JP7465512B2 - 光学顕微鏡、及び撮像方法 - Google Patents
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Description
本発明は、光学顕微鏡、及び画像の撮像方法に関し、特に詳しくは組織観察又は病理診断に用いられる画像を取得するための技術に関する。
非特許文献１、２には、高解像度の透過型光学顕微鏡が開示されている。非特許文献１では、二光子吸収、非特許文献２では、過渡吸収が利用されている。また、特許文献１には信号光の飽和又は非線形な増加が生じることによって、レーザ光の強度と信号光の強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させている。そして、信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行っている。
特許文献２には、試料からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡が開示されている。特許文献２では、レーザ光強度が最大の時に、蛍光の飽和が生じるようにレーザ光の強度を変化させている。そして、蛍光の飽和成分に基づいて観察を行っている。
Tian, et al., Opt. Lett., 27, 1634-1636 (2002)
Sasaki, et al., J. Opt. Soc. Am. A, 9, 932-936 (1992)
病理診断や組織観察等に用いられる画像を撮像する光学顕微鏡では、より簡素な構成にしたいという要望がある。例えば、簡素な構成として安価にすれば、より広く普及させることができる。
非特許文献１、２では、二光子吸収又は過渡吸収を用いているため、装置構成を簡素化することが難しい。例えば、非線形光学効果を誘起するためにパルスレーザによる励起を必要とする。パルスレーザは高価かつ取り扱いが難しいため、病理診断や組織観察に活用することが困難である。
特許文献１の請求項５では、高次の非線形光学効果による光高調波を発生させている。光高調波を発生させる必要があるため、装置構成をより簡素にすることが困難である。特許文献２では、光検出器によって、蛍光を検出している。よって、ＳＮ比をより高くしたいという要望がある。
本実施形態にかかる光学顕微鏡は、組織観察又は病理診断のための画像を撮像する光学顕微鏡であって、光吸収物質を含むサンプルを照明するレーザ光を発生する少なくとも一つのレーザ光源と、前記レーザ光を集光して、前記サンプルに集光するレンズと、前記サンプルに対する前記レーザ光の集光位置を変化させる走査手段と、前記サンプルを透過したレーザ光を信号光として検出する光検出器とを備え、レーザ光強度が最大の時に前記光吸収物質での吸収の飽和が生じることによって、レーザ光強度と信号光強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させ、前記光吸収物質での吸収の飽和に基づく、前記信号光の非線形な成分に基づいて、画像を生成する。
上記の光学顕微鏡において、前記光吸収物質が色素であり、前記サンプルが、前記色素で染色された組織、細胞、又はバクテリアを含むようにしてもよい。
上記の光学顕微鏡において、前記サンプルを染色する前記色素がエオシンＹであり、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積ＣＬが４．０×１０－9ｍｏｌ／ｃｍ２以下となっていてもよい。
上記の光学顕微鏡において、前記レーザ光を変調周波数ｆで強度変調し、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積を積ＣＬとした場合に、前記積ＣＬに対して透過信号に含まれる変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に、積ＣＬの値が含まれていてもよい。
上記の光学顕微鏡において、前記レーザ光の集光位置を前記サンプルの厚さ方向に変化させてもよい。
上記の光学顕微鏡において、前記レーザ光源がＣＷ（Continuous Wave）レーザ光を発生するようにしてもよい。このようにすることで、装置構成を簡素化することができる。
上記の光学顕微鏡において、前記サンプルに入射する前記レーザ光がパルスレーザ光であってもよい。
本実施形態にかかる撮像方法は、光学顕微鏡を用いて組織観察又は病理診断のための画像を撮像する撮像方法であって、光吸収物質を含むサンプルを照明するレーザ光を発生するステップと、前記レーザ光を集光して、前記サンプルに集光するステップと、前記サンプルに対する前記レーザ光の集光位置を変化させるステップと、前記サンプルを透過したレーザ光を信号光として検出するステップと、レーザ光強度が最大の時に前記光吸収物質での吸収の飽和が生じることによって、レーザ光強度と信号光強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させるステップと、前記光吸収物質での吸収の飽和に基づく、前記信号光の非線形な成分に基づいて、画像を生成するステップと、を備えている。
上記の撮像方法において、前記光吸収物質が色素であり、前記サンプルが、前記色素で染色された組織、細胞、又はバクテリアを含むようにしてもよい。
上記の撮像方法において、前記サンプルを染色する前記色素がエオシンＹであり、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積ＣＬが４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２以下となっていてもよい。
上記の撮像方法において、前記レーザ光を変調周波数ｆで強度変調し、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積を積ＣＬとした場合に、前記積ＣＬに対して透過信号に含まれる変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に、積ＣＬの値が含まれていてもよい。
上記の撮像方法において、前記レーザ光の集光位置を前記組織サンプルの厚さ方向に変化させるようにしてもよい。
上記の撮像方法において、前記レーザ光がＣＷ（Continuous Wave）レーザ光であってもよい。このようにすることで、装置構成を簡素化することができる。
上記の撮像方法において、前記サンプルに入射する前記レーザ光がパルスレーザ光であってもよい。
本発明によれば、診断画像を簡便かつ高解像度で撮像することができる診断用光学顕微鏡と診断画像の撮像方法を提供することができる。
以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。
本実施の形態にかかる光学顕微鏡は病理診断用のサンプルを撮像して、診断用画像を取得するものである。具体的には、エオシンＹなどの色素で組織サンプルを染色している。そして、組織サンプルを光学顕微鏡で撮像することで、診断用画像を取得することができる。例えば、以下のような疾患や組織が病理診断の対象となる。
腎組織（糸球体腎炎など、種々の炎症における生検）
甲状腺腫を除く内分泌臓器の機能性腫瘍（下垂体腺腫、副腎皮質腺腫、膵島腺腫など）
異所性ホルモン産生腫瘍（カルチノイドなど）
軟部組織悪性腫瘍（脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経線維腫など）
脂質蓄積症（ゴーシェ病、ニーマン・ピック病など）
多糖体蓄積症
心筋生検（心筋症）
甲状腺腫を除く内分泌臓器の機能性腫瘍（下垂体腺腫、副腎皮質腺腫、膵島腺腫など）
異所性ホルモン産生腫瘍（カルチノイドなど）
軟部組織悪性腫瘍（脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経線維腫など）
脂質蓄積症（ゴーシェ病、ニーマン・ピック病など）
多糖体蓄積症
心筋生検（心筋症）
もちろん、本実施の形態における光学顕微鏡で撮像される組織サンプル、及び、組織サンプルの診断画像から診断される疾患等は、上記の例に限定されるものではない。本実施の形態の光学顕微鏡は、色素で染色された組織サンプルの診断画像を撮像している。具体的には、色素での吸収の飽和を利用して高空間分解能検出を行っている。組織観察又は病理診断のための画像を高分解能で撮像することができる。
サンプルは、色素で染色された細胞、組織、バクテリア等とすることができる。なお、サンプルは、色素で染色されていなくてもよい。つまり、サンプルは、光吸収物質を含むものであればよい。例えば、光吸収物質はレーザ光を吸収するとともに、レーザ光強度が高くなると吸収の飽和が生じる物質であればよい。
実施の形態１．
実施の形態１にかかる診断用光学顕微鏡とその撮像方法について、図１を用いて説明する。図１は、光学顕微鏡１を示す図である。光学顕微鏡１は、レーザ光源１１と、変調器１２とガルバノミラー１３と、対物レンズ１４を備えている。さらに、光学顕微鏡１は、集光レンズ２１と、光検出器３１と、ロックインアンプ３２と、処理部３３、ビームサンプラ３４と、参照光検出器３５と、を備えている。
実施の形態１にかかる診断用光学顕微鏡とその撮像方法について、図１を用いて説明する。図１は、光学顕微鏡１を示す図である。光学顕微鏡１は、レーザ光源１１と、変調器１２とガルバノミラー１３と、対物レンズ１４を備えている。さらに、光学顕微鏡１は、集光レンズ２１と、光検出器３１と、ロックインアンプ３２と、処理部３３、ビームサンプラ３４と、参照光検出器３５と、を備えている。
まず、サンプル４０を照明するための照明光学系について説明する。レーザ光源１１は、サンプル４０を照明するためのレーザ光Ｌ１を発生する。レーザ光源１１は、連続発振のＣＷ（Continuous Wave）レーザ光源である。レーザ光源１１は、サンプル４０中の色素を励起する励起光である。例えば、レーザ光Ｌ１の中心波長λは５３２ｎｍとなっている。レーザ光源１１からのレーザ光Ｌ１は、変調器１２に入射する。
変調器１２は、例えば、ＡＯＭ（音響光学変調器：Ａｃｏｕｓｔｏ－Ｏｐｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である。変調器１２は、レーザ光Ｌ１のレーザ光強度を変調する。つまり、レーザ光強度（以下、単に強度とも称する）が時間に応じて変化する。ここでは、図２に示すように、レーザ光強度（励起光強度）が単一周波数で時間的に変化するように強度変調する。なお、図２は、変調後のレーザ光強度を示すグラフであり、横軸が時間、縦軸がレーザ光強度を示している。
変調器１２によって変調周波数ｆでレーザ光Ｌ１の強度が時間的に変調される。変調周波数ｆは例えば、１０ｋＨｚとなっている。もちろん、変調周波数ｆは特に限定されるものではない。変調器１２としては、ＡＯＭに限らず、電気光学変調器（ＥＯＭ）を用いても良い。
変調器１２からのレーザ光Ｌ１はビームサンプラ３４を通過する。ビームサンプラ３４は、透明なガラス基板などであり、レーザ光Ｌ１の一部を反射させ取り出す。ビームサンプラ３４で取り出されたレーザ光Ｌ１を参照光Ｌ３とする。ビームサンプラ３４で反射された参照光Ｌ３は、参照光検出器３５で検出される。参照光検出器３５は、参照光Ｌ３の光量に応じた参照光信号をロックインアンプ３２に出力する。
ビームサンプラ３４を通過したレーザ光Ｌ１はガルバノミラー１３に入射する。ガルバノミラー１３は、レーザ光Ｌ１の集光位置を走査する走査手段である。ガルバノミラー１３は、レーザ光Ｌ１を偏向することで、サンプル４０を走査する。ここでは、ガルバノミラー１３は、Ｘ方向及びＹ方向にレーザ光Ｌ１を走査する光スキャナとなっている。よって、サンプル４０において、レーザ光Ｌ１の照明位置が２次元走査される。なお、Ｘ方向及びＹ方向は、対物レンズ１４の光軸に直交する方向であり、互いに直交する方向である。
ガルバノミラー１３で反射したレーザ光Ｌ１は、対物レンズ１４に入射する。対物レンズ１４は、レーザ光Ｌ１をサンプル４０に集光する。対物レンズ１４の開口数や倍率は特に限定されるものではない。
対物レンズ１４は、レーザ光Ｌ１をサンプル４０に集光する。対物レンズ１４で集光されたレーザ光Ｌ１がサンプル４０を照明する。また、ガルバノミラー１３によって、サンプル４０に対する相対的な照明位置が変化する。また、照明位置を走査する走査手段はガルバノミラー１３に限られるものではない。例えば、サンプル４０が配置される駆動ステージ等を走査手段として用いてもよい。もちろん、これらを組み合わせても良い。例えば、Ｘ方向はガルバノミラー１３で走査し、Ｙ方向はステージで走査しても良い。
走査手段は、レーザ光Ｌ１とサンプル４０との相対位置を変化させて走査を行う構成であればよい。なお、２次元方向のみの走査に限らず、３次元に走査するようにしてもよい。例えば、サンプル４０と対物レンズ１４との距離を変えることで、Ｚ方向に走査してもよい。これにより、３次元画像や断層画像を撮像することができる。
サンプル４０は、病理診断用の組織サンプルである。つまり、サンプル４０は、患者から採取された組織サンプルとなっている。サンプル４０は、色素で染色されている。レーザ光Ｌ１の波長は、色素の励起波長となっている。レーザ光Ｌ１は、サンプル４０中の色素で吸収される。レーザ光Ｌ１の一部は、サンプル４０を透過した透過光となる。
次にサンプル４０からの信号光を検出するための検出光学系について、説明する。サンプル４０を透過したレーザ光Ｌ１を信号光Ｌ２とする。信号光Ｌ２は、集光レンズ２１で集光される。集光レンズ２１の開口数は、対物レンズ１４の開口数と同じもしくはそれよりも高いものを用いるのが好ましい。なお、集光レンズ２１は、省略することも可能である。
信号光Ｌ２は、光検出器３１に入射する。光検出器３１は、集光レンズ２１で集光された信号光Ｌ２を検出する。光検出器３１は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）又はフォトダイオード（ＰＤ）である。光検出器３１は、信号光Ｌ２の検出光量に応じた検出信号をロックインアンプ３２に出力する。
ロックインアンプ３２は所定の繰り返し周波数をロックインして、光検出器３１からの信号をロックイン検出する。ここで、ロックインアンプ３２には参照光検出器３５からの参照光信号が入力されている。参照光信号は、変調周波数ｆで強度変調されている。ロックインアンプ３２は、変調周波数ｆのｎ倍（ｎは２以上の整数）の周波数で信号を復調する。例えば、変調周波数ｆを１０ｋＨｚとした場合、２０ｋＨｚ、３０ｋＨｚ・・・の周波数で復調が行われる。これにより、信号光Ｌ２の非線形な成分を抜き出して検出することができる。
処理部３３は、パーソナルコンピュータなどの情報処理装置であり、ロックインアンプ３２からの検出信号を記憶する。処理部３３は、ガルバノミラー１３を制御し、励起光をサンプル４０上で走査させる。処理部３３は、検出信号をガルバノミラー１３の走査位置に対応付ける。さらに処理部３３はロックインアンプ３２から出力された信号に基づいて光学像を形成する。
処理部３３で所定の操作を行うことにより、光学像を画面上に表示させることができる。また、処理部３３は、光学像のデータをメモリなどに記憶することができる。これにより、サンプル４０を透過した透過光によるサンプル４０の観察、撮像を行うことができる。さらに、処理部３３は、色素での吸収の飽和に基づく、信号光Ｌ２の非線形な成分に基づいて、診断画像を生成する。診断画像の生成については後述する。
変調器１２は、レーザ光強度が最大の時に色素での吸収の飽和が生じることによって、レーザ光強度と信号光強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させている。この点について、図３，及び図４を用いて説明する。図３は、対物レンズ１４の焦点とその近傍を示す模式図である。図４は、励起光強度と色素での吸収パワーとの関係を示すグラフである。図４では、横軸が励起光強度（レーザ光強度）を示し、縦軸が色素による光吸収量を示している。
図３に示すように、対物レンズ１４は、レーザ光Ｌ１をサンプル４０に集光している。したがって、サンプル４０中にレーザ光Ｌ１の焦点Ｆが形成される。例えば、ＸＹ平面におけるレーザ光Ｌ１の強度の空間分布は、ガウス分布となっている。焦点Ｆの中心において、レーザ光強度（励起光強度）が最も高くなる。さらに、焦点Ｆから離れるにつれて、レーザ光強度が低くなっていく。
通常のレーザ走査顕微鏡で透過光を検出する場合、レーザ光の吸収により画像にコントラストが発生する。したがって、通常のレーザ透過顕微鏡の解像度は、対物レンズで集光されるレーザ光のスポット径によって制限される。すなわち、解像度は、レーザ光波長と対物レンズの開口数で制限される。また、Ｚ方向におけるサンプル４０の全体でレーザ光が吸収される。よって、Ｚ方向におけるサンプル４０の厚さが厚い場合、焦点面以外でもレーザ光が吸収されてしまう。よって、通常のレーザ透過顕微鏡では、高解像度の診断画像を撮像することが困難である。また病理診断で使用される広視野透過顕微鏡（明視野顕微鏡）においても、観察面前後の光吸収により高解像度の診断画像を撮像することが困難である。
そこで、本実施の形態では色素での吸収飽和を利用している。レーザ光Ｌ１は色素を励起する励起光となる。励起光強度を高くするほど、色素に吸収される光量が増加していく。図４に示すように、励起光強度が高くなるにつれて、色素による光吸収量が高くなっていく。図４に示すように線形領域では、励起光強度と光吸収量とが線形関係（比例関係）となっている。さらに、励起光強度がある程度高くなると、色素において吸収の飽和が生じる。色素での吸収の飽和が生じると、励起光強度と光吸収量の関係が非線形となる。
ここで、励起光強度と光吸収量の関係が非線形となる領域を非線形領域とする。非線形領域は線形領域よりも励起光強度が高い領域である。線形領域では励起光強度と光吸収量との関係は傾き１の直線に一致するが、非線形領域ではその関係が傾き１の直線を外れ、傾きが１未満となる。さらに、励起光強度が高くなるにつれて、傾きが小さくなっていく。なお、色素の吸収断面積に応じて、非線形領域と線形領域との境界が異なる。
図５は、焦点Ｆにおける励起光強度と透過光強度を示す図であり、図６は非焦点における励起光強度と透過光強度を示す図である。図５，図６の上側のグラフが、励起光強度と透過光強度のそれぞれの時間変化を示すグラフを示し、横軸が時間ｔを示し、縦軸が励起光強度及び透過光強度を示している。図５，図６の下側のグラフが、透過光強度をフーリエ変換した振幅スペクトルを示している。
また、時間変化を示すグラフでは、実線が励起光強度を示しており、破線が透過光強度を示している。図５，図６では、色素による吸収の飽和が無い状態で、励起光強度と透過光強度の波形が一致するものとして図示している。したがって、非焦点では、励起光強度と透過光強度のグラフが重なっている。
焦点Ｆでは励起光強度が高いため、色素の吸収に飽和が生じる。したがって、色素を透過した透過光に吸収の飽和に応じた非線形な増加分が生じる。図５に示すように、励起光強度がピークとなるタイミングとその近傍では、吸収パワーが飽和し透過光に非線形な増加分が生じる。なお、焦点Ｆにおいて、励起光強度がボトムとなるタイミングでは、吸収パワーが飽和していないので、透過光の非線形な増加分は生じない。焦点Ｆでの透過光強度をフーリエ変換した振幅スペクトルでは、変調周波数ｆの整数倍の周波数（ｆ、２ｆ、３ｆ、４ｆ・・・）にピークを持つ線スペクトルとなる。
一方、非焦点では、励起光強度が低いため、励起光強度がピークとなるタイミングであっても、色素の吸収に飽和が生じない。すなわち、非焦点では、いずれのタイミングでも色素の吸収に飽和が生じないため、励起光強度と透過光強度とが線形関係となる。非焦点での透過光強度をフーリエ変換した振幅スペクトルでは、変調周波数ｆのみにピークを持つ線スペクトルとなる。
このように、焦点Ｆにおいて色素による吸収が飽和する。焦点Ｆから離れるほど、吸収の飽和成分が小さくなる。焦点Ｆから離れるほど、吸収の飽和に応じた透過光の非線形な増加成分が小さくなる。換言すると、焦点Ｆの中心に近づくほど、吸収の飽和に応じた透過光の非線形な増加成分が大きくなる。
このように、励起光強度が弱いときは、励起光強度と透過光強度が比例するが、励起光強度が非線形領域まで高くなると励起光強度と透過光強度が比例しなくなる。光検出器３１は、サンプル４０を透過した透過光を信号光Ｌ２として検出している。レーザ光強度を高くすると、光検出器３１で検出される信号光Ｌ２に非線形な増加成分が生じる。信号光の非線形な増加成分は、レーザ光強度が大きいほど発生しやすい。さらに、レーザ光強度が大きいほど、信号光に含まれる非線形な増加成分が大きくなる。処理部３３は、信号光Ｌ２の非線形成分に応じて、診断画像を生成する。
図７は、励起光強度と信号光強度との関係の計算結果を示すグラフである。横軸が励起光強度であり、縦軸が信号光強度である。図７の信号光強度は、変調周波数成分（ｆ）、変調周波数ｆの２倍の変調高調波成分（２ｆ）、及び３倍の変調高調波成分（３ｆ）をそれぞれ示している。
図７の計算には、エオシンＹ分子の光物性値を使用している。また、励起光の変調周波数ｆは１０ｋＨｚであり、その波長は５３２ｎｍを仮定している。
変調周波数成分（ｆ）で復調した透過信号と励起強度の関係は傾き１に一致する。すなわち、変調周波数成分（ｆ）で復調された透過信号は、線形信号となる。一方、変調周波数ｆの２倍の変調高調波（２ｆ）と３倍の変調高調波（３ｆ）で復調された透過信号は励起強度に対して、それぞれ２次と３次の非線形な増加を示す。すなわち、変調周波数ｆの２倍の変調高調波（２ｆ）と３倍の変調高調波（３ｆ）で透過信号を復調することで、透過信号のうち２次と３次の非線形信号成分をそれぞれ検出できる。
図８，図９は、ＸＺ平面における微小点の透過画像のシミュレーション結果を示す図である。図８，図９の上側には、透過信号の変調周波数成分（ｆ）、変調周波数ｆの２倍の変調高調波成分（２ｆ）および３倍の変調高調波成分（３ｆ）で構成された微小点の透過画像が示されている。図８の下側のグラフは、上記各画像のＸ方向に沿った強度プロファイルを示しており、図９の下側のグラフはＺ方向に沿った強度プロファイルを示している。レーザ光Ｌ１は波長５３２ｎｍの励起光として、ｙ方向の直線偏光としている。色素はエオシンＹであり、変調周波数ｆ＝１０ｋＨｚとしている。対物レンズの開口数は１．４である。
図８，図９では、変調周波数ｆと変調周波数の変調高調波２ｆ、３ｆの信号でそれぞれ構成された微小点の画像の信号強度プロファイルが示されている。変調周波数ｆの信号で構成された画像におけるＸ方向プロファイルのＦＷＨＭ（Full Width at Half Maximum）は１７４ｎｍであり、Ｚ方向プロファイルのＦＷＨＭは４９７ｎｍとなる。変調周波数ｆの２倍の変調高調波２ｆの信号で構成された画像におけるＸ方向プロファイルのＦＷＨＭは１３０ｎｍであり、Ｚ方向プロファイルのＦＷＨＭは３４６ｎｍとなる。変調周波数ｆの３倍の変調高調波３ｆの信号で構成された画像におけるＸ方向プロファイルのＦＷＨＭは１０９ｎｍであり、Ｚ方向プロファイルのＦＷＨＭは２８８ｎｍとなる。したがって、変調周波数ｆのｎ倍（ｎは２以上の整数）の高調波成分で検出信号を復調することで、画像の広がりが小さくなり、高空間分解能である撮像が可能となる。
例えば、２次の変調高調波成分を検出することにより、１次の変調周波数成分を検出した場合と比べてＸＹ平面で１．３４倍の空間分解能で検出することができる。このように２次、３次の変調高調波成分を検出することにより、空間分解能をそれぞれ１．３４倍、１．６０倍に向上させることができる。従って、回折限界を超えた空間分解能で撮像することが可能になり、従来のレーザ顕微鏡に比べて高空間分解能で撮像することができる。さらに、光検出器３１は、蛍光ではなく、レーザ光波長の透過光を信号光Ｌ２として検出している。換言すると、光検出器３１でサンプル４０を透過した透過光を検出しているため、高いＳ／Ｎで検出することができる。よって、簡便な構成で高空間分解能での撮像を実現することができる。よって、診断精度の向上に資することができる。
光検出器３１が、照明光であるレーザ光Ｌ１と同じ波長の透過光を信号光Ｌ２として検出している。このため、高次の非線形効果を観察する場合でも、レーザ光と同じ波長の光を検出すればよい。すなわち、サンプル４０を透過した透過光の検出で、非線形効果に基づく観察が可能になる。すなわち、非線形光学損失を計測しているため、短波長用の光学部品や計測器を準備しなくても、容易に高次の非線形応答を確認することができる。よって、可視域用の光学系を用いながらも、高い空間分解能を実現することができる。非線形の応答を分離検出することにより、回折限界を越えた空間分解能で試料の形状を３次元観察することができる。
本実施の形態にかかる光学顕微鏡を用いることで、電子顕微鏡を用いずとも、高解像度の診断画像の撮像が可能となる。よって、電子顕微鏡よりも安価な光学顕微鏡で、診断精度を向上することが可能になる。さらに、電子顕微鏡用のサンプルを作成する必要がなくなるため、簡便に診断することができる。高い３次元空間分解能を得ることができるため、厚いサンプル４０を薄い切片に加工せずとも断面像を撮像することができる。
さらに、特許文献１では、高次の非線形光学効果により光高調波を発生させる構成とする必要があるのに対して、本実施の形態では、色素での吸収の飽和を用いているため、高次の非線形光学効果により光高調波を発生させる必要がない。
上記の説明では、変調器を用いてレーザ光強度を変化させたが、これ以外の方法によってレーザ光強度を変化させても良い。たとえば、特許文献２に示したように、レーザ光Ｌ１の光路にＮＤフィルタを挿脱することで、レーザ光強度を段階的に変化させることができる。そして、レーザ光強度が最大となるときに、色素での吸収の飽和が発生するようにする。あるいは、出力強度の異なる２つ以上のレーザ光源を用いて、レーザ光強度を変えてもよい。これにより、同様の効果を得ることができる。例えば、信号光が非線形領域となる第１の強度と、第１の強度と異なる第２の強度の少なくとも２つの強度とで試料に照射されるようレーザ光の強度を変化させる。第２の強度では線形領域となるようにしてもよい。そして、第１の強度での信号光の強度及び前記第２の強度での信号光の強度に基づいて信号光の非線形な増加成分を算出する。このようにしても、同様の効果を得ることができる。
また、他の方法として、複数の周波数で復調する方法がある。例えば、復調周波数を０（ＤＣ）、ｆ、２ｆ、・・・と複数にする。それぞれの復調結果の線形演算を行うことで、非線形信号を抽出する。複数の復調周波数を用いることで、単一周波数の復調に比べて、信号光が増大する。例えば、２次の非線形成分の抽出には、０（ＤＣ）、ｆ、２ｆの３つの復調周波数で復調する。また、３次の非線形成分の抽出には、０（ＤＣ）、ｆ、２ｆ、３ｆの４つの復調周波数で復調する。ｎ次の非線形信号に対して、ｎｆ以下の周波数の信号を測定すればよい。例えば、処理部３３が上記の処理を行うことで、画像を生成することができる。
上記の説明では、サンプル４０からの透過信号のみを検出したが、同時にサンプル４０からの蛍光を検出してもよい。例えば、レーザ光Ｌ１の光路にダイクロイックミラーを挿入することで、サンプル４０から発生した蛍光信号をレーザ光Ｌ１から分岐できる。蛍光信号の検出には、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）又はフォトダイオード（ＰＤ）を使用してもよい。よって、蛍光画像と、透過光の非線形な増加成分に基づく画像とを同時に撮像することができ、高精度の病理診断に資することができる。
レーザ光源１１をＣＷレーザ光源とすることで装置構成を簡素化することができ、取り扱いを容易にすることができる。また、サンプル４０に照射されるレーザ光Ｌ１はパルスレーザ光であってもよい。例えば、レーザ光源１１をパルスレーザ光源としてもよい。あるいは、レーザ光源１１をＣＷレーザ光源として、変調器１２によりレーザ光Ｌ１がパルスレーザ光となるよう変調されてもよい。パルスレーザ光を用いることで、入射強度を弱くしても、吸収の飽和を生じさせることができる。これにより、サンプル４０の褪色を防ぐことができる。
実施例
図１０は、本実施の形態にかかる光学顕微鏡で測定された、励起光強度（レーザ光強度）を変えた場合の色素溶液からの透過信号光強度の変化を示す図である。横軸が励起光強度であり、縦軸が信号強度である。図１０の信号光強度は、変調周波数成分（ｆ）と変調周波数ｆの２倍の変調高調波成分（２ｆ）で復調された透過信号の強度をそれぞれ示している。
図１０は、本実施の形態にかかる光学顕微鏡で測定された、励起光強度（レーザ光強度）を変えた場合の色素溶液からの透過信号光強度の変化を示す図である。横軸が励起光強度であり、縦軸が信号強度である。図１０の信号光強度は、変調周波数成分（ｆ）と変調周波数ｆの２倍の変調高調波成分（２ｆ）で復調された透過信号の強度をそれぞれ示している。
色素はエオシンＹであり、その溶液濃度は４ｍＭである。励起光波長は５３２ｎｍであり、対物レンズの開口数は０．３である。変調周波数ｆ＝１０ｋＨｚとしている。
変調周波数成分（ｆ）で復調した透過信号と励起強度の関係は傾き１に一致する。すなわち、変調周波数成分（ｆ）で復調された透過信号は、線形信号となる。一方、変調周波数ｆの２倍の変調高調波（２ｆ）で復調された透過信号は励起強度に対して、２次の非線形な増加を示す。すなわち、変調周波数ｆの２倍の変調高調波（２ｆ）で透過信号を復調することで、透過信号のうち２次の非線形信号成分を検出できる。
図１１は、本実施の形態にかかる光学顕微鏡で撮像された画像とそのプロファイルを示す図である。図１１は、エオシンＹ溶液で染色した直径２μｍのポリスチレンビーズをサンプル４０として観察した際のＸＹ画像を示している。具体的には、図１１は、変調周波数ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像と、その２倍の変調高調波２ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像を示している。さらに、図１１の下側のグラフは、それぞれの画像のマーク部分におけるプロファイルを示している。
レーザ光波長は５３２ｎｍである。１画素あたりの露光時間は、５００μｓｅｃである。画素サイズは、３０３ｎｍ／ｐｉｘｅｌである。対物レンズの開口数は０．３である。変調周波数ｆの画像におけるレーザ光強度は、５６Ｗ／ｃｍ２であり、変調高調波２ｆの画像におけるレーザ光強度は、２７ｋＷ／ｃｍ２である。
変調高調波２ｆの信号で構成された画像は、変調周波数ｆの信号で構成された画像よりも高い空間分解能となっている。変調高調波２ｆの信号で構成されたビーズ画像のサイズ（ＦＷＨＭ）は２．１μｍであり、変調周波数ｆで構成された同じビーズ画像のサイズ（ＦＷＨＭ）は、３．０μｍである。変調高調波２ｆの成分の検出により、高解像度での撮像が可能となる。
図１２は、ラットの腎組織をサンプルとして撮像したＸＹ画像を示している。サンプルを染色した色素はエオシンＹである。具体的には、図１２は、変調周波数ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像と、変調高調波２ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像を示している。さらに、図１２の下側のグラフは、それぞれの画像のマーク部分のプロファイルを示している。
レーザ光波長は５３２ｎｍである。１画素あたりの露光時間は、５００μｓｅｃである。画素サイズは、２９３ｎｍ／ｐｉｘｅｌである。対物レンズの開口数は０．３である。変調周波数ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は、１００Ｗ／ｃｍ２であり、変調高調波２ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は２７ｋＷ／ｃｍ２である。
図１３は、高開口数NA＝１．４の対物レンズを使用して撮像したラットの腎組織のＸＹ画像を示している。サンプルを染色した色素はエオシンＹである。具体的には、図１３は、変調周波数ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像と、変調高調波２ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像を示している。
レーザ光波長は５３２ｎｍである。１画素あたりの露光時間は、５００μｓｅｃである。画素サイズは、５９ｎｍ／ｐｉｘｅｌである。対物レンズの開口数は１．４である。変調周波数ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は、１１０Ｗ／ｃｍ２であり、変調高調波２ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は１３０ｋＷ／ｃｍ２である。
図１４は、ラットの腎組織をサンプルとして撮像したＸＺ画像を示している。サンプルを染色した色素はエオシンＹである。具体的には、図１４は、変調周波数ｆで復調し信号で構成されたサンプル画像と、その２倍の変調高調波２ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像を示している。
レーザ光波長は５３２ｎｍである。１画素あたりの露光時間は、５００μｓｅｃである。画素サイズは、９８ｎｍ／ｐｉｘｅｌである。対物レンズの開口数は１．４である。変調周波数ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は、７．９ｋＷ／ｃｍ２であり、変調高調波２ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は３９０ｋＷ／ｃｍ２である。
図１５は、ラットの腎組織をサンプルとして撮像したＸＹ画像を示している。サンプルを染色した色素はヘマトキシリンである。具体的には、図１５は、変調周波数ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像と、変調高調波２ｆで復調した信号で構成されたサンプル画像を示している。さらに、図１５の下側のグラフは、それぞれの画像のマーク部分のプロファイルを示している。
レーザ光波長は５３２ｎｍである。１画素あたりの露光時間は、５００μｓｅｃである。画素サイズは、２９３ｎｍ／ｐｉｘｅｌである。対物レンズの開口数は０．３である。変調周波数ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は、１００Ｗ／ｃｍ２であり、変調高調波２ｆの信号で構成された画像におけるレーザ光強度は４８ｋＷ／ｃｍ２である。
上記の実施例の画像から明らかなように、透過信号に含まれる高調波成分に基づいて診断画像を生成することで、高解像度の診断画像を取得することができる。
以下、サンプル４０を染色する色素の濃度およびサンプル４０の厚さについて説明する。サンプル中の色素の量が多すぎる場合、色素の吸収により検出される透過光の光量が少なくなる。このため、検出される透過光の非線形信号成分の量が少なくなる。例えば、サンプル中の色素の濃度が十分高い場合、検出される透過光の非線形信号成分の量が少なくなる。あるいは、サンプルの厚さが十分厚い場合、検出される透過光の非線形信号成分の量が少なくなる。したがって、サンプル中の色素濃度とサンプルの厚さを一定値以下とすることが好ましい。
以下、透過信号強度と、サンプル４０を染色する色素の濃度およびサンプル４０の厚さの関係について説明する。色素の濃度をＣとし、Ｚ方向におけるサンプル４０の厚さをＬとする。なお、ここでの厚さＬは、組織切片や細胞の厚さではなく、サンプル４０中で光吸収が比較的強く起こる部位の厚さとしてもよい。濃度Ｃと厚さＬとの積を積ＣＬとする。透過信号強度をItrとすると、Itrと積ＣＬの関係は数式(１)と数式(２)を用いて表される。ここで数式（１）のIexは励起強度を示す。Wo(x)はLambert W関数を示す。Is はsaturation intensityと呼ばれ、その内容は後述する。数式(２)のσは色素の吸収断面積、NAはアボガドロ定数を示す。
ここで数式（１）と数式（２）のIs はsaturation intensityと呼ばれ、数式（３）に示すようになる。数式（３）のhはプランク定数、cは光速、λはレーザ光L1の波長、kfは分子励起状態から基底状態への輻射を伴う緩和過程の速度定数、knfは輻射を伴わない緩和過程の速度定数をそれぞれ示している。
図１６にエオシンＹの光物性値を基に、数式（１）と数式（２）を用いて計算した積ＣＬと、信号光強度との関係を示す。横軸は積ＣＬを示し、縦軸は信号光（透過光）強度を示している。変調周波数ｆ＝１０ｋＨｚである。図１６では、透過光の変調周波数成分（ｆ）、２次の変調高調波成分（２ｆ）、及び３次の変調高調波成分（３ｆ）のグラフを示している。図１６では、各成分について、４通りの励起光強度での計算結果を示している。
例えば、積ＣＬが４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２以下の場合、積ＣＬの増加とともに透過光の変調高調波成分が増加する。積ＣＬが４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２よりも大きい場合、積ＣＬの増加とともに２次又は３次の変調高調波成分が減少する。
このように、特にエオシンＹで染色した組織サンプルを撮像する場合において、積ＣＬを４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２以下とすることが好ましい。色素の吸収飽和に応じた信号光の非線形な増加成分に基づいて、高解像度の診断用画像を生成することができる。
エオシンＹ以外の色素で染色した組織サンプルを撮像する場合においても、積ＣＬの値を、透過信号強度の変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが積ＣＬに対して正となる範囲で調整することが好ましい。サンプルを任意の色素で染色した場合において、積ＣＬに対して変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に積ＣＬの値が含まれていることが好ましい。色素の吸収飽和に応じた信号光の非線形な増加成分に基づいて、高解像度の診断用画像を生成することができる。
なお、レーザ光波長は、色素の吸収ピーク波長と一致していてもよく、一致していなくても良い。また、レーザ光波長を吸収ピーク波長から短波長側にずらしてもよい。このようにすることで、より高い分解能で撮像することができる。例えば、紫外線レーザ光を励起光として用いることも可能である。
また、レーザ波長を色素の吸収ピーク波長からずらすことで、吸収断面積が小さくなる。色素の吸収断面積に応じて、積ＣＬに対して変調周波数ｆの変調高調波成分が正の傾きを持つ範囲が変わることになる。つまり、レーザ波長に応じて、積ＣＬに対して透過信号強度の変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲の上限値が変わることになる。この点について、図１７を用いて説明する。図１７は色素の吸収断面積を変えた場合の積ＣＬと、信号光強度との関係を示す。
図１７に示すように、吸収断面積が大きい場合、色素の吸収が飽和しやすくなるため、積ＣＬに対して透過信号強度の変調周波数ｆの変調高調波成分２ｆ、３ｆの傾きが正となる範囲の積ＣＬの上限値が小さくなる。このため、吸収断面積が大きいほど、傾きが正となる範囲が狭くなる。また、レーザ波長に応じて、色素の吸収断面積が変化する。レーザ波長を変えることで、積ＣＬに対して透過信号強度の変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に積ＣＬの値を含ませることができる。すなわち、色素に対して適切な吸収断面積を有するレーザ波長を選択することで、高解像度の画像を撮像することができる。
なお、サンプル４０は、エオシン、及びヘマトキシリン以外の色素で染色されていてもよい。また、サンプル４０は、２以上の色素で染色されていても良い。例えば、免疫染色、PAS（periodic acid-Schiff）染色、Masson trichrome染色、Congo red染色、Oil red O染色、アザン染色、ギムザ染色、スダンＩＩＩ染色等の染色法を用いてもよい。もちろん、サンプル４０を染色する色素の種類および染色法等は、上記の例に限定されるものではない。
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることは言うまでもない。
この出願は、２０２１年２月１日に出願された日本出願特願２０２１－１４２７２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１ 光学顕微鏡
１１ レーザ光源
１２ 変調器
１３ ガルバノミラー
１４ 対物レンズ
２１ 集光レンズ
３１ 光検出器
３２ ロックインアンプ
３３ 処理部
３４ ビームサンプラ
３５ 参照光検出器
４０ サンプル
１１ レーザ光源
１２ 変調器
１３ ガルバノミラー
１４ 対物レンズ
２１ 集光レンズ
３１ 光検出器
３２ ロックインアンプ
３３ 処理部
３４ ビームサンプラ
３５ 参照光検出器
４０ サンプル
Claims (14)
- 組織観察又は病理診断のための画像を撮像する光学顕微鏡であって、
所定のレーザ波長を有し、光吸収物質を含むサンプルを照明するレーザ光を発生する少なくとも一つのレーザ光源と、
前記レーザ光を集光して、前記サンプルに集光するレンズと、
前記サンプルに対する前記レーザ光の集光位置を変化させる走査手段と、
前記サンプルを透過したレーザ光を前記レーザ波長の信号光として検出する光検出器とを備え、
レーザ光強度が最大の時に前記光吸収物質での吸収の飽和が生じることによって、レーザ光強度と信号光強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させ、
前記光吸収物質での吸収の飽和に基づく、前記信号光の非線形な成分に基づいて、画像を生成する光学顕微鏡。 - 前記光吸収物質が色素であり、
前記サンプルが、前記色素で染色された組織、細胞、又はバクテリアを含む請求項１に記載の光学顕微鏡。 - 前記サンプルを染色する前記色素がエオシンＹであり、
前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積ＣＬが４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２以下となっている請求項２に記載の光学顕微鏡。 - 前記レーザ光を変調周波数ｆで強度変調し、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積を積ＣＬとした場合に、
前記積ＣＬに対して透過信号に含まれる変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に、前記積ＣＬの値が含まれている請求項２に記載の光学顕微鏡。 - 前記レーザ光の集光位置を前記サンプルの厚さ方向に変化させている請求項１～４のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
- 前記レーザ光源がＣＷ（Continuous Wave）レーザ光を発生する請求項１～５のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
- 前記サンプルに入射する前記レーザ光がパルスレーザ光である請求項１～５のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
- 光学顕微鏡を用いて組織観察又は病理診断のための画像を撮像する撮像方法であって、
所定のレーザ波長を有し、光吸収物質を含むサンプルを照明するレーザ光を発生するステップと、
前記レーザ光を集光して、前記サンプルに集光するステップと、
前記サンプルに対する前記レーザ光の集光位置を変化させるステップと、
前記サンプルを透過したレーザ光を前記レーザ波長の信号光として検出するステップと、
レーザ光強度が最大の時に前記光吸収物質での吸収の飽和が生じることによって、レーザ光強度と信号光強度との関係が非線形な非線形領域となるようにレーザ光の強度を変化させるステップと、
前記光吸収物質での吸収の飽和に基づく、前記信号光の非線形な成分に基づいて、画像を生成するステップと、を備えた撮像方法。 - 前記光吸収物質が色素であり、
前記サンプルが、前記色素で染色された組織、細胞、又はバクテリアを含む請求項８に記載の撮像方法。 - 前記色素がエオシンＹであり、
前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積ＣＬが４．０×１０－９ｍｏｌ／ｃｍ２以下となっている請求項９に記載の撮像方法。 - 前記レーザ光を変調周波数ｆで強度変調し、前記色素の濃度Ｃと前記サンプルの厚さＬとの積を積ＣＬとした場合に、
前記積ＣＬに対して透過信号に含まれる変調周波数ｆの変調高調波成分の傾きが正となる範囲に、前記積ＣＬの値が含まれている請求項９に記載の撮像方法。 - 前記レーザ光の集光位置を前記サンプルの厚さ方向に変化させている請求項８～１１のいずれか１項に記載の撮像方法。
- 前記レーザ光がＣＷ（Continuous Wave）レーザ光である請求項８～１２のいずれか１項に記載の撮像方法。
- 前記サンプルに入射する前記レーザ光がパルスレーザ光である請求項８～１２のいずれか１項に記載の撮像方法。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP2021014272 | 2021-02-01 | ||
| JP2021014272 | 2021-02-01 | ||
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| JPWO2022163445A1 JPWO2022163445A1 (ja) | 2022-08-04 |
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| JP2022578273A Active JP7465512B2 (ja) | 2021-02-01 | 2022-01-19 | 光学顕微鏡、及び撮像方法 |
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| JP2015197606A (ja) | 2014-04-01 | 2015-11-09 | 株式会社ニコン | 超解像観察装置及び超解像観察方法 |
| JP2020523615A (ja) | 2017-06-15 | 2020-08-06 | サンストーン サイエンティフィック リミテッド | 特殊染色用のプロセス記録スライド |
-
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