JPH09318881A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 対物レンズ等の光学系の設計が容易で、自家
蛍光の発生が少なく、蛍光像と透過光像とを実質的に同
時に取得することができる蛍光顕微鏡を提供する。 【解決手段】 励起光源１０から出力されビームスプリ
ッタ１１および１２を透過したパルス励起光Ａ１は試料
３０に照射され、その試料３０から蛍光Ｂが発生する。
一方、ビームスプリッタ１１で反射したパルス励起光Ａ
２は蛍光色素２０に照射され蛍光を発生させ、その蛍光
はパルス照明光Ｃとして試料３０に照射され透過光Ｄを
発生させる。ここで、パルス照明光Ｃすなわち透過光Ｄ
は、蛍光Ｂの波長と略同一の波長であり、また、透過光
Ｄは、蛍光Ｂが発生する時刻とは異なる時刻に発生す
る。ゲート駆動装置５５からのタイミング信号に基づい
て、蛍光Ｂの光像はカメラ５０により撮像され、透過光
Ｄの光像はカメラ５１により撮像される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料の蛍光像およ
び透過光像の双方を取得することができる蛍光顕微鏡に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、光学顕微鏡を用いて或る特定
の同一の試料について蛍光像および透過光像の双方を取
得することが望まれている。例えば、透過光像に基づい
て試料の外観を捉え、蛍光像に基づいて、その試料のど
の部位から蛍光が発生しているかを観察するような場合
である。このような蛍光像および透過光像の双方を取得
する光学顕微鏡として幾つかのタイプのものが知られて
いる。

【０００３】図３は、第１の従来技術による光学顕微鏡
の構成図である。この光学顕微鏡では、シャッタ１１１
が開いているときに、励起光源１１０から出力された励
起光Ａは、ダイクロイックミラー１１２および対物レン
ズ１１３を経て試料１３０に照射され、試料１３０で発
生した蛍光Ｂは、対物レンズ１１３およびダイクロイッ
クミラー１１２を経てカメラ１５０により撮像される。
また、シャッタ１２１が開いているときには、照明光源
１２０から出力された照明光Ｃは、反射鏡１２２および
コンデンサレンズ１２３を経て試料１３０に照射され、
その照明光Ｃが試料１３０を透過して形成された透過光
Ｄは、対物レンズ１１３およびダイクロイックミラー１
１２を経てカメラ１５０により撮像される。そして、シ
ャッタ１１１および１２１それぞれの開閉動作は、蛍光
Ｂと透過光Ｄとが同時に発生しないようにするととも
に、画像処理装置１６０によって、カメラ１５０により
撮像された蛍光像および透過光像は、その開閉動作のタ
イミングに基づいて互いに分離される。

【０００４】図４は、第２の従来技術による光学顕微鏡
の構成図である。この光学顕微鏡では、励起光源２１０
から出力された励起光Ａは、ダイクロイックミラー２１
１および対物レンズ２１２を経て試料２３０に照射さ
れ、試料２３０で発生した蛍光Ｂは、対物レンズ２１
２、ダイクロイックミラー２１１、ダイクロイックミラ
ー２４０および反射鏡２４１を経て、カメラ２５０によ
り撮像される。また、照明光源２２０から出力された照
明光Ｃは、反射鏡２２１およびコンデンサレンズ２２２
を経て試料２３０に照射され、その照明光Ｃが試料２３
０を透過して形成された透過光Ｄは、対物レンズ２１
２、ダイクロイックミラー２１１、ダイクロイックミラ
ー２４０、反射鏡２４２および反射鏡２４３を経て、カ
メラ２５１により撮像される。すなわち、蛍光像はカメ
ラ２５０により取得され、透過光像はカメラ２５１によ
り取得される。なお、この光学顕微鏡の場合には、ダイ
クロイックミラー２４０により蛍光Ｂと透過光Ｄとを分
離する必要があることから、照明光Ｃは、蛍光Ｂの波長
とは異なる波長であることが必要である。

【０００５】図５は、第３の従来技術による光学顕微鏡
の構成図である。この光学顕微鏡では、励起光源３１０
から出力された励起光Ａは、ダイクロイックミラー３１
１および対物レンズ３１２を経て試料３３０に照射さ
れ、試料３３０で発生した蛍光Ｂは、対物レンズ３１２
およびダイクロイックミラー３１１を経てカメラ３５０
により撮像される。また、励起光Ａが試料３３０を透過
して形成された透過光Ｄは、対物レンズ３４０を経てカ
メラ３５１により撮像される。すなわち、蛍光像はカメ
ラ３５０により取得され、透過光像はカメラ３５１によ
り取得される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来技術には以下のような問題点がある。すなわち、第１
の従来技術（図３）では、蛍光像を取得するためにはシ
ャッタ１２１を閉じてシャッタ１１１を開き、透過光像
を取得するためにはシャッタ１１１を閉じてシャッタ１
２１を開く必要がある。しかし、このシャッタ１１１お
よび１２１それぞれの開閉操作を人手で行うことから、
蛍光像の取得時刻と透過光像の取得時刻とは一致せず、
同一時刻・同一状態における試料１３０の蛍光像および
透過光像を取得することはできない。特に、試料１３０
が生体試料のように動く場合には、この問題は大きい。
また、蛍光Ｂの波長と透過光Ｄの波長（すなわち照明光
Ｃの波長）とは一般には異なることから、対物レンズ１
１３の結像特性を損なうことなく設計することが困難で
あるという問題点もある。

【０００７】第２の従来技術（図４）では、同一時刻・
同一状態における試料２３０の蛍光像および透過光像を
取得することはできる。しかし、蛍光像と透過光像とを
同時に取得するために、蛍光Ｂの波長と透過光Ｄの波長
とを第１の従来技術の場合よりも更に大きく異なるもの
にする必要がある。このことから、対物レンズ２１２の
結像特性を損なうことなく設計することは更に困難にな
り、特に自家蛍光の小さいな光学レンズを使用して設計
することは不可能であり、対物レンズ２１２から発生す
る自家蛍光量が大きくなるという問題点がある。

【０００８】第３の従来技術（図５）は、共焦点顕微鏡
としては一応の成功が見られている。しかし、共焦点顕
微鏡であるが故に、第１の従来技術の場合と同様に、対
物レンズ３１２の設計上の問題点がある。また、蛍光像
および透過光像を取得するには試料３３０と光軸とを相
対的に走査する必要があるため、蛍光像および透過光像
を高速に取得することができないという問題点もある。
もし、共焦点顕微鏡方式を採用しないとすれば、蛍光像
を取得するための対物レンズ３１２と透過光像を取得す
るための対物レンズ３４０とは別個のものであるため
に、対物レンズ３１２および３４０それぞれの結像特性
を同一のものとして蛍光像と透過光像とを合致させる必
要がある。また、試料３３０が立体的なものである場合
には、蛍光像と透過光像とは、試料３３０の同一箇所に
関するものではないという問題点もある。

【０００９】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、対物レンズ等の光学系の設計が容易
で、自家蛍光の発生が少なく、蛍光像と透過光像とを実
質的に同時に取得することができる蛍光顕微鏡を提供す
ることを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光顕微鏡
は、(1) パルス励起光を出力する励起光源と、(2) 励起
光源から出力されたパルス励起光を導いて試料の所定領
域に照射する励起光学系と、(3) パルス励起光が試料に
照射されたときに発生する蛍光の波長と略同一の波長の
パルス照明光を、パルス励起光の出力タイミングに同期
して出力する照明光源と、(4) 照明光源から出力された
パルス照明光を導いて、パルス励起光が試料に照射され
て蛍光が発生する時刻とは異なる時刻に、パルス照明光
を試料の所定領域の裏面に照射する照明光学系と、(5)
パルス励起光が試料に照射されて発生する蛍光と、パル
ス照明光が試料に照射されて透過する透過光とを入力
し、蛍光および透過光それぞれの光像を結像する結像光
学系と、(6) パルス励起光の出力タイミングに基づい
て、蛍光の光像の取得タイミングを指示する蛍光像取得
タイミング信号と、透過光の光像の取得タイミングを指
示する透過光像取得タイミング信号とを出力するタイミ
ング制御手段と、(7) 蛍光像取得タイミング信号および
透過光像取得タイミング信号それぞれに基づいて、蛍光
および透過光それぞれの光像を取得する光像取得手段
と、を備えることを特徴とする。

【００１１】この蛍光顕微鏡によれば、励起光源から出
力されたパルス励起光は、励起光学系を経て試料の所定
領域に照射され、その試料から蛍光が発生する。一方、
照明光源から出力されたパルス照明光は、照明光学系を
経て試料の所定領域の裏面に照射されて試料を透過し、
透過光が発生する。ここで、パルス照明光すなわち透過
光は、蛍光の波長と略同一の波長であり、また、透過光
は、蛍光が発生する時刻とは異なる時刻に発生する。こ
の蛍光および透過光は、結像光学系により結像され、タ
イミング制御手段から出力される蛍光像取得タイミング
信号および透過光像取得タイミング信号それぞれに基づ
いて、それぞれの光像が光像取得手段により取得され
る。

【００１２】結像光学系は、蛍光および透過光の双方を
分岐する結像分岐手段を備え、蛍光および透過光の双方
の光像を互いに異なる第１および第２の位置それぞれに
結像し、光像取得手段は、第１の位置に結像された蛍光
の光像を蛍光像取得タイミング信号に基づいて撮像する
蛍光像撮像手段と、第２の位置に結像された透過光の光
像を透過光像取得タイミング信号に基づいて撮像する透
過光像撮像手段と、を備えることとしてもよい。この場
合、蛍光および透過光の双方は、結像分岐手段により分
岐されて、蛍光および透過光の双方の光像は、互いに異
なる第１および第２の位置それぞれに結像され、そし
て、第１の位置に結像された蛍光の光像は、蛍光像取得
タイミング信号に基づいて蛍光像撮像手段により撮像さ
れ、第２の位置に結像された透過光の光像は、透過光像
取得タイミング信号に基づいて透過光像撮像手段により
撮像される。

【００１３】結像光学系は、蛍光および透過光の双方の
光像を略同一の位置に結像し、光像取得手段は、蛍光お
よび透過光の双方の光像を撮像する撮像手段と、撮像さ
れた蛍光および透過光それぞれの光像を蛍光像取得タイ
ミング信号および透過光像取得タイミング信号に基づい
て互いに時間分離する光像分離手段と、を備えることと
してもよい。この場合、蛍光および透過光の双方の光像
は撮像手段により撮像され、撮像された蛍光および透過
光それぞれの光像は、蛍光像取得タイミング信号および
透過光像取得タイミング信号に基づいて光像分離手段に
より互いに時間分離される。

【００１４】励起光学系は、励起光源から出力されたパ
ルス励起光の一部を分岐する励起光分岐手段を備え、照
明光源は、励起光分岐手段から分岐されたパルス励起光
の照射により発生する蛍光をパルス照明光として出力す
る蛍光色素を備えることとしてもよい。この場合、励起
光分岐手段から分岐されたパルス励起光の照射に基づい
て、パルス照明光は蛍光色素から出力されるので、パル
ス励起光とパルス照明光とは、それぞれの光路長差に応
じた時間差で試料に到達する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。図１は、本発明に係る蛍光顕微鏡の構成図であ
る。

【００１６】励起光源１０は、試料３０に照射すべきパ
ルス励起光を出力するものであり、例えば、パルスレー
ザ光源が好適に用いられる。この励起光源１０から出力
されたパルス励起光は、ビームスプリッタ（励起光分岐
手段）１１、ビームスプリッタ１２、ダイクロイックミ
ラー１３および対物レンズ１４からなる励起光学系を経
て、試料３０の表面の所定領域に照射される。すなわ
ち、ビームスプリッタ１１は、励起光源１０から出力さ
れたパルス励起光の一部を透過させ残部を反射させて２
分岐し、ビームスプリッタ１２は、このビームスプリッ
タ１１を透過したパルス励起光を更に２分岐する。ダイ
クロイックミラー１３は、このビームスプリッタ１２を
透過したパルス励起光Ａ１を反射させ、対物レンズ１４
は、そのパルス励起光Ａ１を集光して、試料３０の所定
領域に照射する。なお、このダイクロイックミラー１３
は、パルス励起光Ａ１を反射させ、試料３０から発生す
る蛍光Ｂを透過させるものである。

【００１７】パルス励起光Ａ１が試料３０に照射される
と、試料３０に含まれる蛍光物質から蛍光Ｂが発生す
る。この蛍光Ｂは、対物レンズ１４、ダイクロイックミ
ラー１３、ビームスプリッタ（結像分岐手段）４０およ
び反射鏡４１〜４３からなる結像光学系を経て、カメラ
５０（蛍光像撮像手段）およびカメラ（透過光像撮像手
段）５１それぞれの撮像面上に結像される。すなわち、
対物レンズ１４は、試料３０の所定領域で発生した蛍光
Ｂを入力して通過させ、ダイクロイックミラー１３は、
対物レンズ１４から出力された蛍光Ｂを透過させ、ビー
ムスプリッタ４０は、蛍光Ｂの一部を反射させ残部を透
過させる。そして、反射鏡４１は、ビームスプリッタ４
０で反射した蛍光Ｂを反射させ、カメラ５０の撮像面上
に蛍光Ｂの光像を結像する。また、反射鏡４２および４
３それぞれは、ビームスプリッタ４０を透過した蛍光Ｂ
を順次反射させ、カメラ５１の撮像面上に蛍光Ｂの光像
を結像する。

【００１８】一方、ビームスプリッタ１１で反射された
パルス励起光Ａ２は、所定の長さの光ファイバ１５を経
て、蛍光色素２０に照射される。この光ファイバ１５
は、試料３０で蛍光Ｂが発生する時刻と、後述する透過
光Ｄが発生する時刻とが重ならないように、パルス励起
光Ａ２に適当な遅延を与える遅延光学系として用いられ
ている。

【００１９】蛍光色素２０は、パルス励起光Ａ２が照射
されると蛍光を発生し、その蛍光を試料３０に照射され
るべきパルス照明光Ｃとして出力する照明光源として用
いられるものである。このパルス照明光Ｃの波長は、パ
ルス励起光Ａ１が試料３０に照射されて発生する蛍光Ｂ
の波長と略同一である。なお、蛍光色素２０として、試
料３０に含まれている蛍光色素と同一のものが用いられ
ると、パルス照明光Ｃの波長と蛍光Ｂの波長とが一致す
るので最も好適である。

【００２０】蛍光色素２０から出力されたパルス照明光
Ｃは、反射鏡２１およびコンデンサレンズ２２からなる
照明光学系を経て、試料３０の裏面の所定領域に照射さ
れる。このコンデンサレンズ２２の光軸は、対物レンズ
１４の光軸と略一致している。したがって、パルス照明
光Ｃが照射される試料３０の所定領域は、パルス励起光
Ａ１が照射される試料３０の所定領域と略同一であり、
また、パルス照明光Ｃが試料３０を透過して出てくる透
過光Ｄは、蛍光Ｂと同様に結像光学系に入射し、この結
像光学系を経て、その光像がカメラ５０およびカメラ５
１それぞれの撮像面上に結像される。なお、図１では、
説明の便宜のため、試料３０とビームスプリッタ４０と
の間におけるパルス励起光Ａ１、蛍光Ｂおよび透過光Ｄ
それぞれの光軸は、互いにずれて記されているが、実際
には一致する。

【００２１】カメラ５０および５１それぞれの撮像面位
置にはゲート５２および５３それぞれが設けられてい
る。ゲート５２は、カメラ５０の撮像面上に透過光Ｄの
光像が結像されているときに閉じ、カメラ５０の撮像面
上に蛍光Ｂの光像が結像されているときに開く。一方、
ゲート５３は、カメラ５１の撮像面上に蛍光Ｂの光像が
結像されているときに閉じ、カメラ５１の撮像面上に透
過光Ｄの光像が結像されているときに開く。したがっ
て、カメラ５０は蛍光Ｂの光像のみを撮像し、カメラ５
１は透過光Ｄの光像のみを撮像する。

【００２２】このゲート５２および５３それぞれの開閉
動作は、ゲート駆動装置（タイミング制御手段）５５か
ら出力される蛍光像取得タイミング信号および透過光像
取得タイミング信号それぞれにより制御され、ゲート駆
動装置５５は、光検出器５４からの出力信号に同期して
蛍光像取得タイミング信号および透過光像取得タイミン
グ信号を出力し、光検出器５４は、ビームスプリッタ１
２により反射されたパルス励起光の一部を受光して、そ
の受光量に応じた出力信号を出力する。すなわち、ゲー
ト５２および５３それぞれの開閉動作は、パルス励起光
の出力タイミングに同期して制御される。

【００２３】そして、画像処理装置６０は、このように
してカメラ５０および５１それぞれにより撮像された蛍
光Ｂおよび透過光Ｄそれぞれの光像を入力して、所定の
画像処理を行う。

【００２４】次に、この蛍光顕微鏡の作用について図２
を用いて説明する。図２は、本発明に係る蛍光顕微鏡に
おける蛍光像および透過光像それぞれの結像タイミング
と撮像タイミングの説明図である。なお、図２（ａ）〜
（ｇ）それぞれの横軸は、同一の時間軸で記してある。

【００２５】励起光源１０から出力されたパルス励起光
のうち、ビームスプリッタ１１を透過しビームスプリッ
タ１２で反射されたパルス励起光は、光検出器５４によ
り検出される。この光検出器５４が受光するパルス励起
光の光量、すなわち、光検出器５４からの出力信号は、
図２（ａ）に示すように一定周期Ｔで変化する。

【００２６】また、励起光源１０から出力されたパルス
励起光のうち、ビームスプリッタ１１および１２を透過
したパルス励起光Ａ１は、ダイクロイックミラー１３で
反射され、対物レンズ１４により集光されて、試料３０
の所定領域に照射される。試料３０の所定領域にパルス
励起光Ａ１が照射されて発生した蛍光Ｂは、対物レンズ
１４、ダイクロイックミラー１３、ビームスプリッタ４
０および反射鏡４１〜４３を経て、カメラ５０および５
１それぞれの撮像面に結像される。

【００２７】一方、励起光源１０から出力されたパルス
励起光のうち、ビームスプリッタ１１で反射されたパル
ス励起光Ａ２は、光ファイバ１５を経て蛍光色素２０に
入射して蛍光を発生させる。その蛍光色素２０から発生
した蛍光である照明光Ｃは、反射鏡２１で反射され、コ
ンデンサレンズ２２により集光されて、試料３０の所定
領域に裏面から照射される。そして、試料３０の所定領
域に照明光Ｃが照射されて発生した透過光Ｄは、対物レ
ンズ１４、ダイクロイックミラー１３、ビームスプリッ
タ４０および反射鏡４１〜４３を経て、カメラ５０およ
び５１それぞれの撮像面に結像される。

【００２８】このようにしてカメラ５０および５１それ
ぞれの撮像面に到達する光（蛍光Ｂおよび透過光Ｄ）の
光量の変化は、図２（ｂ）および（ｃ）それぞれに示す
ようになる。これらの図に示すように、カメラ５０およ
び５１それぞれの撮像面に蛍光Ｂおよび透過光Ｄそれぞ
れが到達するタイミングは、光検出器５４がパルス励起
光を受光するタイミング（図２（ａ））に対して、同一
ではなく一定の遅延時間がある。この遅延は、ビームス
プリッタ１１から光検出器５４に至るまでの光路長と、
ビームスプリッタ１１から試料３０までの光路長および
試料３０からカメラ５０の撮像面までの光路長の和と、
ビームスプリッタ１１から蛍光色素２０を経てカメラ５
１の撮像面に至るまでの光路長との間の相互間の差に因
るものである。

【００２９】また、光ファイバ１５によりパルス励起光
Ａ２に適当な遅延が与えられているので、試料３０にお
いて蛍光Ｂおよび透過光Ｄそれぞれが発生する時刻は互
いに重なることはなく、したがって、カメラ５０および
５１それぞれの撮像面には、蛍光Ｂの光像および透過光
Ｄの光像が、互いに異なる時刻に結像されることにな
る。

【００３０】そして、ゲート５２は、ゲート駆動装置５
５から出力される蛍光像取得タイミング信号により開閉
制御されて、図２（ｄ）に示すように、カメラ５０の撮
像面に蛍光Ｂの光像が結像しているときには開き、透過
光Ｄの光像が結像しているときには閉じるので、蛍光Ｂ
の光像のみが、カメラ５０により撮像される（図２
（ｆ））。一方、ゲート５３は、ゲート駆動装置５５か
ら出力される透過光像取得タイミング信号により開閉制
御されて、図２（ｅ）に示すように、カメラ５１の撮像
面に透過光Ｄの光像が結像しているときには開き、蛍光
Ｂの光像が結像しているときには閉じるので、透過光Ｄ
の光像のみが、カメラ５１により撮像される（図２
（ｇ））。

【００３１】この蛍光顕微鏡によれば、励起光源１０か
ら出力されるパルス励起光の周期Ｔが短いほど、カメラ
５０により撮像される蛍光Ｂの光像とカメラ５１により
撮像される透過光Ｄの光像とは、実質的に同時に取得さ
れたものと言うことができる。特に、試料３０が生体試
料であってその動きが速い場合には、周期Ｔは短いほど
好ましい。ただし、カメラ５０および５１それぞれの撮
像面に結像される蛍光Ｂおよび透過光Ｄとが時間的に分
離可能であることが必要であるので、周期Ｔは、蛍光Ｂ
が発生している時間と透過光Ｄ（すなわち照明光Ｃ）が
発生している時間との和より大きい必要がある。

【００３２】また、蛍光Ｂおよび透過光Ｄ（すなわち照
明光Ｃ）それぞれの波長は略同一であり、特に、試料３
０に含まれる蛍光色素と同一のものを蛍光色素２０とし
て用いる場合には両波長は全く同一であるので、対物レ
ンズ１４は、この波長に関してのみ結像特性を最適に設
計するだけで十分であり、光学系の設計が容易となる。

【００３３】さらに、対物レンズ１４から発生する自家
蛍光を最小限に抑えることができるので、ノイズの少な
い蛍光像を撮像することができる。特に、対物レンズ１
４として、パルス励起光Ａ１を試料３０に集光照射する
ためのレンズと、試料３０から発生した蛍光を入射する
ためのレンズとが、互いに分離されて同心円状に配され
ている暗視野対物レンズを用いれば、パルス励起光Ａ１
と蛍光Ｂとの光路は分離されるので、カメラ５０および
５１に到達する自家蛍光は極めて少なくなる。

【００３４】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、励起光源１
０として、連続発振の光源と高速チョッパとを用いて、
パルス励起光を出力してもよい。この場合には、光検出
器５４は不要であり、ゲート駆動装置５５は、この高速
チョッパによるパルス励起光発生タイミングに同期し
て、蛍光像取得タイミング信号および透過光像取得タイ
ミング信号を出力すればよい。

【００３５】また、遅延光学系として、上記実施形態で
は光ファイバ１５が用いられたが、組み合わせられた複
数の反射鏡で構成されてもよい。この場合、その複数の
反射鏡の間で光が反射されることにより光路長が長くな
り、その光路長に応じた遅延が設定されることになる。

【００３６】また、遅延光学系は、上記実施形態ではパ
ルス励起光Ａ２の光路上に設けられたが、パルス励起光
Ａ１の光路上に設けられてパルス励起光Ａ１に遅延を与
えてもよいし、パルス照明光Ｃの光路上に設けられてパ
ルス照明光Ｃに遅延を与えてもよい。要は、試料３０で
発生する蛍光Ｂおよび透過光Ｄそれぞれが互いに異なる
時刻に発生するように、パルス励起光Ａ１およびパルス
照明光Ｃそれぞれを所定時間差で試料３０に照射するこ
とである。

【００３７】また、蛍光色素２０に替えてパルス照明光
Ｃを出力する照明光源と、励起光源１０およびその照明
光源それぞれの出力を制御する制御装置とを備えて、励
起光源からのパルス励起光Ａ１と照明光源からのパルス
照明光Ｃとを所定時間差で同期して出力するようにして
もよい。なお、ここでも照明光源から出力されるパルス
照明光Ｃの波長は、試料３０にパルス励起光Ａ１が照射
されて発生する蛍光Ｂの波長と略同一である必要があ
る。この照明光源として色素レーザを用いるのが好適で
ある。

【００３８】また、上記実施形態においては、蛍光像お
よび透過光像それぞれを撮像するために２台のカメラ５
０および５１を備えたが、１台のカメラでもよい。この
場合には、その１台のカメラが蛍光像および透過光像を
撮像し、画像処理装置６０は、ゲート駆動装置５５から
出力される蛍光像取得タイミング信号および透過光像取
得タイミング信号それぞれに基づいて、カメラが撮像し
た光像を蛍光像と透過光像とに分離する。

【００３９】さらに、ゲート駆動装置５５によるゲート
５２の開閉タイミングをずらしながらカメラ５０により
蛍光Ｂの光像を撮像してもよい。この場合には、時間分
解蛍光画像を取得することができる。

【００４０】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、励起光源から出力されたパルス励起光は、励起光
学系を経て試料の所定領域に照射され、その試料から蛍
光が発生する。一方、照明光源から出力されたパルス照
明光は、照明光学系を経て試料の所定領域に裏面から照
射されて試料を透過し、透過光が発生する。ここで、パ
ルス照明光すなわち透過光は、蛍光の波長と略同一の波
長であり、また、透過光は、蛍光が発生する時刻とは異
なる時刻に発生する。この蛍光および透過光は、結像光
学系により結像され、タイミング制御手段から出力され
る蛍光像取得タイミング信号および透過光像取得タイミ
ング信号それぞれに基づいて、それぞれの光像が光像取
得手段により取得される。

【００４１】このように、パルス励起光およびパルス照
明光それぞれにより蛍光像および透過光像それぞれを互
いに異なる時刻に生成する構成としたので、蛍光像およ
び透過光像を実質的に同時に取得することができる。試
料が生体試料であってその動きが速い場合であっても、
その試料の蛍光像および透過光像を実質的に同時に取得
することができる。また、試料から発生する蛍光および
透過光の波長は略同一であるので、結像光学系、特に対
物レンズは、その波長に関してのみ結像特性を最適に設
計するだけで十分であり設計が容易となる。さらに、自
家蛍光を最小限に抑えることができるので、ノイズの少
ない蛍光像を取得することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る蛍光顕微鏡の構成図である。

【図２】本発明に係る蛍光顕微鏡における蛍光像および
透過光像それぞれの結像タイミングと撮像タイミングの
説明図である。

【図３】第１の従来技術による光学顕微鏡の構成図であ
る。

【図４】第２の従来技術による光学顕微鏡の構成図であ
る。

【図５】第３の従来技術による光学顕微鏡の構成図であ
る。

【符号の説明】

１０…励起光源、１１，１２…ビームスプリッタ、１３
…ダイクロイックミラー、１４…対物レンズ、１５…光
ファイバ、２０…蛍光色素、２１…反射鏡、２２…コン
デンサレンズ、３０…試料、４０…ビームスプリッタ、
４１，４２，４３…反射鏡、５０，５１…カメラ、５
２，５３…ゲート、５４…光検出器、５５…ゲート駆動
装置、６０…画像処理装置。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パルス励起光を出力する励起光源と、 前記励起光源から出力された前記パルス励起光を導いて
   試料の所定領域に照射する励起光学系と、 前記パルス励起光が前記試料に照射されたときに発生す
   る蛍光の波長と略同一の波長のパルス照明光を、前記パ
   ルス励起光の出力タイミングに同期して出力する照明光
   源と、 前記照明光源から出力された前記パルス照明光を導い
   て、前記パルス励起光が前記試料に照射されて蛍光が発
   生する時刻とは異なる時刻に、前記パルス照明光を前記
   試料の前記所定領域の裏面に照射する照明光学系と、 前記パルス励起光が前記試料に照射されて発生する蛍光
   と、前記パルス照明光が前記試料に照射されて透過する
   透過光とを入力し、前記蛍光および前記透過光それぞれ
   の光像を結像する結像光学系と、 前記パルス励起光の出力タイミングに基づいて、前記蛍
   光の光像の取得タイミングを指示する蛍光像取得タイミ
   ング信号と、前記透過光の光像の取得タイミングを指示
   する透過光像取得タイミング信号とを出力するタイミン
   グ制御手段と、 前記蛍光像取得タイミング信号および前記透過光像取得
   タイミング信号それぞれに基づいて、前記蛍光および前
   記透過光それぞれの光像を取得する光像取得手段と、 を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記結像光学系は、前記蛍光および前記
   透過光の双方を分岐する結像分岐手段を備え、前記蛍光
   および前記透過光の双方の光像を互いに異なる第１およ
   び第２の位置それぞれに結像し、 前記光像取得手段は、前記第１の位置に結像された前記
   蛍光の光像を前記蛍光像取得タイミング信号に基づいて
   撮像する蛍光像撮像手段と、前記第２の位置に結像され
   た前記透過光の光像を前記透過光像取得タイミング信号
   に基づいて撮像する透過光像撮像手段と、を備える、 ことを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
3. 【請求項３】 前記結像光学系は、前記蛍光および前記
   透過光の双方の光像を略同一の位置に結像し、 前記光像取得手段は、前記蛍光および前記透過光の双方
   の光像を撮像する撮像手段と、撮像された前記蛍光およ
   び前記透過光それぞれの光像を前記蛍光像取得タイミン
   グ信号および前記透過光像取得タイミング信号に基づい
   て互いに時間分離する光像分離手段と、を備える、 ことを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
4. 【請求項４】 前記励起光学系は、前記励起光源から出
   力された前記パルス励起光の一部を分岐する励起光分岐
   手段を備え、 前記照明光源は、前記励起光分岐手段から分岐された前
   記パルス励起光の照射により発生する蛍光を前記パルス
   照明光として出力する蛍光色素を備える、 ことを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。