JP5609729B2 - 顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構 - Google Patents

Description

本発明は、試料に照明光を照射して、試料からの戻り光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構に関するものである。

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この顕微鏡として、非特許文献１に開示される４Ｐｉ共焦点顕微鏡を用いることができる。４Ｐｉ共焦点顕微鏡は、高解像度の画像を得ることを目的とした顕微鏡装置になる。

４Ｐｉ共焦点顕微鏡は、試料を挟んで２つの対物レンズを対向配置している。レーザ光源から発振されたレーザ光は途中で分岐しており、分岐した２つのレーザ光は２つの対物レンズからそれぞれ試料に照射する。このときに、２つのレーザ光の焦点位置が試料において重なるようにする。これにより、励起光（レーザ光）を干渉させて、焦点の光軸方向（Ｚ軸方向）の領域を狭小にしており、Ｚ軸方向の分解能を高くしている。

そして、対物レンズにより狭小な領域に焦点が結ばれたレーザ光によって試料に導入した蛍光色素や蛍光タンパクが蛍光する。この蛍光は戻り光となって、２つの対物レンズから回収される。このときに、戻り光を再び干渉させることで、Ｚ軸方向の分解能を向上させている。そして、干渉した戻り光が検出部により検出されることで、高解像度の試料の画像を生成している。

高解像度の画像を生成する顕微鏡としては、他に全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ顕微鏡）を用いることもできる。このＴＩＲＦ顕微鏡では、励起光としてエバネッセント光を用いて、エバネッセント場を利用した局所的な励起を行っている。これにより、極めて被写体の深度を浅くすることができ、Ｚ軸方向の分解能を高くしている。これにより、試料の画像を高解像度に生成している。

Journal of the Optical Society of America A 9: 2159-2166「Properties of a 4pi confocal fluorescence microscope by Stefan Hell and Ernest H. K. Stelzer」

前述した４Ｐｉ顕微鏡は、２つのレーザ光を試料において干渉させることで、高解像度の画像を得るようにしている。このために、２つのレーザ光は試料において正確に焦点を一致させる必要がある。従って、２つの対物レンズの位置関係は高精度に調整しなければならない。また、２つの対物レンズからそれぞれ戻り光を回収させており、且つ２つの戻り光を干渉させている。このため、戻り光の光路も正確に重ね合わせる必要があることから、顕微鏡全体の光学調整を極めて厳格に行う必要がある。従って、過剰に高い光学調整の精度が要求される。

また、ＴＩＲＦ顕微鏡の場合には、エバネッセント場が発生する極めて限定された領域の画像が得られる。つまり、試料の厚さ数百ナノメートルでのみ励起光によって蛍光を発生するため、観察対象となる領域は深さ方向（Ｚ軸方向）において非常に限定された領域になる。これにより、深さ方向における観察の自由度が低下する。

そこで、本発明は、簡単な光学調整で高解像度の試料の画像を得ると共に、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことを目的とする。

以上の課題を解決するため、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、前記検出部で検出された戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出する抽出部と、を備えたことを特徴とする。

この顕微鏡装置によれば、試料に直接的に入射する照明光と反射面で反射した反射光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光においても干渉を行う。これにより、光軸方向において分解能を高くすることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。２つの対物レンズを用いて焦点を一致させなくてもよいことから、簡単に光学調整を行うことができ、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向において任意の位置の観察を行うことができる。

また、前記焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールを備えたことを特徴とする。これにより、焦点の合った部分だけの画像を生成する共焦点顕微鏡とすることができることから、高解像度の画像を生成することができる。

また、前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、前記照明光の光軸方向に直交する平面に前記照明光を走査する走査部と、を備えたことを特徴とする。対物レンズにより照明光に焦点を結ばせて、光軸方向に直交する平面を走査手段が走査することで、所定領域の３次元の試料の画像を生成することができる。

また、前記光源は、近赤外光のパルスレーザを前記照明光として発振することを特徴とする。光源が近赤外光のパルスレーザを発振することで、２光子励起を生じさせることができ、光軸方向の分解能を高くできる。これにより、高解像度の画像生成を行うことができる。

また、複数のマイクロレンズを配列した第１の回転ディスクと、この第１の回転ディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列した第２の回転ディスクと、前記第１の回転ディスクと前記第２の回転ディスクとを一体的に回転させる回転ドラムと、を備えたことを特徴とする。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡として用いることで、画像生成の速度を高速化できる。

また、前記抽出部として、前記反射面に対して前記焦点の位置を異ならせたときの戻り光を前記検出部が検出して、これらの戻り光を比較して強度が高くなっている１つの領域以外の領域を除去するデコンボルーション処理を行う演算部を備えたことを特徴とする。焦点位置を異ならせたときの戻り光を検出して、特定の領域の強度を検出するデコンボルーション処理を行うことで、光軸方向に優れた分解能の画像を得ることができる。

また、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、前記照明光を第１の照明光と第２の照明光とに分岐して、この第２の照明光を拡散光にして前記反射面で反射させ、前記第１の照明光と反射した前記第２の照明光との焦点を一致させる光分岐部と、を備えたことを特徴とする。これにより、焦点の中心を反射面から離間した位置に且つ自由な位置に設定することができ、光軸方向における任意の位置の画像を得ることができる。

また、前記光源は、前記試料の蛍光が飽和する強度であり且つ一定の周波数で変調したレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、飽和励起顕微鏡として用いることができる。飽和励起顕微鏡として用いることで、光軸方向の限定された領域のみが飽和をするため、分解能を向上させることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。

また、前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、顕微鏡装置をＰＡＬＭに適用することができる。ＰＡＬＭでは個々の蛍光分子が蛍光するため、ＸＹ方向の分解能が高くなることから、ＸＹ方向およびＺ方向の３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。

また、前記光源は、前記照明光を励起用レーザ光として発振する励起用レーザ光源と、前記励起用レーザ光の焦点の外周にリング状の焦点を結ばせるＳＴＥＤレーザを発振するＳＴＥＤレーザ光源と、前記励起用レーザ光と前記ＳＴＥＤレーザとの光路を一致させるダイクロイックミラーと、を備えたことを特徴とする。これにより、ＳＴＥＤ顕微鏡として適用することができ、ＸＹ方向に高い分解能を得ることができる。このため、ＸＹ方向およびＺ方向の３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。

また、本発明の観察方法は、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源から、前記照明光の焦点の範囲内に定在波が発生するように前記照明光を反射させる反射面を形成した試料搭載部に搭載した前記試料に前記照明光を照射して、蛍光した戻り光を検出するステップと、前記検出するステップにより検出された前記戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出するステップと、を備えることを特徴とする。

また、本発明の試料搭載機構は、干渉性を有し、試料を励起させる照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、
この試料搭載機構の前記照明光が入射する側の面に前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させる反射面を形成し、
前記観察時に、前記戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出することを特徴とする。

本発明は、試料搭載部の試料を搭載する面を反射面として、試料に直接的に照射される照明光と反射面で反射した照明光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光においても干渉をさせている。これにより、焦点の範囲内の狭小な領域を蛍光させて分解能を高くでき、高解像度の画像を得ることができる。２つの対物レンズを使用して焦点を一致させなくてもよいことから、簡単な光学調整で顕微鏡装置を構成でき、エバネッセント光を使用していないため、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことができる。

実施形態の顕微鏡装置の構成図である。 実施形態の焦点の状態を説明した図である。 図２の焦点の強度分布を示すグラフである。 図２から焦点の中心をずらしたときの状態を説明した図である。 図４の焦点の強度分布を示すグラフである。 図２から焦点の中心をさらにずらしたときの状態を説明した図である。 図６の焦点の強度分布を示すグラフである。 変形例１の顕微鏡装置の構成図である。 変形例１の顕微鏡装置の概念図である。 変形例２の顕微鏡装置の構成図である。 光分岐ユニットの構成を示す図である。 変形例２の焦点の状態を示す図である。 図１２の焦点の強度分布を示すグラフである。 図１２から焦点の中心をずらしたときの状態を説明した図である。 変形例５のレーザ光源の構成図である。 変形例６の試料搭載部を説明する図である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。図１は顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１はレーザ光源２とシャッタ３とダイクロイックミラー４と光走査ユニット５と瞳リレーレンズ６とミラー７と結像レンズ８と対物レンズ９と試料搭載部１０と蛍光フィルタ１１と集束レンズ１２とピンホール１３と検出部１４とコントローラ１５とディスプレイ１６とを備えて構成している。試料搭載部１０には蛍光指示薬（蛍光色素）が導入された試料Ｓが載置されている。

レーザ光源２は干渉性を有するレーザ光Ｌを照明光として発振する光源になる。また、レーザ光Ｌは励起光であり、試料Ｓに導入した蛍光色素を励起させる波長λを有する。レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌは図示しないコリメートレンズにより平行光にされて、シャッタ３に導かれる。シャッタ３は所定のタイミングで開放制御することでレーザ光Ｌを通過させる。シャッタ３を通過したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４に入射する。

ダイクロイックミラー４はレーザ光源２からのレーザ光Ｌを反射し、試料Ｓからの戻り光（蛍光）Ｒを透過させる特性を持つ光学部品である。よって、レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４で反射して、光走査ユニット５に導かれる。光走査ユニット５は第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとを有する走査部である。

第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとは１本の軸の周りに回転可能に構成している。これにより、光走査ユニット５はレーザ光Ｌの反射角を制御して、レーザ光Ｌの焦点Ｆを試料搭載部１０に載置した試料ＳのＸＹ方向（水平面方向：光軸（Ｚ軸）方向と直交する面）に走査する。

光走査ユニット５からのレーザ光Ｌは瞳リレーレンズ６に入射し、その後にミラー７で反射される。そして、レーザ光Ｌは対物レンズ９により試料搭載部１０に搭載された試料Ｓに焦点Ｆを結ぶ。対物レンズ９の瞳は瞳リレーレンズ６によって、光走査ユニット５の位置にリレーされるので、光走査ユニット５により走査される光は、対物レンズ９の瞳位置でレーザ光Ｌが走査される。

試料Ｓは試料搭載機構としての試料搭載部１０に搭載されており、対物レンズ９によってレーザ光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶ。また、光走査ユニット５により試料ＳのＸＹ方向にレーザ光Ｌが走査される。試料搭載部１０の試料Ｓを搭載する面はレーザ光Ｌを反射させる反射面１０ａとしている。これにより、対物レンズ９から入射したレーザ光Ｌと反射面１０ａで反射したレーザ光Ｌとが干渉して定在波を発生させる。

試料Ｓには蛍光色素が導入されており、レーザ光Ｌによって試料Ｓの蛍光色素が励起される。これにより、蛍光して戻り光（蛍光）Ｒが発生する。発生した戻り光Ｒは対物レンズ９に入射して、レーザ光Ｌとは逆方向に進行する。そして、対物レンズ９、結像レンズ８、ミラー７、瞳リレーレンズ６、光走査ユニット５を経て、ダイクロイックミラー４に入射する。

ダイクロイックミラー４は試料Ｓの蛍光の波長を透過させる特性を有している。よって、戻り光Ｒはダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１１に入射する。蛍光フィルタ１１は特定の波長成分、つまり蛍光の波長の光を選択的に透過させるフィルタである。

よって、戻り光Ｒは蛍光フィルタ１１により、蛍光の波長成分の光が選択的に透過されて、ピンホール１３を通過する。ピンホール１３は焦点面以外からの光を除去するために焦点と共役な位置関係に配置している。これにより、焦点面からの光だけを抜き出して通過させることができる。ピンホール１３を通過した戻り光Ｒは検出部１４に入射する。このピンホール１３を形成することで、顕微鏡装置１を共焦点顕微鏡として適用している。つまり、ピンホール１３を通過した戻り光Ｒは焦点Ｆの近傍のみの光であり、焦点範囲に合った画像を共焦点画像として得ている。

検出部１４は光検出部である。つまり、受光した戻り光Ｒの光量を電気信号に光電変換する。この変換した電気信号は戻り光Ｒの光量のデジタルデータ（光量データ）になる。検出部１４が変換した光量データはコントローラ１５に入力される。コントローラ１５は入力した光量データをレーザ光Ｌの走査位置と対応させて画像のデータを生成する演算を行う。これにより、試料Ｓの画像を生成する。生成した画像は焦点面近傍からの蛍光画像になり、つまり共焦点画像になる。この共焦点画像がディスプレイ１６に表示される。

次に、本実施形態の動作について説明する。試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌは対物レンズ９により焦点Ｆを結ぶ。この焦点Ｆを試料Ｓで結ばせることで、試料Ｓの蛍光色素を励起させている。このときの焦点ＦはＰＳＦ（点像分布関数）に基づく一定の広がりを有している。図２は焦点Ｆの状態を示しており、この焦点Ｆは楕円形の一定範囲に広がり有している。

試料Ｓは試料搭載部１０に搭載しており、試料搭載部１０の試料Ｓを搭載する面は反射面１０ａとして形成している。この反射面１０ａはレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを反射させる面となっており、レーザ光Ｌが入射する側の面に形成している。反射面１０ａは、レーザ光Ｌの波長λおよび戻り光Ｒの波長（試料Ｓが蛍光した波長）を反射させる光学特性を有していればよい。

例えば、アルミニウムや金等の金属のミラーコーティングを反射面１０ａに形成してもよいし、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを選択的に反射させる誘電体多層膜を反射面１０ａとして形成してもよい。要は、レーザ光Ｌおよび戻り光Ｒを反射（全反射）させるものであれば、それ以外の波長域の光は透過させるものであってもよい。なお、反射面１０ａを保護するための保護層を反射面１０ａに形成してもよい。

レーザ光Ｌの焦点Ｆは楕円形に所定範囲の領域となっている。よって、焦点Ｆの光軸方向の中心を反射面１０ａと一致させるように調整する。これは、対物レンズ９を調整することにより行う。焦点Ｆの中心が反射面１０ａと一致したときには、焦点Ｆの半分は反射面１０ａにより反射される。

このとき、対物レンズ９から直接的に試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌを直接光とし、反射面１０ａにより反射されたレーザ光Ｌを反射光とする。反射光と直接光とは相互に向きが異なるため、反射光は直接光に対して位相が１８０度（λ／２相当）シフトする。これにより、直接光と反射光とが干渉して定在波（定常波）が発生する。

定在波を発生させているため、反射面１０ａからＺ軸方向において「λ／４」の領域（図２の領域Ｆ１）では直接光と反射光とが強め合うように干渉する。領域Ｆ１は直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分になることから定在波の「腹」になり、レーザ光Ｌの強度が高くなる。

一方、反射面１０ａから光軸方向において「λ／２」の領域（図示せず）では直接光と反射光とにより弱め合うような干渉が生じる。この領域は、直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と３／２波長分になることから、定在波の「節」になる。このために、レーザ光Ｌの強度が弱め合って、打ち消される。これにより、当該領域では蛍光（戻り光Ｒ）が発生しなくなる。

また、反射面１０ａから光軸方向において「（３／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ２）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ２では直接光と反射光との光路差が２波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ２の部分は焦点Ｆの中心部分から離れた位置になっているため、領域Ｆ１に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ２は領域Ｆ１よりも暗い領域となる。

さらに、反射面１０ａから光軸方向においてλの領域（図示せず）では直接光と反射光とが弱め合うような干渉が生じ、レーザ光Ｌが打ち消される。つまり、当該領域では直接光と反射光との光路差が（５／２）×λになるため、レーザ光Ｌが弱め合って打ち消される。このため、蛍光（戻り光Ｒ）が発生しなくなる。

従って、反射面１０ａをレーザ光Ｌが反射する反射面１０ａとすることで、Ｚ軸方向に励起する領域（蛍光する領域）を狭小にすることができる。図３（ａ）はＺ軸方向のレーザ光Ｌの強度分布を示しており、この図に示すように、領域Ｆ１およびＦ２で強度（光強度）が高くなっているが、他の領域では強度がほぼゼロになっている。

つまり、焦点Ｆの領域のうち一部の領域Ｆ１、Ｆ２のみの強度（レーザ光Ｌの強度）を高くすることができ、蛍光する領域を狭小な領域Ｆ１、Ｆ２に限定することができる。これにより、Ｚ軸方向の分解能が高くなる。以上は、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌに干渉による定在波を発生させた場合を説明したが、戻り光Ｒについても干渉させることで、分解能を高くしている。

図１に示したように、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌと戻り光Ｒとはほぼ同じ光路を辿っている。つまり、同じ光路において、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとは往復している関係になる。前述したものは往路について干渉による定在波を発生させているが、復路についても干渉を発生させている。これにより、戻り光Ｒについても分解能を高くすることができる。

レーザ光Ｌにより試料Ｓが励起して蛍光することにより、戻り光Ｒが発生する。蛍光が発生する点を極めて小さな光点とすると、この光点から発生する戻り光Ｒは直接的に対物レンズ９に入射する光（直接光）と反射面１０ａで反射してから対物レンズ９に入射する光（反射光）との２つの光が発生する。従って、戻り光Ｒの直接光と反射光とはその光路差に基づいて干渉が発生する。

蛍光した光点が反射面１０ａから「λ／４」の位置（領域Ｆ１）にあるとすると、直接光と反射光との光路差は「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分に相当する。つまり、往路の場合と同様に復路の場合も戻り光Ｒが強め合う。同様に、励起された光点が反射面１０ａから「（３／４）×λ」の位置（領域Ｆ２）にあるときには光路差が２波長分になり、戻り光Ｒが強め合う。ただし、領域Ｆ２を光点としたときの戻り光Ｒの強度は領域Ｆ１を光点としたときの戻り光Ｒの強度よりも弱くなる。

一方、蛍光した光点が反射面１０ａから「λ／２」或いは「（３／２）×λ」に位置している場合には、戻り光Ｒが弱め合うため、打ち消される。干渉による定在波が発生した戻り光Ｒはピンホール１３により通過される光が制限され、検出部１４で検出される。復路（戻り光Ｒ）のみを考えた場合には、その強度分布は図３（ａ）と同じになるが、往路のレーザ光Ｌ（励起系）と復路の戻り光Ｒ（検出系）との相乗効果により、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図３（ｂ）のようになる。

この図３（ｂ）の強度分布は図３（ａ）の強度分布を概ね２乗した分布になる。なお、図中の光強度は２乗になっているため、その値も２乗になっている。図３（ｂ）の強度分布では図３（ａ）の強度分布よりもガウシアン分布がシャープになっている。つまり、強度が高い領域をさらに狭小な領域とすることができる。これにより、分解能を高くすることができる。戻り光Ｒはピンホール１３を通過しており、これにより高い分解能の共焦点画像を得ることができる。

このとき、検出部１４では領域Ｆ１とＦ２との強度が高くなっている戻り光Ｒを検出する。ここでは、狭小な領域Ｆ１の蛍光が観察対象となる。よって、領域Ｆ２の強度の影響をデコンボルーション処理により除去する。つまり、点像分布関数（ＰＳＦ）を用いて、領域Ｆ２については検出部１４が検出した戻り光Ｒから除去する計算を行う。或いは、戻り光Ｒを実測して領域Ｆ２を除去するように処理を行う。このデコンボルーション処理を行うことで、領域Ｆ１のみの蛍光を観察することができ、より狭小な領域の戻り光Ｒを検出できる。これにより、分解能をさらに高くすることができる。

図１に示すように、対物レンズ９は１つだけを用いており、４Ｐｉ顕微鏡のように２つの対物レンズを用いてレーザ光の焦点を重ねるようにしなくてもよい。これにより、顕微鏡装置１の光学調整を簡単に行うことができる。また、エバネッセント光を用いることなく、試料Ｓの画像生成を行っているため、光軸方向の観察に自由度を持たせることができる。

以上において、レーザ光源２は複数波長のレーザ光Ｌを選択的に発振可能なように構成してもよい。また、蛍光色素の色に応じた波長を持つレーザ光Ｌを発振するようにしてもよい。従って、蛍光色素の色を変えたときには、レーザ光源２のレーザ光Ｌは蛍光色素の色に応じた発振波長とする。これにより、複数の色の蛍光色素の画像取得を行うことができる。また、レーザ光源２に代替して、ＬＥＤやＳＬＤ（Super Luminescent Diode）等の可干渉距離の短い光を発振するようにしてもよい。

また、光走査ユニット５によりレーザ光Ｌは試料Ｓにおいて水平面方向（ＸＹ方向）に走査される。このときに、レーザ光Ｌの焦点Ｆは反射面１０ａに対してＺ軸方向において常に一定の位置（焦点Ｆの中心が反射面１０ａとなるような位置）にする必要がある。この位置関係を維持しながら光走査ユニット５がＸＹ方向にレーザ光Ｌを走査する。つまり、焦点Ｆを反射面１０ａに追従させる必要がある。

このために、オートフォーカス機能を搭載して、自動的に焦点Ｆを調整するようにしてもよい。このオートフォーカス機能はレーザ光Ｌの反射光を用いてもよい。例えば、光ディスクで使用される非点収差法を用いて常に反射面１０ａに焦点Ｆを高速に追従させることができる。

また、反射面１０ａの複数点の高さを予め測定しておき、反射面１０ａの面の傾きを予測してレーザ光Ｌの焦点Ｆを自動的に追従させてもよい。また、レーザ光Ｌが走査されるＸＹ平面（水平面）に対して反射面１０ａが傾きを生じている場合には、反射面１０ａとＸＹ平面とが平行になるように傾き調整を行ってもよい。

また、レーザ光源２から発振するレーザ光Ｌを近赤外光のパルスレーザを用いるようにしてもよい。レーザ光Ｌは近赤外光を用いるため、ダイクロイックミラー４等の光学系もそれに対応したものを用いる。また、２光子励起によって生じた蛍光に対応した蛍光フィルタ１１を用いる。これにより、顕微鏡装置１を２光子励起顕微鏡として用いることができる。

２光子励起顕微鏡としているため、焦点近傍でのみ２光子励起が生じる。このため、深部観察等において光路の途中で発生する蛍光やそれによって生じる退色の影響を極めて少ないものとすることができ、分解能を高くすることができる。特に、２光子励起現象は光密度が高い領域において生じるため、図３（ａ）および（ｂ）の領域Ｆ１の頂点近傍でのみ２光子励起が生じるため、光軸方向の分解能がさらに向上する。

なお、２光子励起の場合には、蛍光はレーザ光Ｌの波長λのおおよそ半分になるため、戻り光Ｒの検出時には干渉によって強め合う領域が、レーザ光Ｌの干渉によって強め合う領域以外にも生じる。ただし、往路および復路の相力の干渉の効果が乗じられるため、復路のみで生じる強め合う領域の影響は小さくなる。従って、２光子励起の場合も同様に分解能を高くすることができる。

また、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心を反射面１０ａに一致させなくてもよい。つまり、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから任意の間隔だけ離間させてもよい。図４は、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心を反射面１０ａから「λ／４」の分だけ離間した位置となるようにした例になる。この場合には、図２のように領域Ｆ１、Ｆ２の２箇所だけではなく、図４に示すように領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の３箇所が干渉による定在波により強度が高くなる。

この場合には、焦点Ｆの中心が反射面１０ａからずれていることにより、焦点Ｆの中心が反射面１０ａと一致しているときと比較して若干の非対称性を持つ。このために、干渉により弱め合う領域についても僅かに強度を有する。図５(ａ)は、この場合のレーザ光Ｌの強度分布を示している。

ただし、戻り光Ｒについても光路差に基づく干渉を発生させている。これにより、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図５（ａ）の強度分布の概ね２乗になることから、図５（ｂ）のようなシャープな形になる。これにより、図３（ｂ）とほぼ同程度の強度分布を持つ戻り光Ｒを検出することができる。従って、分解能を高くすることができ、高解像度の試料Ｓの画像を得ることができる。

また、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから「（３／４）×λ」の位置にすることもできる。この場合には、図６に示すように、焦点Ｆは領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４の４つの領域が高い強度となる。この場合のレーザ光Ｌの強度分布は図７（ａ）のようになり、検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は同図（ｂ）のようになる。これにより、分解能を高くすることができ、高解像度の画像生成を行うことができる。

ここで、図３（ｂ）、図５（ｂ）および図７（ｂ）は、それぞれ焦点Ｆの中心を反射面１０ａに対して変化させたときの強度分布を示している。このため、Ｚ軸方向に強度が高くなる領域が異なるようになる。このうち、観察対象となるのは何れか１つの領域（例えば、領域Ｆ１）であり、それ以外の領域（例えば、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）を除去しなければならない。

領域Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４の強度はＰＳＦに基づいて所定の演算処理（デコンボルーション処理）を行うことで除去できる。この演算処理はコントローラ１５により行われる。ここで、図３（ｂ）の強度分布または図５（ｂ）の強度分布と図７（ｂ）の強度分布を用いてデコンボルーション処理を行う。

つまり、反射面１０ａに対して焦点Ｆの中心を異ならせたときの戻り光Ｒを検出して、戻り光Ｒの強度分布を比較することにより対象となる領域Ｆ１のみを抽出する処理を行う。これにより、領域Ｆ１のみが抽出され、光軸方向の分解能が向上する。また、図７（ｂ）において、領域Ｆ１だけではなく、領域Ｆ２、Ｆ３またはＦ４のみを抽出するようにデコンボルーション処理を行うこともできる。この場合には、Ｚ軸方向に反射面１０ａから異なる距離の複数の断面画像を生成することができる。

次に、変形例１について説明する。図８および図９は変形例１の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１はニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置になり、レーザ光源２とスキャナユニット２０と顕微鏡３０とカメラ４０とを備えて構成している。

レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌは光ファイバ２Ｆによってスキャナユニット２０にまで伝達される。スキャナユニット２０は、マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２と回転ドラム２３とモータ２４とコリメートレンズ２５とダイクロイックミラー２６とリレーレンズ２７とを備えて構成している。

マイクロレンズディスク２１は、図９に示すように４条の螺旋状パターンの複数のマイクロレンズ２１Ｍを配列した第１の回転ディスクである。ピンホールディスク２２は、マイクロレンズディスク２１のマイクロレンズ２１Ｍのパターンと同じパターンで複数のピンホール２２Ｐを配列した第２の回転ディスクである。

マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２との間には所定の間隔が設けられている。また、マイクロレンズディスク２１およびピンホールディスク２２の回転方向において、マイクロレンズ２１Ｍとピンホール２２Ｐとが同じ位置となるように形成している。

回転ドラム２３はマイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とを一体的に回転させる。モータ２４は回転ドラム２３に回転力を付与する回転手段である。コリメートレンズ２５は光ファイバ２Ｆによって導かれたレーザ光Ｌを平行光に変換する。このレーザ光Ｌは複数のマイクロレンズ２１Ｍによって複数のピンホール２２Ｐで焦点を結ぶようになっている。

マイクロレンズ２１Ｍとピンホール２２Ｐとの間にはダイクロイックミラー２６が配置されている。ダイクロイックミラー２６はレーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの波長の光を透過させ、試料Ｓの蛍光の波長の光を反射させる特性を持つ光学部品である。よって、マイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐにレーザ光Ｌは透過する。

各マイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐに向けてレーザ光Ｌが入射する。ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは顕微鏡３０に入射する。顕微鏡３０は結像レンズ３１と対物レンズ３２とを有して構成している。ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは結像レンズ３１によって所定傾きの平行光に変換される。この平行光が対物レンズ３２に入射する。

対物レンズ３２に入射したレーザ光Ｌは試料搭載部１０の試料Ｓで焦点を結ぶ。そして、試料Ｓで蛍光色素が励起されて蛍光が発生する。この蛍光は戻り光Ｒとなって顕微鏡３０、そしてピンホール２２Ｐを通過してダイクロイックミラー２６で反射する。この反射した戻り光Ｒはリレーレンズ２７によってカメラ４０の撮像素子で結像をする。カメラ４０の前段には図示しない蛍光フィルタが設けられており、試料Ｓの蛍光だけが選択的にカメラ４０に結像される。

なお、図８において、レーザ光Ｌの光路を２つ示しているが、このうち実線で示す光路と破線で示す光路とは異なるマイクロレンズ２１Ｍを通過する光であることを示している。つまり、レーザ光Ｌの光軸中心のレーザ光Ｌと光軸中心からずれたレーザ光Ｌを示している。また、図９において、顕微鏡３０は１枚のレンズとして模式的に表している。

本変形例の動作について説明する。モータ２４は回転ドラム２３を回転させることにより、マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転する。レーザ光源２からレーザ光Ｌを発振させることにより、レーザ光Ｌはマイクロレンズ２１Ｍからピンホール２２Ｐを通過する。マイクロレンズディスク２１とピンホールディスク２２とは一体的に回転している。これにより、レーザ光Ｌが試料搭載部１０の試料Ｓにて走査される。且つ、複数のマイクロレンズ２１Ｍおよび複数のピンホール２２Ｐを配置していることから、同時に複数の焦点Ｆが生じる。そして、試料Ｓにレーザ光Ｌの焦点が結ばれることにより、試料Ｓの蛍光色素が発光する。

この蛍光が戻り光Ｒとなって、カメラ４０に結像する。戻り光Ｒのうち焦点面以外の光はピンホール２２Ｐを殆ど通過できないため、カメラ４０に到達しない。これによって、カメラ４０は焦点面のみの共焦点画像を撮影することになる。レーザ光Ｌが試料Ｓにて走査されるため、カメラ４０の受光面にて戻り光Ｒが走査される。従って、焦点Ｆの情報がカメラ４０に投影されて、試料Ｓの観察を行うことができる。

試料搭載部１０には反射面１０ａが形成されており、前述した実施形態と同様にレーザ光Ｌを干渉させて定在波を発生させている。このために、レーザ光Ｌの焦点Ｆの領域を狭くすることができ、高い分解能を得ることができる。また、戻り光Ｒにおいても干渉を発生させているために、高い分解能を得ることができる。そして、変形例１ではニポウディスク方式の顕微鏡装置１を適用していることから、極めて高速に画像生成を行うことができるようになる。

次に、変形例２について説明する。図１０は変形例２の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１は実施形態の顕微鏡装置１に対して新たに光分岐ユニット５０を光分岐部として追加している。この光分岐ユニット５０は光走査ユニット５とダイクロイックミラー４との間に設けている。

図１１は光分岐ユニット５０の構成を示している。光分岐ユニット５０はハーフミラー５１とデフォーマブルミラー５２と反射ミラー５３とハーフミラー５４とを有して構成している。レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌはハーフミラー５１によりレーザ光Ｌ１とＬ２とに分離される。同図の実線は分離された一方のレーザ光Ｌ１（第１の照明光）を示しており、破線は他方のレーザ光Ｌ２（第２の照明光）を示している。

ハーフミラー５１で分離されたレーザ光Ｌ２はデフォーマブルミラー５２により反射する。デフォーマブルミラー５２はそのミラー曲面が変形可能な光学部品であり、静電力、電磁力、圧電素子等で駆動される。このデフォーマブルミラー５２でレーザ光Ｌ２が反射することにより、レーザ光Ｌ２は微小な拡散光に変換される。そして、このレーザ光Ｌ２は反射ミラー５３で反射して、ハーフミラー５４に入射する。

ハーフミラー５４において、ハーフミラー５１を透過したレーザ光Ｌ１と反射ミラー５３で反射したレーザ光Ｌ２とが光路を同じにする。なお、レーザ光Ｌ１とレーザ光Ｌ２との光路差はレーザ光Ｌの波長λの整数倍となるように光分岐ユニット５０を構成している。

このとき、レーザ光Ｌ１は平行光となっているが、レーザ光Ｌ２は拡散光となっている。そして、対物レンズ９により試料Ｓに焦点を結ぶ。このときに、レーザ光Ｌ１の焦点Ｆの中心が試料搭載部１０の反射面１０ａから「（７／４）×λ」となるように対物レンズ９を調整している。つまり、前述してきたものよりも、焦点Ｆの中心を反射面１０ａから離間した位置にしている。勿論、反射面１０ａに対する焦点Ｆの中心は「（７／４）×λ」には限定されない。

図１２はこの場合の焦点Ｆを示している。レーザ光Ｌ１（実線）の焦点Ｆの中心は反射面１０ａから「（７／４）×λ」の位置となっており、焦点Ｆの全体が反射面１０ａから離間している。このとき、拡散光となっているレーザ光Ｌ２はレーザ光Ｌ１の焦点Ｆよりも遠方で焦点を結ぶようになる。従って、レーザ光Ｌ２は反射面１０ａで反射した後に焦点を結ぶ。このときに、反射後のレーザ光Ｌ２の焦点がレーザ光Ｌ１の焦点Ｆと一致するように、デフォーマブルミラー５２をコントロールする。

従って、レーザ光Ｌ１およびＬ２の焦点Ｆは図１２に示すようになる。同図に示すように、焦点ＦではＺ軸方向に強度が高くなる領域を複数発生する（領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５）。このときの焦点Ｆにおけるレーザ光Ｌ１およびＬ２の強度分布は図１３のようになる。

レーザ光Ｌが焦点Ｆを結ぶことにより、試料Ｓが蛍光して戻り光Ｒが発生する。この戻り光Ｒについても、対物レンズ９に直接的に入射する光（戻り光Ｒ１：実線の光）と反射面１０ａで反射した後に対物レンズ９に入射する光（戻り光Ｒ２：破線の光）とが発生する。そして、戻り光Ｒ１とＲ２とは光路差により干渉する。干渉した戻り光Ｒ１とＲ２とが戻り光Ｒとして、ピンホール１３を通過して検出部１４に入射して検出される。

このときの検出部１４で検出される戻り光Ｒの強度分布は図１３（ｂ）のようになる。つまり、図１３（ａ）の強度分布を２乗したシャープな形になる。コントローラ１５は検出部１４が検出した戻り光Ｒの光量データに対してデコンボルーション処理を行う。これにより、特定の領域の強度だけが検出される。そして、図１３に示すように、Ｚ軸方向に複数の戻り光Ｒの強度が検出される。従って、所望の領域の強度のみを抽出するデコンボルーション処理を行うことで、試料ＳにおけるＺ軸方向の複数の断面画像を得ることができる。

ここでは、焦点Ｆの中心が反射面１０ａから「（７／４）×λ」の位置となるようにしたが、焦点Ｆの中心は反射面１０ａから任意の位置に設定してもよい。焦点Ｆの中心を光軸方向にずらすことで、強度が高くなる領域の位置を変化させることができる。図１４（ａ）および図１４（ｂ）は、反射面１０ａから（７／４）×λの位置を焦点Ｆの中心としたときから、焦点Ｆの中心をＺ軸方向に変化させた場合を示している。

このように、焦点Ｆの中心をＺ軸方向に変化させることで、Ｚ軸方向の複数の領域の強度が得られる。そして、検出した戻り光Ｒに基づいて、より正確なデコンボルーション処理を行うことで、試料ＳのＺ軸方向における任意の位置における断面の画像生成を行うことができる。

このときに、光分岐ユニット５０のレーザ光Ｌ１またはＬ２の何れかの光路に位相変調素子を挿入して、一方の位相をコントロールすることができる。これにより、焦点Ｆの状態を常に図１２のようにすることができる。このときには、デコンボルーション処理を行うときのＰＳＦが一定になるため、演算処理が容易になる。なお、位相変調素子ではなく、レーザ光Ｌ１またはＬ２の何れかの光路長をコントロールすることによっても、同様の効果を得ることができる。

従って、本変形例２では、反射面１０ａから離間した位置（「（７／４）×λ」の位置）の試料Ｓの断面画像を得ることができる。また、反射面１０ａに対して焦点Ｆの中心をＺ軸方向にすらすことで、試料ＳのＺ軸方向の任意の位置の断面画像を得ることができる。

次に、変形例３について説明する。変形例３では、顕微鏡装置１を飽和励起顕微鏡として用いている。顕微鏡装置１の構成としては図１と同じである。ただし、レーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの強度を高くすると共に、レーザ光Ｌを一定の周波数ｆで変調する。これにより、レーザ光Ｌの焦点Ｆの中心部分（頂上付近）において蛍光信号の飽和が発生する。

これにより、この頂上付近の領域の蛍光信号の時間変化には歪みを生じ、周波数２ｆ、３ｆの高調波を含むようになる。このような高調波を含む信号成分を検出することにより、Ｚ軸方向およびこれに直交するＸＹ方向の限定された狭小な領域でのみ蛍光の飽和を生じさせる。従って、狭小な領域でのみ蛍光を飽和させて、これを検出することで、分解能を高くすることができる。そして、反射面１０ａによりレーザ光Ｌを反射させて干渉させているため、より高解像度の画像を得ることができる。

次に、変形例４について説明する。変形例４はＰＡＬＭ（Photoactivated localization microscope）という手法に顕微鏡装置１を適用している。ここでは、レーザ光源２は２色のレーザ光Ｌを発振するものを用いる。このうち、１つはスイッチング用のレーザ光Ｌであり、もう１つは蛍光取得用のレーザ光Ｌである。

また、蛍光分子を個別に発光させるために、蛍光のＯＮ（蛍光可能な状態）とＯＦＦ（蛍光不可能な状態）とを切り替えることが可能な蛍光タンパク質（蛍光プローブ）を用いる。この蛍光プローブを蛍光がＯＦＦの状態で試料Ｓに導入する。この状態で非常に微弱なスイッチング用のレーザ光Ｌで蛍光プローブのスイッチングを行う。このときに、試料Ｓの各蛍光分子の距離が充分に離れた少数の蛍光分子だけがＯＮにされる条件下でスイッチングを行う。

その後に、蛍光取得用のレーザ光Ｌで計測された蛍光分子の点像分布にガウス関数によるフィッティングを行う。そして、その中心位置を分子の位置として記録する。続けて、このＯＮの状態の蛍光分子を退色させた後に、別の蛍光分子のスイッチングを行い、この方法を繰り返す。これにより、ＸＹ方向の分解能が極めて優れた画像を取得することができる。

このときに、反射面１０ａにより反射したレーザ光Ｌと対物レンズ９から直接的に入射するレーザ光Ｌとの干渉により定在波を発生させることで、Ｚ方向に高い分解能を得ている。従って、ＸＹ方向およびＺ方向において分解能を高くすることができ、３次元に高解像度の画像を得ることができる。

次に、変形例５について説明する。変形例５は顕微鏡装置１を誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡に適用している。このＳＴＥＤ顕微鏡におけるレーザ光源２は、図１５に示すように、励起用レーザ光源６０とＳＴＥＤレーザ光源６１と位相制御板６２と反射ミラー６３とダイクロイックミラー６４とを備えている。

励起用レーザ光源６０が発振するレーザ光Ｌは前述したものであり、試料Ｓに照射させて蛍光色素を励起させる。ＳＴＥＤレーザ光源６１が発振するＳＴＥＤレーザＬＳは、励起用レーザ光源６０が発振したレーザ光Ｌの焦点Ｆに対してリング状の強度分布を持つ誘導放出用のレーザ光になる。

ＳＴＥＤレーザＬＳは反射ミラー６３により反射して、ダイクロイックミラー６４に入射する。このダイクロイックミラー６４にはレーザ光Ｌも入射している。ダイクロイックミラー６４はレーザ光Ｌを透過して、ＳＴＥＤレーザＬＳを反射する特性を有している。これにより、レーザ光ＬとＳＴＥＤレーザＬＳとが同軸になり、同じ光路を辿る。

これにより、試料Ｓにおいて、レーザ光Ｌの焦点Ｆの外周にリング状にＳＴＥＤレーザＬＳの焦点が重なる。ＳＴＥＤレーザＬＳは誘導放出の作用を発生させる。レーザ光Ｌの焦点Ｆとなる中心部分は蛍光を発生し、リング状のＳＴＥＤレーザＬＳの焦点は蛍光を発しなくなる。これにより、中心部分の領域が蛍光し、その周辺が蛍光しなくなることから、蛍光する領域を狭小にすることができる。

従って、ＸＹ方向に高い分解能を得ることができ、高解像度の画像取得を行うことができる。そして、前述したように、反射面１０ａを用いて干渉による定在波を発生させることで、Ｚ方向の分解能も高くすることができる。これにより、ＸＹ方向およびＺ方向の分解能を高くすることができ、３次元の高解像度の画像生成を行うことができる。

次に、変形例６について説明する。図１６に示すように、変形例６は顕微鏡装置１を倒立顕微鏡として構成したものである。試料搭載部１０は台７１と反射蓋７２とを有して構成している。台７１は内部に試料Ｓを搭載可能な皿状に構成している。また、反射蓋７２は試料Ｓの側に反射面７２ａを形成している。台７１と反射蓋７２との間には細胞１層分程度（１０μｍ程度）の間隙を設けるようにする。

顕微鏡装置１は倒立顕微鏡であり、図１の顕微鏡装置１とは試料搭載部１０の構成が重力方向において逆方向になっている。倒立顕微鏡としたときでも、反射蓋７２に反射面７２ａを形成することで、干渉による定在波を発生させることができ、高い分解能を得ることができる。これにより、高解像度の画像生成を行うことができる。

１ 顕微鏡装置
２ レーザ光源
５ 光走査ユニット
９ 対物レンズ
１０ 試料搭載部
１０ 試料搭載部
１０ａ 反射面
１４ 検出部
１５ コントローラ
２０ スキャナユニット
２１ マイクロレンズディスク
２２ ピンホールディスク
２３ 回転ドラム
２４ モータ
３０ 顕微鏡
３１ 結像レンズ
３２ 対物レンズ
４０ カメラ
５０ 光分岐ユニット
５１ ハーフミラー
５２ デフォーマブルミラー
５３ 反射ミラー
５４ ハーフミラー
６０ 励起用レーザ光源
６１ レーザ光源
６２ 位相制御板
６３ 反射ミラー
６４ ダイクロイックミラー

Claims (12)

1. 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、
   前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
   前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、
   前記検出部で検出された戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出する抽出部と、
   を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールを備えたこと
   を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記試料に前記照明光の焦点を結ばせる対物レンズと、
   前記照明光の光軸方向に直交する平面に前記照明光を走査する走査部と、
   を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
4. 前記光源は、近赤外光のパルスレーザを前記照明光として発振すること
   を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
5. 複数のマイクロレンズを配列した第１の回転ディスクと、
   この第１の回転ディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列した第２の回転ディスクと、
   前記第１の回転ディスクと前記第２の回転ディスクとを一体的に回転させる回転ドラムと、
   を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
6. 前記抽出部として、
   前記反射面に対して前記焦点の位置を異ならせたときの戻り光を前記検出部が検出して、これらの戻り光を比較して強度が高くなっている１つの領域以外の領域を除去するデコンボルーション処理を行う演算部を備えたこと
   を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
7. 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源と、
   前記試料に前記照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
   前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させるように前記照明光を反射させる反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、
   前記照明光を第１の照明光と第２の照明光とに分岐して、この第２の照明光を拡散光にして前記反射面で反射させ、前記第１の照明光と反射した前記第２の照明光との焦点を一致させる光分岐部と、
   を備えたこと
   を特徴とする顕微鏡装置。
8. 前記光源は、前記試料の蛍光が飽和する強度であり且つ一定の周波数で変調したレーザ光を発振すること
   を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
9. 前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振すること
   を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
10. 前記光源は、
    前記照明光を励起用レーザ光として発振する励起用レーザ光源と、
    前記励起用レーザ光の焦点の外周にリング状の焦点を結ばせるＳＴＥＤレーザを発振するＳＴＥＤレーザ光源と、
    前記励起用レーザ光と前記ＳＴＥＤレーザとの光路を一致させるダイクロイックミラーと、
    を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
11. 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を発振する光源から、前記照明光の焦点の範囲内に定在波が発生するように前記照明光を反射させる反射面を形成した試料搭載部に搭載した前記試料に前記照明光を照射して、蛍光した戻り光を検出するステップと、
    前記検出するステップにより検出された前記戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出するステップと、
    を備えることを特徴とする観察方法。
12. 干渉性を有し、試料を励起させる照明光を照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、
    この試料搭載機構の前記照明光が入射する側の面に前記照明光の焦点の範囲内に定在波を発生させる反射面を形成し、
    前記観察時に、前記戻り光のうち、前記戻り光の強度が高くなっている、前記反射面から一定の距離範囲にある領域の戻り光を抽出することを特徴とする試料搭載機構。

Images