WO2017022096A1 - 顕微鏡および画像取得方法 - Google Patents

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light
fluorescence
intensity
signal
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厚志 土井
兼太郎 井元
高橋　晋太郎
真一 瀧本
克昌 藤田
泰央 米丸
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オリンパス株式会社
国立大学法人大阪大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the present invention relates to a microscope and an image acquisition method.
  • Patent Document 1 A microscopic technique having a high spatial resolution exceeding the diffraction limit is known (for example, see Patent Document 1).
  • a sample is irradiated with laser light having such intensity that fluorescence is saturated, and an image is generated by detecting only a signal corresponding to a saturation component of fluorescence using a modulation / demodulation technique.
  • the non-linearity of the fluorescence generation efficiency with respect to the excitation light is high, and it is possible to realize high spatial resolution by utilizing the fact that the spot diameter can be reduced by detecting this.
  • Patent Document 1 modulates the intensity of excitation light and demodulates it at a higher-order frequency.
  • the time change of the fluorescence becomes equal to the time change of the excitation light.
  • the time change of the fluorescence and the excitation light shows different aspects. Since the change appears as a higher-order frequency component of the modulated frequency as a result, only this higher-order frequency component is detected by demodulating with a lock-in amplifier.
  • Patent Document 1 only nonlinear components are obtained by irradiating excitation light having two or more intensities including the intensity at which fluorescence is saturated, acquiring images, and fitting the relationship of the fluorescence intensity to the excitation light intensity. An extraction method is also disclosed.
  • a signal of a saturation component is only partially detected.
  • the intensity I Ex (t) of the laser light and the intensity I Fl (t) of the fluorescence can be expressed by the following expressions (1) and (2).
  • ⁇ is a coefficient of a first-order component (proportional to the first power) with respect to the laser light
  • ⁇ is a coefficient of a second-order (proportional to the second power) component with respect to the laser light.
  • a component of the third order (proportional to the third power) or more may be generated.
  • the fluorescent unsaturated component contributes to ⁇
  • the fluorescent saturated component contributes to ⁇ . That is, detecting the fluorescence saturation component is equivalent to detecting the ⁇ component.
  • ⁇ is also included in other terms, and the intensity included in the final term is 1/8 of the whole. That is, the fluorescence saturation signal obtained by demodulation at the frequency 2f is 1/8 of what is actually generated, and the remaining 7/8 does not contribute to the output image. For this reason, the method of Patent Document 1 cannot acquire all of the saturation signals, and there is a problem that the S / N ratio is poor.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a microscope and an image acquisition method capable of improving the S / N ratio and realizing higher spatial resolution by simple processing. It is aimed.
  • signal light is generated by irradiation, and at least one of the irradiation lights has an irradiation intensity that saturates or nonlinearly increases / decreases the signal light, and two or more irradiation lights having different irradiation intensities are applied to the same location
  • An irradiating unit that irradiates the sample separately, a signal light detecting unit that detects the signal light generated by irradiating the sample with the irradiation light, and a plurality of optical signals acquired by the signal light detecting unit.
  • the difference between a plurality of normalized optical signals obtained by normalization so that the light intensity components without saturation or non-linear increase / decrease coincide is calculated and obtained. It is a microscope provided with the image generation part which produces
  • the signal light detection unit acquires optical signals having intensities corresponding to the irradiation intensities of the respective irradiation lights separately irradiated to the same portion of the sample by the irradiation unit.
  • the signal light may be fluorescence.
  • the irradiation unit sets the irradiation intensity and the irradiation time of each irradiation light so that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each corresponding irradiation light are equal, so that the light It is good also as normalizing a signal.
  • the difference calculation process can be performed using the optical signal acquired by the signal light detection unit as it is as the normalized optical signal, and the difference calculation process can be simplified. Further, it is possible to avoid the narrowing of the dynamic range of the optical signal.
  • the image generation unit may normalize the optical signal based on a ratio of integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each corresponding irradiation light. By comprising in this way, the saturation component of signal light can be extracted correctly, without adjusting the setting conditions of irradiation intensity and irradiation time of irradiation light.
  • the irradiation unit irradiates the irradiation light that generates the signal light by a two-photon excitation method, and an integral value within the irradiation time of the square of the irradiation intensity of each corresponding irradiation light is
  • the optical signal may be normalized by setting the irradiation intensity and irradiation time of each irradiation light so as to be equal.
  • the said irradiation part irradiates the said irradiation light which generates the said signal light by a two-photon excitation method
  • the said image generation part is the said irradiation time of the square of the irradiation intensity
  • the optical signal may be normalized by the ratio of the integral values.
  • the image generation unit calculates the difference for each line irradiated with the irradiation light, for each signal light image, for each pixel of the signal light image, or for each stack of the plurality of signal light images. It is good also as calculating.
  • the difference is calculated for each signal light image or for each stack, the calculation process can be performed after forming an image for each irradiation light to some extent, and the difference process can be simplified. it can.
  • the difference process can be performed after forming an image for each irradiation light to some extent, and the difference process can be simplified. it can.
  • the difference process can be simplified. it can.
  • when calculating the difference for each line or pixel even if fluctuations in the irradiation time of the irradiation light, sample displacement, etc. occur due to the influence of changes in the environmental temperature, it is possible to make errors less likely to occur. .
  • the image generation unit may include a lock-in amplifier that performs the difference calculation process, and the lock-in amplifier may calculate the difference for each pixel of the signal light image.
  • the difference calculation process can be performed easily and accurately using a commercially available lock-in amplifier.
  • the irradiation unit separately irradiates the sample with three or more irradiation lights having different irradiation intensities, and the image generation unit performs a difference with respect to the plurality of normalized optical signals a plurality of times. It is good as well. With this configuration, it is possible to generate a signal light image based on higher-order saturated components in the optical signal and realize higher spatial resolution.
  • the image generation unit may have a deconvolution function.
  • signal light is generated by irradiation, and at least one of the irradiation lights has an irradiation intensity that saturates or nonlinearly increases / decreases the signal light, and two or more irradiation lights having mutually different irradiation intensities are applied to the same part Irradiating separately, a signal light detecting step for detecting the signal light generated by irradiating the sample with each irradiation light, and a plurality of optical signals obtained by the signal light detecting step.
  • an optical signal having an intensity corresponding to the irradiation intensity of each irradiation light separately irradiated to the same portion of the sample by the irradiation step is acquired by the signal light detection step.
  • the signal light since at least one irradiation light has an irradiation intensity that saturates or nonlinearly increases / decreases the signal light, a plurality of normalizations normalized so that the light intensity components of these optical signals coincide with each other in the calculation step Only the saturation or nonlinear increase / decrease component of the signal light can be efficiently extracted by the arithmetic processing of the difference of the optical signal. Therefore, a signal light image having a higher spatial resolution with an improved S / N ratio can be generated by the image generation step.
  • the signal light may be fluorescence.
  • the irradiation step sets the irradiation intensity and irradiation time of each irradiation light so that the integrated values within the irradiation time of the corresponding irradiation intensity of each irradiation light are equal. It is good also as normalizing a signal.
  • the difference calculation process can be performed by using the optical signal acquired in the signal light detection step as it is as the normalized optical signal, and the difference calculation process can be simplified. Further, it is possible to avoid the narrowing of the dynamic range of the optical signal.
  • the image generation step may normalize the optical signal based on a ratio of integral values within the irradiation time of the corresponding irradiation intensity of the irradiation light.
  • the irradiation step irradiates the irradiation light that generates the signal light by a two-photon excitation method, and an integral value within the irradiation time of the square of the irradiation intensity of each corresponding irradiation light is
  • the optical signal may be normalized by setting the irradiation intensity and irradiation time of each irradiation light so as to be equal.
  • the irradiation step irradiates the irradiation light that generates the signal light by a two-photon excitation method
  • the image generation step includes the irradiation time of the square of the irradiation intensity of each corresponding irradiation light.
  • the optical signal may be normalized by the ratio of the integral values.
  • FIG. 6A shows an example of the result of having carried out the two-photon excitation observation of the fluorescent bead of diameter 100nm like the conventional with the excitation light of wavelength 800nm. It is a figure which shows an example of the result of having carried out the two-photon excitation observation of the same bead as FIG. 6A in the same condensing position with the fluorescence microscope which concerns on this embodiment. It is the figure which showed the line profile of the bead shown with the number of 1 to 5 in FIG. 6A. It is a figure which shows the relationship between the irradiation intensity of a 3rd laser beam, and a pulse width.
  • the fluorescence microscope 1 has a configuration capable of observing the sample S by one-photon excitation.
  • the fluorescence microscope 1 includes a light source device (irradiation unit) 3 that emits laser light (irradiation light), an illumination optical system (irradiation unit) 5 that irradiates the sample S with laser light emitted from the light source device 3, and Based on a detection optical system (signal light detection unit) 7 that detects fluorescence (signal light) generated by irradiating the sample S with laser light, and a fluorescence signal (light signal) acquired by the detection optical system 7.
  • a processing device (image generation unit) 9 such as a PC (Personal Computer) that generates a fluorescent image (signal light image) is provided.
  • the light source device 3 includes a laser light source 11 that generates laser light, and a light modulation unit 13 that modulates the laser light emitted from the laser light source 11.
  • the light modulation unit 13 is, for example, an acousto-optic element, and can modulate the laser light from the laser light source 11 into a pulse having a rectangular shape with a predetermined intensity and a predetermined pulse width.
  • the light modulator 13 selectively emits the laser light from the laser light source 11 by switching to two laser lights having different irradiation intensities and pulse widths. Further, the light modulation unit 13 sets the irradiation intensity and pulse width (irradiation time) of these laser beams so that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each laser beam in the exposure for one pixel are equal. It has become.
  • the illumination optical system 5 includes a two-axis galvano scanner (hereinafter simply referred to as a scanner) 15 that two-dimensionally scans the laser light emitted from the light source device 3 and a pupil that condenses the laser light scanned by the scanner 15. While the projection lens 17, the imaging lens 19 that makes the laser light condensed by the pupil projection lens 17 substantially parallel light, and the laser light that has been made substantially parallel light by the imaging lens 19 irradiate the sample S, the sample S And an objective lens 21 that condenses the fluorescence generated when the S fluorescent material is excited.
  • a scanner two-axis galvano scanner
  • the scanner 15 includes a pair of galvanometer mirrors 16A and 16B that can swing around swinging axes that intersect each other.
  • the scanner 15 is arranged so that the intermediate position between the pair of galvanometer mirrors 16A and 16B is conjugate to the pupil position of the objective lens 21. Further, the scanner 15 can scan the laser light in the X direction and the Y direction orthogonal to each other in accordance with the swing angle of each galvanometer mirror 16A, 16B.
  • the detection optical system 7 includes a dichroic mirror 23 that branches the fluorescence that is collected by the objective lens 21 and returns to the optical path of the laser light from the optical path of the laser light, and a condensing lens 25 that collects the fluorescence branched by the dichroic mirror 23. And a pinhole 27 that restricts the passage of the fluorescence condensed by the condenser lens 25 and a detector 29 that detects the fluorescence that has passed through the pinhole 27.
  • the dichroic mirror 23 transmits the laser light from the laser light source 11 that has passed through the light modulation unit 13 toward the scanner 15, while the laser light from the sample S passes through the objective lens 21, the imaging lens 19, and the pupil projection lens 17.
  • the fluorescent light returning from the optical path is reflected toward the condenser lens 25.
  • the pinhole 27 is disposed at a position optically conjugate with the sample S, and constructs a confocal optical system.
  • the pinhole 27 can pass only the fluorescence generated at the focal position of the objective lens 21 in the sample S.
  • the detector 29 is a photomultiplier tube (PMT), for example, and sends a fluorescence signal corresponding to the detected fluorescence intensity to the processing device 9.
  • PMT photomultiplier tube
  • the processing device 9 scans the laser beam sent from the scanner 15 and the fluorescence signal sent from the detector 29 when fluorescence generated by irradiating the scanning beam with the laser beam is detected. Are stored in association with each other to generate a two-dimensional fluorescence image.
  • the fluorescent image generated by the processing device 9 can be displayed on a display (not shown) or stored in a memory (not shown).
  • the processing device 9 calculates the difference between the two fluorescent signals sent from the detector 29 corresponding to two laser beams having different irradiation intensities and pulse widths, and the obtained difference.
  • a fluorescent image is generated using the signal.
  • the light modulation unit 13 sets the irradiation intensity and the pulse width of the two laser beams so that the integrated values of the irradiation intensities of the respective laser beams within the irradiation time are equal to each other.
  • the two fluorescence signals are normalized so that non-saturated components (light intensity components) in which saturation does not occur coincide with each other. Therefore, the two fluorescence signals output from the detector 29 become normalized fluorescence signals (normalized light signals), respectively.
  • two laser beams one of which has an irradiation intensity that saturates fluorescence and has mutually different irradiation intensity and pulse width, are the same on the sample S It was acquired by the irradiation step S1 for irradiating the spot separately, the fluorescence detection step (signal light detection step) S2 for detecting the fluorescence generated by each laser beam being irradiated to the sample S, and the fluorescence detection step S2.
  • Step S3 and image generation step S4 for generating a fluorescent image using the difference signal obtained in calculation step S3 are included.
  • the laser light is modulated by the light modulation unit 13, and the fluorescence images are respectively emitted by two laser lights having different irradiation intensity and pulse width. To get.
  • the light modulation unit 13 has a pulse width of ⁇ t1 at an intensity (I EX1 ) at which the laser light generated from the laser light source 11 is not saturated for each pixel.
  • I EX1 intensity
  • the laser beam thus modulated is referred to as a first laser beam.
  • the vertical axis indicates the intensity of the laser beam
  • the horizontal axis indicates the irradiation time. The same applies to FIGS. 3B, 7 and 9A.
  • the first laser light emitted from the light modulation unit 13 passes through the dichroic mirror 23, is scanned by the scanner 15, and is condensed by the pupil projection lens 17. Then, the first laser light is collimated by the imaging lens 19 and irradiated on the sample S by the objective lens 21 (irradiation step S1). Thereby, the first laser beam is scanned two-dimensionally on the sample S according to the swing angle of each galvanometer mirror 16A, 16B of the scanner 15.
  • Fluorescence generated when the fluorescent material of the sample S is excited by scanning the first laser light is condensed by the objective lens 21 and is transmitted through the imaging lens 19, the pupil projection lens 17, and the scanner 15. Returning to the optical path, the dichroic mirror 23 branches off the optical path of the laser light.
  • the fluorescence is condensed by the condenser lens 25, and only the fluorescence generated at the focal position of the objective lens 21 in the sample S passes through the pinhole 27 and is detected by the detector 29 (fluorescence detection step S2).
  • the fluorescence image of the sample S is produced
  • the fluorescent image generated by the processing device 9 may be displayed on a display.
  • the light modulation unit 13 has a pulse width of ⁇ t2 shorter than ⁇ t1 with an intensity (I EX2 ) at which the laser light generated from the laser light source 11 is saturated for each pixel.
  • I EX2 > I EX1 .
  • the laser beam thus modulated is referred to as a second laser beam.
  • the first laser light and the second laser light have an irradiation intensity (I EX1 , I EX2 ) and an irradiation time ( ⁇ t1, ⁇ t2) such that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity in the exposure for one pixel are equal to each other. ) Is set.
  • the second laser beam is scanned two-dimensionally on the sample S as in the case of the first laser beam. Thereby, the fluorescence generated when the fluorescent substance of the sample S is excited is detected by the detector 29, and the fluorescent image of the sample S is generated by the processing device 9.
  • the processing device 9 detects the fluorescence generated by the first laser beam and detects the fluorescence signal acquired by the detector 29 and the fluorescence generated by the second laser beam, thereby detecting the detector 29.
  • the difference from the fluorescence signal acquired by the above is calculated (calculation step S3), and a fluorescence image is generated using the obtained difference signal (image generation step S4).
  • the intensity of the fluorescence generated by the first laser light between the pixels (hereinafter referred to as the first fluorescence) is expressed by the following equation (3), and the fluorescence generated by the second laser light between the pixels.
  • the intensity of (hereinafter referred to as second fluorescence) is represented by the following formula (4).
  • the first laser beam (I EX1 ) is a condition that does not saturate the fluorescence, there is no ⁇ term in the equation (3). Further, since the time waveform of the laser is a rectangular wave, the time integral of the inside Delta] t 1 and Delta] t 2 is replaced with the product of the Delta] t 1 and Delta] t 2, respectively. On the other hand, since the second laser light (I EX2 ) has an intensity at which the fluorescence is saturated, the term ⁇ remains in the equation (4).
  • the light modulation section 13 causes the irradiation intensity and pulse of the two laser lights so that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of the first laser light and the second laser light in the exposure for one pixel become equal.
  • the width By setting the width, the following equation (5) is established.
  • the processor 9 calculates the difference between the fluorescence signal of the first fluorescence and the fluorescence signal of the second fluorescence, thereby eliminating the linear term with ⁇ as shown in the following equation (6).
  • ⁇ the non-linear component term of ⁇ , that is, only the saturated component of fluorescence can be extracted.
  • the processing device 9 generates a fluorescent image based on the difference signal obtained by the difference calculation process of the expression (6), so that a high resolution using only a saturated component of fluorescence has a high S / N ratio. Can be realized in the state.
  • FIG. 4A shows, as a comparative example of the present embodiment, the first comparative fluorescence when the sample S is irradiated with the first comparative laser light and the second comparative laser light that are changed only in the irradiation intensity at the same irradiation time. And PSF of the second comparative fluorescence.
  • the first comparison laser beam is modulated to an intensity at which the fluorescence is not saturated
  • the second comparison laser beam is modulated to an intensity at which the fluorescence is saturated.
  • the shapes of the first comparative fluorescence and the second comparative fluorescence differ depending on whether or not they are saturated. However, since the irradiation intensity of the laser light is different, the fluorescence intensity is also greatly different. Extracting only the saturation component by the difference and improving the spatial resolution means that the tail portion of the PSF shown in FIG. 4A (that is, the fluorescence intensity portion where saturation is not generated) is efficiently brought close to zero by the difference. However, in the state of FIG. 4A, since the difference in intensity between the first comparative fluorescence and the second comparative fluorescence is large, the skirt does not become zero even if the difference calculation is performed, that is, a linear component remains.
  • the intensity of the first fluorescence and the second fluorescence is normalized by the light modulation unit 13 so that the non-saturated components (linear components) in which saturation does not occur coincide with each other. Therefore, the bottom portions of the PSFs shown in the figure match between the first fluorescence and the second fluorescence, and the central portion is in a state where the intensity is different due to saturation.
  • the skirt (linear component) in FIG. 4B becomes zero, and as shown in FIG. 4C, the PSF Only the non-linear component (saturated component) which is the central part of can be efficiently extracted. Thereby, the width of the PSF can be narrowed to increase the spatial resolution.
  • the sample S is irradiated with two laser beams each having an irradiation intensity that saturates the fluorescence, and the processing device 9 causes the laser beams to be irradiated.
  • the irradiation intensity and pulse width of the first laser beam and the second laser beam are set in advance by the light modulator 13 so that the expression (5) is satisfied.
  • the processing device 9 may normalize the fluorescence signals of the first fluorescence and the second fluorescence by multiplying the coefficients so that the expression (5) is substantially satisfied.
  • both the irradiation intensity and pulse width setting of the first laser light and the second laser light, and the coefficient multiplication of the fluorescence signals of the first fluorescence and the second fluorescence may be performed. The fluorescence signal thus normalized becomes a normalized fluorescence signal.
  • the ratio k of the integrated value within the irradiation time of the irradiation intensity of each laser beam is expressed by Equation (7).
  • the processing device 9 sets a ratio k of the irradiation intensity of the laser beam to the integral value within the irradiation time, and multiplies the equation (3) of the first fluorescence by the ratio k. Therefore, the difference from the second fluorescence equation (4) may be calculated.
  • Equation (6) is a negative value
  • the direction of the difference calculation is subtracted from the fluorescence signal acquired in the saturated state from the fluorescence signal acquired in the non-saturated state, as shown in Equations (6) and (8).
  • the pulse waveform of each laser beam does not have to be rectangular, and the equation (5) may be established at the time of difference.
  • the first laser beam is set to an intensity at which the fluorescence is not saturated, but the first laser beam may also be set to an intensity at which the fluorescence is saturated. ) Can be deleted by the difference. In this case, the difference in terms of ⁇ is output.
  • the second-order term is shown as the nonlinear term, but a third-order or later component may be generated. Even in this case, since the linear term is eliminated by the difference, all the second and higher order terms are detected.
  • the fluorescent image is first acquired with the first laser light having an intensity that does not saturate the fluorescence, and then the fluorescent image is acquired with the second laser light having an intensity that saturates the fluorescence. It is desirable to do. Since the irradiation intensity of the second laser light is stronger than that of the first laser light, the possibility of fluorescence fading during observation can be reduced by performing image acquisition with the first laser light first. . Note that since the irradiation time of the second laser light is short, the fading of fluorescence hardly occurs even in image acquisition using the second laser light.
  • the processing device 9 may have a deconvolution function and deconvolve the fluorescence image after the difference calculation. For example, if the measurement condition error does not satisfy the equation (5), or if the coefficient M is set to be the following equation (9) instead of the equation (5), the first difference is calculated to satisfy this equation.
  • the coefficient M is set to be the following equation (9) instead of the equation (5)
  • the first difference is calculated to satisfy this equation.
  • a negative intensity component is added to the PSF during the difference calculation. Will occur.
  • the PSF shape including the negative intensity component is grasped in advance by simulation or actual measurement, and the fluorescence image after the difference calculation is deconvoluted using the grasped PSF shape, the negative intensity component is not included. It becomes possible to restore the fluorescence image.
  • the PSF including a negative component has a high spatial frequency, and the spatial resolution can be further improved by deconvolution.
  • the difference is calculated for each fluorescent image, but instead, for example, the processing device 9 performs a stack of a plurality of fluorescent images, a line irradiated with laser light, Alternatively, the difference may be calculated at any timing for each pixel of the fluorescent image.
  • the calculation process can be performed after an image is formed to some extent for each excitation light, and the difference process can be simplified. is there.
  • the difference is calculated for each line of laser light or for each pixel of the fluorescent image, the irradiation time of the laser light may fluctuate due to the influence of changes in the environmental temperature or the stage on which the sample S is placed. Even if the sample S drifts and the position shift occurs, there is an advantage that an error can be hardly generated.
  • an acousto-optic element has been described as an example of the light modulation unit 13.
  • any configuration may be used as long as the irradiation intensity and pulse width of laser light can be adjusted.
  • another element such as an electro-optical element may be used as the light modulation unit 13, or the laser light source 11 may be directly modulated without using the light modulation unit 13.
  • the biaxial galvano scanner is exemplified as the scanner 15.
  • the stage S may be held while holding the sample S by a stage, and the scanner 15 is limited to the biaxial galvano scanner. It is not a thing.
  • the fluorescence microscope 1 includes an ultrashort pulse laser such as a titanium sapphire laser as the laser light source 11 as shown in FIG.
  • the fluorescent light emitted from the sample S and condensed by the objective lens 21 is not provided with the pinhole 27 and is branched from the optical path of the laser beam by the dichroic mirror 23 before entering the imaging lens 19. It is made to inject into.
  • the light modulation unit 13 switches the laser light to two laser lights having different irradiation intensity and pulse width in a rectangular pulse, and within the irradiation time of the irradiation intensity of each laser light in exposure for one pixel.
  • the irradiation intensity and pulse width of these two laser beams are set so that the integral values are equal.
  • the intensity of the first fluorescence generated by the first laser light during one pixel is represented by the following equation (10), and the intensity of the second fluorescence generated by the second laser light during one pixel is represented by the following ( 11)
  • the unsaturated component is irradiated with laser light.
  • the saturation component is proportional to the fourth power of the irradiation intensity of the laser beam.
  • the time integration of the square of the irradiation intensity of the laser light between the pixels is made equal between the first laser light and the second laser light as in the condition of the expression (12). This is significantly different from the case of one-photon excitation.
  • FIGS. 6A, 6B, and 6C An example of a fluorescent image acquired by the present embodiment and a comparative example thereof are shown in FIGS. 6A, 6B, and 6C.
  • FIG. 6A shows a result of two-photon excitation observation of a fluorescent bead having a diameter of 100 nm with a laser beam having a wavelength of 800 nm as in the past as a comparative example of the present embodiment. A plurality of beads are displayed in the fluorescence image.
  • FIG. 6B shows the result of two-photon excitation observation of the same bead as in FIG. 6A at the same condensing position according to this embodiment.
  • FIG. 6B shows that the size of the fluorescent bead is smaller than that of FIG. 6A, and the spatial resolution is improved.
  • FIG. 6C shows a line profile of beads indicated by numbers 1 to 5 in FIG. 6A.
  • FIG. 6C shows that the line profile is acquired at a position crossing the center of gravity of each bead, the position where the line profile is taken around the position of the center of gravity is rotated, each line profile is added and averaged, and this process is performed for each bead. The average of the line profile of 1 to 5 beads was taken.
  • the broken line is the line profile of the beads observed by the conventional two-photon observation method of FIG. 6A
  • the solid line is the line profile of the beads observed by the two-photon excitation observation of this embodiment shown in FIG. 6B.
  • the spatial resolution can be improved as compared with the conventional two-photon excitation observation.
  • the line profile of FIG. 6C includes the size of the fluorescent beads, and is not the resolution of the microscope itself (PSF). That is, according to the fluorescence microscope 1 and the image acquisition method according to the present embodiment, the degree of improvement in PSF resolution is greater than the result of FIG. 6C.
  • the fluorescence signal is normalized by the modulation of the laser beam by the light modulation unit 13, but instead, the processing device 9 emits the square of the irradiation intensity of each corresponding laser beam. It is good also as normalizing a fluorescence signal by the ratio of the integral value in time.
  • the ratio k of the integral value within the irradiation time of the square of the irradiation intensity of each laser beam is expressed by equation (14).
  • the processing device 9 sets the integral value ratio k within the irradiation time of the square of the irradiation intensity of the laser light, and sets the ratio k in the equation (10) of the first fluorescence. What is necessary is just to calculate the difference with (11) Formula of 2nd fluorescence after multiplying.
  • the illumination optical system 5 separately irradiates the sample S with three or more laser beams having different irradiation intensities, and the processing device 9 has a plurality of normalized fluorescence.
  • the difference from the first embodiment is that the difference with respect to the signal is performed a plurality of times.
  • the configuration of the fluorescence microscope 1 is the same as that shown in FIG. In the description of the present embodiment, the same reference numerals are given to portions that share the same configuration as the fluorescence microscope 1 and the image acquisition method according to the first embodiment described above, and description thereof is omitted.
  • the light modulation unit 13 selectively emits three laser beams having different irradiation intensities and pulse widths.
  • three laser beams are a first laser beam shown in FIG. 3A, a second laser beam shown in FIG. 3B, and a third laser beam shown in FIG. These are first fluorescence, second fluorescence, and third fluorescence, respectively.
  • the third laser light is assumed to have a pulse width of ⁇ t3 shorter than ⁇ t2 with an irradiation intensity stronger than that of the second laser light for each pixel.
  • the light modulation unit 13 includes the first fluorescence including no saturation component, the second fluorescence including a saturation component exhibiting a second-order nonlinear response to the excitation laser, and the third fluorescence including a third-order saturation component.
  • the irradiation intensity and pulse width of each laser beam are adjusted so that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each laser beam in the exposure for one pixel are equal.
  • the intensity of the first fluorescence is expressed by the following expression (16)
  • the intensity of the second fluorescence is expressed by the expression (17)
  • the intensity of the third fluorescence is expressed by the expression (18).
  • the pulse shapes of these three laser beams are rectangular, and the integration of the irradiation time is equal to multiplication by the pulse width.
  • the above equation (5) is established by setting the irradiation intensity and pulse width of each laser beam by the light modulator 13, and the difference between the fluorescence signal of the first fluorescence and the fluorescence signal of the second fluorescence is the same as in the first embodiment.
  • the above equation (6) holds.
  • equation (20) is established by the difference between the fluorescence signal of the first fluorescence and the fluorescence signal of the third fluorescence.
  • equation (21) the ⁇ term whose fluorescence intensity is proportional to the square of the irradiation intensity of the laser beam is also deleted, and only the ⁇ term proportional to the third power remains. This means that the second and subsequent nonlinear terms are detected in the first embodiment, whereas the third and subsequent nonlinear terms are detected in the third embodiment. Therefore, according to the present embodiment, further improvement in spatial resolution can be realized.
  • This embodiment is not limited to the third order, and as long as the S / N ratio allows, the spatial resolution can be improved by increasing the order of nonlinear terms detected by increasing the number of times of image acquisition and difference. It is. Although it is assumed that the first fluorescence includes only a linear component, the second fluorescence includes up to a second-order nonlinear component, and the third laser light includes up to a third-order nonlinear component, both are higher-order nonlinear components. May be included. Further, the present embodiment is not limited to one-photon excitation, and can be used in two-photon excitation observation as in the second embodiment.
  • the processing device 9 may normalize the fluorescence signal based on the ratio of the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each corresponding laser beam.
  • the ratio of the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of the first laser beam and the second laser beam is set to the above equation (7), and the irradiation time of the irradiation intensity of the first laser beam and the third laser beam is used.
  • the ratio of the integral values is the following equation (22).
  • the processing apparatus 9 multiplies the first fluorescence (16) equation by the ratio k of the laser light irradiation intensity shown in equation (7) to the integral value within the irradiation time, and then the second fluorescence equation (17). What is necessary is just to calculate the difference with these. By doing so, as shown in the above equation (8), it is possible to eliminate a linear term having ⁇ and extract only a nonlinear component term (saturated component) of ⁇ .
  • the processing device 9 sets the ratio l of the irradiation intensity of the laser beam to the integral value within the irradiation time, and multiplies the equation (16) of the first fluorescence by the ratio l. Therefore, the difference from the expression (18) of the third fluorescence may be calculated.
  • the processing device 9 uses the ratio k and the ratio l with respect to the time integral value of the irradiation intensity of the laser beam as shown in the following expression (24) based on the expressions (8) and (23). Only high-order nonlinear components (saturated components) can be extracted.
  • the processing device 9 includes a lock-in amplifier 31 that performs a difference calculation process. This is different from the first embodiment in that a difference is calculated for each pixel.
  • the same reference numerals are given to portions that share the same configuration as the fluorescence microscope 1 and the image acquisition method according to the first embodiment described above, and description thereof is omitted.
  • the light modulator 13 switches the first laser light and the second laser light a plurality of times within the time for detecting one pixel, and alternately irradiates the sample S at a specific frequency. Yes.
  • switching of each laser beam is repeated twice per pixel, but the number of times is not limited to this.
  • the light modulation unit 13 adjusts the irradiation intensity and pulse width of each laser beam so that the integrated values within the irradiation time of the irradiation intensity of each laser beam in the exposure for one pixel become equal. Yes.
  • FIG. 9B shows changes in fluorescence signal of fluorescence generated by each laser beam irradiation.
  • the signal value of each pixel is an integrated value within each pixel time of the fluorescence signals of the first fluorescence and the second fluorescence generated by the first laser light and the second laser light.
  • the signal value of the second fluorescence is indicated by dots.
  • the light modulation unit 13 Since the irradiation intensity of each laser beam and the pulse width are set by the light modulator 13, the expression (5) (equation (12) in the two-photon excitation) is satisfied, so the signal intensity of the first fluorescence and the second fluorescence The difference is only the nonlinear component. Further, the light modulation unit 13 alternately irradiates the sample S with the first laser beam and the second laser beam at a specific frequency as shown in FIG. 9A, thereby generating alternately at the specific frequency as shown in FIG. 9B. The first fluorescence and the second fluorescence to be detected are detected by the detector 29.
  • the lock-in amplifier 31 is disposed between the detector 29 and the processing device 9 and detects the fluorescence signals of the first fluorescence and the second fluorescence shown in FIG. Demodulation is performed at a specific frequency of the modulation unit 13. Thereby, the difference between the fluorescence signal of the first fluorescence and the fluorescence signal of the second fluorescence can be extracted.
  • the processing device 9 even if the fluorescence signal output from the detector 29 is arithmetically processed and the difference calculation is not performed by the processing device 9, the processing device 9 only processes the signal after passing through the commercially available lock-in amplifier 31. A fluorescence image using only a saturated component can be created. In this case, the processing device 9 only creates and displays a fluorescent image.
  • the saturation of the fluorescence has been described so far, but the present proposal can be used for other phenomena as long as the nonlinear response of the fluorescence signal due to the increase of the excitation light intensity.
  • isomerization occurs due to an increase in excitation light intensity. Since this is also a non-linear response (non-linear increase / decrease in fluorescence) to an increase in excitation light intensity, the spatial resolution can be improved by applying the present plan in the same manner as saturation.
  • each of the fluorescence signals in the same manner as in each of the above embodiments in which each of the fluorescence signals is normalized so that the non-saturated components that do not saturate match each other, each of the fluorescence signals so that the light intensity components that do not cause nonlinear increase and decrease match each other. Should be normalized.
  • the present proposal is also useful in the case of other light detection in which the signal light nonlinearly responds by increasing the irradiation laser light intensity. It can also be used for reflection, absorption, scattering, and multiphoton effects. The effects on these phenomena are described below.
  • the signal light is not the fluorescence emitted from the sample, but the reflected light, scattered light, transmitted light, or the light component generated by the multiphoton effect when the sample is irradiated with the laser light.
  • the scattering described here refers to Mie scattering and Rayleigh scattering.
  • An apparatus configuration diagram is shown in FIG. In the description of the present embodiment, portions that share the same configuration as those of the fluorescence microscope 1 and the image acquisition method according to each of the embodiments described above are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • FIG. 10 is substantially the same as FIG. 1, except that the dichroic mirror 23 is replaced with a beam splitter 33 and a dichroic filter 35 is inserted between the beam splitter 33 and the condenser lens 25.
  • the light emitted from the laser light source 11 does not need to induce fluorescence of the sample S, and a component in which the laser light is reflected or backscattered by the sample S is detected as signal light. That is, the laser light incident on the sample S is reflected or backscattered by the sample S, and the reflected light or backscattered light is collected by the objective lens 21. Thereafter, the reflected light or backscattered light is deflected by the beam splitter 33, passes through the dichroic filter 35, passes through the pinhole 27, and is detected by the detector 29.
  • a nonlinear component of the laser beam is generated in the sample S. That is, when the wavelength of the laser beam is ⁇ , a harmonic having a wavelength of ⁇ / n (n: a natural number of 2 or more) is generated.
  • the dichroic filter 35 is designed to transmit the same wavelength as that of the laser light and cut other wavelengths including nonlinear components generated in the sample S. Therefore, the signal that passes through the dichroic filter 35 and is detected by the detector 29 is only reflected light or backscattered light that does not contain a nonlinear component.
  • the intensity of the component having the same wavelength as the laser beam is reduced by the amount of the nonlinear component. It will be. Therefore, in the state where the non-linear component is not generated, the intensity of the reflected light or the backscattered light from the sample S of the laser light is proportional to the intensity of the laser light incident on the sample S, but in the state where the non-linear component is generated. As a result, a non-linear decrease corresponding to the generation of the non-linear component occurs.
  • reflected light or backscattered light is detected, but transmitted light or forward scattered light transmitted through the sample S may be detected. Even in this case, only the same wavelength component as the laser light is extracted by the dichroic filter 35 and detected by the detector 29. The same is true in that signal light is acquired by irradiating laser light with different irradiation conditions, and the spatial resolution is improved by extracting only nonlinear components by differential processing of the signal.
  • the dichroic filter 35 may cut the same wavelength as the laser light and transmit other wavelengths.
  • a component having a wavelength different from that of the laser light is detected by the detector 29.
  • hyper-Rayleigh scattering, harmonic generation, Raman scattering, coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS), four-wave mixing, stimulated emission, difference frequency generation, sum generation, parametric fluorescence, or stimulated Raman scattering (SRS) Light may be detected.
  • the integrated value within the irradiation time of the laser beam irradiation intensity is equal to the equation (5) in the first embodiment. Set the irradiation conditions.
  • the laser light irradiation intensity is raised to the power of the non-linear order as shown in the expression (12) of the second embodiment. Irradiation conditions are set so that the integral values of are equal.
  • the nonlinear component extracted by the difference is a nonlinear component having a higher order than the order of the nonlinear effect for generating the signal light. That is, when considering SHG that is second-order harmonic generation, at least the order of the nonlinear effect for generating signal light is second-order, but the higher-order component extracted by the difference of the present plan is the third-order or later nonlinear component. It becomes.
  • the difference processing may be performed using the ratio k as in the equations (7) and (14), and only a higher-order nonlinear component is extracted by performing a plurality of differences as in the third embodiment.
  • a nonlinear increase component of signal light generated by the nonlinear optical effect may be detected.
  • the sample is a saturable absorber or the like
  • nonlinear signal light increases by increasing the laser light intensity. It is also possible to acquire only this non-linear increase component by the difference of the present plan.
  • it can utilize also for the detection of a photoacoustic signal like a nonpatent literature 1.
  • the irradiation intensity and irradiation time of the laser beam irradiated on the sample are set under a plurality of conditions, and the difference between the acoustic signals detected by the transducer in each condition is taken, so that the laser light absorption is reduced.
  • the spatial resolution can be improved by extracting high-order nonlinear components.
  • the present scheme detects a nonlinear response component of a signal with respect to light irradiation, and the phenomenon may be anything and is not limited to the above.
  • the light to irradiate the sample has been described as a laser beam so far. This is because a strong light source such as a laser is suitable for generating a non-linear response, and has an intensity that generates a non-linear response. Any light source may be used.

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Abstract

簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することを目的として、本発明の蛍光顕微鏡（１）は、照射によって蛍光を発生し、少なくとも１つが蛍光を飽和させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の励起光を試料（Ｓ）の同一箇所に別々に照射する光源装置（３）および照明光学系（５）と、各励起光を試料（Ｓ）に照射することにより発生した蛍光をそれぞれ検出する検出光学系（７）と、検出光学系（７）により取得された複数の蛍光信号を、対応する各励起光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和が生じていない非飽和成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化蛍光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて蛍光画像を生成する処理装置（９）とを備える。

Description

顕微鏡および画像取得方法
　本発明は、顕微鏡および画像取得方法に関するものである。
　回折限界を超える高い空間分解能を有する顕微鏡技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
　この特許文献１においては、蛍光が飽和するような強度のレーザ光を試料に照射し、変復調技術を利用して蛍光の飽和成分に該当する信号のみを検出して画像を生成している。蛍光の飽和が生じている領域においては、励起光に対する蛍光の発生効率の非線形性が高く、これを検出することでスポット径を小さくできることを利用して、高い空間分解能を実現することができる。
　さらに具体的には、特許文献１は、励起光の強度を変調し、それよりも高次の周波数で復調している。蛍光が飽和していない状態においては、蛍光の時間変化は励起光の時間変化と等しくなるが、蛍光が飽和している箇所では、蛍光と励起光の時間変化は異なる様相を示すようになる。その変化分が、結果として変調した周波数の高次周波数成分として現れるので、この高次周波数成分のみをロックインアンプで復調することにより検出している。
　また、特許文献１には、蛍光が飽和する強度を含む２以上の強度の励起光を照射して、それぞれ画像を取得し、励起光強度に対する蛍光強度の関係をフィッティングすることで非線形成分のみを抽出する手法も開示されている。
特許第４４８７０７８号公報 特許第５３１１５９５号公報
Ｄａｎｉｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｐｔｉｃｓ　１９（８），　０８６００６　（Ａｕｇｕｓｔ　２０１４）．
　特許文献１に記載された変復調を利用した飽和成分の検出技術では、飽和成分の信号を部分的に検出しているに過ぎない。例えば、レーザ光が周波数ｆで変調されるものとすると、レーザ光の強度ＩＥｘ（ｔ）と蛍光の強度ＩＦｌ（ｔ）は下記の（１）式、（２）式により表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　ここで、αはレーザ光に対する１次（１乗に比例）の成分の係数であり、βはレーザ光に対する２次（２乗に比例）の成分の係数である。なお、レーザ光の強度によっては３次（３乗に比例）以上の成分も発生するが、ここでは簡単のために２次までの成分で示している。蛍光の非飽和成分はαに寄与し、蛍光の飽和成分はβに寄与する。即ち、蛍光の飽和成分を検出するということは、βの成分を検出することに等しい。特許文献１に記載の方法では、ロックインアンプを利用して２ｆの成分のみを復調することにより、（２）式の最終項のみ、即ちβの成分のみをαの成分から分離して検出することができる。しかし、βは他の項にも含まれており、最終項に含まれる強度は全体の１／８である。即ち、周波数２ｆで復調して得られる蛍光飽和の信号は、実際に発生しているものの１／８であり、残り７／８は出力画像に寄与しない。そのため、特許文献１の方法では飽和信号の全てを取得することはできず、Ｓ／Ｎ比が悪いという課題がある。
　また、特許文献１に記載されたフィッティングを利用する検出技術では、各ピクセルにおいてフィッティング処理を行う必要があり、膨大な計算量が必要となるとともに、フィッティングによる誤差が画像に影響する。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる顕微鏡および画像取得方法を提供することを目的としている。
　本発明の第１態様は、照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射部と、各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出部と、該信号光検出部により取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和また非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡である。
　本態様によれば、照射部により試料の同一箇所に対して別々に照射された各照射光の照射強度に対応する強度の光信号が信号光検出部によりそれぞれ取得される。この場合において、少なくとも１つの照射光が信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有しているので、画像生成部により、これらの光信号の光強度成分が一致するよう正規化された複数の正規化光信号の差分を演算することで、信号光の飽和または非線形増減成分のみを効率よく抽出して信号光画像を生成することができる。したがって、複数の正規化光信号の差分を演算するだけの簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。本態様においては、前記信号光が蛍光であってもよい。
　上記態様においては、前記照射部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。
　このように構成することで、信号光検出部により取得された光信号をそのまま正規化光信号として差分の演算処理を行うことができ、差分の演算処理を簡易にすることができる。また、光信号のダイナミックレンジが狭くなるのを回避することができる。
　上記態様においては、前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。
　このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件を調整することなく、信号光の飽和成分を正確に抽出することができる。
　上記態様においては、前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。
　このように構成することで、簡易な差分の演算処理で、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
　上記態様においては、前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。
　このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件の調整に手間を掛けずに、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
　上記態様においては、前記画像生成部が、前記照射光が照射されるライン毎、前記信号光画像毎、前記信号光画像のピクセル毎、または、複数の前記信号光画像のスタック毎に前記差分を演算することとしてもよい。
　このように構成することで、信号光画像毎またはスタック毎に差分を演算する場合は、照射光ごとに画像をある程度形成してから演算処理を行うことができ、差分処理を簡易にすることができる。また、ライン毎またはピクセル毎に差分を演算する場合は、環境温度の変化の影響などによって照射光の照射時間の揺らぎや試料の位置ずれなどが生じたとしても、誤差を生じ難くすることができる。
　上記態様においては、前記画像生成部が、前記差分の演算処理を行うロックインアンプを備え、該ロックインアンプにより前記信号光画像のピクセル毎に前記差分を演算することとしてもよい。
　このように構成することで、市販されているロックインアンプを利用して差分の演算処理を簡易かつ正確に行うことができる。
　上記態様においては、前記照射部が、相互に照射強度が異なる３以上の前記照射光を前記試料に別々に照射し、前記画像生成部が、前記複数の正規化光信号に対する差分を複数回行うこととしてもよい。
　このように構成することで、光信号におけるより高次の飽和成分に基づいて信号光画像を生成して、より高度の空間分解能を実現することができる。
　上記態様においては、前記画像生成部が、デコンボリューション機能を有することとしてもよい。
　このように構成することで、差分の演算処理時に負の強度成分が発生したとしても、負の強度成分を含まない信号光画像を生成することができる。また、空間周波数の高周波成分を強調してより高い分解能を実現することができる。
　本発明の第２態様は、照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射ステップと、各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出ステップと、該信号光検出ステップにより取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算する演算ステップと、該演算ステップにより得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成ステップとを含む画像取得方法である。
　本態様によれば、照射ステップにより試料の同一箇所に対して別々に照射された各照射光の照射強度に対応する強度の光信号が信号光検出ステップによりそれぞれ取得される。この場合において、少なくとも１つの照射光が信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有しているので、演算ステップによるこれらの光信号の光強度成分が一致するよう正規化された複数の正規化光信号の差分の演算処理により、信号光の飽和または非線形増減成分のみを効率よく抽出することができる。したがって、画像生成ステップにより、Ｓ／Ｎ比が向上されたより高い空間分解能を有する信号光画像を生成することができる。本態様においては、前記信号光が蛍光であってもよい。
　上記態様においては、前記照射ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。
　このように構成することで、信号光検出ステップにより取得された光信号をそのまま正規化光信号として差分の演算処理を行い、差分の演算処理を簡易にすることができる。また、光信号のダイナミックレンジが狭くなるのを回避することができる。
　上記態様においては、前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。
　このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件を調整することなく、信号光の飽和成分を正確に抽出することができる。
　上記態様においては、前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させることとしてもよい。
　このように構成することで、簡易な差分の演算処理で、２光子励起観察によりＳ／Ｎ比が向上されたより高い空間分解能を有する信号光画像を生成することができる。
　上記態様においては、前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化することとしてもよい。
　このように構成することで、照射光の照射強度や照射時間の設定条件の調整に手間を掛けずに、２光子励起観察により、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
　本発明によれば、簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができるという効果を奏する。
本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。 本発明の第１実施形態に係る画像取得方法を説明するフローチャートである。 第１レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。 第２レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。 本実施形態の比較例として、相互に同じ照射時間で照射強度のみを変えた第１比較用レーザ光と第２比較用レーザ光を試料に照射した場合の第１比較用蛍光と第２比較用蛍光のＰＳＦを示す図である。 各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように照射強度およびパルス幅が設定された第１レーザ光と第２レーザ光を試料に照射した場合の第１蛍光と第２蛍光のＰＳＦを示す図である。 ＰＳＦの中心部である非線形成分（飽和成分）のみが抽出された状態を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。 本実施形態の比較例として、従来のように直径１００ｎｍの蛍光ビーズを波長８００ｎｍの励起光で２光子励起観察した結果の一例を示す図である。 本実施形態に係る蛍光顕微鏡により、図６Ａと同じビーズを同じ集光位置で２光子励起観察した結果の一例を示す図である。 図６Ａにおいて１から５の数字で示したビーズのラインプロファイルを示した図である。 第３レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。 本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。 第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度とパルス幅の関係を示す図である。 第１レーザ光と第２レーザ光の照射により発生する各蛍光の蛍光信号の変化を示す図である。 本発明の第５実施形態に係る蛍光顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。
〔第１実施形態〕
　本発明の第１実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る蛍光顕微鏡１は、図１に示すように、１光子励起により試料Ｓを観察可能な構成を有している。すなわち、蛍光顕微鏡１は、レーザ光（照射光）を射出する光源装置（照射部）３と、光源装置３から射出されたレーザ光を試料Ｓに照射する照明光学系（照射部）５と、レーザ光が試料Ｓに照射されることにより発生する蛍光（信号光）を検出する検出光学系（信号光検出部）７と、検出光学系７により取得された蛍光信号（光信号）に基づいて蛍光画像（信号光画像）を生成するＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）のような処理装置（画像生成部）９とを備えている。
　光源装置３は、レーザ光を発生するレーザ光源１１と、レーザ光源１１から発せられたレーザ光を変調する光変調部１３とを備えている。
　光変調部１３は、例えば、音響光学素子であり、レーザ光源１１からのレーザ光を所定の強度および所定のパルス幅の矩形形状からなるパルスに変調することができるようになっている。
　本実施形態においては、光変調部１３は、レーザ光源１１からのレーザ光を相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光に切り替えて択一的に射出させるようになっている。また、光変調部１３は、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、これらレーザ光の照射強度およびパルス幅（照射時間）を設定するようになっている。
　照明光学系５は、光源装置３から射出されたレーザ光を２次元的に走査させる２軸ガルバノスキャナ（以下、単にスキャナという。）１５と、スキャナ１５により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１７と、瞳投影レンズ１７により集光されたレーザ光を略平行光にする結像レンズ１９と、結像レンズ１９により略平行光にされたレーザ光を試料Ｓに照射する一方、試料Ｓの蛍光物質が励起されることにより発生する蛍光を集光する対物レンズ２１とを備えている。
　スキャナ１５は、互いに交差する揺動軸回りに揺動可能な一対のガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂを備えている。このスキャナ１５は、これら一対のガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの中間位置が対物レンズ２１の瞳位置と共役な位置関係となるように配置されている。また、スキャナ１５は、各ガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの揺動角度に応じて、直交するＸ方向とＹ方向にレーザ光を走査させることができるようになっている。
　検出光学系７は、対物レンズ２１により集光されてレーザ光の光路を戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー２３と、ダイクロイックミラー２３により分岐された蛍光を集光する集光レンズ２５と、集光レンズ２５により集光された蛍光の通過を制限するピンホール２７と、ピンホール２７を通過した蛍光を検出する検出器２９とを備えている。
　ダイクロイックミラー２３は、光変調部１３を通過したレーザ光源１１からのレーザ光をスキャナ１５に向けて透過させる一方、試料Ｓから対物レンズ２１、結像レンズ１９および瞳投影レンズ１７を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を集光レンズ２５に向けて反射するようになっている。
　ピンホール２７は、試料Ｓと光学的に共役な位置に配置されており、共焦点光学系を構築している。このピンホール２７は、試料Ｓにおける対物レンズ２１の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させることができるようになっている。
　検出器２９は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、検出した蛍光の輝度に相当する蛍光信号を処理装置９に送るようになっている。
　処理装置９は、スキャナ１５から送られてくるレーザ光の走査位置と、その走査位置にレーザ光が照射されることにより発生する蛍光が検出されたときに検出器２９から送られてくる蛍光信号とを対応づけて記憶することにより、２次元的な蛍光画像を生成するようになっている。処理装置９により生成された蛍光画像は、図示しないディスプレイに表示したり、図示しないメモリに保存したりすることができるようになっている。
　本実施形態においては、処理装置９は、相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光に対応して検出器２９から送られてくる２つの蛍光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて蛍光画像を生成するようになっている。光変調部１３により、各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、検出器２９から送られてくる２つの蛍光信号は、飽和が生じていない非飽和成分（光強度成分）が互いに一致するよう正規化されている。したがって、検出器２９から出力される２つの蛍光信号がそれぞれ正規化蛍光信号（正規化光信号）となる。
　次に、本実施形態に係る画像取得方法について説明する。
　本実施形態に係る画像取得方法は、図２のフローチャートに示されるように、一方が蛍光を飽和させる照射強度を有し、相互に照射強度およびパルス幅が異なる２つのレーザ光を試料Ｓの同一箇所に別々に照射する照射ステップＳ１と、各レーザ光が試料Ｓに照射されることにより発生する蛍光をそれぞれ検出する蛍光検出ステップ（信号光検出ステップ）Ｓ２と、蛍光検出ステップＳ２により取得された複数の蛍光信号を、対応する各レーザ光の照射強度とパルス幅とに基づき、飽和が生じていない非飽和成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化蛍光信号の差分を演算する演算ステップＳ３と、演算ステップＳ３により得られた差分信号を用いて蛍光画像を生成する画像生成ステップＳ４とを含んでいる。
　このように構成された蛍光顕微鏡１および画像取得方法の作用について説明する。
　本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法により試料Ｓを観察するには、光変調部１３によりレーザ光を変調して、相互に照射強度とパルス幅が異なる２つのレーザ光によりそれぞれ蛍光画像を取得する。
　具体的には、まず、図３Ａに示すように、光変調部１３により、レーザ光源１１から発生させたレーザ光を１ピクセル毎に蛍光が飽和しない強度（ＩＥＸ１）でΔｔ１のパルス幅となるように変調する。以下、このように変調されたレーザ光を第１レーザ光という。図３Ａにおいて、縦軸はレーザ光の強度を示し、横軸は照射時間を示している。図３Ｂ、図７、図９Ａにおいて同様である。
　光変調部１３から射出された第１レーザ光は、ダイクロイックミラー２３を透過してスキャナ１５により走査され、瞳投影レンズ１７により集光される。そして、第１レーザ光は、結像レンズ１９により平行光にされて対物レンズ２１により試料Ｓに照射される（照射ステップＳ１）。これにより、スキャナ１５の各ガルバノミラー１６Ａ，１６Ｂの揺動角度に応じて、第１レーザ光が試料Ｓ上で２次元的に走査される。
　第１レーザ光が走査されて試料Ｓの蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光は、対物レンズ２１により集光されて結像レンズ１９、瞳投影レンズ１７、スキャナ１５を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２３によりレーザ光の光路から分岐される。
　そして、蛍光は集光レンズ２５により集光され、試料Ｓにおける対物レンズ２１の焦点位置において発生した蛍光のみがピンホール２７を通過して、検出器２９により検出される（蛍光検出ステップＳ２）。これにより、処理装置９において、検出器２９により取得された蛍光の蛍光信号と対応するレーザ光の走査位置とに基づいて試料Ｓの蛍光画像が生成される。処理装置９により生成された蛍光画像はディスプレイに表示させてもよい。
　次に、図３Ｂに示すように、光変調部１３により、レーザ光源１１から発生させたレーザ光を１ピクセル毎に蛍光が飽和する強度（ＩＥＸ２）でΔｔ１よりも短いΔｔ２のパルス幅となるように変調する。ＩＥＸ２＞ＩＥＸ１である。以下、このように変調されたレーザ光を第２レーザ光という。これら第１レーザ光と第２レーザ光は、互いに１ピクセル分の露光における照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、照射強度（ＩＥＸ１，ＩＥＸ２）および照射時間（Δｔ１，Δｔ２）が設定されている。
　第２レーザ光は、第１レーザ光の場合と同様に、試料Ｓ上で２次元的に走査される。これにより、試料Ｓの蛍光物質が励起されて発生した蛍光が検出器２９により検出され、処理装置９により試料Ｓの蛍光画像が生成される。
　続いて、処理装置９により、第１レーザ光により発生した蛍光が検出されることによって検出器２９により取得された蛍光信号と、第２レーザ光により発生した蛍光が検出されることによって検出器２９により取得された蛍光信号との差分が演算され（演算ステップＳ３）、得られた差分信号を用いて蛍光画像が生成される（画像生成ステップＳ４）。
　ここで、１ピクセル間に第１レーザ光で発生する蛍光（以下、第１蛍光とする。）の強度は下記の（３）式で示され、１ピクセル間に第２レーザ光で発生する蛍光（以下、第２蛍光とする。）の強度は下記の（４）式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　第１レーザ光（ＩＥＸ１）は蛍光が飽和しない条件であるため、（３）式においてはβの項は存在しない。また、レーザの時間波形が矩形波であるため、Δｔ１およびΔｔ２内での時間積分は、それぞれΔｔ１およびΔｔ２との積と置き換えられる。一方、第２レーザ光（ＩＥＸ２）は蛍光が飽和する強度であるため、（４）式においてはβの項が残る。
　この場合において、光変調部１３により、１ピクセル分の露光における第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、下記の（５）式が成り立つ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　これにより、処理装置９において、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差分が演算されることで、下記の（６）式に示されるように、αがある線形項を消去して、βの非線形成分項のみ、すなわち、蛍光の飽和成分のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　（６）式では、（４）式のβの成分が減衰することなく残っており、これは本手法が蛍光の飽和成分をロスなく高効率に検出できることを意味している。したがって、処理装置９により、（６）式の差分演算処理によって得られた差分信号に基づいて蛍光画像が生成されることで、蛍光の飽和成分のみを利用した高い分解能をＳ／Ｎ比が高い状態で実現することができる。
　次に、ここまで数式を用いて説明した内容について、図を用いて概念的に説明する。
　図４Ａ，４Ｂ，４Ｃは蛍光の点像強度分布（ＰＳＦ）を示したものである。図４Ａ，４Ｂ，４Ｃにおいて、縦軸は蛍光の強度を示し、横軸は位置を示している。図６Ｃ、図９Ｂにおいて同様である。図４Ａは、本実施形態の比較例として、相互に同じ照射時間で照射強度のみを変えた第１比較用レーザ光と第２比較用レーザ光を試料Ｓに照射した場合の第１比較用蛍光と第２比較用蛍光のＰＳＦを示している。第１比較用レーザ光は蛍光が飽和しない強度に変調されたものであり、第２比較用レーザ光は蛍光が飽和する強度に変調されたものである。
　第１比較用蛍光と第２比較用蛍光は飽和の有無により形状が異なるが、レーザ光の照射強度が異なるために蛍光強度も大きく異なることになる。差分によって飽和成分のみを抜き出して空間分解能を向上させるということは、図４Ａに示すＰＳＦの裾部分（すなわち、飽和が生じていない蛍光強度部分）を差分によって効率的にゼロに近づけるということであるが、図４Ａの状態では第１比較用蛍光と第２比較用蛍光の強度の差が大きいため、差分演算を行っても裾部がゼロにはならない、すなわち、線形成分が残ってしまう。
　これに対し、本実施形態においては、光変調部１３により、図４Ｂに示すように、飽和が生じていない非飽和成分（線形成分）が一致するよう第１蛍光と第２蛍光の強度が正規化されているので、第１蛍光と第２蛍光とで同図に示すＰＳＦの裾部が一致し、中心部が飽和によって強度に差が出る状態となる。
　したがって、処理装置９により、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差分を演算することで、図４Ｂの裾部（線形成分）がゼロとなり、図４Ｃに示すように、ＰＳＦの中心部である非線形成分（飽和成分）のみを効率的に抽出することができる。これにより、ＰＳＦの幅を狭くして空間分解能を高めることができる。
　以上説明したように、本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法によれば、片方が蛍光を飽和させる照射強度を有する２つのレーザ光を試料Ｓに照射し、処理装置９により、レーザ光に対応する蛍光信号の非飽和成分が一致するよう正規化された２つの蛍光信号の差分を演算することで、蛍光の飽和成分のみを効率よく抽出して蛍光画像を生成することができる。したがって、２つの蛍光信号の差分を演算するだけの簡単な処理で、Ｓ／Ｎ比を向上してより高い空間分解能を実現することができる。
　本実施形態においては、光変調部１３により、（５）式が成り立つように第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度とパルス幅を予め設定することとした。これに代えて、処理装置９により、差分演算の際に、（５）式が実質的に成り立つように第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号を係数倍して正規化することとしてもよい。あるいは、第１レーザ光および第２レーザ光の照射強度とパルス幅の設定と、第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号の係数倍の双方を行うこととしてもよい。このように正規化された蛍光信号が正規化蛍光信号となる。
　この場合、例えば、各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率ｋを（７）式とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　そして、処理装置９により、（７）式に示すように、レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｋを設定し、第１蛍光の（３）式に比率ｋを乗算してから第２蛍光の（４）式との差分を演算することとすればよい。
　このようにすることで、下記の（８）式に示すように、αのある線形項を消去してβの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 　信号を係数倍するということは実質的に信号のダイナミックレンジを狭めることに繋がる反面、例えば非飽和状態の蛍光信号のＳ／Ｎ比が低い場合には、励起強度を高めてＳ／Ｎ比を向上させてから係数倍で正規化し、差分後のＳ／Ｎ比を高くすることもできる。
　また、通常、βは負の値であるので、差分演算の方向は（６）式や（８）式に示すように、非飽和状態で取得した蛍光信号から飽和状態で取得した蛍光信号を減算する方が望ましいが、特に限定するものではない。
　また、各レーザ光のパルス波形についても矩形である必要は無く、差分時に（５）式が成り立てばよい。
　また、本実施形態においては、第１レーザ光は蛍光が飽和しない強度に設定することとしたが、第１レーザ光も蛍光が飽和する強度に設定することとしてもよく、αの項（線形項）が差分によって消去できればよい。この場合は、βの項も差分されたものが出力されることになる。
　また、本実施形態においては、非線形項として２次の項までを示したが、３次以降の成分が発生していてもよい。この場合においても、差分によって線形項が消去されるので、２次以降の高次項が全て検出されることになる。
　また、実際に蛍光画像を取得する際には、蛍光が飽和しない強度の第１レーザ光で先に蛍光画像を取得し、その後に、蛍光が飽和する強度の第２レーザ光で蛍光画像を取得することが望ましい。第２レーザ光の方が第１レーザ光よりも照射強度が強いため、第１レーザ光による画像取得を先に行うことで、観察の途中で蛍光の退色が起きる可能性を低減することができる。なお、第２レーザ光の照射時間は短いため、第２レーザ光を用いた画像取得であっても蛍光の退色は生じ難い。
　また、本実施形態においては、処理装置９がデコンボリューション機能を有し、差分演算後の蛍光画像をデコンボリューションすることとしてもよい。
　例えば、測定条件の誤差で（５）式を満たせない場合や、（５）式ではなく下記の（９）式となるような係数Ｍを設けて、この式を満たすように差分演算時に第１蛍光の蛍光信号や第２蛍光の蛍光信号に係数Ｍを乗算したり、もしくは光変調部１３でレーザ光の照射強度とパルス幅を設定したりする場合は、差分演算時にＰＳＦに負の強度成分が発生する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　この負の強度成分を含んだＰＳＦの形状を予めシミュレーションや実測定で把握しておき、把握したＰＳＦの形状を用いて差分演算後の蛍光画像をデコンボリューションすれば、負の強度成分を含まない蛍光画像を復元することが可能になる。この場合、負の成分を含んだＰＳＦは空間周波数の高周波が強調されたものになっており、デコンボリューションにより、空間分解能をより向上させることが可能にある。
　また、本実施形態においては、蛍光画像毎に差分を演算することとしたが、これに代えて、例えば、処理装置９により、複数の蛍光画像のスタック毎、レーザ光が照射されるライン毎、または、蛍光画像のピクセル毎のいずれかのタイミングで差分を演算することとしてもよい。
　蛍光画像毎や複数の蛍光画像のスタック毎に差分を演算する場合は、励起光ごとに画像をある程度形成してから演算処理を行うことができ、差分処理を簡易にすることができるという利点がある。一方、レーザ光のライン毎や蛍光画像のピクセル毎に差分を演算する場合は、環境温度の変化の影響などによって、レーザ光の照射時間に揺らぎが生じたり、試料Ｓが載置されるステージがドリフトして試料Ｓに位置ずれが生じたりしたとしても、誤差を生じ難くすることができるという利点がある。
　また、本実施形態においては、光変調部１３として音響光学素子を例示して説明したが、レーザ光の照射強度とパルス幅を調整できればどのような構成でもよい。例えば、光変調部１３として電気光学素子など他の素子を利用することとしてもよいし、あるいは、光変調部１３を用いずにレーザ光源１１を直接変調することとしてよい。
　また、本実施形態においては、スキャナ１５として、２軸ガルバノスキャナを例示して説明したが、例えば、ステージにより試料Ｓを保持してステージスキャンすることとしてもよく、２軸ガルバノスキャナに限定されるものではない。
〔第２実施形態〕
　次に、本発明の第２実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、第１実施形態の１光子励起観察に代えて、２光子励起観察を行う点で第１実施形態と異なる。
　本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　本実施形態に係る蛍光顕微鏡１は、図５に示すように、レーザ光源１１として、チタンサファイアレーザなどの超短パルスレーザを備えている。また、ピンホール２７を備えず、試料Ｓから発せられて対物レンズ２１により集光された蛍光を結像レンズ１９に入射させる前にダイクロイックミラー２３によりレーザ光の光路から分岐させて集光レンズ２５に入射させるようになっている。
　本実施形態においても、光変調部１３は、レーザ光を矩形パルスで照射強度とパルス幅が異なる２つのレーザ光に切り替えるとともに、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、これら２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅を設定するようになっている。
　この場合の１ピクセル間に第１レーザ光で発生する第１蛍光の強度は下記の（１０）式で示され、１ピクセル間に第２レーザ光で発生する第２蛍光の強度は下記の（１１）式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　１光子励起の場合の（３）式、（４）式と比較して、（１０）式、（１１）式に示されるように、２光子励起の場合は、非飽和成分がレーザ光の照射強度の２乗に比例し、飽和成分がレーザ光の照射強度の４乗に比例する点で異なる。光変調部１３により、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、２つのレーザ光の照射強度およびパルス幅が設定されることで、上記の（５）式に相当する式として下記の（１２）式が成り立つ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　そして、処理装置９により、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号の差分が演算されることで、上記の（６）式と同様に、下記の（１３）式に示されるように、αのある線形項を消して、βの非線形成分項のみ、すなわち、飽和成分のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　このように、（１２）式の条件のように、１ピクセル間のレーザ光の照射強度の２乗の時間積分が第１レーザ光と第２レーザ光で等しいようにするところが第１実施形態の１光子励起の場合と大きく異なる点である。
　本実施形態により取得される蛍光画像の一例とその比較例等を図６Ａ，６Ｂ，６Ｃに示す。図６Ａは、本実施形態の比較例として、従来のように、直径１００ｎｍの蛍光ビーズを波長８００ｎｍのレーザ光で２光子励起観察した結果である。蛍光画像内に複数個のビーズが表示されている。
　一方、図６Ｂは、本実施形態により、図６Ａと同じビーズを同じ集光位置で２光子励起観察した結果である。図６Ｂは、図６Ａと比べて蛍光ビーズのサイズが小さく見えており、空間分解能が向上していることが分かる。
　図６Ａにおいて１から５の数字で示したビーズのラインプロファイルを示したのが図６Ｃである。図６Ｃは、各ビーズの重心位置を横切る位置でラインプロファイルを取得し、重心位置を中心にラインプロファイルを取る位置を回転させて、各ラインプロファイルを足し合わせて平均化し、この工程を各ビーズについて行って１から５のビーズのラインプロファイルの平均を取ったものである。図６Ｃにおいて、破線は図６Ａの従来の２光子観察手法で観察したビーズのラインプロファイルであり、実線は図６Ｂに示す本実施形態の２光子励起観察で観察したビーズのラインプロファイルである。
　図６Ｃのラインプロファイルから明らかなように、本実施形態によれば、従来の２光子励起観察と比較して空間分解能を向上することができる。なお、図６Ｃのラインプロファイルは蛍光ビーズのサイズも含んでいるため、顕微鏡の分解能そのもの（ＰＳＦ）ではない。すなわち、本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法によれば、ＰＳＦの分解能の向上度は図６Ｃの結果よりも大きくなる。
　本実施形態においては、光変調部１３によるレーザ光の変調により蛍光信号を正規化することとしたが、これに代えて、処理装置９が、対応する各レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率により、蛍光信号を正規化することとしてもよい。
　この場合、例えば、各レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率ｋを（１４）式とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　そして、処理装置９により、（１４）式に示すように、レーザ光の照射強度の２乗の照射時間内の積分値の比率ｋを設定し、第１蛍光の（１０）式に比率ｋを乗算してから第２蛍光の（１１）式との差分を演算することとすればよい。
このようにすることで、下記の（１５）式に示すように、βの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
〔第３実施形態〕
　次に、本発明の第３実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、照明光学系５が、相互に照射強度が異なる３以上のレーザ光を試料Ｓに別々に照射し、処理装置９が、複数の正規化蛍光信号に対する差分を複数回行う点で第１実施形態と異なる。蛍光顕微鏡１の構成は図１と同様である。
　本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　本実施形態では、１光子励起観察と２光子励起観察のどちらでも利用可能であるが、１光子励起観察について説明する。
　光変調部１３は、相互に照射強度とパルス幅が異なる３つのレーザ光を択一的に射出するようになっている。例えば、３つのレーザ光を図３Ａに示す第１レーザ光と、図３Ｂに示す第２レーザ光と、図７に示す第３レーザ光とし、これらを試料Ｓに照射することにより発生する蛍光をそれぞれ第１蛍光、第２蛍光、第３蛍光とする。第３レーザ光は、例えば、１ピクセル毎に第２レーザ光よりも強い照射強度で、Δｔ２よりも短いΔｔ３のパルス幅を有するものとする。
　光変調部１３は、第１蛍光が飽和成分を含まず、第２蛍光が励起レーザに対して２次の非線形応答を示す飽和成分までを含み、第３蛍光が３次の飽和成分までを含み、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各々のレーザ光の照射強度およびパルス幅を調整するようになっている。
　この場合の第１蛍光の強度は下記の（１６）式で示され、第２蛍光の強度は（１７）式で示され、第３蛍光の強度は（１８）式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
　これら３つのレーザ光のパルス形状は矩形であり、照射時間の積分はパルス幅による乗算に等しくなっている。
　光変調部１３による各レーザ光の照射強度とパルス幅の設定により、上記の（５）式が成り立ち、第１実施形態と同様に、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号と差分によって上記の（６）式が成り立つ。
　同様に、第１蛍光と第３レーザ光に対しても下記（１９）式が成り立ち、第１蛍光の蛍光信号と第３蛍光の蛍光信号との差分により（２０）式が成り立つ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
　（６）式および（２０）式は双方ともαがある線形項が消去された形となっている。
　処理装置９において、（２０）式をＩ２ ＥＸ２Δｔ２／Ｉ２ ＥＸ３Δｔ３倍してから（６）式と（２０）式の成分で差分演算することで、下記の（２１）式のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
　（２１）式においては、蛍光強度がレーザ光の照射強度の２乗に比例するβの項も消去され、３乗に比例するγの項のみが残っている。これは、第１実施形態では２次以降の非線形項が検出されるのに対して、第３実施形態では３次以降の非線形項が検出されるということを意味する。したがって、本実施形態によれば、更なる空間分解能の向上を実現することができる。
　本実施形態は３次までに限定されるわけではなく、Ｓ／Ｎ比が許す限り、画像取得と差分回数を増やすことで検出される非線形項の次数を上げて空間分解能を向上させることが可能である。なお、第１蛍光は線形成分のみ、第２蛍光は２次の非線形成分までを含み、第３レーザ光は３次の非線形成分まで含むと仮定したが、いずれもそれよりも高次の非線形成分を含んでいてもよい。また、本実施形態は１光子励起に限定されるものではなく、第２実施形態と同様に、２光子励起観察においても利用できる。
　本実施形態においては、処理装置９が、対応する各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、蛍光信号を正規化することとしてもよい。
　この場合、例えば、第１レーザ光と第２レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率を上記の（７）式とし、第１レーザ光と第３レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値の比率を下記の（２２）式とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000022
　そして、処理装置９により、（７）式に示すレーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｋを第１蛍光の（１６）式に乗算してから第２蛍光の（１７）式との差分を演算することとすればよい。このようにすることで、上記の（８）式に示すように、αのある線形項を消去してβの非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。
　また、処理装置９により、（２２）式に示すように、レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値に対する比率ｌを設定し、第１蛍光の（１６）式に比率ｌを乗算してから第３蛍光の（１８）式との差分を演算することとすればよい。
　このようにすることで、下記の（２３）式に示すように、αのある線形項を消去してβとγを含む非線形成分項（飽和成分）のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000023
　そして、処理装置９により、（８）式と（２３）式に基づき、下記の（２４）式に示すように、レーザ光の照射強度の時間積分値に対する比率ｋおよび比率ｌを利用することで、高次の非線形成分（飽和成分）のみを抽出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
〔第４実施形態〕
　次に、本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡（顕微鏡）および画像取得方法について、図を参照して以下に説明する。
　本発明の第４実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法は、図８に示すように、処理装置９が、差分の演算処理を行うロックインアンプ３１を備え、ロックインアンプ３１により蛍光画像のピクセル毎に差分を演算する点で第１実施形態と異なる。
　本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　光変調部１３は、図９Ａに示すように、１ピクセルを検出する時間内に第１レーザ光と第２レーザ光を複数回切り替えて、交互に特定周波数で試料Ｓに照射するようになっている。図９Ａでは１ピクセル間に各レーザ光の切り替えを２回繰り返しているが、回数はこれに限られるものではない。また、光変調部１３は、１ピクセル分の露光における各レーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各々のレーザ光の照射強度およびパルス幅を調整するようになっている。
　各レーザ光の照射により発生する蛍光の蛍光信号の変化を図９Ｂに示す。各々のピクセルの信号値は第１レーザ光および第２レーザ光で発生した第１蛍光および第２蛍光の蛍光信号の各ピクセル時間内での積分値となるが、図９Ｂにおいては第１蛍光および第２蛍光の信号値をドットで示している。
　光変調部１３による各レーザ光の照射強度とパルス幅の設定により、（５）式（２光子励起では（１２）式）が満たされているので、第１蛍光と第２蛍光の信号強度の差は非線形成分のみとなる。また、光変調部１３が、図９Ａのように、第１レーザ光と第２レーザ光を交互に特定周波数で試料Ｓに照射することで、図９Ｂのように、その特定周波数で交互に発生する第１蛍光と第２蛍光が検出器２９により検出される。
　ロックインアンプ３１は、検出器２９と処理装置９との間に配置されており、検出器２９から送られてくる図９Ｂに示す第１蛍光と第２蛍光の蛍光信号を検出して、光変調部１３の特定周波数で復調するようになっている。これにより、第１蛍光の蛍光信号と第２蛍光の蛍光信号との差を取り出すことができる。
　本実施形態によれば、検出器２９から出力される蛍光信号を演算処理して処理装置９で差分演算を行わなくても、市販のロックインアンプ３１を通してから処理装置９で処理するだけで、飽和成分のみを利用した蛍光画像を作成することができる。この場合、処理装置９は蛍光画像の作成と表示を行うだけとなる。
　また、これまでは蛍光の飽和について述べてきたが、励起光強度の増加による蛍光信号の非線形応答であれば他の現象についても本案は利用可能である。例えば、蛍光のスイッチングが生じる蛍光タンパクや合成色素では励起光強度の増加によって異性化が生じる。これも励起光強度の増加に対する非線形応答（蛍光の非線形増減）であるため、飽和と同様に本案を適用することで、空間分解能を向上することができる。この場合、飽和が生じていない非飽和成分が互いに一致するよう各蛍光信号を正規化する上記各実施形態と同じようにして、非線形増減が生じていない光強度成分が互いに一致するよう各蛍光信号を正規化することとすればよい。
　また、これまでは信号光が蛍光の場合について述べてきたが、本案は照射レーザ光強度の増加によって信号光が非線形応答する他の光検出の場合にも有用であり、例えば、特許文献２にあるような、反射、吸収、散乱、多光子効果にも利用できる。以下、これら現象に対する効果について述べる。
〔第５実施形態〕
　本実施形態では信号光が試料から発せられた蛍光ではなく、レーザ光が試料に照射された際に生じる反射光や散乱光、透過光、または多光子効果で生じる光成分などの場合である。まず、信号光が反射光乃至後方散乱光である場合について述べる。なお、ここで述べる散乱はミー散乱、レイリー散乱のことを差す。装置構成図を図１０に示す。
　本実施形態の説明において、上述した各実施形態に係る蛍光顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　図１０は図１とほぼ同じであるが、ダイクロイックミラー２３がビームスプリッタ３３に置き換わり、ビームスプリッタ３３と集光レンズ２５との間にダイクロイックフィルタ３５が挿入されている点が異なる。図１０において、レーザ光源１１から出射された光は試料Ｓの蛍光を誘起するものである必要は無く、レーザ光が試料Ｓで反射乃至後方散乱された成分が信号光として検出される。即ち、試料Ｓに入射したレーザ光は試料Ｓによって反射乃至後方散乱を受けて、反射光乃至後方散乱光が対物レンズ２１で集光される。その後反射光乃至後方散乱光はビームスプリッタ３３によって偏向され、ダイクロイックフィルタ３５を経て、ピンホール２７を通過し、検出器２９で検出される。
　ここで、レーザ光の強度を上げると、試料Ｓ内でレーザ光の非線形成分が発生する。即ち、レーザ光の波長をλとすると、波長がλ／ｎ（ｎ：２以上の自然数）の高調波が発生する。ダイクロイックフィルタ３５はレーザ光の波長と同じ波長を透過させ、試料Ｓ内で生じた非線形成分を含む他の波長をカットするように設計されている。よって、ダイクロイックフィルタ３５を透過して検出器２９で検出される信号は非線形成分を含まない反射光乃至後方散乱光のみとなる。ここで、試料Ｓに入射したレーザ光の強度に着目すると、レーザ強度が高く非線形成分が発生している場合は、非線形成分が発生した分だけ、レーザ光と同波長の成分の強度が減少することになる。よって、非線形成分が発生していない状態においては、レーザ光の試料Ｓによる反射光乃至後方散乱光の強度は試料Ｓに入射するレーザ光の強度に比例するが、非線形成分が発生する状態においては、非線形成分が発生した分だけ非線形な減少が生じることになる。これは上記の蛍光の飽和と同様の効果であり、上記の式の蛍光強度Ｉｆｌをそれぞれ反射強度ＩＲｅ、散乱強度ＩＳｃと置き換えても式が成り立つ。即ち、反射や散乱においても、照射条件の異なる複数のレーザ光を入射して差分処理を行うことで、非線形成分のみを抽出し、それに基づいて画像を取得することができる。この場合、蛍光の飽和と同様に、空間分解能が向上した画像を取得できることになる。
　また、上記の説明では反射光乃至後方散乱光を検出するようにしたが、試料Ｓを透過した透過光乃至前方散乱光を検出するようにしてもよい。この場合においても、ダイクロイックフィルタ３５でレーザ光と同じ波長成分のみを抜き出して、検出器２９で検出する。照射条件の異なるレーザ光を照射して信号光を取得し、その信号を差分処理することで非線形成分のみを抽出して空間分解能を向上させる点については同じである。
　また、上記ダイクロイックフィルタ３５は、レーザ光と同じ波長をカットし、他の波長を透過するようにしてもよい。その場合はレーザ光と異なる波長の成分が検出器２９によって検出されることになる。例えば、ハイパーレイリー散乱、高調波発生、ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、四光波混合、誘導放出、差周波発生、和週波発生、パラメトリック蛍光、または誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）などの各種光を検出してもよい。この場合、ラマン散乱のように信号光強度に対するレーザ光強度の関係が線形である場合、実施形態１の（５）式と同様にレーザ光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように照射条件を設定する。また、高調波発生のように信号光強度とレーザ光強度の関係が非線形である場合は実施形態２の（１２）式のようにレーザ光の照射強度を非線形次数分だけ累乗したものの照射時間内の積分値が等しくなるように照射条件を設定する。なお、この際に差分によって取り出される非線形成分は、少なくとも信号光が発生するための非線形効果の次数よりも高次の非線形成分となる。即ち、２次の高調波発生であるＳＨＧで考えると、少なくとも信号光が発生するための非線形効果の次数は２次であるが、本案の差分によって取り出される高次成分は３次以降の非線形成分となる。また、（７）式や（１４）式のような比率ｋを用いて差分処理を行ってもよく、第３実施形態のように複数回の差分を行ってより高次の非線形成分のみを取り出すことや、第４実施形態のようにロックインアンプを利用して非線形成分のみを取り出すことも可能である。
　加えて、非線形光学効果により発生する信号光の非線形な増加成分を検出してもよい。例えば、試料が過飽和吸収体等の場合、レーザ光強度を増加することで非線形な信号光の増加が生じる。この非線形な増加成分のみを本案の差分で取得することも可能である。また、非特許文献１のような光音響信号の検出にも利用することができる。この場合は、本案と同様に試料に照射するレーザ光の照射強度と照射時間を複数条件で設定し、各々の条件化においてトランスデューサで検出された音響信号の差分を取ることで、レーザ光吸収の高次非線形成分を抽出して空間分解能を向上させることができる。このように、本案は光照射に対する信号の非線形応答成分を検出するものであり、その現象は何でもよく、上記に限られるものではない。また、これまでは試料に照射する光をレーザ光として述べてきたが、これは非線形応答が生じるためにはレーザのような強い光源が適しているからであり、非線形応答を生じさせる強度を有するものであればどのような光源でもよい。
　以上、本発明の各実施形態およびその変形例について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
　１　　蛍光顕微鏡（顕微鏡）
　３　　光源装置（照射部）
　５　　照明光学系（照射部）
　７　　検出光学系（信号光検出部）
　９　　処理装置（画像生成部）
　Ｓ１　　照射ステップ
　Ｓ２　　蛍光検出ステップ（信号光検出ステップ）
　Ｓ３　　演算ステップ
　Ｓ４　　画像生成ステップ
 

Claims (16)

  1. 　照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射部と、
    　各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出部と、
    　該信号光検出部により取得された複数の光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算し、得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡。
  2. 　前記信号光が蛍光であることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
  3. 　前記照射部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
  4. 　前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
  5. 　前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項２に記載の顕微鏡。
  6. 　前記照射部が、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、
    　前記画像生成部が、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項２に記載の顕微鏡。
  7. 　前記画像生成部が、前記照射光が照射されるライン毎、前記信号光画像毎、前記信号光画像のピクセル毎、または、複数の前記信号光画像のスタック毎に前記差分を演算する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
  8. 　前記画像生成部が、前記差分の演算処理を行うロックインアンプを備え、該ロックインアンプにより前記信号光画像のピクセル毎に前記差分を演算する請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
  9. 　前記照射部が、相互に照射強度が異なる３以上の前記照射光を前記試料に別々に照射し、
    　前記画像生成部が、前記複数の正規化光信号に対する差分を複数回行う請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
  10. 　前記画像生成部が、デコンボリューション機能を有する請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡。
  11. 　照射によって信号光を発生し、少なくとも１つが前記信号光を飽和または非線形増減させる照射強度を有し、相互に照射強度が異なる２以上の照射光を試料の同一箇所に別々に照射する照射ステップと、
    　各前記照射光を前記試料に照射することにより発生した前記信号光をそれぞれ検出する信号光検出ステップと、
    　該信号光検出ステップにより取得された複数の信号光信号を、対応する各前記照射光の照射強度と照射時間とに基づき、飽和または非線形増減が生じていない光強度成分が一致するよう正規化して得られる複数の正規化光信号の差分を演算する演算ステップと、
    　該演算ステップにより得られた差分信号を用いて信号光画像を生成する画像生成ステップとを含む画像取得方法。
  12. 　前記信号光が蛍光であることを特徴とする、請求項１１に記載の画像取得方法。
  13. 　前記照射ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１１または請求項１２に記載の画像取得方法。
  14. 　前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１１または請求項１２に記載の画像取得方法。
  15. 　前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射するとともに、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値が等しくなるように、各前記照射光の照射強度および照射時間を設定することにより、前記光信号を正規化させる請求項１２に記載の画像取得方法。
  16. 　前記照射ステップが、２光子励起法によって前記信号光を発生させる前記照射光を照射し、
    　前記画像生成ステップが、対応する各前記照射光の照射強度の２乗の前記照射時間内の積分値の比率により、前記光信号を正規化する請求項１２に記載の画像取得方法。
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