JP2007264664A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】明暗むらが少なく、照明の明るい多焦点走査レーザ顕微鏡を提供する。
【解決手段】本発明にかかるレーザ顕微鏡は、レーザ光源１０１と、レーザ光源１０１からの光を試料１１１に集光する第１の対物レンズ１１０と、試料１１１から発生した第二高調波と多光子励起光とを波長差を利用して分離するダイクロイックミラー１１４と、分離された第二高調波を観察のために受光するＣＣＤカメラ１１７と、分離された多光子励起光を観察のために受光するＣＣＤカメラ１１８とを備えるものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関し、特に、試料の第ニ高調波を検出するＳＨＧ（Second Harmonic Generation）顕微鏡に好適なレーザ顕微鏡に関する。

レーザ光を利用するレーザ顕微鏡は、その用途に応じて様々なタイプのものが開発されている。レーザ顕微鏡は、レーザより出力されたレーザ光を試料上に集光し、試料による反射光、発光光などを受光することによって、試料の観察や検査などを行うことができる。

レーザ顕微鏡の一つの態様として、共焦点顕微鏡が知られている。共焦点顕微鏡は、優れた分解能や試料の３次元情報を取得することができるなどの点から、注目を集めている。このような共焦点顕微鏡の一つに、回転するピンホール基板を利用して照射光を試料上で走査する共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１を参照）。光源からの光は回転する複数のピンホールが形成されたピンホール基板に入射する。ピンホールによって分割された光が試料上を走査する。ピンホールは、試料上での明暗むらを防止するため、基板上に螺旋配列に従って配置され、螺旋のトラックに沿って径方向及び周方向にピッチが等しくなるように配置される。

あるいは、ピンホールの配置密度が一定となるように、ピンホールが配置された、共焦点用光スキャナが知られている（例えば、特許文献２を参照）。ピンホールは、マイクロレンズを使用することができる。しかし、これらの配置に従ったピンホール基板は、明暗むらを抑制し同時に試料上の照明の明るさを大きくする点において、十分な結果を得られない場合があった。また、このようなアレイ基板を効果的に設計する方法について、これまで十分な検討がなされていなかった。

他のレーザ顕微鏡として、試料にレーザ光を照射することにより発生した第二高調波を利用して、試料の各種物理特性を計測する第二高調波顕微鏡が実用化されるようになってきている。この第二高調波顕微鏡を用いた計測は、レーザ光源から出力されたレーザ光を試料に焦点させるとともに、試料上を走査させ、試料内部から発せられた第二高調波を検出することによって実施する。第二高調波顕微鏡は、特に、医療やバイオテクノロジーの分野などにおける、細胞やたんぱく質レベルの構造もしくは機能の検出などに有効な手段として注目を集めている。

この顕微鏡において試料に光を照射すると、多くの場合、第二高調波発光と共に、多光子励起蛍光が試料から生成される。第二高調波の検出のために、従来の第二高調波顕微鏡は、多光子励起蛍光を光学フィルタによって遮断していた。そのため、多光子励起蛍光に関する情報がフィルタによって失われてしまっていた。あるいは、光学フィルタによっては、十分に多光子励起蛍光を遮断できない場合があった。

特開平５−１２７０９０号公報 特開平５−１１９２６２号公報

本発明は上記従来技術などに鑑みてなされたものであって、試料の効果的な観察を可能とする、レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を試料に集光するレンズと、前記試料から発生した第二高調波と多光子励起光とを波長差を利用して分離する手段と、前記分離された第二高調波を観察のために受光する手段と、前記分離された多光子励起光を観察のために受光する手段と、を備える、レーザ顕微鏡である。これにより、効果的に第二高調波による試料観察を行うことができる。

上記第１の態様に係るレーザ顕微鏡において、前記波長差を利用して分離する手段はダイクロイックミラーであり、前記試料から発生した光の第二高調波と多光子励起光のうちの一方を反射し他方を透過することができる。

上記第１の態様に係るレーザ顕微鏡において、さらに、前記試料からの光を集めるための対物レンズを備え、前記対物レンズと前記試料に集光するレンズとの間に、前記試料が配置されることが好ましい。これにより、入射光と発光光を分離するためのダイクロイックミラーを不要とすることができる。

上記第１の態様に係るレーザ顕微鏡において、前記第二高調波を観察のために受光する手段と多光子励起光を観察のために受光する手段は、それぞれ受光した光を電気信号に変換する装置を使用することができる。
また、上記第１の態様に係るレーザ顕微鏡において、前記波長差を利用して分離する手段によって分離された第二高調波と多光子励起光とを、さらに発生タイミング差を利用して分離する手段を備えてもよい。これにより、さらに効果的に第二高調波による試料観察を行うことができる。

本発明の第２の態様は、レーザ光源と、前記レーザ光源からの光を試料に集光するレンズと、前記試料から発生した第二高調波と多光子励起光とを発生タイミング差を利用して分離する手段と、前記分離された第二高調波もしくは多光子励起光を観察のために受光する手段と、を備える、レーザ顕微鏡である。これにより、効果的に第二高調波による試料観察を行うことができる。

上記第２の態様に係るレーザ顕微鏡において、前記分離する手段は、前記試料から発生した前記第二高調波を透過し、前記多光子励起光を遮断するタイミングで開閉するゲートを備えることが好ましい。これにより、効果的に第二高調波と多光子励起光を分離することができる。さらに、ゲートは、前記レーザ光源のパルス出力タイミングに同期して予め定められた時間開くことによって、前記第二高調波を透過し、前記多光子励起光を遮断することが好ましい。これにより、タイミングの制御を効果的に行うことができる。ゲートは、前記レーザ光源のパルス出力タイミングと所定の遅延をもって同期することができる。これにより、試料や顕微鏡に基づいた、タイミングの制御を効果的に行うことができる。

上記第１あるいは第２の態様に係るレーザ顕微鏡において、光学系の分散によるパルス幅の広がりを抑制するプリチャーパを備えることが好ましい。

本発明によれば、試料の効果的な観察を可能とする、レーザ顕微鏡を提供することができる。

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。

実施の形態１．
図１は、本実施形態におけるレーザ顕微鏡１００の概略を示す構成図である。本形態のレーザ顕微鏡１００は試料が発生する第二高調波を検出可能なＳＨＧ（Second Harmonic Generation）顕微鏡である。ＳＨＧ顕微鏡は、試料に所定波長の光を入射し、第二高調波発生（ＳＨＧ）を用いた光学顕微鏡である。ＳＨＧ顕微鏡は触媒反応表面、金属や半導体の微細構造など、様々な試料の観察に利用することがきるが、特に、医療やバイオテクノロジーの分野などにおける、細胞やたんぱく質レベルの構造もしくは機能の検出などに有効な手段である。ＳＨＧ光強度の像は分子の配向分布などを表し、非平衡な現象による分子濃度などの偏り、配向の分布のパターンなどが観察できる。生物体試料は非対称な生体分子から構成されており、そのＳＨＧ像は生物体内の特別な構造の分布を抽出観察するために有効である。多くの場合、第二高調波発光と共に、多光子励起蛍光が試料から生成される。本形態のＳＨＧ顕微鏡１００は、試料が生成した第二高調波と共に、多光子励起蛍光を同時に観察することができる。多光子励起蛍光は、２光子以上の光子を同時に吸収することよる励起蛍光である。

図１において、１０１はレーザ光源、１０２はレーザ光源を制御するレーザ制御部、１０３は光学系による波長分散の拡大を補償するプリチャーパ、１０４はミラー、１０５はビームエキスパンダ、１０６は複数のマイクロレンズが形成されたマイクロレンズ・アレイ・ディスク、１０７はレンズ、１０８、１０９はミラー、１１０は試料に光を集光する第１の対物レンズ、１１１は試料、１１２は試料１１１からの光を集める第２の対物レンズ、１１３は特定波長の光を遮断する光学フィルタ、１１４はダイクロイックミラー、１１５、１１６はレンズ、１１７、１１８は撮像装置の一例であるＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ、１１９は画像処理装置の一例であるコンピュータシステムである。レーザ光源１０１からの光は、図１の光学系を介して試料１１１に入射し、試料１１１の発光する第二高調波がＣＣＤカメラ１１７で検出され、多光子励起蛍光がＣＣＤカメラ１１８によって、それぞれ別に検出される。

本形態のレーザ光源１０１としては、第２次高調波と多光子蛍光の発生が可能なレーザ装置が使用される。例えば、生物細胞の観察などにおいて、モード・ロックド・チタン・サファイア・レーザを使用した赤外光パルスなどを使用することができる。レーザ光波長、レーザ光強度、発振態様、繰り返し周波数、パルス幅などのレーザ光の特性は、試料や観察方法によって適切なものが選択される。

レーザ光源１０１から出力されたパルスレーザ光は、プリチャーパ１０３に入射する。プリチャーパ１０３は光学系によるレーザ光における異なる周波数光の位相ずれを予め補償する。これにより、試料に照射されるパルスレーザ光の光学系によるパルス幅の広がりを抑制することができる。尚、プリチャーパ１０３については、後に詳述される。プリチャーパ１０３によって位相ずれの補償がなされた光は、ミラー１０４によって反射されることによって光路方向が変更され、ビームエキスパンダ１０５に入射する。入射光は、ビームエキスパンダ１０５によってビーム・スポット径が拡大される。

スポット径を拡大されたビームは、マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６に入射する。マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６はモータなどの駆動装置（不図示）によって所定の角速度で回転されている。回転数はマイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６の構造、撮像系の条件などによって適宜選択される。典型的な回転数は、およそ６０〜３００００ｒｐｍである。マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６は、所定の規則に従って配置された複数のマイクロレンズを備えており、試料上に多焦点を形成することができる。さらに、マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６が回転することによって試料上の焦点が移動し、多くの集光されたビームが試料上を同時に走査することができる。尚、マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６の構造については、後に詳述される。

マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６に入射した光は、複数のビームに分割されて、レンズ１０７に入射する。入射した複数のビームは、レンズ１０７によって平行光とされ、ミラー１０８に入射する。ミラー１０８によって反射され、光路方向を変更された光は、再度ミラー１０９によって光路方向変更され、第１の対物レンズ１１０に入射する。

第１の対物レンズ１１０は入射した多ビームを試料上に集光する。本形態の対物レンズ１１０として、水浸タイプの対物レンズが例示されている。マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６によって分割された多ビームは、対物レンズ１１０の結像作用によって、試料１１１上に多焦点を形成する。試料１１１上の多焦点ビームは、マイクロレンズ・アレイ・ディスク１０６の回転により、試料１１１上を走査する。

試料１１１は、入射光によって、入射光の２倍の周波数を有する第二高調波と、多光子励起蛍光を発光する。典型的な多光子励起蛍光は２光子励起蛍光である。試料１１１からの発光光は、第２の対物レンズ１１２によって集められる。本形態の対物レンズ１１２として、水浸タイプの対物レンズが例示されている。第２の対物レンズ１１２は、試料１１１に関して、第１の対物レンズ１１０と反対側に配置されている。試料１１１は、第１の対物レンズ１１０と第２の対物レンズ１１２の間に配置され、２つの対物レンズの焦点は、試料上で実質的に一致することが好ましい。入射光を試料上に集光する対物レンズ１１０ではなく、レーザの出力光が試料を透過する透過方向に配置された別の対物レンズ１１２で試料からの発光光を受光することによって、入射光と発光光を分離するためのダイクロイックミラーを不要とすることができる。

図２は、試料への入射光、試料からの第二高調波、及び多光子励起蛍光の典型的な関係を示している。図２は一例を示すものであって、各光の波長関係は、入射光と試料とによって、大きく変化しうる。図２においてグラフのＸ軸は光の周波数を、Ｙ軸は光のエネルギーもしくは強度を意味している。２０１は試料が発光する第二高調波、２０２は試料が発光する多光子励起蛍光、２０３は光源からの入射光である。第二高調波２０１は、入射光２０３の半分の波長（２倍の周波数）を備えており、多光子励起蛍光２０２の波長は第二高調波２０１よりもわずかに大きな値である。本形態のＳＨＧ顕微鏡は、第二高調波２０１と多光子励起蛍光２０２のそれぞれを、分離して検出することができる。

対物レンズ１１２からの光は光学フィルタ１１３を通過してダイクロイックミラー１１４に入射する。光学フィルタ１１３は、レーザ光源１０１から試料１１１を透過した透過光を遮断する。光学フィルタ１１３は、レーザ光源１０１の出力光２０３の波長域を遮断するバンド・パス・フィルタもしくはローパス・フィルタなどによって構成することができる。フィルタ１１３が試料１１１から光の入射光成分を遮断することによって、効果的に試料の発光を観察することができる。

試料の発光光の第二高調波と多光子励起蛍光は、ダイクロイックミラー１１４によって分離される。図２に示すように、第二高調波と多光子励起蛍光との間には所定の波長差（周波数差）が存在するので、ダイクロイックミラー１１４を利用するとによって一方の光を反射し他方の光を透過するとで、これらを分離することができる。ダイクロイックミラー１１４の波長−反射率（透過率）特性は、試料が発生する第二高調波と多光子励起蛍光の波長に基づいて決定される。第二高調波の波長範囲を反射し、多光子励起蛍光の波長範囲を透過する、あるいは、第二高調波の波長範囲を透過し、多光子励起蛍光の波長範囲を反射する特性を有することができる。

本例のダイクロイックミラー１１４は第二高調波を反射し、多光子励起蛍光を透過する。反射された第二高調波はレンズ１１５によって集光されて、ＣＣＤカメラ１１７に入射する。一方、透過した多光子励起蛍光はレンズ１１６を介してＣＣＤカメラ１１８に集光されて入射する。ＣＣＤカメラ１１７は、微弱光である第二高調波を効果的に検出するため、イメージ・インテンシファイアを備えることが好ましい。ＣＣＤカメラ１１７、１１８は入射光を検出し、ビデオ信号に変換して画像処理装置１１９に送信する。画像処理装置１１９は受信した検出データについて必要な画像処理を行い、ディスプレイ上に撮像された画像を表示する。

発光光の第二高調波成分と多光子励起蛍光成分を分離して検出することによって、それぞれの画像データの比較を効果的に行うことができる。また、本形態の顕微鏡は同一の対物レンズで試料からのを受光するので、異なる対物レンズを使用する場合と比較して、正確な比較が可能となる。尚、撮像装置として、ＣＭＯＳセンサやフォトダイオード・アレイなどを使用することができる。あるいは、ＣＣＤカメラなどの撮像装置に代えて、接眼装置を実装することができる。第二高調波と多光子励起蛍光の検出のために、マイクロレンズ・アレイ・ディスクを使用することなく、顕微鏡を構成することが可能である。

実施の形態２．
図３は、本実施の形態におけるＳＨＧ顕微鏡の概略を示す構成図である。図３において、図１と同一の符号は同一の要素を示しており、説明が省略される。図３において、３０１は撮像装置の一例であるインテンシファイドＣＣＤカメラ、３０２は遅延回路である。本形態のＳＨＧ顕微鏡は、ダイクロイックミラー１１４の代わりに、ミラー３０６を備えている。試料１１１からの光はミラー３０６で反射され、レンズ１１５によって集光されてＣＣＤカメラ３０１に入射する。

本形態のインテンシファイドＣＣＤカメラ３０１は所定のタイミングで開閉するゲートを備えるゲート付インテンシファイドＣＣＤカメラである。インテンシファイドＣＣＤカメラ３０１は、イメージ・インテンシファイア３０３、ＣＣＤ３０４、及び、制御・駆動部３０５を備えている。レーザ制御部１０２は、遅延回路部３０２を介してインテンシファイドＣＣＤカメラ３０１と回路的に接続されている。レーザ制御部１０２は、レーザの繰り返し周波数と同期したクロック信号を、遅延回路部３０２を介してインテンシファイドＣＣＤカメラ３０１に送信する。

イメージ・インテンシファイア３０３はゲート機能を備えており、入射光を所定のタイミングで遮断もしくは増幅させることができる。本形態のイメージ・インテンシファイア３０３は、レーザ制御部１０２からのクロック信号に基づいて、入射光の増幅を制御する。イメージ・インテンシファイア３０３は、その内部のマイクロチャネル・プレートに印加する電圧を変化させることによって、ゲートの開閉を行うことができる。制御・駆動部３０５は、イメージ・インテンシファイア３０３、ＣＣＤ３０４の駆動及び制御、あるいは、ＣＣＤカメラ３０１全体の制御を行う回路部である。尚、ゲート付インテンシファイドＣＣＤカメラは広く知られた技術であるので、詳細な説明は省略される。

図４は、光源から出力される入射光、試料１１１が発生する第二高調波及び多光子励起蛍光の典型的な関係の一例を示している。図４において、各グラフのＸ軸は時間、Ｙ軸はエネルギーを意味する。４０１はレーザ光源１０１が出力され試料に入射する入射光、４０２は試料が発光する第二高調波、４０３は試料が発光する多光子励起蛍光、４０４はＣＣＤカメラ３０１のゲートが開口しているタイミングを示している。第二高調波４０２と多光子励起蛍光４０３は、異なるタイミングで発光される。第二高調波４０２は入射光の入射と実質的に同時に生成される。一方、図４に示すように、多光子励起蛍光４０３は第二高調波４０２よりも遅れて放出される。本形態の顕微鏡は、第二高調波と多光子励起蛍光の発生タイミングの差を利用して、これらを分離する。

従って、ＣＣＤカメラ３０１のゲートを所定のタイミングで、所定時間あけることによって、多光子励起蛍光４０３を遮断し、第二高調波４０２を多光子励起蛍光４０３から分離して検出することができる。例えば、図４において、レーザ光の入射タイミングでゲートを開け第二高調波４０２を検出し、第二高調波４０２の発光時間に相当する時間後にゲートを閉じることで、第二高調波４０２の後に続く多光子励起蛍光４０３を遮断することができる。同様に、多光子励起蛍光４０３を第二高調波４０２から分離して検出することも可能である。

ゲートの動作タイミングは、レーザ光源１０１のパルス周波数に基づいて決定される。レーザ光源１０１は、制御回路１０２の生成クロックに従ってパルスレーザを出力する。このクロック信号を、遅延回路を介すことによって所定の遅延を行い、ＣＣＤカメラ３０１に入力する。ＣＣＤカメラ３０１は、このクロック信号に同期してゲートの開閉を行う。例えば、入力されたクロック信号に従ってゲートを開け、予め定められた時間の間のみゲートを開ける。尚、タイミングの遅延処理は、レーザ制御部もしくはＣＣＤカメラにおいて行ってもよい。

遅延量は、ＳＨＧ顕微鏡の光学系及び試料の発光特性に基づいて、適宜に決定され、また、システムによって必要とされない場合もある。ゲートの開口時間は、第二高調波の発光時間と多光子励起蛍光の発光時間に基づいて決定される。第二高調波をできるだけ多く受光し、多光子励起蛍光をできるだけ少なく受光するように開口時間を決定することが好ましい。タイミング遅延量とゲート開口時間を変化させながら、取得された画像データを比較することによって、適切なタイミング、開口時間を決定することができる。

本形態の構成を有することにより、光学フィルタによって完全に分離することが困難である強い多光子励起蛍光成分を第二高調波成分から効果的に分離することができ、ＳＨ画像データのＳ／Ｎを向上することができる。発光光の時間的な遮断もしくは透過、検出の制御は、イメージ・インテンシファイアのゲートの他、広く知られた様々なものを使用することができる。

実施の形態３．
図５は、実施の形態１もしくは２のＳＨＧ顕微鏡において使用可能なマイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１の一例の構成を示している。マイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１は光を透過するドットの一例である複数のマイクロレンズLiを備えている。各マイクロレンズＬiのディスク５０１上の配置位置は、ディスクの回転中心を原点として、極座標（ｒi、θi）で特定される。ｒiは回転中心からのマイクロレンズＬiの距離（以下、半径距離とはこれを意味する）、θiは各レンズの相対角度である。図５（ａ）において、５０２は複数のマイクロレンズＬiから構成されるマイクロレンズ・アレイであって、５０２で指示される領域内に各マイクロレンズが所定の規則に従って配置されている。マイクロレンズ・アレイ５０２は、マイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１の円周方向に帯状に延びている。

５０３によって指示される点線の円は、マイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１に照射されるレーザのスポット径を示している。レーザのスポットの直径は、回転中心から最も遠いレンズと最も近いレンズの間の、半径方向の距離とほぼ同一であることが効率の点から好ましい。例えば、最も遠いレンズの半径中心からの距離がｒl、最も近いレンズの半径中心からの距離がｒ0である場合、これらの半径方向の距離は、（ｒl−ｒ0）である。例えば、マイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１が一周することによって、試料上のレーザ光照射範囲全ての１回の走査が完了する。

図５（ｂ）は、マイクロレンズ・アレイの拡大された一部を示している。ここで、サフィックスiは、ｒが徐々に大きくなる順番で付されている（ｒi＜ｒi+1＜ｒi+2）。また、図５（ｂ）においては、（θi＜θi+1＜θi+2）の関係が成立している。円周方向へのマイクロレンズの配置方向は、θが減少するように配置し、図と逆とすることももちろん可能である。図５（ｂ）は、回転中心からｓ周目、（ｓ+1）周目、及び（ｓ+2）周目に配置されているマイクロレンズを示している。

図５（ａ）に示すように、マイクロレンズ・アレイ・ディスク５０１が回転することによって、各マイクロレンズＬiによって分離されたビームは、ディスク５０１の回転に従って移動し、試料上を走査する。試料上に各ビームによって形成される走査線がカバーする部分の結像を、撮像装置は得ることができる。複数のビームが走査時間内に同時に広範囲を走査することにより、高い空間分解能と時間分解能を同時に実現することができる。

本形態におけるマイクロレンズ・アレイの設計方法は、分割された複数のビームによる試料上での明るさのむらを減少するように、各マイクロレンズの回転中心からの半径距離ｒを決定する。一つのレーザ焦点が走査する場合、焦点によって形成される走査線による単位時間、単位面積あたりの光強度（走査線の明るさ）は、そのレーザ焦点の線速度に反比例する。従って、分割された複数のビームによって得られる各走査線の明るさは、各ビーム・スポットの速度に反比例する。座標ｒが大きいほどスポット速度が速いので、座標ｒが最も大きいレンズの走査線が最も暗く、座標ｒが最も小さいレンズの走査線が最も明るい。従って、試料上で均一な明るさを得るためには、回転中心から半径方向の外側へいくにつれ、試料上を走査する走査線の面積あたりの数が増加することが重要である。

本形態のマイクロレンズ・アレイ５０２によって試料上に形成される隣接する走査線間の距離は、各走査線の明るさが減少するにつれて、減少するように設計される。レンズに関しては言えば、半径距離（ｒ）が最も近いレンズ間の半径方向距離（各レンズの半径距離の差（ｒi+1−ｒi））は、レンズの半径距離ｒが大きくなるにつれて小さくなるように設計される。例えば、図５（ｂ）おいて、（ｒi+2−ｒi+1）＜（ｒi+1−ｒi）の関係が成立する。尚、いくつかのレンズペアについては、半径方向のレンズ間距離がほぼ同一であることも可能である。

各マイクロレンズの半径距離の好ましい設計方法は、半径距離が最も近いレンズ間の半径距離の差を、いずれか一方のレンズ、あるいはこれらレンズに半径距離について近接するレンズによって形成される走査線の明るさに基づいて決定する。特に、半径距離が最も近い２つのレンズの一方の明るさ、あるいは、双方の明るさに基づいて決定されることが好ましい。各走査線の明るさは、対応レンズの回転中心からの半径距離に反比例するため、隣接レンズ間距離は、対応するレンズの一方もしくは双方の半径距離の分数に基づいて決定することが好ましい。好ましい例として、半径距離の差は、一方のレンズの半径距離もしくは、双方の半径距離の平均に比例するように決定することができる。以下に、各レンズの半径距離の好ましい設計方法の一例を示す。

ディスク上のマイクロレンズLｉによって形成され、ディスクの回転によって走査されるレーザ焦点の線速度ｖiと、焦点を形成するレンズのディスク中心からの距離ｒiの関係は次式で表される。

ここで、ωは回転するレンズの角速度である。

それぞれの走査線の半径方向の間隔を回転中心からの距離に反比例させることによって、むらの少ない照明を実現することができる。走査線の回転中心からの距離を、次の階差数列によって決定することができる。

これを、ｒiについて解くと、次式が得られる。

ここで、ａはｒiの初項ｒ0と第２項ｒ1によって決定される定数であり、次式で与えられる。

初項ｒ0と第２項ｒ1は、走査線数や、ビーム・スポット径などに従って適切に決定することができる。
数式４によってｒiを求めることによって、各レンズの半径距離を決定することができる。

各マイクロレンズのディスク上の位置を決定するために、座標ｒiの他に座標θを決定することが必要である。光の利用効率を高めるためには、なるべくレンズの半径を大きくすることが好ましい。そこで、座標ｒiを決定した後に、ディスクにおけるレンズの占める面積を大きくするように、Lｉの座標θiを決定することが重要である。

このためには、円周方向に隣接するマイクロレンズの間に、次の周のマイクロレンズが配置されることが好ましい。図５（ｂ）を参照すれば、ｓ周目の隣接レンズ間に、（ｓ+1）周目に配置されているレンズが配置される。例えば、円周方向に隣接するマイクロレンズ（Ｌi、Ｌi+1）間の中心位置に、半径方向に隣接するレンズ（Ｌn）が実質的に配置されることが好ましい。具体的には、図５（ｂ）において、（θi+θi+1）／２とθnがほぼ等しいことを意味する。好ましいθの決定方法の一つは、等角配列に従うものである。等角配列は、円周方向に隣接するレンズ間の角度座標差が、各レンズ間で実質的に同一である。例えば、図５（ｂ）において、（θi+1-θi）で表される角度差が全て等しい。

具体的には、各レンズのθは、以下の式に従って決定することができる。

ここでｎは自然数であり、最もレンズの半径を大きくできるように選ぶことが好ましい。等角配列において上式に従ってθ座標を決定することによって、θ座標に関してｓ周目の隣接レンズ間の中央に、ｓ+1周目のレンズを配置することができる。以上のように、各マイクロレンズの座標ｒiとθiとを決定することによって、効果的にレンズ配置設計を行うことができる。

次に、密なレンズの配置を与える他の配列の一つである螺旋配列を使用したマイクロレンズ・アレイの設計方法について説明する。図６は、螺旋配列に従って配列されたマイクロレンズ・アレイ６０１を示している。図６の実線上６０２に各マイクロレンズＬiが配列される。具体的には、螺旋配列は、次式によって表される。

ｌは、螺旋における、隣接する周の間の距離である。これをθiについて解くと次式が得られる。

各マイクロレンズの座標ｒiは、各マイクロレンズによって形成される走査線の時間・面積あたり光強度が均一になるように決定することができる。例えば、上記の決定方法に従って、座標ｒiを決定することができる。θiを決定するために、螺旋の間隔ｌが決定されている必要がある。ディスク上のレンズ面積を大きくするためには、螺旋の間隔ｌは円周方向に隣接するレンズ間の最も小さい距離に基づいて決定することが好ましい。各走査線の明るさを均一にする配置を行う場合、ディスクの外側にあるほどレンズ間距離を小さくすることが好ましいので、螺旋の間隔ｌの好ましい決定方法の一つは、最も中心から離れたレンズＬlastと円周方向に隣接するレンズＬlast-1との間の距離に等しくなるように螺旋の間隔ｌを決定する。具体的には、ｌは次式によって表される。

上記設計方法によって、螺旋配列に従ってマイクロレンズを配置する場合に、レンズ面積を大きくするように効果的にレンズ配置設計を行うことができる。

図７は、他の態様のマイクロレンズ・アレイ・ディスク７０１の構成を示している。図７（ａ）において、マイクロレンズ・アレイ・ディスク７０１は、円周方向に延びる帯状のマイクロレンズ・アレイ７０２を備えている。マイクロレンズ・アレイ７０２は複数のマイクロレンズＬiから構成され、各マイクロレンズＬiは所定の規則に従って配置されている。入射レーザ光のスポット径７０３は、効率の観点から、マイクロレンズ・アレイ７０２の幅とほぼ同様の大きさを備える。

マイクロレンズ・アレイ７０２は円周方向に分割される複数のセクションＳjから構成されており、各セクションＳjは同一のレンズ配置を備えている。一つのセクションがレーザ・スポット７０３を通過することによって、試料上で１回の走査が完了する。マイクロレンズ・アレイ・ディスク７０１が１回転することによって、セクション数に相当する複数回の走査を行うことができる。図７のセクション数は８であり、１回転当たりの走査回数が８である。これにより、高速走査が可能となる。あるいは、同一の走査回数に対して、マイクロレンズ・アレイ・ディスク７０１の回転数を小さくすることがきるので、ディスクぶれを抑制することができ、照明の不均一さを減少することができる。マイクロレンズ・アレイに複数のセクションを設けることによって、単一のセクションのみの場合と比較し、設計によって、密にレンズを配置することができる。

図７（ｂ）は、一つのセクション内の一部を示している。図７（ｂ）において、図面の下方部分に回転中心が存在する。各レンズは回転中心からの異なる半径距離ｒを備え、円周方向の位置である座標θは、例えば等角配列によって決定することができる。ｓ周目の隣接するレンズのθについての中心位置に、（ｓ+1）周目のレンズが配置されている。

複数セクションを備えるマイクロレンズ・アレイの設計は、以下のように行うことができる。各セクション内のマイクロレンズの配置は、[数式３]に従って座標ｒijを決定し、等角配列に従って座標θijを決定することができる。各セクションＳj内のマイクロレンズについて、例えば、[数式３]に従って座標ｒijを決定する。等角配列の場合のレンズＬijの座標θijは、ディスク１回転あたりの走査回数をｍとして、次式で与えることができる。

同様に、螺旋配列についても複数のセクションに分割することができる。螺旋配列における座標θijは、次式で与えることができる。

同じ走査線数、最大走査線間隔でマイクロレンズ・アレイを設計する場合、螺旋配列と等角配列とは、マイクロレンズ・アレイの半径に従って、選択することが好ましい。マイクロレンズ・アレイの最大半径（マイクロレンズの最も大きいｒi）に対する最小半径（マイクロレンズの最も小さいｒi）の比が所定値以上である場合には、等角配列によってレンズ配置設計を行うことが好ましく、所定値未満においては、螺旋配列によってレンズ配置設計を行うことが好ましい。螺旋配列は最大半径に対する最小半径の比に関係なく一定のレンズ密度になるのに対して、等角配列は、比を大きくすると密度が大きくなるからである。例えば、走査線数５７８本、走査線最大間隔１９．５μｍ、マイクロレンズ・アレイの最小半径４０ｍｍ、セクション数１２とした場合、ディスク上においてレンズの占める割合は、等角配列が螺旋配列よりも１％程度大きくすることができる。

尚、マイクロレンズ・アレイ・ディスクは、ＳＨＧ顕微鏡に限らず、様々なタイプのレーザ顕微鏡や検査装置などのレーザ走査装置、その他光学系に適用することができる。また、本形態のレンズ配置は、共焦点光学系におけるピンホール・アレイのピンホールの配置に適用することが可能である。ピンホールは、光を透過するドットの他の例である。

実施の形態４．
図８は、実施の形態１もしくは２に示されたＳＨＧ顕微鏡に適用可能な、プリチャーパの構成を示している。プリチャーパは、光学系の分散によって引き起こされる周波数による位相ずれを予め補償することによって、レーザパルスのパルス幅の広がりを抑制することができる。本形態のプリチャーパは、特に、フェムト秒オーダーのパルスレーザにおいて、大きな効果を奏する。フェムト秒パルスレーザを用いた第２高調波もしくは多光子励起蛍光の励起効率は、パルス幅に大きく左右されるものであるので、パルス幅の制御は重要である。図８（ａ）は、パルス光の変化の様子を概念的に示している。パルス入射光のパルス幅は、プリチャーパ８００を通過することによって、実線でしめされた波形のように、次の光学系８０１を通過した後も維持される。プリチャーパ８００を使用しない場合、パルス光は、点線で示された波形のように、パルス幅が拡大する。

図８（ｂ）に示すように、本形態のプリチャーパ８００は、４つのプリズム８０２−８０５により構成されている。レーザ光源からの入射光は、第１のプリズム８０２の頂角近傍に入射し、屈折して、出射面より出射する。次に第２のプリズムの頂角近傍に入射し、同様に屈折をして出射する。順次、プリズムへの入射、屈折、出射を繰り返し、第４のプリズムから出射した光は、後続の光学系に入射する。各プリズムの材料、屈折率、形状、あるいは、プリズム間距離や角度などの配置条件は、設計上適切なものが選択される。各プリズムの屈折率、１次及び２次分散が決定されている場合、プリズム間距離とプリズムの角度を調整することによって、適切なプリチャーパを設計することができる。

プリチャーパ８００は、負の群速度分散を起こすことによって、光学系における群速度分散を相殺する。プリチャーパ８００は、プリズムの角度分散を利用することによって、負の角度分散を起こしている。角度分散を起こす光学素子として、グレーティングを利用することも可能である。しかし、光損失の観点から、プリズムを利用することが好ましい。本形態のプリチャーパによりパルス幅を制御することよって、効果的な観察を可能とすることができる。

本発明の実施の形態に係るＳＨＧレーザ顕微鏡の概略を示す構成図である。 本発明の実施の形態に係るＳＨＧレーザ顕微鏡において、レーザ入射光、第２高調波、及び多光子励起光の波長−強度特性を示す図である。 本発明の他の実施の形態に係ＳＨＧレーザ顕微鏡の概略を示す構成図である。 本発明の他の実施の形態に係るＳＨＧレーザ顕微鏡において、レーザ入射光、第２高調波、及び多光子励起光の時間−強度特性を示す図である。 本発明の実施の形態に係るマイクロレンズ・アレイ・ディスクの概略を示す構造図である。 本発明の実施の形態に係るマイクロレンズ・アレイ・ディスクの概略を示す構造図である。 本発明の実施の形態に係るマイクロレンズ・アレイ・ディスクの概略を示す構造図である。 本発明の実施の形態に係るプリチャーパの概略を示す構成図である。

符号の説明

１０１ レーザ光源、１０２ レーザ制御部、１０３ プリチャーパ、１０４ ミラー、
１０５ ビームエキスパンダ、１０６ マイクロレンズ・アレイ・ディスク、
１０７ レンズ、１０８、１０９ ミラー、１１０ 第１の対物レンズ、１１１ 試料、
１１２ 第２の対物レンズ、１１３ 光学フィルタ、１１４ ダイクロイックミラー、
１１５、１１６ レンズ、１１７、１１８ ＣＣＤカメラ、１１９ 画像処理装置、
２０１ 第二高調波、２０２ 多光子励起蛍光、２０３ 入射光、３０１ ＣＣＤカメラ、
３０２ 遅延回路、３０３ イメージ・インテンシファイア、３０４ ＣＣＤ、
３０５ 制御・駆動部、３０６ ミラー、４０１ 入射光、４０２ 第二高調波、
４０３ 多光子励起蛍光、４０４ ゲート開口タイミング、
５０１、６０１、７０１ マイクロレンズ・アレイ・ディスク、
５０２、６０２、７０２ マイクロレンズ・アレイ、
５０３、７０３ レーザ・スポット、８００ プリチャーパ

Claims (10)

1. レーザ光源と、
   前記レーザ光源からの光を試料に集光するレンズと、
   前記試料から発生した第二高調波と多光子励起光とを波長差を利用して分離する手段と、
   前記分離された第二高調波を観察のために受光する手段と、
   前記分離された多光子励起光を観察のために受光する手段と、
   を備える、レーザ顕微鏡。
2. 前記波長差を利用して分離する手段はダイクロイックミラーであり、前記試料から発生した光の第二高調波と多光子励起光のうちの一方を反射し他方を透過する、請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
3. さらに、前記試料からの光を集めるための対物レンズを備え、
   前記対物レンズと前記試料に集光するレンズとの間に、前記試料が配置される、請求項１又は２に記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記第二高調波を観察のために受光する手段と多光子励起光を観察のために受光する手段は、それぞれ受光した光を電気信号に変換する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡。
5. 前記波長差を利用して分離する手段によって分離された第二高調波と多光子励起光とを、さらに発生タイミング差を利用して分離する手段を備える請求項１乃至４のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡。
6. レーザ光源と、
   前記レーザ光源からの光を試料に集光するレンズと、
   前記試料から発生した第二高調波と多光子励起光とを発生タイミング差を利用して分離する手段と、
   前記分離された第二高調波もしくは多光子励起光を観察のために受光する手段と、
   を備える、レーザ顕微鏡。
7. 前記分離する手段は、前記試料から発生した前記第二高調波を透過し、前記多光子励起光を遮断するタイミングで開閉するゲートを備え、前記受光する手段は受光した光を電気信号に変換する、請求項６に記載のレーザ顕微鏡。
8. 前記ゲートは、前記レーザ光源のパルス出力タイミングに同期して予め定められた時間開くことによって、前記第二高調波を透過し、前記多光子励起光を遮断する、請求項７に記載のレーザ顕微鏡。
9. 前記ゲートは、前記レーザ光源のパルス出力タイミングと所定の遅延をもって同期する、請求項８に記載のレーザ顕微鏡。
10. さらに、光学系の分散によるパルス幅の広がりを抑制するプリチャーパを備える、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡。

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