ｃ－３）に示すように、中心近傍に信号光の光束領域Ａ、Ｂのみが分布する矩形状の信号光領域を設けることができる。
　さらに、ベクトルＶａ、Ｖｂの方向は、何れも平面方向または曲面方向に平行な方向であり、且つ、ベクトルＶａ、Ｖｂの大きさは互いに異なっていても良い。または、図１０（ｄ）に示す分光素子１１３の傾斜面Ｌ２１、Ｌ２２のうち、何れか一方が傾斜を有しない平坦な面とし、分光素子１１３に入射する蛍光のうち、傾斜面Ｌ２１、Ｌ２２に入射する何れかの蛍光のみに屈折作用が働くようにしても良い。同様に、図１２（ａ）に示す分光素子１１３の回折領域Ｈ２１、Ｈ２２のうち、何れか一方が回折パターンを有しない領域とし、分光素子１１３に入射する蛍光のうち、回折領域Ｈ２１、Ｈ２２に入射する何れかの蛍光のみに回折作用が働くようにしても良い。また、光束領域Ａ、Ｂを通る信号光は、受光面上において、必ずしも分離されている必要はなく、互いに重なっても良い。このように、分光素子１１３は、蛍光検出器１１１の受光面上において、信号光に迷光１、２が掛からないように構成されれば良い。
　以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上記実施の形態に何ら制限されるものではなく、また、本発明の実施の形態も上記以外に種々の変更が可能である。
　たとえば、上記実施の形態では、ウエル１３に赤血球を収容させて、赤血球がマラリア原虫に感染しているか否かが判定されたが、ウエル１３に収容させる試料および判定対象となる事象は、これに限られない。
　たとえば、特定の遺伝子を発現している細胞や、核酸、タンパク質、脂質、糖等の生体物質が通常より過剰である、または不足している細胞を、特定の細胞として種々の細胞群から検出しても良い。あるいは、逆に細胞群の中から正常に機能している細胞を、特定の細胞として検出しても良い。これは、例えば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の未分化状態から分化状態への誘導において、正常に分化した細胞を検出する目的で使われる。このような特定の細胞は自然界に存在する細胞であってもよいし、人為的処理が施された細胞であってもよい。自然界に存在する細胞としては、特に限定されないが、たとえば病原細胞、病変細胞、病原菌または病原生物に感染された細胞、突然変異した細胞、特定の性質を有する未知の細胞等が挙げられる。また、人為的処理は、特に限定されないが、たとえば物理的処理（例：電磁波照射）、化学的処理（例：薬剤処理）、遺伝子工学的処理（例：遺伝子組み換え処理）等が挙げられる。
　また、このような人為的処理のうち、細胞に与える影響が既知である処理を細胞群に施し、当該影響が表れない細胞または当該影響がより強く表れる細胞を特定の細胞として検出することもできる。たとえば、薬剤処理へ耐性または高感受性を示す細胞を特定の細胞として検出することができる。
　また、細胞群の種類も特に限定はされるものではない。単細胞生物の群の他、多細胞生物由来の細胞の群であってもよい。多細胞生物由来の細胞としては、たとえば生物の正常組織または病態組織から得られた細胞や、これらの細胞に由来する培養細胞等が挙げられる。また、これらの細胞を得る生物も、特に限定されない。たとえば、動物から採取した細胞または植物から採取した細胞であってよい。より具体的には、たとえば脊椎動物（特に哺乳類及び鳥類）から採取した細胞、昆虫から採取した細胞、植物培養細胞等を検出対象の細胞として挙げることができるが、検出対象の細胞はこれらに限定されるものではない。また、同一の細胞の群であっても、複数種の細胞が混在する群であってもよい。
　また、上記実施の形態において、バイオセンサ基板１０を回転装置１２３により回転させる際に、ウエル１３の上部にふたを設けても良い。これにより、ウエル１３からの試料の不所望な流出（意図しない流出）、蒸発または移動を防ぐことができる。
　また、上記実施の形態では、反射膜１４上に配置されたウエル層１２に底面部１３ａを有するウエル１３を備えた構成を記載したが、ウエル１３の底面部１３ａが反射膜１４の上面となる構成としても良い。即ち、図１４（ａ）に示すように、ウエル１３はウエル層１２の貫通穴で構成され、反射膜１４上に形成されている。また、ウエル１３を用いずに、図１４（ｂ）に示すように、反射膜１４上に試料を固定する構成でも良く、図１４（ｃ）に示すように、反射膜１４上に形成された層１５上に試料を固定する構成でも良い。図１４（ｂ）、（ｃ）に示す構成の場合、固定する箇所には、何らかの吸着作用のある構造を設けることができる。例えば、図１４（ｂ）の場合は反射膜１４上に、図１４（ｃ）の場合は層１５上にヒドロキシル（ＯＨ）基を豊富に持つ分子層を形成することで試料の吸着が促進される。
　また、上記実施の形態では、ウエル１３の底面部１３ａに並列的に配された試料に対して、励起光を収束させ、それらの試料からの蛍光を検出した。しかしながら、図１５（ａ）に示すようにウエル１３内に試料が多重に重なって配されている場合、底面部１３ａに接触している試料の層以外の層（１つ上の層等）に励起光を収束させることにより、その層の試料からの蛍光を他の層の試料からの蛍光と区別して検出してもよい。これにより、底面部１３ａに接触している試料のみでなく、同一ウエル１３内のそれ以外の試料についても蛍光の検出を行うことができるため、蛍光検出処理のスループットを向上することができる。
　なお、底面部１３ａに接触している試料の層以外の層（１つ上の層等）に励起光を収束させる方法としては、対物レンズアクチュエータ１２２に出力されるオフセット電圧を調整する方法等がある。また、サーボ信号を生成するためのレーザ光を出射する半導体レーザと、励起光を出射する半導体レーザとをそれぞれ配する構成において、サーボ信号を生成するためのレーザ光の収束位置よりも遠くに励起光の収束位置を設定する方法等がある。
　また、底面部１３ａに接触している試料の層以外の層（１つ上の層等）からの蛍光を信号光として取得する方法として、アナモレンズ１０９を蛍光の光軸方向にシフトさせる方法がある。この場合、図１５（ｂ）、（ｃ）に示すように、蛍光検出装置１には、アナモレンズ１０９を支持すると共に、アナモレンズ１０９を光軸方向に移動可能にするレンズアクチュエータ１２０が設置される。レンズアクチュエータ１２０には、アナモレンズ１０９を駆動するためのモータ１２０ａが配置されている。このレンズアクチュエータ１２０を制御してアナモレンズ１０９を光軸方向にシフトさせると、励起光のバイオセンサ基板１０における焦点位置はそのままで、蛍光検出器１１１側の焦点位置のみを調整することができる。
たとえば、図１５（ｂ）のように深さ位置ＤＰ１からの蛍光（信号光）が蛍光検出器１１１の受光面上の信号光領域に照射される状態から、アナモレンズ１０９を図１５（ｃ）の位置に変位させると、深さ位置ＤＰ１より奥の深さ位置ＤＰ２からの蛍光（信号光）が蛍光検出器１１１の受光面上の信号光領域に照射されるようになる。図１５（ｂ）の状態からアナモレンズ１０９を図１５（ｃ）と反対方向に変位させると、深さ位置ＤＰ１よりも浅い位置からの蛍光（信号光）が蛍光検出器１１１の受光面上の信号光領域に照射されるようになる。このように、アナモレンズ１０９の位置を調整することにより、図１５（ａ）のように試料が多重に重なっていても、検出目標の層からの蛍光を検出することができる。
　この構成によれば、励起光の焦点位置をずらす必要がないため、反射励起光を受光する光検出器１０８の検出信号に基づいて安定したフォーカス制御が可能となる。ただし、励起光は反射面１１ａに収束されるため、ウエル１３の底面部１３ａから離れるに従って励起光が広がることとなる。このため、ウエル１３の底面部１３ａから離れた層の試料には広がった状態で励起光が照射されることとなり、その分、発生する蛍光が弱くなる。よって、試料の積層数が多い場合には、適宜、上記のように、オフセット電圧を調整して、励起光の焦点位置を反射面１１ａからウエル１３方向にシフトさせるようにすると良い。また、このようにして得られた複数の層からの情報を重ね合わせることで、立体的な分布情報として取り扱うことが可能になる。そのため、少量のサンプルであっても多くの試料を検査できる。
　また、上記実施の形態では、ＰＢＳ１０２と１／４波長板１０４が用いられたが、１／４波長板１０４を省略して、ＰＢＳ１０２に替えてビームスプリッタ（ＢＳ）が配置されても良い。
　また、上記実施の形態では、１つの半導体レーザ１０１から出射された励起光を、反射膜１４に照射して対物レンズ１０６を制御するためのサーボ信号を生成すると共に、試料に照射して蛍光を生じさせた。しかしながら、これに限らず、サーボ信号を生成するためのレーザ光を出射する半導体レーザと、蛍光を生じさせるための励起光を出射する半導体レーザが、蛍光検出装置１内に別々に配されても良い。
　また、上記実施例１では、分光素子１１０は、アナモレンズ１０９と蛍光検出器１１１との間に配されたが、ダイクロイックプリズム１０５とアナモレンズ１０９との間に配されても良い。また、分光素子１１０に、励起光に対しては分光作用を付与せず蛍光に対してのみ分光作用を付与する波長選択性を持たせる場合、かかる分光素子１１０は、対物レンズ１０６とダイクロイックプリズム１０５との間に配されても良い。
　また、上記実施例１では、図８（ｂ）に示すように、信号光の照射領域は受光面上において互いに分離されていたが、必ずしも分離されている必要はなく、互いに重なっても良い。
　また、上記実施例１では、分光素子１１０の光入射面にはブレーズ型の回折パターンが形成されたが、これに限らず、ステップ型の回折パターンが形成されても良い。この場合、回折領域Ｈ１１～Ｈ１４の回折作用により、各回折領域に入射する蛍光から＋１次回折光と－１次回折光が生じる。このとき、信号光の＋１次回折光と－１次回折光のうち何れか一方が信号光領域内に含まれ、他方は、信号光領域の外側に導かれることとなる。このため、試料によって生じる蛍光のセンサによる受光光量は、上記実施例１の半分になる。したがって、蛍光の受光光量の点からは、上記実施例１のように、分光素子１１０に形成される回折パターンをブレーズ型とするのが望ましい。
　また、上記実施例２では、分光素子１１３は、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）と、信号光の曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ０２）の間に設置されたが、分光素子１１３は、迷光１の曲面方向の収束による焦線位置（Ｐ１２）と、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）の間に設置されても良い。この場合、図１０（ａ）の場合と異なり、迷光１の平面方向の収束による焦線位置（Ｐ１３）と分光素子１１３の位置関係が逆になるものの、各位置における光束領域の分布は、図１１（ａ）と全く同じになる。
　また、上記実施の形態では、ダイクロイックプリズム１０５により、バイオセンサ基板１０からの反射励起光と蛍光が分離されたが、他の方法によって反射励起光と蛍光が分離されても良い。
　図１６は、他の方法によって反射励起光と蛍光を分離する場合の蛍光検出装置２の構成を示す図である。蛍光検出装置２では、ＰＢＳ１０２の替わりにＰＢＳ１３１が配され、ダイクロイックプリズム１０５の替わりに反射ミラー１３２が配され、光検出器１０８の替わりに光検出器１３３が配され、アナモレンズ１０７と蛍光検出器１１１が省略されている。また、上記実施の形態の分光素子１１０または分光素子１１３が省略され、分光素子１３４が、アナモレンズ１０９と光検出器１３３との間に配されている。さらに、アパーチャ１１２が省略され、ホルダ１２１には、対物レンズ１０６の反射ミラー１３２側に円形のアパーチャ１３５が配されている。ＰＢＳ１３１は、ＰＢＳ１０２と異なり、励起光に作用し、蛍光には作用しない波長選択性のＰＢＳからなっている。すなわち、励起光は、偏光方向に応じてＰＢＳ１３１を透過または反射し、蛍光は、偏光方向に関係なく全てがＰＢＳ１３１を透過する。アパーチャ１３５も、波長選択性を有しており、励起光に対しては所定の周辺部を遮光し、蛍光は、全てを透過する。
　この場合、上記実施の形態と同様、半導体レーザ１０１から出射された励起光はＰＢＳ１３１によって反射され、コリメータレンズ１０３側からＰＢＳ１３１に入射する反射励起光は、ＰＢＳ１３１を透過する。反射ミラー１３２側からアパーチャ１３５に入射する励起光は、アパーチャ１３５により所定径となる。対物レンズ１０６側からアパーチャ１３５に入射する蛍光は、アパーチャ１３５を透過して反射ミラー１３２に入射する。反射ミラー１３２に入射する蛍光は、反射ミラー１３２によって反射され、１／４波長板１０４と、コリメータレンズ１０３と、ＰＢＳ１３１と、アナモレンズ１０９を透過する。
　分光素子１３４は、反射励起光に回折作用を付与せず、蛍光のみに回折作用を付与する波長依存性を有している。分光素子１３４は、上記実施例１の分光素子１１０または上記実施例２の分光素子１１３と同様の分光作用を蛍光に付与し、さらに、入射する蛍光を図１６の上方向に分光させて反射励起光から分離する分光作用を蛍光に付与する。なお、反射励起光の起点（反射面１１ａ）と蛍光の起点（試料）との差異、および、反射励起光と蛍光に対する光学部材における色収差に基づき、蛍光は、光検出器１３３の受光面上において、デフォーカス状態となってしまう。分光素子１３４は、上述の分光作用に加え、このデフォーカスを吸収するレンズ作用（回折作用）を有している。すなわち、分光素子１３４は、試料からの蛍光の収束位置（Ｐ０１：図５（ａ）、図１０（ａ）参照）が光検出器１３３の受光面に一致するよう、蛍光にレンズ作用を付与する。これにより、光検出器１３３の受光面上において、反射励起光の照射位置よりも図１６の上方向に、図８（ｂ）と同様の照射領域または図１１（ｄ）と同様の光束領域が位置付けられる。そして、光検出器１３３の受光面上には、図４に示すような４分割センサと、かかる４分割センサよりも図１６の上方向に、上記実施の形態と同様の信号光を受光するためのセンサが位置付けられる。
　光検出器１３３は、反射励起光に基づく検出信号を信号演算回路２０１に出力し、蛍光に基づく検出信号を信号増幅回路２０４に出力する。これにより、蛍光検出装置２においても、上記実施の形態と同様、自家蛍光の影響を低く抑えながら、精度良く試料を測定することができる。
　なお、図１６に示す構成では、励起光のビーム径を規定するためのアパーチャ１３５がホルダ１２１に設置されたが、これに替えて、コリメータレンズ１０３の出射側にアパーチャを設置し、このアパーチャに偏光選択性と波長選択性を持たせても良い。なお、このように、コリメータレンズ１０３の出射側にアパーチャを配置すると、対物レンズ１０６に向かう励起光の光束が固定されるため、トラッキング制御等において、対物レンズ１０６がトラッキング方向に変位すると、励起光の光束が対物レンズ１０６の中心からずれてしまい、励起光の光学特性が劣化する惧れがある。よって、この問題を回避するためには、図１４のように、アパーチャ１３５を対物レンズ１０６の入射側に配置し、アパーチャ１３５と対物レンズ１０６とを一体的に移動させるのが望ましい。
　また、上記実施の形態では、ディスク状の担体に試料が保持されたが、試料を保持する担体はこれに限られるものではなく、たとえば、方形形状の輪郭を有するカード状の担体に試料が保持されても良い。この場合、カードは、ウエルとトラックが一方向に直線状に並ぶよう構成され、蛍光検出装置は、対物レンズ１０６に対してカードをトラックに平行な方向に相対的に移動させながら、励起光でトラックを走査するよう構成される。
　この他、本発明の実施の形態は、特許請求の範囲に示された技術的思想の範囲内において、適宜、種々の変更が可能である。
　　１、２　…　蛍光検出装置
　　１０　…　バイオセンサ基板（試料保持担体）
　　１１ａ　…　反射面
　　１３　…　ウエル（試料収容部）
　　１０１　…　半導体レーザ（光源）
　　１０６　…　対物レンズ
　　１０９　…　アナモレンズ（非点収差素子）
　　１１０、１１３、１３４　…　分光素子
　　１１１　…　蛍光検出器（光検出器）
　　１３３　…　光検出器
　　Ｓ１１～Ｓ１６、Ｓ２１～Ｓ２３　…　センサ（受光部）

Claims (8)

  1. 　蛍光標識が施された試料を保持する試料保持担体に対し照射光を照射するとともに、当該照射光の照射により試料から生じる蛍光を検出する蛍光検出装置において、
    　前記照射光を出射する光源と、
    　前記照射光を前記試料保持担体上の前記試料に収束させる対物レンズと、
    　前記試料保持担体から前記対物レンズに入射し前記対物レンズを透過した蛍光に非点収差を導入する非点収差素子と、
    　前記蛍光を複数の光束に分離する分光素子と、
    　前記分光素子によって分離された前記光束を受光する蛍光検出器と、を備え、
    　前記分光素子は、前記蛍光検出器の受光面上において、前記試料の位置から生じた蛍光が、前記試料の位置以外の所定の深さ位置から生じた蛍光から分離されるよう、前記蛍光を分光し、
    　前記蛍光検出器は、前記試料の位置から生じた蛍光が照射され、且つ、前記試料の位置以外の深さ位置から生じた蛍光が照射されない領域に、受光部が配置されている、蛍光検出装置。
  2. 　前記試料保持担体は、前記試料を収容する試料収容部と、前記試料収容部よりも前記照射光の入射側に配置され前記照射光の一部を反射する反射面と、を備え、
    前記反射面において反射された前記照射光の反射光を受光する反射光検出器を有する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
  3. 　前記非点収差素子は、第１の方向における前記蛍光の収束により第１の焦線を生成し、且つ、前記第１の方向に垂直な第２の方向における前記蛍光の収束により第２の焦線を生成し、
    　前記分光素子は、前記蛍光から４つの前記光束を分離し、
    　前記第１の方向と前記第２の方向にそれぞれ平行で且つ互いにクロスする２つの直線の交点を前記蛍光の光軸に整合させたとき、前記２つの直線によって区分される前記蛍光の４つの領域に、４つの前記光束がそれぞれ含まれる、請求項１又は２に記載の蛍光検出装置。
  4. 　前記分光素子は、４つの前記光束を、それぞれ、前記光検出器上において、正方形の４つの頂角の位置に照射させるよう、４つの前記光束の進行方向を変化させる構造を備える、請求項３に記載の蛍光検出装置。
  5. 　前記非点収差素子は、第１の方向における前記蛍光の収束により第１の焦線を生成し、且つ、前記第１の方向に垂直な第２の方向における前記蛍光の収束により第２の焦線を生成し、
    　前記分光素子は、前記蛍光から２つの前記光束を分離し、
    　前記第１の方向に平行な直線を前記蛍光の光軸に整合させたとき、前記直線によって区分される前記蛍光の２つの領域に、２つの前記光束がそれぞれ含まれ、
    　前記分光素子は、前記試料の位置から生じた蛍光が前記非点収差素子によって収束されることにより生じる２つの焦線のうち前記対物レンズ側の焦線よりも前記対物レンズ側に配置されている、請求項１又は２に記載の蛍光検出装置。
  6. 　前記分光素子は、２つの前記光束を前記第２の方向に互いに離間させるよう、２つの前記光束の進行方向を変化させる構造を備える、請求項５に記載の蛍光検出装置。
  7. 　前記分光素子は、波長選択性の回折素子により構成され、
    　前記分光素子は、前記蛍光と前記反射面によって反射された前記照射光の前記反射光とが入射されるとともに、前記蛍光と前記反射光との波長の差異に基づき、前記蛍光と前記反射光を互いに分離させる回折作用を、前記蛍光にさらに付与する、請求項２ないし６の何れか一項に記載の蛍光検出装置。
  8. 前記対物レンズ、前記非点収差素子、前記分光素子又は前記受光部の位置を前記蛍光の光軸方向に可変する機構を備え、前記光軸方向の異なる位置に配置された前記試料から生じる蛍光を分離して検出する、請求項２ないし７の何れか一項に記載の蛍光検出装置。
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