JP2015197606A - 超解像観察装置及び超解像観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】無染色試料を超解像観察する。
【解決手段】本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する抽出部とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。

近年、バイオサイエンス、特に分子生物学の分野や病理診断の分野では、試料を蛍光プローブなどで染色せず「そのままの状態で」顕微することのできる無染色顕微鏡の必要性が高まりつつある。この無染色顕微鏡が満たすべき要求は、主に以下の（１）、（２）である。
（１）高い光学分解能（例えば、平面分解能＜５０ｎｍ、奥行分解能＜１００ｎｍ）。
（２）試料内部における観察対象の識別能力。

これらの要求を満たす可能性のある新しい無染色顕微鏡として、誘導放出顕微鏡が提案された（特許文献１等を参照。）。

国際公開第２０１１／０９９２６９号パンフレット

誘導放出顕微鏡は、観察対象物に固有のエネルギー準位を利用するため、上記の要求（２）を十分に満たしうるものの、上記の要求（１）を満たすためには依然として改善の余地があり、ここに現状の課題が存する。

そこで本発明は、上記の課題を解決すべく、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法を提供する。

本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する抽出部とを備える。

本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω_１の照明光を観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部と、前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分を抽出する抽出部とを備える。

本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光し、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調し、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する。

本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、光周波数ω_１の照明光を観察対象面の領域に集光し、前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調し、前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分を抽出する。

本発明によれば、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法が実現する。

本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 観察対象面Ｐ_０へ入射する励起光及び誘導光の時間変化波形である（励起光の変調を可視化してないもの）。 観察対象面Ｐ_０へ入射する励起光及び誘導光の時間変化波形（励起光の変調を可視化したもの）である。 光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第２実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第３実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第３実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第４実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第４実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第５実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第５実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する光と各領域から射出する各光とを比較する図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として誘導放出過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。

図１は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり超解像顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、レンズ１２と、ビームスプリッタ１３１と、ミラーＭ１と、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１４１、１４３と、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）１５と、ミラーＭ２と、ダイクロイックミラー１３４と、対物レンズ１９と、試料２０と、試料ステージ２８と、対物レンズ２１と、波長選択フィルタ２２と、集光レンズ２３と、フォトダイオードなどの光検出器２４と、ロックインアンプ２５と、信号発生器２６と、パーソナルコンピュータ２７とが配置される。

パルスレーザ光源１１は、フェムト秒パルスレーザ光源、ピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源である。パルスレーザ光源１１によるパルス発振の繰り返し周波数ｆ_ｒは、例えば８０ＭＨｚであり、パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス幅ΔＴは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。

パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１２により径の太い平行光束となり、ビームスプリッタ１３１へ入射する。ビームスプリッタ１３１へ入射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３１を透過するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３１を反射するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３１を透過したパルスレーザ光は光パラメトリック発振器１４１へ入射する。

ビームスプリッタ１３１を反射したパルスレーザ光は、ミラーＭ１を反射し、光パラメトリック発振器１４３へ入射する。

光パラメトリック発振器１４１は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω_１に変換し、光パラメトリック発振器１４３は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω_２に変換する。ここでは、光周波数ω_１、ω_２の大小関係をω_１＞ω_２とする。

音響光学変調器１５は、光パラメトリック発振器１４１の射出光路、つまり光周波数ω_１のパルスレーザ光の単独光路に配置され、そのパルスレーザ光の強度を時間方向にかけて単一周波数ｆ_ｍの正弦波で変調する。なお、音響光学変調器１５によるパルスレーザ光の変調波形（変調周波数ｆ_ｍ）は、信号発生器２６から与えられる制御信号によって制御される。

光パラメトリック発振器１４１から射出した光周波数ω_１のパルスレーザ光は、音響光学変調器１５を介してミラーＭ２を反射し、ダイクロイックミラー１３４を反射する。

光パラメトリック発振器１４３から射出した光周波数ω_２のパルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１３４を透過し、光周波数ω_１のパルスレーザ光と光路を統合させる。

互いの光路を統合させた光周波数ω_１、ω_２のパルスレーザ光は、対物レンズ１９により、試料２０の観察対象面Ｐ_０の微小領域に向かって集光され、光スポットを形成する。

なお、観察対象面Ｐ_０に光周波数ω_１のパルスレーザ光が形成する光スポットと、観察対象面Ｐ_０に光周波数ω_２のパルスレーザ光が形成する光スポットとの間では、形状、位置、及びサイズがほぼ共通である。以下、観察対象面Ｐ_０に光周波数ω_１のパルスレーザ光が形成する光スポットと、観察対象面Ｐ_０に光周波数ω_２のパルスレーザ光が形成する光スポットとを区別せず単に「光スポットＳ」と称す。

ここで、光周波数ω_１のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω_２のパルスレーザ光の光路長との関係は、観察対象面Ｐ_０に照射される順序が以下の順序となるように予め調整されている。

（１）光周波数ω_１のパルスレーザ光
（２）光周波数ω_２のパルスレーザ光
このうち、先に照射される光周波数ω_１のパルスレーザ光には、光スポットＳに存在する特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起準位へと移行（光吸収）させる働きがあり、次に照射される光周波数ω_２のパルスレーザ光には、励起中の電子を基底準位へ移行（誘導放出）させて光周波数ω_２の誘導放出光を発生させる働きがある。

そこで以下では、先に照射される光周波数ω_１のパルスレーザ光を「励起光」と称し、次に照射される光周波数ω_２のパルスレーザ光を「誘導光」と称す。

なお、本実施形態の超解像顕微鏡において、励起光及び誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と光周波数ω_１、ω_２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて上述した誘導放出過程（上述した励起及び誘導放出）が生起するように予め調整されている。光周波数ω_１、ω_２の各々は、波長換算でおよそ紫外域〜近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましく、パルス幅は、ピコ秒〜フェムト秒の時間幅に設定されることが望ましい。

また、本実施形態の超解像顕微鏡において、励起光及び誘導光の各々のパルス光強度は、光スポットＳの中央領域Ａ_２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ_１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に予め調整されている。なお、光吸収量が飽和しているか否かを判別するためには、後述する高周波数成分が検出されるか否かを判別すればよい。

なお、励起光及び誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率とによって調整することが可能である。或いは、励起光及び誘導光の少なくとも一方の光路にＮＤフィルタ（不図示）を配置し、そのＮＤフィルタの透過率を調整してもよい。

図２（ａ）に示すのは観察対象面Ｐ_０に入射する励起光の時間変化波形であり、図２（ｂ）に示すのは観察対象面Ｐ_０に入射する誘導光の時間変化波形である。

図２（ａ）、（ｂ）に示すとおり励起光と誘導光の間でパルスの繰り返し周期Ｔｒは共通であるが、励起光と誘導光の間でパルスが観察対象面Ｐ_０に到達するタイミングは若干ずれている。図２（ｃ）は、励起光及び誘導光の３パルス分の波形を同一座標上に拡大表示したものである。図２（ｃ）において実線で示すのが励起光のパルスであり、点線で示すのが誘導光のパルスである。図２（ｃ）に示すとおり励起光のパルスが観察対象面Ｐ_０に到達するタイミングと、誘導光のパルスが観察対象面Ｐ_０に到達するタイミングとの間のズレΔは、励起光及び誘導光の各々のパルス幅ΔＴより若干大きい程度、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。

なお、励起光及び誘導光が観察対象面Ｐ_０に到達するタイミングのズレΔを調整するために、本実施形態の超解像顕微鏡では、励起光の単独光路と誘導光の単独光路とのうち少なくとも一方の光路には、可動ミラーなどで構成された光路長調整機構（不図示）が設けられていることが望ましい。

また、図２（ａ）、（ｂ）では、音響光学変調器１５による励起光の変調を可視化しなかったが、可視化すると図３（ａ）、（ｂ）のとおりである。図３に示すとおり、音響光学変調器１５による励起光の変調周波数ｆ_ｍは、パルスの繰り返し周波数ｆ_ｒと比較して十分に低く、少なくともｆ_ｍ≦ｆ_ｒ／２の関係を満たし、例えばｆ_ｍは数ＭＨｚ程度である。なお、図３において符号Ｔ_ｍで示すのは励起光の変調周期（＝変調周波数ｆ_ｍの逆数）である。

さて、図１に戻り、試料２０は、例えば、培養液と共に培養容器に収容された透明な生体細胞であり、この生体細胞中の特定物質（例えば、ヘモグロビンなどの特定タンパク質）が観察対象物質である。上述した誘導放出過程では、観察対象物質に固有のエネルギー準位の変位（光吸収）を利用するため、観察対象物質が予め蛍光染色されている必要は無い。

試料ステージ２８は、試料２０を支持し、光軸方向（Ｚ方向）にかけて試料２０を移動させると共に、光軸と垂直な方向（ＸＹ方向）にかけて試料２０を移動させる透過型のステージである。試料ステージ２８がＺ方向にかけて試料２０を移動させると、試料２０の内部における観察対象面Ｐ_０の深さが調整され、試料ステージ２８がＸＹ方向にかけて試料２０を移動させると、光スポットＳで観察対象面Ｐ_０を二次元スキャンすることができる。

観察対象面Ｐ_０の光スポットＳから射出した光、すなわち、光スポットＳから射出した励起光（余剰励起光）、光スポットから射出した誘導光（余剰誘導光）、光スポットで発生した誘導放出光は、対物レンズ２１の先端側から対物レンズ２１に入射する。

対物レンズ２１の仕様（開口数、倍率など）は、対物レンズ１９の仕様と同じであり、対物レンズ２１と対物レンズ１９との間の位置関係及び姿勢関係は、観察対象面Ｐ_０に関して対称である。なお、ここでは対物レンズ２１の仕様と対物レンズ１９の仕様とを共通としたが、完全に共通でなくても構わない。例えば、対物レンズ２１の開口数は対物レンズ１９の開口数より大きくても良い。

対物レンズ２１に先端側から入射した光、すなわち、観察対象面Ｐ_０の光スポットＳから射出した励起光（余剰励起光）、観察対象面Ｐ_０の光スポットＳから射出した誘導光（余剰誘導光）、観察対象面Ｐ_０の光スポットＳから射出した誘導放出光は、対物レンズ２１の瞳側から射出し、波長選択フィルタ２２、集光レンズ２３を順に介して光検出器２４へ向かう。

ここで、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光と光周波数ω_２の光との一方をカットし、かつ、他方を通過させる波長選択性が付与されている。以下、波長選択フィルタ２２は、光周波数ω_１の光を通過させ、かつ光周波数ω_２の光をカットすると仮定する。

よって、光スポットＳから射出した余剰励起光（光周波数ω_１）は光検出器２４へ入射し、光スポットＳから射出した余剰誘導光及び誘導放出光（光周波数ω_２）は光検出器２４へ入射しない。

光検出器２４は、入射光の強度を電気信号に変換するフォトダイオードなどの光電変換素子である。

ロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号から、励起光の変調周波数ｆ_ｍの２倍周波数（２ｆ_ｍ）で変化する成分を信号としてロックイン検出する。なお、ロックインアンプ２５の検出周波数及び検出タイミングは、信号発生器２６から与えられる制御信号によって制御される。

パーソナルコンピュータ２７は、ロックインアンプ２５の検出した信号を取り込む。また、パーソナルコンピュータ２７は、前述したスキャン中、光スポットＳが観察対象面Ｐ_０の各位置にあるとき（具体的には、光スポットＳの中央領域Ａ_２が観察対象面Ｐ_０の各位置にあるとき）に信号の取り込みを行い、観察対象面Ｐ_０における信号の分布を超解像画像として作成すると、不図示のモニタへ表示する。

以下、図４を参照して超解像顕微鏡の超解像効果を説明する。

図４（ａ）に示すのは、光スポットＳの周辺領域Ａ_１へ照射される光の時間変化波形であって、図４（ａ）符号ω_１は、励起光（照射励起光）の波形であり、図４（ａ）符号ω_２は、誘導光（照射誘導光）の波形である（なお、図４では、細かなパルスの図示を省略し、パルスの包絡線のみを示した。）。

図４（ａ’）に示すのは、光スポットＳの周辺領域Ａ_１から射出する光の時間変化波形であって、図４（ａ’）符号ω_１は、光吸収に寄与しなかった余剰励起光の波形であり、図４（ａ’）符号ω_２は、誘導光及び誘導放出光（以下、まとめて「余剰誘導・放出光」と称す。）の合成波形である。

図４（ｂ）に示すのは、光スポットＳの中央領域Ａ_２へ照射される光の時間変化波形であって、図４（ｂ）符号ω_１は、励起光（照射励起光）の波形であり、図４（ｂ）符号ω_２は、誘導光（照射誘導光）の波形である。

図４（ｂ’）に示すのは、光スポットＳの中央領域Ａ_２から射出する光の時間変化波形であって、図４（ｂ’）符号ω_１は、光吸収に寄与しなかった余剰励起光の波形であり、図４（ｂ’）符号ω_２は、誘導光及び誘導放出光（以下、まとめて「余剰誘導・放出光」と称す。）の合成波形である。

さて、本実施形態の超解像顕微鏡では、上述したとおり励起光が変調周波数ｆ_ｍで変調されるので、周辺領域Ａ_１に対する照射励起光の強度（図４（ａ）符号ω_１）、中央領域Ａ_２に対する照射励起光の強度（図４（ｂ）符号ω_１）は、共に変調周波数ｆ_ｍで時間変化する。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、これらの照射励起光が変調周波数ｆ_ｍで時間変化するので、周辺領域Ａ_１における光吸収量（不図示）、中央領域Ａ_２における光吸収量（不図示）も、基本的には周波数ｆ_ｍで時間変化する。

このため、本実施形態の超解像顕微鏡では、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω_１）、中央領域Ａ_２から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω_１）の各々には、周波数ｆ_ｍの周波数成分が発生する。

但し、本実施形態の超解像顕微鏡装置では、周辺領域Ａ_１における光吸収量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量（不図示）は飽和する。

したがって、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω_１）には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、中央領域Ａ_２から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω_１）には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分（例えば周波数２ｆ_ｍの成分）が発生する（図４（ｂ’）の点線矢印を参照。）。

そこで、本実施形態のロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号（＝光周波数ω_１の光強度信号）から、周波数２ｆ_ｍで変化する信号のみをロックイン検出する。

この信号（＝周波数２ｆ_ｍで変化する光周波数ω_１の光強度信号）には、周辺領域Ａ_１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量は反映される。

したがって、本実施形態のロックインアンプ２５は、光スポットＳで発生した光から、中央領域Ａ_２から射出した余剰励起光（図４（ｂ’）符号ω_１）の高周波数成分（周波数２ｆ_ｍで変化する成分）のみを抽出することができる。

したがって、本実施形態の超解像顕微鏡は、光スポットＳより小さい中央領域Ａ_２のみに信号の取得元を制限すること、つまり、試料２０における観察対象物質の密度分布を超解像観察することができる。
［第１実施形態の変形例］
なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を励起光の変調周波数ｆ_ｍの２倍（２ｆ_ｍ）に設定したが、変調周波数ｆ_ｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。

また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、励起光の光周波数ω_１と同じにしたが、誘導光の光周波数ω_２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。

この場合、ロックインアンプ２５は、余剰励起光（図４（ｂ’）符号ω_１）の高周波数成分の代わりに、余剰誘導・放出光（図４（ｂ’）符号ω_２）の高周波数成分を抽出することができる。この場合も超解像観察が可能である。その理由は、以下のとおりである。

すなわち、周辺領域Ａ_１から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω_２）、中央領域Ａ_２から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω_２）の各々には、周波数ｆ_ｍの周波数成分が発生する。

但し、周辺領域Ａ_１における光吸収量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量（不図示）は飽和する。この場合、周辺領域Ａ_１における誘導放出量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ_２における誘導放出量（不図示）は飽和する。

このため、周辺領域Ａ_１から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω_２）には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、中央領域Ａ_２から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω_２）には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分（例えば周波数２ｆ_ｍの成分）が発生する（図４（ｂ’）の点線矢印を参照。）。

なお、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω_２の光をカットし、光周波数ω_１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、励起光が試料２０に到達するタイミングと、誘導光が試料２０に到達するタイミングと間に時間差を設けたが、この時間差をゼロにしてもよい。但し、その場合は、励起光と誘導光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ^−１以上の波長差を付与することが望ましい。
［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として励起状態吸収（ＥＳＡ：Excited-State Absorption）過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

先ず、本実施形態では、光周波数ω_１のパルスレーザ光が励起光として使用され、光周波数ω_２のパルスレーザ光がＥＳＡ光として使用される。光周波数ω_１、ω_２’の各々は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内に設定されることが望ましく、光周波数ω_２は、波長換算でおよそ可視域〜近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。

また、本実施形態では、励起光及びＥＳＡ光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と光周波数ω_１、ω_２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にてＥＳＡ過程が生起するように設定されている。

ＥＳＡ過程は、先ず、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で励起準位へと移行（光吸収）させ、次に、励起中の電子をＥＳＡ光で更に高い準位へと移行させるという過程である。

また、本実施形態では、励起光及びＥＳＡ光のパルス光強度は、光スポットＳの中央領域Ａ_２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ_１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。

図５に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。第１実施形態における時間変化波形（図４）との主な相違点は、図５（ａ’）、（ｂ’）に示すとおり、光スポットＳから射出する光周波数ω_２の光（＝ＥＳＡ過程に寄与しなかった余剰ＥＳＡ光）の時間変化波形の位相がπだけずれている点である。なぜなら、ＥＳＡ過程では励起光の強度が高いほど余剰ＥＳＡ光の強度が減少するからである。

しかし、本実施形態でも、図５（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光及び余剰ＥＳＡ光の各々には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図５（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ_２から射出する余剰励起光及び余剰ＥＳＡ光の各々には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生する。

したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ_１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量は反映される。

したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第２実施形態の変形例］
なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆ_ｍの２倍（２ｆ_ｍ）に設定したが、変調周波数ｆ_ｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。

また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、励起光の光周波数ω_１と同じにしたが、ＥＳＡ光の光周波数ω_２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。

また、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω_２の光をカットし、光周波数ω_１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。
［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態として基底準位枯渇（ＧＳＤ：Ground State Depletion）過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図６は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図６に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、パルスレーザ光源１１及びレンズ１２の代わりにＣＷレーザ光源１１−１、１１−２、及びレンズ１２−１、１２−２を使用し（ＣＷ：Continuous Wave）、光パラメトリック発振器１４１、１４３、ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１を省略したものである。ＣＷレーザ光源１１−１は、レンズ１２−１を介して光周波数ω_１のＣＷレーザ光を出射し、ＣＷレーザ光源１１−２は、レンズ１２−２を介して光周波数ω_２のＣＷレーザ光を出射する。

本実施形態では、このうち光周波数ω_１のＣＷレーザ光が第１励起光として使用され、光周波数ω_２のＣＷレーザ光が第２励起光として使用される。

また、本実施形態では、第１励起光及び第２励起光の強度と光周波数ω_１、ω_２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にてＧＳＤ過程が生起するように設定されている。但し、本実施形態では、光周波数ω_１、ω_２の大小関係は、ω_１＜ω_２である。 具体的に、光周波数ω_１、ω_２の値関係は、ＧＳＤ過程における基底状態から励起状態への励起が発生するような値関係に設定される。また、光周波数ω_１、ω_２の各々は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内に設定されることが望ましい。

ＧＳＤ過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を第１励起光で第１励起準位へと移行（光吸収）させ、同種の残りの観察対象物質の電子を第２励起光により第１励起準位へと移行させるという過程である。

また、本実施形態では、第１励起光及び第２励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ_２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ_１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。

図７に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態でも、図７（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ_１から射出する余剰第１励起光及び余剰第２励起光の各々には周波数ｆ_ｍを超える高周波数成分が発生しないのに対して、図７（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ_２から射出する余剰第１励起光及び余剰第２励起光の各々には周波数ｆ_ｍを超える高周波数成分が発生する。

したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ_１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量は反映される。

したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第３実施形態の変形例］
なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆ_ｍの２倍（２ｆ_ｍ）に設定したが、変調周波数ｆ_ｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。

また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、第１励起光の光周波数ω_１と同じにしたが、第２励起光の光周波数ω_２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。

また、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω_２の光をカットし、光周波数ω_１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω_１の光をカットし、光周波数ω_２の光を通過させる波長選択性が付与される。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、第１励起光及び第２励起光の各々としてＣＷレーザ光を使用したが、パルスレーザ光を使用してもよい。パルスレーザ光を使用する場合の装置構成は、第１実施形態にて説明したとおりである（図１を参照。）。
［第４実施形態］
以下、本発明の第４実施形態として１光子吸収過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図８は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図８に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、パルスレーザ光源１１及びレンズ１２の代わりにＣＷレーザ光源１１−１、１１−２、及びレンズ１２−１、１２−２を使用し（ＣＷ：Continuous Wave）、光パラメトリック発振器１４１、１４３、ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１を省略したものである。ＣＷレーザ光源１１−１は、レンズ１２−１を介して光周波数ω_１のＣＷレーザ光を出射し、ＣＷレーザ光源１１−２は、レンズ１２−２を介して光周波数ω_２のＣＷレーザ光を出射する。

但し、本実施形態では、光周波数ω_１のＣＷレーザ光のみが励起光として使用されるので、観察対象面Ｐ_０に向かう光周波数ω_２のＣＷレーザ光は、オフされる。この光周波数ω_２のＣＷレーザ光をオフするには、ＣＷレーザ光源１１−２をオフすればよい。

また、本実施形態では、励起光の強度及び光周波数ω_１の組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて１光子吸収過程が生起するように設定されている。光周波数ω_１は、波長換算でおよそ紫外域〜可視域の波長範囲内に設定されることが望ましい。

１光子吸収過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で励起準位へと移行（１光子吸収）させるという過程である。このとき、試料２０が蛍光物質を含んだ試料（蛍光試料）であるならば、試料２０から光周波数ω_２の自然放出光（蛍光）が発生する。

また、本実施形態の波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光を通過させ、光周波数ω_２の光をカットする波長選択性が付与されている。このため、本実施形態では、光周波数ω_２の蛍光は光検出器２４に入射しないのに対して、光周波数ω_１の励起光は光検出器２４に入射する。

また、本実施形態における励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ_２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ_１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。

図９に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態でも、図９（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図９（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ_２から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生する。

したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ_１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量は反映される。

したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第４実施形態の変形例］
なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆ_ｍの２倍（２ｆ_ｍ）に設定したが、変調周波数ｆ_ｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、光周波数ω_２の光を試料２０に照射しないので、光周波数ω_２の光を試料２０に導くための要素（ＣＷレーザ光源１１−２、レンズ１２−２、ミラーＭ２、ダイクロイックミラー１３４など）を省略してもよい。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、仮に、試料２０が蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であったとしても、余剰励起光を検出することにより、試料２０を超解像観察することが可能である。
［第５実施形態］
以下、本発明の第５実施形態として２光子吸収過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。

図１０は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図１０に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、観察対象面Ｐ_０に向かう光周波数ω_２のパルスレーザ光をオフしたものである。本実施形態では、周波数ω_１のパルスレーザ光のみが励起光として使用される。なお、観察対象面Ｐ_０に向かう光周波数ω_２のＣＷレーザ光をオフするには、例えば図１０の左上に示すとおりビームスプリッタ１３１を光路から外せばよい。

また、本実施形態では、励起光の強度及び光周波数ω_１の組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて２光子吸収過程が生起するように設定されている。光周波数ω_１は、波長換算でおよそ可視域〜近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。

２光子吸収過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で高い励起準位へと移行（２光子吸収）させるという過程である。このとき、試料２０が蛍光物質を含んだ試料（蛍光試料）であるならば試料２０から光周波数ω_２の自然放出光（蛍光）が発生する。

また、本実施形態の波長選択フィルタ２２には、光周波数ω_１の光を通過させ、光周波数ω_２の光をカットする波長選択性が付与されている。このため、本実施形態では、光周波数ω_２の蛍光は光検出器２４に入射しないのに対して、光周波数ω_１の励起光は光検出器２４に入射する。

また、本実施形態における励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ_２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ_１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。

また、本実施形態のロックインアンプ２５の検出周波数は、励起光の変調周波数ｆ_ｍの２倍ではなく４倍（４ｆ_ｍ）に設定される。

図１１に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、光スポットＳの周辺領域Ａ_１から射出する蛍光の時間変化波形Ｉ（ｒ）はＩ（ｔ）＝（１＋ｃｏｓ２πｆ_ｍｔ）^２で表される。このため、本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光及び蛍光の各々には、周波数２ｆ_ｍの周波数成分が発生する。

しかし、本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ_１から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数２ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図１１（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ_２から射出する余剰励起光及び蛍光の各々には周波数２ｆ_ｍを超える高い周波数成分が発生する。

したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ_１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ_２における光吸収量は反映される。

したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第５実施形態の変形例］
なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆ_ｍの４倍（４ｆ_ｍ）に設定したが、変調周波数２ｆ_ｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数を２Ｎ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、仮に、試料２０が蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であったとしても、余剰励起光を検出することにより、試料２０を超解像観察することが可能である。

また、本実施形態の超解像顕微鏡では、２光子吸収過程を生起させるために光周波数ω_１の励起光のみを使用したが、光周波数ω_１の第１励起光と、光周波数ω_２の第２励起光との双方を使用してもよい。その場合は、第１励起光の光強度を変調周波数ｆ_ｍで変調し、試料２０から射出した第１励起光又は第２励起光を検出周波数２Ｎ×ｆ_ｍ（但し、Ｎは２以上の整数）でロックイン検出すればよい。

なお、本実施形態の超解像顕微鏡において、光周波数ω_２の光を試料２０に照射しない場合は、光周波数ω_２の光を試料２０に導くための要素（ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１、光パラメトリック発振器１４３、ミラーＭ２、ダイクロイックミラー１３４など）を省略してもよい。
［実施形態及び変形例の補足］
なお、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光軸と垂直な面内における解像力の向上について説明したが、光軸方向における解像力についても同様に向上する。なぜなら、前述した高周波成分の発生元は、光軸と垂直な面内だけでなく光軸方向においても光強度の高い集光点近傍のみに制限されるからである。すなわち、飽和による高周波成分を検出する上述した何れかの実施形態又は変形例では、光軸と垂直な方向と光軸方向との双方に亘って、言い換えればｘｙｚの３次元方向に亘って解像力が向上する。

なお、第１実施形態、第２実施形態、第５実施形態、及びその変形例では、光路の異なる２つのパルスレーザ光を生成するために、１台のレーザ光源と２台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台のレーザ光源と１台のパラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。但し、その場合は、２つのパルスレーザ光の一方としてレーザ光源から射出したレーザ光がそのまま使用される。また、その場合は、２つのパルスレーザ光の一方の繰り返し周波数と他方の繰り返し周波数とを同期させることが望ましい。

なお、第１実施形態、第２実施形態、第５実施形態、及びその変形例では、光周波数ω_１の光による吸収の飽和（飽和現象）について説明したが、光周波数ω_２の光による飽和現象を利用しても良い。

また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、観察対象物質の光吸収を伴う光学過程として、誘導放出過程、ＥＳＡ過程、ＧＳＤ過程、１光子吸収過程、２光子吸収過程の何れかを生起させたが、観察対象物質の光吸収を伴う他の光学過程を生起させてもよい。

また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、試料２０は蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であってもよい。したがって、バイオ観察のみでなく、例えば材料観察などの他種の観察にも本発明は適用可能である。

また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、観察対象物質の光吸収を伴う光学過程として１種類の光学過程しか生起させなかったが、互いに異なる２種類以上の光学過程を生起できるような１つの超解像顕微鏡、すなわち、光学過程の異なる複数のモードの間でモード切り換えが可能な超解像顕微鏡を構成してもよい。なお、モード切り換えが可能な超解像顕微鏡には、例えば以下の機能（１）〜（５）が搭載される。

（１）試料２０に照射される光の時間変化波形を調整する機能。

（２）光周波数ω_１及び光周波数ω_２の各々を調整する機能。

（３）試料２０に照射される光周波数ω_１の光と、試料２０に照射される光周波数ω_２の光との少なくとも一方をオン／オフする機能。

（４）ロックインアンプ２５の検出周波数を調整する機能。

（５）選択波長の異なる複数の波長選択フィルタの間で波長選択フィルタ２２を切り換える機能。

また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、透過型の顕微鏡を説明したが、反射型の顕微鏡にも本発明は適用可能である。

また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光周波数ω_１の光の特性の１種である「強度」を変調したが、光周波数ω_１の光の強度の代わりに、光周波数ω_１の光の他の特性、例えば、位相、偏光、光周波数の何れかを変調してもよい。

また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光周波数ω_１の光と光周波数ω_２の光とのうち一方のみの特性を変調したが、光周波数ω_１の光と光周波数ω_２の光との双方の特性を、互いに異なる変調周波数で変調してもよい。
［実施形態の作用効果］
上述した何れかの実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）は、光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面（Ｐ_０）の領域（光スポットＳ）に集光する照明光学系（対物レンズ１９）と、前記領域（光スポットＳ）に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部（音響光学変調器１５）と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域（光スポットＳ）で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）とを備える。

なお、前記変調部の変調対象である前記特性は、前記第１照明光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである。

また、第１実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で誘導放出過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記誘導放出過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。

また、第２実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で励起状態吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記励起状態吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。

また、第３実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で基底準位枯渇過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記基底準位枯渇過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。

また、第１実施形態〜第３実施形態の何れかの超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、例えば周波数Ｎ×ｆ_ｍで前記特性の変化する成分である（但し、Ｎは２以上の整数）。

また、第４実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記領域（光スポット）に対する前記第２照明光の照射は省略され、前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω_１の組み合わせは、前記領域（光スポット）内の観察対象物質で１光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記１光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分である。

また、第５実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記領域（光スポット）に対する前記第２照明光の照射は省略され、前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω_１の組み合わせは、前記領域（光スポット）内の観察対象物質で２光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記２光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分である。
［その他］
また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１１…パルスレーザ光源、１２…レンズ、１３１…ビームスプリッタ、Ｍ１…ミラー、１４１…光パラメトリック発振器、１４３…光パラメトリック発振器、１５…音響光学変調器、Ｍ２…ミラー、１３４…ダイクロイックミラー、１９…対物レンズ、２０…試料、２８…試料ステージ、２１…対物レンズ、２２…波長選択フィルタ、２３…集光レンズ、２４…光検出器、２５…ロックインアンプ、２６…信号発生器、２７…パーソナルコンピュータ

Claims (11)

1. 光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、
   前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部と、
   前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する抽出部と、
   を備えることを特徴とする超解像観察装置。
2. 請求項１に記載の超解像観察装置において、
   前記変調部の変調対象である前記特性は、
   前記第１照明光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである
   ことを特徴とする超解像観察装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で誘導放出過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記誘導放出過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
   ことを特徴とする超解像観察装置。
4. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で励起状態吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記励起状態吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
   ことを特徴とする超解像観察装置。
5. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω_１、前記光周波数ω_２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で基底準位枯渇過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記基底準位枯渇過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
   ことを特徴とする超解像観察装置。
6. 請求項３〜請求項５の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
   前記抽出部の抽出対象は、
   周波数Ｎ×ｆ_ｍで前記特性の変化する成分である（但し、Ｎは２以上の整数）
   ことを特徴とする超解像観察装置。
7. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記領域に対する前記第２照明光の照射は省略され、
   前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω_１の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で１光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記１光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、
   前記抽出部の抽出対象は、
   前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分である
   ことを特徴とする超解像観察蔵置。
8. 請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
   前記領域に対する前記第２照明光の照射は省略され、
   前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω_１の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で２光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記２光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、
   前記抽出部の抽出対象は、
   前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分である
   ことを特徴とする超解像観察装置。
9. 光周波数ω_１の照明光を観察対象面の領域に集光する照明光学系と、
   前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調する変調部と、
   前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分を抽出する抽出部と
   を備えることを特徴とする超解像観察装置。
10. 光周波数ω_１の第１照明光と光周波数ω_２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光し、
    前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調し、
    前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１又はω_２の成分を抽出する
    ことを特徴とする超解像観察方法。
11. 光周波数ω_１の照明光を観察対象面の領域に集光し、
    前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆ_ｍで変調し、
    前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆ_ｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω_１の成分を抽出する
    ことを特徴とする超解像観察方法。

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