JP6379810B2 - 観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、観察装置に関する。

光学顕微鏡は光をプローブとして標本を観察することから非破壊の観察方法として生物研究において広く使われている。特に蛍光顕微鏡は蛍光染色等を行うことで生物内における目的の分子や構造を選択的に検出できることから生物研究において広く使われている顕微鏡である。

生物研究、特に細胞の機能を研究する分野において、高い分解能を持った生物顕微鏡が望まれてきた。細胞のさまざまな機能を受け持つ細胞内小器官は大きいもので１μｍ程度、小さいものとなると１０ｎｍ程度のものもあるからである。
通常の蛍光顕微鏡の分解能はおおよそ０．６１光波長／開口数で表される。分解能向上のためには、光波長を短くすることと、開口数を大きくすることが必要である。ところが、近紫外線やそれよりも短い光波長を使うと細胞内小器官が死滅するなどの不都合があり、一方の開口数も細胞質の屈折率が１．３５〜１．３８程度であることからこれを超えることは困難であり、蛍光顕微鏡の分解能はおおよそ２００ｎｍ程度が限界であった。
近年この限界を越える顕微鏡法として５ＩＭ、ＳＩＭ、ＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭ、ＳＴＥＤ、ＲＥＳＯＬＦＴなどさまざまなものが提案されている。中でもＳＴＥＤ（Stimulated Emission Depletion）技術は、共焦点蛍光顕微鏡の応用技術のひとつであり、光刺激などの共焦点蛍光顕微鏡におけるさまざまな技術との融合が可能であること、生物の動態観測も可能な程度の速度を持つことから期待が持たれている（例えば、非特許文献１を参照。）。
通常の共焦点蛍光顕微鏡では、励起光を標本上の一点に集光し、その点からの蛍光を共焦点光学系により点検出器に導いて捉えるものである。これにより標本面を一括で照明する落射蛍光顕微鏡に比べて標本面内における分解能が若干向上するだけでなく、光軸方向の分解能が大きく向上することを特徴としている。この共焦点蛍光顕微鏡では分解能を主に決めている因子が励起光の点像強度分布の幅であるから、この励起光の点像強度分布を小さくすることができれば分解能を向上させることができる。

Gerald Donnert, Jan Keller, Rebecca Medda, M. Alexandra Andrei, Silvio O. Rizzoli, Reinhard Lu hrmann, Reinhard Jahn, Christian Eggeling, and Stefan W. Hell，"Macromolecular-scale resolution in biological fluorescence microscopy"，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, (米国)，2006，vol.103, No. 31,p.11440-11445

ＳＴＥＤ顕微鏡はほぼ共焦点蛍光顕微鏡と同じ構成となっている。通常の共焦点蛍光顕微鏡とは、上記の点像強度分布をＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光、もしくは、ＳＴＥＤ光と呼ばれる光により実効的に小さくすることが異なる。通常の共焦点蛍光顕微鏡と同様に励起光を標本上に点状に絞って照射するのに加え、観察する標本の蛍光波長の一部と等しい波長を持つ光（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光）を輪帯状にして照射する。その結果、輪帯状のＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光によりその領域の蛍光分子は誘導放出を起こしＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光と同一の波長で光を放出して基底状態に戻る。従ってＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光と異なる波長の蛍光を観測していれば輪帯状のＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光の内側からの蛍光しか検出されないことになる。
実際には励起光の点像強度分布の幅と輪帯状のＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光の内側のくぼみの幅はほぼ同じである。むしろ、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光波長が励起光のそれに比べ長い分だけ幅広いため、これだけでは実効的な点像強度分布を狭めることはできない。そこで、ＳＴＥＤ顕微鏡においては非常に強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光を照射することで輪帯状の光の最大強度付近において飽和を起こさせる。そして、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光強度分布の裾の部分でも誘導放出を起こさせて中央のくぼみを狭めることで、励起光の実効的な点像強度分布を小さくする（第４図）。

Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光は誘導放出をさせるために励起分子の蛍光波長の一部と等しい波長を持つ必要があり、実際、従来技術におけるＳＴＥＤ顕微鏡では一例として励起光波長４８８ｎｍに対して６００ｎｍ前後のＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光を用いることで誘導放出を行っている。ところが、このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光の波長においても蛍光分子の励起確率は０にはならない。Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光波長をあまり離すと誘導放出の確率も落ちてしまうことから、現実的にはＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光波長は励起光波長から最大でも２００ｎｍ程度しか離すことができない。励起確率が最大となる波長からどんなに離れていても蛍光の励起確率は厳密には０にならないことから、強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光により蛍光分子が励起され実効的な点像強度分布がＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光の幅で決まってしまい、解像度が十分に向上しないという課題があった。あるいは、強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光による励起に対して大きな励起光強度とすることで実効的な点像強度分布を狭くすることもできるが、その場合には強い励起光により蛍光分子の退色が激しいという課題もあった。

本発明は、上記問題を解決すべくなされたもので、その目的は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光の悪影響を低減した観察装置を提供することにある。

本発明の一実施形態は、標本に含まれる蛍光分子を励起する第１の光と、励起された前記蛍光分子に誘導放出を生じさせる第２の光とを射出する光源と、前記第１の光と、前記第２の光とをそれぞれ、前記標本上に集光させる光学部材と、前記光源と前記標本との間の前記第２の光の光路上に配置され、前記第２の光を前記標本上で輪帯状の光にする第２の光学部材と、前記標本上の集光位置を可変にする位置可変部と、励起された前記蛍光分子が発する蛍光を検出する検出部と、前記第１の光の波長を所定の変調周波数で変調する変調制御部と、前記所定の変調周波数に基づいて、前記検出部が検出する蛍光から前記第１の光の照射により生じる蛍光を抽出する抽出部とを備える観察装置である。

この発明によれば、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光の悪影響を低減させることができる。

本発明の実施形態に係る観察装置の構成の一例を示す概要図である。 光源の構成の一例を示す概要図である。 ボルテックス位相板による位相遅れの一例を示す概要図である。 標本上での励起光とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光との強度プロファイルの一例を示すグラフである。 標本上での励起効果とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光による誘導放出効果のプロファイルの一例を示すグラフである。 ＦＩＴＣの励起スペクトルと蛍光スペクトルの一例を示すグラフである。

［実施形態]
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。
図１は、本発明の実施形態に係る観察装置１の構成の一例を示す概要図である。本実施形態の観察装置１とは、例えば、生体の細胞などの標本ＳＰを観察する顕微鏡装置である。この標本ＳＰには、励起光が照射された場合に蛍光を発する蛍光分子が含まれている。観察装置１は、標本ＳＰに励起光を照射するとともに、この励起光の照射によって発生した蛍光を検出することにより、標本ＳＰを観察する。また、この観察装置１は、共焦点顕微鏡の原理を応用することにより、解像度（分解能）を向上させる。

［共焦点蛍光顕微鏡技術の概要］
ここで、共焦点蛍光顕微鏡技術の概要について説明する。観察装置１は、標本ＳＰの観察対象の位置に集光するようにして、励起光を照射する。この励起光が照射されることにより、標本ＳＰに含まれる蛍光分子が励起され、蛍光を発する。観察装置１は、この蛍光を光検出器１３０によって検出することにより、標本ＳＰの構造を観察する。ここで、標本ＳＰは、励起光が集光する位置（集光点）以外の位置からも光を発する。光検出器１３０が、観察対象の位置以外の位置からの光を検出してしまうと、解像度（分解能）が低下する。
この観察装置１は、標本ＳＰと光検出器１３０との間の、励起光の集光点と共役である位置に、開口１４１（ピンホール）を有する遮光板１４０を備える。この遮光板１４０は、励起光の集光点から発せられる蛍光以外の光が、光検出器１３０に入射することを防ぐ。これにより、観察装置１は、遮光板１４０を備えない場合に比べて、解像度（分解能）を向上させる。

［ＳＴＥＤ技術の概要］
さらに、この観察装置１は、ＳＴＥＤ（Stimulated Emission Depletion）技術を採用することにより、解像度（分解能）を向上させる。すなわち、観察装置１は、励起光に加えてＳＴＥＤ光を標本ＳＰに照射することにより、励起光のスポット径を等価的に小さくして、解像度（分解能）を向上させる。なお、以下の説明においては、ＳＴＥＤ光をＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光とも記載する。
より具体的に説明する。観察装置１は、励起光を標本ＳＰに照射することにより標本ＳＰの蛍光分子から発せられる蛍光を観察する。このとき、観察装置１は、励起光のスポット径を小さくして照射することにより、解像度（分解能）を向上させることができる。この励起光のスポット径を小さくするほど、解像度（分解能）を向上させることができる。しかしながら、励起光をスポット状にして照射する光学系には回折限界が存在するため、この回折限界に基づいて決まる最小径よりもスポット径を小さくすることはできない。
そこで、観察装置１は、スポット状に照射した励起光の周囲に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光をリング状（輪帯状）にして照射する。この標本ＳＰに含まれる蛍光分子は、励起光が照射されて励起状態に遷移する。ここで、励起状態に遷移した蛍光分子に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光が照射されると、この蛍光分子は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光と同じ波長の光を放出（誘導放出）して、基底状態に遷移する。すなわち、この蛍光分子は、励起光が照射された位置と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光が照射された位置とで互いに異なる波長領域の光を放出して基底状態に遷移する。したがって、観察装置１は、入射した光の波長を区別することによって、励起光が照射された位置から発せられた光と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光が照射された位置から発せられた光とを区別することができる。観察装置１は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光が照射された位置から発せられた光を除外して、励起光が照射された位置から発せられた光を検出することにより、標本ＳＰの構造を観察する。
このとき、観察装置１は、励起光のスポット径に対して、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光を対物レンズ１２０の開口数（ＮＡ）で決まる最小サイズのリング状にして、励起光とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光とを照射する。これにより、励起光のスポット内においては、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光によって誘導放出される領域が大きくなり、励起光によって蛍光を発する領域が小さくなる。これは、励起光のスポット径を小さくしたことと等価である。すなわち、観察装置１は、励起光のスポット径を回折限界を超えて小さくした場合と同様の効果を得ることができる。これにより、観察装置１は、励起光の回折限界を超えて、解像度（分解能）を向上させることができる。以下、この観察装置１について詳細に説明する。

［観察装置１の構成］
この観察装置１は、レーザー光源１０１、ダイクロイックミラー１０８、走査ユニット１１０、走査レンズ１０４、リレーレンズ１０５、ミラー１０６、対物レンズ１２０、標本ホルダ１０７、検出器レンズ１０９、遮光板１４０、光検出器１３０、オシレータ１７０、同期検出器１８０、およびデータ処理装置１６０を備えている。このうち、レーザー光源１０１について、図２を参照して説明する。

図２は、レーザー光源１０１の構成の一例を示す概要図である。レーザー光源１０１は、励起レーザー２０１、音響光学フィルタ２１０、励起レーザー用ビームエキスパンダ２０２、ミラー２０６、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー２０３、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー用ビームエキスパンダ２０４、ボルテックス位相板２０７、ダイクロイックミラー２０５、およびリレー光学系２０８を備えている。

励起レーザー２０１は、標本ＳＰに含まれる蛍光分子を励起する励起光を射出する。以下の説明において、この励起レーザー２０１が射出する励起光を、励起光Ｌ１、または第１の光Ｌ１とも記載する。射出された励起光Ｌ１は、音響光学フィルタ２１０、励起レーザー用ビームエキスパンダ２０２、ミラー２０６、ダイクロイックミラー２０５、およびリレー光学系２０８を介して、ダイクロイックミラー１０８に入射する。

このうち、音響光学フィルタ２１０は、外部から印加される波長変調用の信号に基づいて、音響光学フィルタ２１０を通過する光（励起光Ｌ１）の波長を変化させる。この音響光学フィルタ２１０とは、レーザー光源１０１と標本ＳＰとの間の励起光Ｌ１の光路上に配置され、入力される信号に基づいて、励起光Ｌ１の波長を変化させるフィルタ部材の一例である。また、この音響光学フィルタ２１０とは、音響光学素子の一例である。この音響光学フィルタ２１０が変化させた光の波長の詳細については、後述する。
励起レーザー用ビームエキスパンダ２０２は、励起光Ｌ１を所定の直径まで広げる。ここで、所定の直径とは、標本ＳＰ上に照射される励起光Ｌ１を形成するために十分な直径であり、対物レンズ１２０の後ろ側焦点面を十分覆えるような直径である。
ミラー２０６は、励起レーザー２０１から射出された励起光Ｌ１を反射して、反射した光をダイクロイックミラー２０５に入射させる。

Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー２０３は、標本ＳＰに含まれる蛍光分子のうち、励起された蛍光分子に誘導放出を生じさせるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光を射出する。以下の説明において、このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー２０３が射出するＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光を、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２、または第２の光Ｌ２とも記載する。射出されたＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー用ビームエキスパンダ２０４、ボルテックス位相板２０７、ダイクロイックミラー２０５、およびリレー光学系２０８を介して、ダイクロイックミラー１０８に入射する。

このうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー用ビームエキスパンダ２０４は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を所定の直径まで広げる。ここで、所定の直径とは、対物レンズの後ろ側焦点面を十分覆えるような直径である。
ボルテックス位相板２０７は、入射するＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２に位相遅れを与える。このボルテックス位相板２０７がＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２に与える位相遅れの一例について、図３を参照して説明する。

ボルテックス位相板２０７は、入射するＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２に対して、ボルテックス位相板２０７の中心を原点として時計回りの回転角に比例してＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光波長に対して０〜２πの位相遅れを与える。つまり、ボルテックス位相板２０７は、中心Ｏに対して回転対称の位置をそれぞれ通過するＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２に対して、π［ｒａｄ］の位相差を与える。これにより、このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２が標本ＳＰ上に照射された場合に、標本ＳＰ上の焦点位置において光強度が０になり焦点位置近傍においてリング状の強度分布を有する輪帯状の光が生成される。

これまで、ボルテックス位相板２０７を、光源（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー２０３）と標本ＳＰとの間のＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の光路上に配置され、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を標本ＳＰ上で輪帯状の光にする光学部材の一例として説明した。
このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を輪帯状の光にする光学部材は、このボルテックス位相板２０７に限られない。例えば、ボルテックス位相板２０７に代えて、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー用ビームエキスパンダ２０４の中間にある標本共役の位置に、リング状のスリット（遮光部材）を設けることにより、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を輪帯状の光にしてもよい。

図２に戻り、ダイクロイックミラー２０５は、ミラー２０６から入射する励起光Ｌ１を反射して、反射した励起光Ｌ１をリレー光学系２０８に入射させる。また、ダイクロイックミラー２０５は、ボルテックス位相板２０７から入射するＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を通過させて、通過させたＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリレー光学系２０８に入射させる。つまり、ダイクロイックミラー２０５は、励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２とを合成して、合成した照明光Ｌ３を、リレー光学系２０８に入射させる。
リレー光学系２０８は、入射した照明光Ｌ３をダイクロイックミラー１０８に入射させる。

上述した励起レーザー用ビームエキスパンダ２０２、およびＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー用ビームエキスパンダ２０４は、照明光Ｌ３に含まれる励起光Ｌ１の径（太さ）と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の径（太さ）とが、励起光Ｌ１、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２ともに対物瞳を十分に覆える程度の太さとなるように調整する。

図１に戻り、レーザー光源１０１は、照明光Ｌ３をダイクロイックミラー１０８に入射させる。
ダイクロイックミラー１０８は、レーザー光源１０１から出射される照明光Ｌ３に含まれる励起光Ｌ１の波長、およびＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の波長に対しては通過させる特性を有している。また、ダイクロイックミラー１０８は、標本ＳＰに含まれる蛍光分子から発せられる蛍光Ｌ４の波長のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の波長以外の波長に対しては反射させる特性を有している。このため、ダイクロイックミラー１０８に入射した照明光Ｌ３は、ダイクロイックミラー１０８を通過する。ダイクロイックミラー１０８を通過した照明光Ｌ３は、走査ユニット１１０に入射する。

走査ユニット１１０は、Ｘ軸走査ミラー１１１、およびＹ軸走査ミラー１１２を備えている。このＸ軸走査ミラー１１１、およびＹ軸走査ミラー１１２は、照明光Ｌ３の集光位置が、標本ホルダ１０７の測定面１０７ａの上において、直交する２方向（図１に示すＸ軸方向、およびＹ軸方向）に移動するように、照明光Ｌ３が出射される角度を変更する。すなわち、走査ユニット１１０は、位置可変部の一例であり、照明光Ｌ３を標本ＳＰ上でＸＹ方向に走査することにより、焦点が結ばれる標本ＳＰ上の位置を可変にする。この走査ユニット１１０は、走査レンズ１０４に照明光Ｌ３を出射する。
走査ユニット１１０から出射された照明光Ｌ３は、走査レンズ１０４を介して、入射する照明光Ｌ３のうち励起光Ｌ１をスポット状に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状に、一次像面１００Ａにおいてそれぞれ結像する。また、この照明光Ｌ３は、リレーレンズ１０５、ミラー１０６を介して対物レンズ１２０に入射する。

対物レンズ１２０は、入射した照明光Ｌ３を測定面１０７ａに結像させる。これにより、測定面１０７ａに置かれた標本ＳＰの位置において、励起光Ｌ１がスポット状に結像し、励起光Ｌ１によるスポットを囲むようにしてＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２がリング状に結像する。（図４、図５参照）このように、照明光Ｌ３が標本ＳＰに照射されると、標本ＳＰに含まれる蛍光分子から蛍光Ｌ４が生じる。これら走査レンズ１０４、リレーレンズ１０５、ミラー１０６、および対物レンズ１２０とは、励起光Ｌ１と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２とをそれぞれ集光して、標本ＳＰ上のある位置に焦点を結ばせる光学部材の一例である。

標本ＳＰから生じた蛍光Ｌ４は、再び対物レンズ１２０で集められ、照射された照明光Ｌ３と同じ光路を逆方向に進み、リレーレンズ１０５によって一次像面１００Ａで結像され、その後、走査レンズ１０４、走査ユニット１１０を経て、ダイクロイックミラー１０８に入射する。

上述したように、ダイクロイックミラー１０８は、標本ＳＰに含まれる蛍光分子から発せられる蛍光Ｌ４の波長のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の波長以外の波長に対しては反射させる特性を有している。このため、ダイクロイックミラー１０８は、入射した蛍光Ｌ４のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の波長以外の波長の蛍光Ｌ５を反射させて、反射させた蛍光Ｌ５を検出器レンズ１０９に入射させる。

検出器レンズ１０９は、入射する蛍光Ｌ５を集光して、集光した蛍光Ｌ５を遮光板１４０に入射させる。
遮光板１４０は、いわゆるピンホールである開口１４１を備えている。この遮光板１４０は、検出器レンズ１０９から入射する蛍光Ｌ５のうち、開口１４１に入射した蛍光Ｌ６を通過させるとともに、開口１４１に入射しない光を通過させない。つまり、遮光板１４０は、検出器レンズ１０９から入射する蛍光Ｌ５のうち、開口１４１に入射した蛍光Ｌ６を光検出器１３０に通過させる。

ここで、標本ＳＰに照明光Ｌ３が照射されると、励起光Ｌ１が照射される領域（スポット領域）から蛍光が発せられるだけでなく、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域においても励起光強度が完全になくなるわけではないため、わずかながら蛍光が発せられる。このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域から発せられた蛍光は、スポット領域から発せられた蛍光とともに、遮光板１４０に入射する。しかしながら、このＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域から大きく外れた他の領域から発せられた蛍光は、遮光板１４０上の開口１４１以外の位置に入射するため、遮光板１４０を通過しない。すなわち、スポット領域から大きく外れた他の領域から発せられた蛍光は、遮光板１４０によって遮られる。この結果、観察装置１は、スポット領域から発せられた蛍光を選択して観察することができるため、遮光板１４０を備えない場合に比べて、解像度（分解能）を向上させることができる。また、上述したスポット領域から大きく外れた他の領域には、標本ＳＰのＸＹ平面上のある領域が含まれる。つまり、観察装置１は、標本ＳＰのＸＹ平面上の領域のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域から発せられる蛍光を遮断して観察することにより、ＸＹ平面上の分解能（横分解能）を向上させることができる。また、上述したＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域には、標本ＳＰのＺ軸方向のある領域が含まれる。つまり、観察装置１は、標本ＳＰのＺ軸方向の領域のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の外側に大きく外れた他の領域から発せられる蛍光を遮断して観察することにより、Ｚ軸方向の分解能（縦分解能）を向上させることができる。

光検出器１３０は、遮光板１４０を通過した蛍光Ｌ６を検出し、検出した蛍光Ｌ６を示す信号Ｓ２を同期検出器１８０に出力する。すなわち、この光検出器１３０は、励起された蛍光分子が発する蛍光を検出する検出部の一例である。この光検出器１３０は、オシレータ１７０から出力されている波長変調周波数に対して十分な信号帯域を持つホトマルチプライヤやアバランシェフォトダイオード等の光検出素子を備えている。

オシレータ１７０は、波長変調用の信号Ｓ１を生成し、生成した波長変調用の信号Ｓ１をレーザー光源１０１、および同期検出器１８０に供給する。レーザー光源１０１の音響光学フィルタ２１０は、オシレータ１７０から供給される波長変調用の信号Ｓ１に基づいて、音響光学フィルタ２１０を通過する光（励起光Ｌ１）の波長を変化させる。このように、標本ＳＰに照射される励起光Ｌ１の波長が変化するため、励起光Ｌ１が照射された標本ＳＰに含まれる蛍光分子から発せられる蛍光Ｌ４の波長が、励起光Ｌ１の波長の変化に応じて変化する。すなわち、オシレータ１７０は、励起光Ｌ１を所定の変調周波数によって変調する変調制御部の一例である。

同期検出器１８０は、ロックインアンプ等を備えており、光検出器１３０が出力する蛍光Ｌ６を示す信号Ｓ２のうち、オシレータ１７０から供給される波長変調用の信号Ｓ１に同期した信号Ｓ３を抽出する。また、同期検出器１８０は、抽出した信号Ｓ３をデータ処理装置１６０に出力する。すなわち、この同期検出器１８０は、変調制御部が変調する励起光Ｌ１の波長の変化と、検出部が検出する蛍光の波長の変化とに基づいて、検出部が検出する蛍光の成分のうち、励起光Ｌ１による成分を抽出する抽出部の一例である。つまり、この同期検出器１８０は、所定の変調周波数に基づいて、検出部が検出する蛍光の一部を抽出する、抽出部の一例である。換言すれば、同期検出器１８０は、所定の変調周波数と同じ周波数で強度変化する蛍光を抽出する。
データ処理装置１６０は、同期検出器１８０が出力する信号Ｓ３と、走査ユニット１１０の走査状態とに基づいて、標本ＳＰの観察結果を示すデータを生成する。

［標本から発生する蛍光について］
次に、蛍光分子を含む標本ＳＰにおける蛍光の発生について説明する。この標本ＳＰに含まれる蛍光分子は、自然放出によって蛍光を発する。また、この蛍光分子は、ある範囲の波長の光（例えば、励起光Ｌ１）が照射されることにより励起された場合に、蛍光を発する。すなわち、励起光Ｌ１が標本ＳＰに照射されると、励起光Ｌ１の強度プロファイルに依存した蛍光が発生する。また、この蛍光分子は、ある範囲の波長の光（例えば、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２）が照射されることにより誘導放出が発生する。すなわち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２が標本ＳＰに照射されると、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度プロファイルに依存して誘導放出が発生する。励起された蛍光分子は、この誘導放出が発生すると、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２と同一の波長の光を発して基底状態に戻る。この誘導放出によって生じる光の波長は、励起光Ｌ１によって生じる蛍光の波長範囲に比べて狭い。したがって、観察装置１は、蛍光分子から発せられる光のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の波長とは異なる波長の光を観測することにより、励起光L1によって生じる蛍光のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって自然放出が抑えられなかった部分からの蛍光を検出することができる。次に、図４、図５を参照して、励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２とが標本ＳＰに照射された場合の、標本ＳＰにおける蛍光の発生について説明する。

図４は、標本ＳＰ上での励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度プロファイルの一例を示すグラフである。同図に示すように、観察装置１は、標本ＳＰ上の観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）において、励起光Ｌ１をスポット状に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状にそれぞれ結像させる。ここで、観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）における、励起光Ｌ１のＹ軸方向の強度プロファイルの一例を、波形Ｗ１によって示す。また、観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）における、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２のＹ軸方向の強度プロファイルの一例を、波形Ｗ２によって示す。観察装置１は、位置Ｑ（ｘ，ｙ）を中心にして、励起光Ｌ１をスポット状に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状にそれぞれ結像させる。これにより、励起光Ｌ１の周辺部に、励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２とがいずれも照射される領域（図４の領域Ａ１）が生じる。上述したように、蛍光分子は、励起光Ｌ１が照射されることにより励起された場合において、さらにＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２が照射されると、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２と同一の波長の光を発して基底状態に戻る。このとき、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が強い領域では、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が弱い領域に比べて、誘導放出がより生じやすい。一例として、位置Ｑ（ｘ，ｙ）を励起光Ｌ１の中央部とし、位置Ｒ１（ｘ，ｙ−０．５）、および位置Ｒ１’（ｘ，ｙ＋０．５）を励起光Ｌ１の周辺部とした場合について説明する。この一例の場合、波形Ｗ２に示すように、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度は、スポット状に結像した励起光Ｌ１の中央部において弱く、励起光Ｌ１の周辺部において強い。したがって、誘導放出は、スポット状に結像した励起光Ｌ１の中央部において生じにくく、励起光Ｌ１の周辺部において生じやすい。すなわち、スポット状に結像した励起光Ｌ１の周辺部においては、励起光Ｌ１が照射されているにも関わらず、励起光Ｌ１による蛍光を発しない領域が生じる。このことは、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を照射しない場合に比べて、励起光Ｌ１のスポット径が小さくなったことと等価である。すなわち、観察装置１は、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を照射することにより、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を照射しない場合に比べて、解像度を向上させることができる。次に、蛍光分子に照射されるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くした場合について、図５を参照して説明する。

図５は、標本ＳＰ上での励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２との強度プロファイルの他の一例を示すグラフである。同図に示すように、観察装置１は、標本ＳＰ上の観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）において、励起光Ｌ１をスポット状に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状にそれぞれ結像させる。ここで、観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）における、励起光Ｌ１のＹ軸方向の強度プロファイルの一例を、波形Ｗ３によって示す。また、観察対象の位置Ｑ（ｘ，ｙ）における、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くした場合の、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２のＹ軸方向の強度プロファイルの一例を、波形Ｗ４によって示す。観察装置１は、位置Ｑ（ｘ，ｙ）を中心にして、励起光Ｌ１をスポット状に、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状にそれぞれ結像させる。これにより、励起光Ｌ１の周辺部に、励起光Ｌ１とＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２とがいずれも照射される領域（図４の領域Ａ２）が生じる。

ここでは、一例として、位置Ｑ（ｘ，ｙ）を励起光Ｌ１の中央部とし、位置Ｒ２（ｘ，ｙ−０．５）、および位置Ｒ２’（ｘ，ｙ＋０．５）を励起光Ｌ１の周辺部とした場合について説明する。また、一例として、位置Ｒ３（ｘ，ｙ−０．１）、および位置Ｒ３’（ｘ，ｙ＋０．１）を励起光Ｌ１の中央部の近傍とした場合について説明する。蛍光分子に照射されるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くすると、誘導放出に対して飽和が生じる。このため、蛍光分子に照射されるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くすると、波形Ｗ４に示すように、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が強い領域が、スポット状に結像した励起光Ｌ１の中央部の近傍にまで拡大する。つまり、蛍光分子に照射されるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くすると、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が十分に強くない場合に比べて、誘導放出が生じる領域が励起光Ｌ１の中央部の近傍にまで拡大する。このように誘導放出が生じる領域が励起光Ｌ１の中央部の近傍にまで拡大することは、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が十分に強くない場合に比べて、励起光Ｌ１のスポット径が小さくなったことと等価である。すなわち、観察装置１は、強度を十分に強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を照射することにより、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が十分に強くない場合に比べて、解像度をさらに向上させることができる。

［励起光によって生じる蛍光の抽出］
また、蛍光分子に照射されるＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度を十分に強くすると、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって蛍光分子が励起され蛍光を発することがある。このように、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光は、励起光Ｌ１によって生じる蛍光と区別されずに、観察装置１の光検出器１３０に入射する。つまり、光検出器１３０が検出する蛍光Ｌ６には、励起光Ｌ１によって生じる蛍光と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光とが含まれている。上述したように、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２は、スポット状に結像した励起光Ｌ１に比べて、標本ＳＰ上の広い領域に照射される。つまり、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって蛍光が発生することは、励起光Ｌ１のスポット径が大きくなったことと等価である。したがって、データ処理装置１６０が、励起光Ｌ１によって生じる蛍光と、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光とが含まれている蛍光Ｌ６に基づいて、そのまま標本ＳＰの観察結果を示すデータを生成すると、解像度が低下してしまうことがある。

そこで、本実施形態の観察装置１は、光検出器１３０が検出した蛍光Ｌ６から、励起光Ｌ１によって生じる蛍光を抽出することにより、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光の影響を低減する。これにより、観察装置１は、解像度が低下する程度を低減する。次に、図６を参照して、この観察装置１による励起光Ｌ１によって生じる蛍光の抽出について、具体的に説明する。

図６は、ＦＩＴＣの励起スペクトルと蛍光スペクトルの一例を示すグラフである。ここで、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）とは、標本ＳＰに含まれる蛍光分子の蛍光色素の一例である。この励起スペクトルとは、照射する励起光Ｌ１の励起波長に対して得られる蛍光強度をプロットしたものであり、励起効率に比例する。一例として図６に示す蛍光色素は、照射される励起光Ｌ１の波長について、４００〜５３０［ｎｍ］の範囲に主な励起効率がある。また、この蛍光色素は、照射される励起光Ｌ１の波長が４００〜４９０［ｎｍ］の範囲においては、波長が長くなるにつれて励起効率が高くなることがわかる。したがって、この４００〜４９０［ｎｍ］の範囲において励起光Ｌ１の波長が変化すると、発生する蛍光の強度も変化することがわかる。より具体的には、このＦＩＴＣの一例の場合、４５０〜４８５［ｎｍ］の波長領域において波長変調を加えた励起光Ｌ１を照射すると、最大の励起効率を１としたときの励起効率は０．２２程度から０．８２程度に変化し、それに比例して蛍光強度も変動する。

ここで、励起光Ｌ１の波長変調について具体的に説明する。オシレータ１７０は、所定の周波数（例えば、１［ＭＨｚ］）の正弦波状の信号を発生させ、発生させた信号を信号Ｓ１として出力する。オシレータ１７０は、この信号Ｓ１によって、音響光学フィルタ２１０を駆動する。これにより、音響光学フィルタ２１０は、透過する励起光Ｌ１の中心波長を、正弦波状に変化させる。すなわち、音響光学フィルタ２１０は、オシレータ１７０が出力する信号Ｓ１に基づいて、励起光Ｌ１に波長変調をかける。この音響光学フィルタ２１０が備える音響光学素子においては、ブラッグ反射条件近傍では、その媒質中の音速をＶ、音波の周波数ｆ、光の波長λ、光の入射角度θに対して、次の式（１）に示す関係が成り立つ。

２ｓｉｎθ＝λｆ／Ｖ …（１）

ここで、入射角度θが一定であれば、音響光学素子によって回折される光の波長は、変調周波数に逆比例する。具体的には、振幅Δｆ、音波の中心周波数ｆ_０、音波に変調周波数ｆ’で変調を加えた場合には近似的に、次の式（２）が成り立つ。

λ＝λ_０＋２ｓｉｎθ（Ｖ／ｆ_０ ^２）Δｆｃｏｓ（２πｆ’ｔ） …（２）

すなわち、この式（２）により、音響光学フィルタ２１０を通過する波長に変調が加わることがわかる。ただし、λ_０は透過光の中心波長であり、式（１）が成り立つから、

λ_０＝２ｓｉｎθ（Ｖ／ｆ_０） …（３）
となる。

この式（３）によると式（２）は、式（４）とも表すことができる。

λ＝λ_０（１＋Δｆ／ｆ_０）ｃｏｓ（２πｆ’ｔ） …（４）

励起レーザー２０１は、例えば、白色レーザーなどの発振波長幅の広いレーザーである。この励起レーザー２０１が出射する励起レーザーは、上述のように変調の加えられた音響光学フィルタ２１０を通過することにより、その広い発振波長幅のうち一部の波長の光が切り取られて励起光Ｌ１として出射される。この発振波長幅の広いレーザーとしては、近赤外領域においてはタイサファイヤレーザー、近紫外〜可視領域であればそのタイサファイヤレーザーの第二高調波を使うことができる。あるいは、１００［ｆｓｅｃ］程度以下のパルス幅を持つ超短パルスレーザーを非線形光ファイバに通すことで自己位相変調により波長幅を広げたレーザーや自由電子レーザー等も利用可能である。

また、観察装置１は、波長６００［ｎｍ］の単色光をＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２として標本ＳＰに照射する。ここで、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２は波長変調されていないため、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって標本ＳＰに含まれる蛍光分子が励起された場合に生じる蛍光には、強度変化が生じない。このため、同期検出器１８０は、波長変調された励起光Ｌ１に対応して強度が変化する蛍光を抽出して、抽出した蛍光を示す信号を信号Ｓ３として出力する。すなわち、同期検出器１８０は、光検出器１３０が検出した蛍光Ｌ６のうち、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光を除去する。これにより観察装置１は、強度が十分に強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２によって生じる蛍光の影響を低減することができるため、解像度が低下する程度を軽減することができる。つまり、観察装置１は、強度が十分に強いＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２を照射することにより、Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２の強度が十分に強くない場合に比べて、解像度をさらに向上させることができる。

［変形例］
なお、同期検出器１８０は、光検出器１３０が出力する蛍光Ｌ６を示す信号Ｓ２のうち、オシレータ１７０から供給される波長変調用の信号Ｓ１に同期した信号Ｓ３を抽出する。つまり、波長を周波数Ｆで変調した場合、周波数Ｆに同期した信号Ｓ３を抽出する。このときに、同期検出器１８０は、周波数Ｆの整数倍である高次変調成分の蛍光を信号Ｓ３として抽出してもよい。この同期検出器１８０が、高次変調成分に基づいて、信号Ｓ３を抽出する一例について説明する。

図６に示したように、励起スペクトルは、４５０〜４８５［ｎｍ］の波長領域において波長変調を加えた励起光Ｌ１を照射すると、最大の励起効率を１としたときの励起効率は０．２２程度から０．８２程度に変化し、それに比例して蛍光強度も変動する。このとき、波長の変化に対する励起効率の変化は、非線形である。したがって、波長を周波数Ｆで変調した場合、変調された蛍光強度は、高調波成分（２Ｆ成分等）を有する。同期検出器１８０は、２次高調波成分（２Ｆ成分）の蛍光を信号Ｓ３として抽出する。このように、高次変調成分に基づいて信号Ｓ３を抽出することにより、基本変調成分に基づいて信号Ｓ３を抽出する場合に比べて、信号Ｓ２に含まれる雑音を低減して、信号Ｓ３を抽出することもできる。

すなわち、これまで同期検出器１８０は、所定の変調周波数と同じ周波数で強度変化する蛍光を抽出するとして説明したが、これに限らない。すなわち、同期検出器１８０は、が抽出する蛍光の強度変化の周波数は、所定の変調周波数と同じ周波数に限らない。光検出器１３０は、所定の変調周波数のＮ倍（Ｎは２以上の整数）で強度変化する蛍光を抽出するよう構成されてもよい。

以上、本発明の実施形態を、図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加えることができる。上述した実施形態に記載の構成を組み合わせてもよい。

なお、オシレータ１７０から出力する信号Ｓ１としては上述のような正弦波のほか、パルスであってもかまわない。その場合でも上記の構成はそのまま利用することができる。
また、本実施形態においては、一光子励起を例として説明したが、多光子励起の顕微鏡にも応用できる。その場合、レーザー光源１０１内における励起レーザー２０１を多光子励起のためのレーザー、例えば、タイサファイヤレーザーにすればよい。
また、励起レーザー２０１は、白色レーザーなどの発振波長幅の広い単一のレーザーであるとして説明したが、これに限られない。例えば、励起レーザー２０１は、発振波長幅の狭いレーザーを複数組み合わせることによって、発振波長幅を広くしてもよい。

また、本実施形態においては、ボルテックス位相板２０７によってＤｅｐｌｅｔｉｏｎ光Ｌ２をリング状（輪帯状）に結像させる具体例について説明したが、これに限られない。例えば、観察装置１は、ボルテックス位相板２０７に代えて、輪帯状の遮光板を標本共役の位置に備えていてもよい。

また、本実施形態においては、励起レーザー２０１は、発振波長のスペクトルが固定されており、音響光学フィルタ２１０が波長を変化させることで、励起光Ｌ１の波長を変調する例を説明したが、これに限られない。例えば、励起レーザー２０１とは、入力される信号に基づいて、射出する励起光Ｌ１の波長を変化可能な波長可変レーザーであってもよい。すなわち、光源（レーザー光源１０１）は、入力される信号に基づいて、射出する励起光Ｌ１の波長を変化可能な波長可変レーザーを備えていてもよい。また、この場合、変調制御部（オシレータ１７０）は、励起レーザー２０１に変調信号を出力する。このように構成しても、励起光Ｌ１の波長を変調することができる。

また、本実施形態においては、フィルタ部材が音響光学フィルタ２１０である例について説明したが、これに限られない。フィルタ部材は、光の入射角度に応じて透過する光の波長が変化する干渉フィルタであってもよい。この場合、観察装置１は、入力される信号に基づいて、干渉フィルタに励起光Ｌ１が入射する角度を可変にする不図示の角度可変部をさらに備える。また、この場合、変調制御部（オシレータ１７０）は、角度可変部に変調信号を出力する。このように構成しても、励起光Ｌ１の波長を変調することができる。

また、この場合、観察装置１は、角度可変部に代えて、または角度可変部に追加して、不図示の励起光入射位置可変部を備えていてもよい。この励起光入射位置可変部は、入力される信号に基づいて、フィルタ部材に励起光Ｌ１が入射する位置を可変にする。この場合、変調制御部（オシレータ１７０）は、この励起光入射位置可変部に変調信号を出力する。このように構成しても、励起光Ｌ１の波長を変調することができる。

また、Ｘ軸走査ミラー１１１、およびＹ軸走査ミラー１１２を備える走査ユニット１１０を、位置可変部の一例として説明したが、これに限られない。例えば、位置可変部は、標本ホルダ１０７を、図１に示すＸ軸方向、およびＹ軸方向に駆動するＸＹステージであってもよい。このように構成しても、位置可変部は、照明光Ｌ３の焦点が結ばれる標本ＳＰ上の位置を可変にすることができる。

なお、上述した各実施形態の観察装置１が備えるデータ処理装置１６０、および同期検出器１８０（以下、これらを総称して、各制御部と記載する。）は、専用のハードウェアにより実現されるものであってもよく、また、メモリおよびマイクロプロセッサにより実現させるものであってもよい。

なお、観察装置１が備える各制御部は、メモリおよびＣＰＵ（中央演算装置）により構成され、表示装置が備える各部の機能を実現するためのプログラムをメモリにロードして実行することによりその機能を実現させるものであってもよい。

また、観察装置１が備える各制御部の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、制御部が備える各部による処理を行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。

また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ウェブページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。

１…観察装置、
１０１…レーザー光源、１１０…走査ユニット、１３０…光検出器、１４０…遮光板、１７０…オシレータ、１８０…同期検出器、１６０…データ処理装置、２０１…励起レーザー、２０３…Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ光レーザー、２０７…ボルテックス位相板、２１０…音響光学フィルタ

Claims (8)

1. 標本に含まれる蛍光分子を励起する第１の光と、励起された前記蛍光分子に誘導放出を生じさせる第２の光とを射出する光源と、
   前記第１の光と、前記第２の光とをそれぞれ、前記標本上に集光させる光学部材と、
   前記光源と前記標本との間の前記第２の光の光路上に配置され、前記第２の光を前記標本上で輪帯状の光にする第２の光学部材と、
   前記標本上の集光位置を可変にする位置可変部と、
   励起された前記蛍光分子が発する蛍光を検出する検出部と、
   前記第１の光の波長を所定の変調周波数で変調する変調制御部と、
   前記所定の変調周波数に基づいて、前記検出部が検出する蛍光から前記第１の光の照射により生じる蛍光を抽出する抽出部と
   を備える観察装置。
2. 前記抽出部は、
   前記所定の変調周波数と同じ周波数で強度変化する蛍光を抽出する
   請求項１に記載の観察装置。
3. 前記抽出部は、
   前記所定の変調周波数のＮ倍（Ｎは２以上の整数）で強度変化する蛍光を抽出する
   請求項１または請求項２に記載の観察装置。
4. 前記光源は、
   入力される信号に基づいて、射出する前記第１の光の波長を変化可能な波長可変レーザーを備え、
   前記変調制御部は、
   前記光源に変調信号を出力する
   請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の観察装置。
5. 前記光源と前記標本との間の前記第１の光の光路上に配置され、入力される信号に基づいて、前記第１の光の波長を変化させるフィルタ部材
   をさらに備え、
   前記光源は、
   白色光を前記第１の光として射出し、
   前記変調制御部は、
   前記フィルタ部材に変調信号を出力する
   請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の観察装置。
6. 前記フィルタ部材とは、音響光学素子である、
   請求項５に記載の観察装置。
7. 前記フィルタ部材とは、光の入射角度に応じて透過する光の波長が変化する干渉フィルタであり、
   入力される信号に基づいて、前記干渉フィルタに前記第１の光が入射する角度を可変にする角度可変部
   をさらに備え、
   前記変調制御部は、
   前記角度可変部に変調信号を出力する
   請求項５に記載の観察装置。
8. 前記フィルタ部材とは、光の入射位置に応じて透過する光の波長が変化する干渉フィルタであり、
   入力される信号に基づいて、前記フィルタ部材に前記第１の光が入射する位置を可変にする位置可変部
   をさらに備え、
   前記変調制御部は、
   前記位置可変部に変調信号を出力する
   請求項５に記載の観察装置。