CN115421288A - 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置 - Google Patents

一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置 Download PDF

Info

Publication number
CN115421288A
CN115421288A CN202210983942.0A CN202210983942A CN115421288A CN 115421288 A CN115421288 A CN 115421288A CN 202210983942 A CN202210983942 A CN 202210983942A CN 115421288 A CN115421288 A CN 115421288A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescence
objective
super
light
laser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210983942.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王保举
刘畅
潘彬雄
蔡雨言
詹求强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Normal University
Original Assignee
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Normal University filed Critical South China Normal University
Priority to CN202210983942.0A priority Critical patent/CN115421288A/zh
Publication of CN115421288A publication Critical patent/CN115421288A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置，本发明搭建了由激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块、光电探测模块组成的显微成像装置，在入射激光激发下，实现无光漂白、低光毒性、低复杂度、低成本、易用的三维无旁瓣各向同性超/高分辨显微技术。

Description

一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像 方法及装置
技术领域
本发明涉及光学显微的技术领域，具体涉及一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置
背景技术
长期以来,远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测工具。由于光学衍射极限的存在，光斑沿光轴方向被拉长，这导致传统荧光显微镜轴向分辨率远低于横向分辨率。这意味着其三维分辨率并不是各向同性的，因而三维成像质量受到影响。三维均衡的超分辨成像对于生物医学、微纳光学等诸多交叉学科具有重要意义。因此，诸多研究者对三维各向同性的光学超分辨方法开展了大量研究。
有研究者提出利用双物镜搭建4Pi显微镜，通过增加物镜的接收角(等效增加物镜的NA),可以减小点扩散函数的尺度从而提高分辨率。双物镜4Pi显微镜在轴向上压缩点扩散函数而并未提高横向分辨率，这造成了轴向与横向分辨率的失衡，成像结果畸变严重；双物镜4Pi显微镜的旁瓣效应明显，其纵向旁瓣约为主瓣的40％～45％,实验中甚至达到70％以上，即使利用针孔滤波、反卷积技术等手段，旁瓣的强度仍然保持在30％左右；双物镜4Pi显微镜对于样品要求严苛，由于干涉主瓣无法移动，只能用于成像薄透明样品；双物镜4Pi显微镜的对准要求极为严苛，系统光路复杂，微小的扰动对于成像结果具有明显影响。因此，如果能克服双物镜4Pi显微镜的缺陷，开发一种低成本的、简易的、无旁瓣的三维各向同性显微方法，这对于增强我国在超分辨显微成像基础研究和仪器开发的国际影响力将具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，所述方法包括以下步骤：
S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光，再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统，经空间光调制器进行波前调制得到沿轴向分布的前后两个焦点；
S2前后两个焦点在物镜端出射，由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场；
S3将荧光探针标记的样品置于反射镜表面，利用干涉光场对其进行X、Y、Z方向逐点扫描，再用光电探测器检测每点对应的荧光信号，结合非线性效应可得到三维无旁瓣的所述各向同性高/超分辨荧光图像。
需要说明的是，所述反射镜置于沿光轴分布前后焦点的中点处，物镜出射前焦点的入射光场和物镜出射后焦点经由反射镜反射的反射光场在前焦点位置处收敛；其中，所述干涉光场分布的位置随前焦点和反射镜相对位置的变化而发生改变，通过改变前后两个焦点的距离，保证干涉光场的轴向移动，实现轴向高/超分辨成像。
需要指出的是，本发明的激光至少包括连续型近红外光(波长：700nm-1100nm)、飞秒型近红外光(波长：700nm-1100nm)、连续型可见光(波长：400nm-700nm)中的一种或多种。
需要指出的是，本发明的所述反射镜至少包括镀铝膜平面反射镜，镀银膜平面反射镜，镀金膜平面反射镜中的一种且对光场具有半波损失(π的相位差)。
需要说明的是，干涉光场沿中心光斑(主瓣)对称分布，纵向光斑(旁瓣)垂直于光轴强逐级减弱；其中，干涉光场主瓣的轴向半高宽被大幅度压缩，其轴向半高宽较该激发波长激光经物镜聚焦后光斑轴向半高宽提高4-7倍；第一级旁瓣的强度为干涉光场主瓣的一半，随着级次提高，旁瓣强度降低。
需要说明的是，通过主瓣高/超压缩的半高宽，实现Z方向逐层扫描，实现距离镜面不同距离的连续轴向高/超分辨成像。
需要说明的是，所述荧光探针包含稀土掺杂上转换纳米颗粒，其非线性阶数n≥4，可以通过连续型/飞秒型近红外光匹配其激活离子Tm3+的激发态吸收能量，Nd3+或Yb3+作为敏化剂共掺杂上转换纳米颗粒，可分别被波长为980nm，795nm、730nm激光激发产生四光子荧光辐射过程，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣高分辨成像。
需要说明的是，所述荧光探针也可以是包括量子点或有机染料中的一种。
需要说明的是，所述荧光探针还可以是用雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，产生高阶非线性效应n≥28，以获取更高阶的非线性效应，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣各向同性超高分辨成像。
本发明还提供一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像的装置，所述装置包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块和光电探测模块；其中，所述激光发生模块用于生成作为激发光的连续型近红外光、飞秒型近红外光和连续型可见光，激发光经整形后进入双焦点调制模块进行波前调制得到沿着光轴分布的前后两个焦点，经由多光子显微扫描模块聚焦到反射镜样品模块产生双焦点干涉，利用高阶荧光探针的非线性得到无旁瓣各向同性的中心光斑，对样品进行不同区域的扫描，相关荧光信号由光电探测模块进行收集。
需要说明的是，还包括沿所述激光发生模块中的激光器所发射入射光束光轴方向依次放置的滤光片、准直扩束系统、二分之一波片以及偏振片；激光器产生稳定、单一波峰的激光，经由滤光片滤除入射无光杂光，进入准直扩束系统镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率。入射激光经由二分之一波片与偏振片配合调节功率，实现样品相应激活离子激发态吸收的匹配。
需要说明的是，所述双焦点调制模块包括沿激光束前进方向放置的反射镜与空间光调制器；反射镜将通过激光发生模块入射的准直光束反射至空间光调制器，其调制焦平面与到物镜的后焦平面光学共轭。通过输入不同的相位调制，得到沿光轴分布距离不同的前后两个焦点，用于调制后续的单物镜干涉成像光场。
需要说明的是，所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，由双焦点调制模块的入射光场经过物镜聚焦到反射镜样品模块。
需要说明的是，所述反射镜样品模块从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金/铝层、二氧化硅保护层、具有荧光探针标记的样品和盖玻片；经由波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场，通过高非线性效应消除了干涉光场的旁瓣并提高了中心主瓣的横向分辨率，最终得到三维无旁瓣各向同性的干涉光场。
需要说明的是，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器；其中，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在入射激光的激发下沿各个方向上发射荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
需要指出的是，在本发明中，除了使用XY扫描振镜搭配Z轴位移台实现激光点扫描外，还可以使用XYZ三轴位移台实现三维成像。XYZ位移台通过数据采集卡实现与输入信号与输出信号的联动，通过在三维空间移动样品实现样品的三维扫描，每次扫描收集的信号由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
本发明有益效果在于：
1、与传统双物镜4Pi显微镜相比，本发明引入了一个空间光调制器和一面镀银/金/铝膜反射镜，在单物镜简易系统下完成了轴向点扩散函数的压缩，系统简单，搭建成本低，不需要严苛的物镜对准条件；
2、与传统双物镜4Pi显微镜相比，本发明消除了干涉光场的旁瓣，解决了传统干涉光场成像的伪像问题。不使用复杂的反卷积算法、不额外引入滤波针孔，本发明结合超高阶荧光非线性材料使干涉光场仅保持轴向被压缩的中心光斑，大大提高了成像的信噪比；
3、与传统双物镜4Pi显微镜相比，本发明实现了干涉中心光斑的轴向移动。由于干涉场中心光斑的位置确定性，传统双物镜4Pi显微镜只能用于成像薄透明样品。本发明通过调控输入空间光调制器的相位图像，改变前后两个焦点的距离(前焦点和反射镜相对位置)，实现干涉光场中心光斑的轴向移动，使厚样品成像成为可能；由于反射镜的反射效应，无需在样品背面进行荧光收集，不透明样品同样可以进行高/超分辨成像。
4、与传统远场光学显微镜相比，本发明结合镜面双焦点效应与超高阶非线性荧光探针，在横向与轴向上极大地压缩了点扩散函数尺寸，消除旁瓣的影响，实现了真正意义上的三维超分辨各向同性成像。
附图说明
图1为实施例1中进行波前调制的双焦点相位调制板；
图2为实施例1中调制双焦点的不同距离实现干涉光场移动的模拟图；
图3为实施例1中不同非线性阶数下共聚焦显微镜与基于高阶荧光非线性的双焦点干涉显微镜光场模拟图；
图4为实施例2中显微成像装置的结构示意图；
图5为实施例2中反射镜样品模块的结构示意图。
具体实施方式
以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
本发明为一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，所述方法包括以下步骤：
S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光，再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统，经空间光调制器进行波前调制得到沿光轴分布的的前后两个焦点；
S2前后两个焦点在物镜端出射，由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场；
S3将荧光探针标记的样品置于反射镜表面，利用干涉光场对其进行X、Y、Z方向逐点扫描，再用光电探测器检测每点对应的荧光信号，结合非线性效应可得到三维无旁瓣的所述各向同性高/超分辨荧光图像。
进一步的，本发明的所述反射镜置于沿光轴分布前后焦点的中点处，物镜出射前焦点的入射光场和物镜出射后焦点经由反射镜反射的反射光场在前焦点位置处收敛；其中，所述干涉光场分布的位置随前焦点和反射镜相对位置的变化而发生改变，通过改变前后两个焦点的距离，保证干涉光场的轴向移动，实现轴向高/超分辨成像。
进一步的，本发明的本发明的激光至少包括连续型近红外光(波长：700nm-1100nm)、飞秒型近红外光(波长：700nm-1100nm)、连续型可见光(波长：400nm-700nm)中的一种或多种。
进一步的，本发明的本发明的所述反射镜至少包括镀铝膜平面反射镜，镀银膜平面反射镜，镀金膜平面反射镜中的一种且对光场具有半波损失(π的相位差)。
进一步的，本发明的干涉光场沿中心光斑(主瓣)对称分布，纵向光斑(旁瓣)垂直于光轴强逐级减弱；其中，干涉光场主瓣的轴向半高宽被大幅度压缩，其轴向半高宽较该激发波长激光经物镜聚焦后光斑轴向半高宽提高4-7倍；第一级旁瓣的强度为干涉光场主瓣的一半，随着级次提高，旁瓣强度降低。
进一步的，本发明的通过主瓣高/超压缩的半高宽，实现Z方向逐层扫描，实现距离镜面不同距离的连续轴向高/超分辨成像。
进一步的，本发明的所述荧光探针包含稀土掺杂上转换纳米颗粒，其非线性阶数n≥4，可以通过连续型/飞秒型近红外光匹配其激活离子Tm3+的激发态吸收能量，Nd3+或Yb3+作为敏化剂共掺杂上转换纳米颗粒，可分别被波长为980nm，795nm、730nm激光激发产生四光子荧光辐射过程，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣高分辨成像。
进一步的，本发明的荧光探针也可以是包括量子点或有机染料中的一种。
进一步的，本发明的所述荧光探针还可以是用雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，产生高阶非线性效应n≥28，以获取更高阶的非线性效应，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣各向同性超高分辨成像。
本发明还提供一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像的装置，所述装置包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块和光电探测模块；其中，所述激光发生模块用于生成作为激发光的连续型近红外光、飞秒型近红外光或连续型可见光，激发光经整形后进入双焦点调制模块进行波前调制得到沿着光轴分布的前后两个焦点，经由多光子显微扫描模块聚焦到反射镜样品模块产生双焦点干涉，利用高阶荧光探针的非线性得到无旁瓣各向同性的中心光斑，对样品进行不同区域的扫描，相关荧光信号由光电探测模块进行收集。
进一步的，本发明的还包括沿所述激光发生模块中的激光器所发射入射光束光轴方向依次放置的滤光片、准直扩束系统、二分之一波片以及偏振片；激光器产生稳定、单一波峰的激光，经由滤光片滤除入射无光杂光，进入准直扩束系统镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率。入射激光经由二分之一波片与偏振片配合调节功率，实现样品相应激活离子激发态吸收的匹配。
进一步的，本发明的所述双焦点调制模块包括沿激光束前进方向放置的反射镜与空间光调制器；反射镜将通过激光发生模块入射的准直光束反射至空间光调制器，其调制焦平面与到物镜的后焦平面光学共轭。通过输入不同的相位调制，得到沿光轴分布距离不同的前后两个焦点，用于调制后续的单物镜干涉成像光场。
进一步的，本发明的所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，由双焦点调制模块的入射光场经过物镜聚焦到反射镜样品模块。
进一步的，本发明的所述反射镜样品模块从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金/铝层、二氧化硅保护层、具有荧光探针标记的样品和盖玻片；经由波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场，通过高非线性效应消除了干涉光场的旁瓣并提高了中心主瓣的横向分辨率，最终得到三维无旁瓣各向同性的干涉光场。
进一步的，本发明的所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器；其中，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在入射激光的激发下沿各个方向上发射荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
进一步的，在本发明中，除了使用XY扫描振镜搭配Z轴位移台实现激光点扫描外，还可以使用XYZ三轴位移台实现三维成像。XYZ位移台通过数据采集卡实现与输入信号与输出信号的联动，通过在三维空间移动样品实现样品的三维扫描，每次扫描收集的信号由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
实施例1
S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光、再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统。输入如图1所示的相位调制板经空间光调制器进行波前调制得到沿光轴分布的的前后两个焦点。如图2(a)所示，通过调节相位板参数，实现两个焦点相距位置的调控；
S2波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场，通过调控两个焦点位置实现干涉光场的轴向移动，如图2(b)所示；
S3通过对Yb3+离子和Pr3+离子的能级分析和速率方程计算模拟，证明该掺杂体系可实现光子雪崩超高阶非线性(n＝28)效应，在激发波长为852nm的激光作用下，调节激光功率，当功率处于光子雪崩阈值附近时，纳米探针发出的光子雪崩荧光具有超高阶非线性响应，荧光点扩散函数被大幅压缩，达到突破衍射极限的分辨率。不同非线性阶数下共聚焦显微镜与基于高阶荧光非线性的双焦点干涉显微镜光场模拟图如图3所示。
实施例2
本发明的装置的示意图见图4，包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块、光电探测模块。激发光生成模块包括连续型近红外光(700nm-1100nm)/飞秒型近红外光(700nm-1100nm)/连续型可见光(400nm-700nm)激光器1，滤光片2，准直扩束镜3(包含针孔滤波器)，二分之一波片4以及偏振片5。近红外激光器产生高斯型激光输出，滤光片滤除激光中其他波段的杂散光，准直扩束镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率，同时焦点处放置针孔滤波器，滤除高频杂散光，二分之一波片4安装在可旋转安装座上搭配线偏振器5用于调节激光束的功率。
双焦点调制模块包括沿反射镜和空间光调制器6。反射镜将通过激光发生模块入射的准直光束反射至空间光调制器，其调制焦平面与到物镜的后焦平面光学共轭。通过输入不同的相位调制，得到沿光轴分布距离不同的前后两个焦点，用于调制后续的单物镜干涉成像光场。
多光子显微扫描模块，包括扫描振镜7，扫描透镜8，管镜9，高反低透二向色镜10以及物镜11。扫描振镜控制激光束的光路偏转实现对样品的二维扫描，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，扫描透镜和管镜对扫描振镜出射光束进行聚焦和准直，使激光束在扫描过程中依然匹配显微物镜的入瞳大小，最后由双焦点调制模块的入射光场经由物镜聚焦到反射镜样品模块12。
反射镜样品模块如图5所示，从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金/铝层、二氧化硅保护层、高阶上转换荧光探针、量子点或有机染料标记的样品、盖玻片。经由波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场，稀土掺杂上转换荧光探针高非线性效应消除了干涉光场的旁瓣并提高了中心主瓣的横向分辨率，最终得到三维无旁瓣各向同性的干涉光场。
光电探测模块包括聚焦透镜13和光电探测器14，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在入射激光的激发下沿各个方向上发射荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。除了使用XY扫描振镜搭配Z轴位移台实现激光点扫描外，可以使用XYZ三轴位移台实现三维成像。XYZ位移台通过数据采集卡实现与输入信号与输出信号的联动，通过在三维空间移动样品实现样品的三维扫描，每次扫描收集的信号由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光，再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统，经空间光调制器进行波前调制得到轴向分布的前后两个焦点；
S2前后两个焦点在物镜端出射，由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场；
S3上转换荧光发射与激发光强度具有高阶非线性响应关系，通过所设计荧光探针的多光子非线性荧光效应，荧光点扩散函数在X、Y、Z方向上被大幅压缩，分辨率获得大幅提高，突破衍射极限；
S4将荧光探针标记的样品置于反射镜表面，利用干涉光场对其进行X、Y、Z方向逐点扫描，再用光电探测器检测每点对应的荧光信号，结合非线性效应可得到三维无旁瓣的所述各向同性高/超分辨荧光图像。
2.根据权利要求1所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述反射镜置于沿光轴分布前后焦点的中点处，物镜出射前焦点的入射光场和物镜出射后焦点经由反射镜反射的反射光场在前焦点位置处收敛；其中，所述干涉光场分布的位置随前焦点和反射镜相对位置的变化而发生改变，通过改变前后两个焦点的距离，保证干涉光场的轴向移动，实现轴向高/超分辨成像。
3.根据权利要求1或2所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，干涉光场沿中心光斑(主瓣)对称分布，纵向光斑(旁瓣)垂直于光轴强逐级减弱；其中，干涉光场主瓣的轴向半高宽被大幅度压缩，其轴向半高宽较该激发波长激光经物镜聚焦后光斑轴向半高宽提高4-7倍；第一级旁瓣的强度为干涉光场主瓣的一半，随着级次提高，旁瓣强度降低。
4.根据权利要求3所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，通过主瓣高/超压缩的半高宽，实现Z方向逐层扫描，实现距离镜面不同距离的连续轴向高/超分辨成像。
5.根据权利要求3所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述荧光探针包含稀土掺杂上转换纳米颗粒，其非线性阶数n≥4，可以通过连续型/飞秒型近红外光匹配其激活离子Tm3+的激发态吸收能量，Nd3+或Yb3+作为敏化剂共掺杂上转换纳米颗粒，可分别被波长为980nm，795nm、730nm激光激发产生四光子荧光辐射过程，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣高分辨成像。
6.根据权利要求1所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述荧光探针还可以是用雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，产生高阶非线性效应n≥28，以获取更高阶的非线性效应，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣各向同性超高分辨成像。
7.一种实现如权利要求1-6任一所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述装置包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块和光电探测模块；其中，所述激光发生模块用于生成作为激发光的连续型近红外光、飞秒型近红外光或连续型可见光，激发光经整形后进入双焦点调制模块进行波前调制得到沿着光轴分布的前后两个焦点，经由多光子显微扫描模块聚焦到反射镜样品模块产生双焦点干涉，利用高阶荧光探针的非线性得到无旁瓣各向同性的中心光斑，对样品进行不同区域的扫描，相关荧光信号由光电探测模块进行收集。
8.根据权利要求7所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，还包括沿所述激光发生模块中的激光器所发射入射光束光轴方向依次放置的滤光片、准直扩束系统、二分之一波片以及偏振片；激光器产生稳定、单一波峰的激光，经由滤光片滤除入射无光杂光，进入准直扩束系统镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率。入射激光经由二分之一波片与偏振片配合调节功率，实现样品相应激活离子激发态吸收的匹配。
9.根据权利要求7所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述双焦点调制模块包括沿激光束前进方向放置的反射镜与空间光调制器；反射镜将通过激光发生模块入射的准直光束反射至空间光调制器，其调制焦平面与到物镜的后焦平面光学共轭。通过输入不同的相位调制，得到沿光轴分布距离不同的前后两个焦点，用于调制后续的单物镜干涉成像光场。
10.根据权利要求7所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，由双焦点调制模块的入射光场经过物镜聚焦到反射镜样品模块。
11.根据权利要求7所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述反射镜样品模块从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金/铝层、二氧化硅保护层、具有荧光探针标记的样品和盖玻片；经由波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场，通过高非线性效应消除了干涉光场的旁瓣并提高了中心主瓣的横向分辨率，最终得到三维无旁瓣各向同性的干涉光场。
12.根据权利要求7所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述光电探测模块包括依次同轴放置的聚焦透镜和光电探测器；其中，聚焦透镜和光电探测器设置在物镜收集的荧光的前进方向上，样品在入射激光的激发下沿各个方向上发射荧光，物镜收集一部分的荧光信号，信号经过高反低透二向色镜与聚焦透镜，由光电探测器接收，光电探测器每接收完一次检测的信号后，将信号发送到计算机，计算机通过旋转装置控制扫描振镜旋转，移动聚焦光斑扫描下一个像素，从而获得一幅二维激光扫描超分辨荧光图像，载物台一侧设有用于驱动载物台沿Z轴方向移动的电机，通过计算机控制，可以在上述基础上进行Z轴扫描，最终获得三维激光扫描超分辨荧光图像。
CN202210983942.0A 2022-08-17 2022-08-17 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置 Pending CN115421288A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210983942.0A CN115421288A (zh) 2022-08-17 2022-08-17 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210983942.0A CN115421288A (zh) 2022-08-17 2022-08-17 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115421288A true CN115421288A (zh) 2022-12-02

Family

ID=84199062

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210983942.0A Pending CN115421288A (zh) 2022-08-17 2022-08-17 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115421288A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116430565A (zh) * 2023-04-25 2023-07-14 西安工业大学 一种显微成像装置及成像方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116430565A (zh) * 2023-04-25 2023-07-14 西安工业大学 一种显微成像装置及成像方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107941763B (zh) 一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置
CN108303806B (zh) 一种深度成像超分辨显微成像系统
CN106970055B (zh) 一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置
JP6996048B2 (ja) 広視野高分解能顕微鏡
US9201008B2 (en) Method and system for obtaining an extended-depth-of-field volumetric image using laser scanning imaging
US6844963B2 (en) Double-resonance-absorption microscope
CN103543135B (zh) 一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置
JP5547868B2 (ja) 顕微鏡系およびこれを用いた方法
US7554664B2 (en) Laser scanning microscope
CN107534261A (zh) 用于在时间上拉伸/压缩光学脉冲的空间啁啾腔室
CN206095943U (zh) 一种结构光照明的双光子荧光显微系统
CN108333151B (zh) 一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统及成像方法
CN109211871A (zh) 一种受激发射损耗荧光寿命超分辨成像装置
CN105467572A (zh) 单波长实现多光子脉冲sted-spim显微系统
CN110646402B (zh) 一种超分辨快速扫描的相干拉曼散射成像方法
CN105510290A (zh) 光子重组的非线性超分辨显微方法及装置
CN110146473A (zh) 一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法
JP2010015026A (ja) 超解像顕微鏡およびこれに用いる空間変調光学素子
CN115421288A (zh) 一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置
Bechtel et al. Large field of view MEMS-based confocal laser scanning microscope for fluorescence imaging
CN105043988A (zh) 基于扫描振镜的单点去卷积显微系统与成像方法
CN112485232B (zh) 基于一维暗斑分时照明的亚十纳米定位测向方法和装置
CN113325563B (zh) 一种具有大视场的多色三维超分辨膨胀显微镜系统
CN220709036U (zh) 一种任意曲面三维寻址扫描超分辨显微成像系统
CN109633881A (zh) 一种受激发射损耗显微镜的成像系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination