JP2021529991A

JP2021529991A - フォトスイッチング及び定在波照明技術を用いた顕微鏡における改善された軸分解能のためのシステム及び方法

Info

Publication number: JP2021529991A
Application number: JP2020573194A
Authority: JP
Inventors: ハリシュロフ; ジョンポールジャンニーニ; イーコンウー; リヴィエールパトリックジーンラ; ミングオ; ジージーチェン; ハルシャドヴィシュヴァースラオ
Original assignee: ザユナイテッドステイツオブアメリカ，アズリプレゼンテッドバイザセクレタリー，デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2021-11-04
Also published as: EP3799622A4; US20210271060A1; EP3799622A1; WO2020009902A1; CN112639448A

Abstract

光スイッチング及び定在波照明技術を使用する顕微鏡における、軸分解能を改善するためのシステム及び方法の様々な実施形態が説明されている。【選択図】図３

Description

本開示は、一般に、顕微鏡における軸分解能の改善に関するものであり、特に、フォトスイッチング及び定在波照明技術を用いた即時構造化照明顕微鏡（instant structured illumination microscopy）における軸分解能の改善のためのシステム及び方法に関する。

従来の広視野蛍光顕微鏡におけるアクセス可能な軸空間周波数（すなわち分解能）を上げる既知の方法の１つは、定在波照明を使用することである。この方法では、反対方向に伝搬する２つのコヒーレントビームを結像焦点面で重ね合わせる。ビーム間の干渉は、λ／（２ｎｃｏｓΘ）で与えられる周期性を有する鋭い周期的な照明フリンジをもたらす。ここで、λは照明波長、ｎは媒体のインデックス、Θはビームの「交差角」、すなわち図１Ａに示す垂直に対する角度である。図示のように、２つのビームは、垂直軸（垂直光軸を表す破線）に対して共通の角度Θで交差する。

図１Ｂを参照すると、例示的な顕微鏡セットアップ１０は、対物レンズ１２と、結果として生じる干渉パターンが鋭い暗／明強度のフリンジを示す反対方向に伝搬するビームを形成するミラー１４との配置で示されている。例えば、θ＝０、ｎ＝１．３３、及びλ＝４０５ｎｍの場合、フリンジ間の周期性は１５２ｎｍであり、暗／明フリンジ間の間隔は約７６ｎｍしかない。これは、原理的に、この長さスケールの構造が観察され得ることを意味する。このような干渉パターン１６は、対向する対物レンズを通して相互にコヒーレントな光ビームを導入する（又は、対物レンズを通して単一のコリメートビームを導入し、それをミラーで折り返すことによって、フリンジパターンが照明のコヒーレンス長内に形成される）ことによって設定することができる。これらの（又は概念的に類似している）照明パターンは、定在波顕微鏡、４Ｐｉ顕微鏡、及び超解像Ｉ５Ｓ顕微鏡の基礎を形成する。

薄い試料（厚さ＜λ）では、上述のように、定在波照明パターンを導入することにより、貴重なサブ回折情報を得ることができる。試料に対して定在波パターンを移動させる（すなわち定在波パターンの位相を変化させる）と、焦点面内で交互の試料領域が光る。これにより、点広がり関数の軸方向の広がりよりも細かい軸方向の特徴を識別することができる。しかし、実質的に厚い試料については、３つの問題が生じる。第１に、焦点外蛍光は、焦点内信号を弱めることができる。第２に、高周波干渉パターンの反復する軸方向の性質は、「どのフリンジがどのフリンジであるか」についての曖昧さ、すなわち、点広がり関数（ＰＳＦ）内のフリンジが、再構成画像内にリンギングアーティファクトを生成することを意味する（この問題の別の説明は、照明の高周波が顕微鏡の通過帯域にエイリアシングされることである）。第３に、定在波の周波数ｆが顕微鏡の光伝達関数（ＯＴＦ）の帯域制限（band limit）の外にあるので、再構成された画像に存在する中間周波数「ギャップ」がある。

定在波照明を用いた場合の周波数ギャップを図２Ａ、２Ｂに示す。図２Ａを参照すると、インスタントＳＩＭ照明を使用する場合のＸＺＯＴＦ（ｋｚ、縦方向、ｋｘ、横方向）の例が示されている。軸回折限界は白色楕円の境界によって与えられる。図２Ｂを参照すると、定在波照明を使用する場合、例えば、まず、空間周波数ｆ及び異なる位相を有する定在波で分子を光活性し（エイリアシング問題を解決し）、インスタントＳＩＭシステムを用いて光活性化分子を画像化し、そして、結果の画像をデコンボリューションすることによる、ＯＴＦが示されている。これで、ＯＴＦの追加のコピーが、＋／−ｆを中心に、ＤＣコンポーネント（赤い点）のオリジナルＯＴＦに加えて存在する。軸空間分解能は向上するが、中間の空間周波数ではかなりのギャップが存在する。これらのギャップは、ｆが帯域制限の外側にあるため、基礎となる顕微鏡の検出ＯＴＦによって「カバー」されない。

これらの後の２つの問題は、従来の４Ｐｉ顕微鏡では解決されていないが、複雑な３ビーム干渉パターン、励起光と発光光の両方の干渉、及び失われた軸空間周波数を「埋め（fill in）」、それらを周波数空間の適切な位置に再割り当てするために焦点面ごとの複数の画像を使用するＩ５Ｓシステムで対処されている。

しかし、Ｉ５Ｓシステムでは、次のような問題が発生する。第１に、Ｉ５Ｓシステムは、これまでのところ、二対物干渉法（two-objective interferometry）及び複雑なビームセットアップを必要とする。これにより、

よりもよい空間精度に合わせて、（各対物に１つの）２つの別個の経路に沿って光学系を維持する必要があるため、システムを調整及び構築が困難となる。第２に、Ｉ５Ｓシステムでは、軸分解能を向上させるために焦点面ごとに１５枚の画像が必要である。これにより、イメージングプロセスが著しく遅くなり、固定セルへのイメージングが制限される。第３に、Ｉ５Ｓシステムでは、共焦点ピンホールが採用されていないため、密にラベル付けされた試料では、焦点外光からのポアソンノイズが焦点面におけるコントラストを制限する。最後に、Ｉ５Ｓシステムのビーム照明スキームは、同じ照明スキームが軸分解能の向上と横方向分解能の向上の両方を作り出すために使用されるので、高度に特殊化されている。分解能の向上が結合されているので、この方法は共焦点幾何学に容易に適応できない。

とりわけ、これらの観察を念頭に置いて、本開示の様々な態様が考案され、開発された。

垂直軸に対して共通の角度で交差する２つのビームを示す図である。対物レンズ及びミラー配置を備えた顕微鏡セットアップの例と、結果として生じる干渉パターンを示す簡略図である。

インスタントＳＩＭを用いた場合のＸＺ光伝達関数の画像である。定在波照明を用いた場合のＸＺ光伝達関数の画像である。

定在波顕微鏡システムを示す簡略図である。

中間空間周波数を「埋める（fill in）」ための複数のパターンの使用を示す図であり、複数のパターンのそれぞれは異なる周期性を有する。

顕微鏡システムの実施形態を示す簡略ブロック図である。

増加した軸分解能を示す、図５の顕微鏡システムによって生成されたシミュレーション画像である。増加した軸分解能を示す、図５の顕微鏡システムによって生成されたシミュレーション画像である。増加した軸分解能を示す、図５の顕微鏡システムによって生成されたシミュレーション画像である。増加した軸分解能を示す、図５の顕微鏡システムによって生成されたシミュレーション画像である。増加した軸分解能を示す、図５の顕微鏡システムによって生成されたシミュレーション画像である。

異なる周期性の定在波で照明するための照明器／反射器光学系を有する顕微鏡システムの実施形態を示す簡略ブロック図である。

均一照明の画像（右）に対する異なる位相のシャープな正弦波照明の画像（左）である。対物後焦点面（objective back focal plane）を表す青色の円を示し、赤色の点は後焦点面における照明パターンを示す。試料に導入されたよりシャープな照明パターンの画像である。

定在波を生成するための中間的で最も微細な周期性の軸方向照明構造を供給する定在波顕微鏡システムの実施形態を示す簡略図である。

対応する参照符号は、図面のビュー内の対応する要素を示す。図中で用いられている見出しは、特許請求の範囲を限定するものではない。

従来の広視野蛍光顕微鏡の軸分解能は〜５００−７００ｎｍの範囲に制限されることがよく知られている。軸分解能をさらに向上させることができるシステム及び方法は、蛍光顕微鏡において非常に興味のあるものであり、そのような改善は、生物学的試料をより詳細に観察することを可能にする。これらの欠点に対処するために、各焦点面でわずか４枚の追加画像を取得し、焦点面当たり（１つの画像ではなく）合計５枚の画像を得ることによって、〜１００ｎｍまでの軸分解能を可能にするシステム及び方法に関連する様々な実施形態がここに開示される。画像の軸分解能を向上させるために必要な適度な数の追加画像を考慮すると、本システム及び方法の実施形態は、他の顕微鏡技術では現在不可能である、生細胞における持続的な体積画像化（volumetric imaging）（「４Ｄイメージング」）に適用することができる。さらに、本システム及び方法は柔軟であり、これらのタイプの顕微鏡システムの横方向分解能をさらに向上させることができる他の超解像顕微鏡と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、顕微鏡システムは、定在波で試料を活性化するために照射される試料に共役に配置された空間光変調器を含む。いくつかの実施形態では、定在波に対して、中間及び最も微細な周期性の軸方向照明構造を供給するための方法及び関連システムが開示される。いくつかの実施形態では、３重ビーム分割デバイスを使用して、試料で干渉する、単一の光ビームから３つの相互にコヒーレントな光ビームを生成し、より高い軸分解能を達成するために必要なより低い空間周波数軸方向フリンジを生成する。図面を参照すると、フォトスイッチング及び定在波照明技術を用いた顕微鏡システムの実施形態が図示され、一般的に、図３〜図９に１００、２００、３００、及び４００として示されている。
フォトスイッチング定在波照明

本システムと方法は、フォトスイッチング技術を用いて、コンパクトな定在波反射器及び照明器配置を利用して、蛍光励起及び読み出し（readout）から定在波照明を分離（decoupling）することを目的としている。これらの要素を組み合わせることで、従来よりもはるかに高速で軸方向超解像が可能となる。本システム及び方法は、顕微鏡の大きなクラス（例えばスピニングディスク共焦点顕微鏡や広視野顕微鏡）に適用することができるが、ｉＳＩＭをフォトスイッチング及び定在波照明技術と組み合わせることにより、〜１００ｎｍの軸分解能及び生細胞イメージングと一致する高いフレームレートの共焦点３Ｄ超解像顕微鏡が可能となるため、本開示は、例として、インスタント構造化照明顕微鏡（ｉＳＩＭ^４）に適用される本発明の概念を説明する。
フォトスイッチング技術を用いて、定在波照明を蛍光励起及び読み出しから分離する

ｒｓＥＧＰ２のような可逆的にスイッチング可能な蛍光分子を使用し、定在波照明器／反射器配置（後述する）を使用することによって、軸分解能の向上を基礎となる顕微鏡に「加える」ことができるので、蛍光励起及び読み出しは、多種多様な共焦点（又はその他の）顕微鏡幾何学（その励起光学系、したがって照明は、ベース顕微鏡に対して実質的に変化しないままである）を用いて実施することができる。また、典型的な蛍光励起波長に加えて活性化波長を用いることにより、λ_{ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ}＜λ_{ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ}となるため、軸分解能が若干向上する。
定在波照明器/反射器

図３を参照すると、フォトスイッチング及び定在波照明技術を利用するための顕微鏡システムの第１実施形態は１００で示され、コリメートビーム１０２を、対物レンズ１０４を透過させ、ミラー１０６を使用して、コリメートビーム１０２を反射して戻す。干渉パターン１０８は２つのコリメートビーム１０２−送信されたコリメートビーム１０２Ａ及び反射されたコリメートビーム１０２Ｂの間で発生し、定在波となる。いくつかの実施形態では、定在波パターンの位相の微細な制御は、ミラー１０６に取り付けられた圧電素子１１０を平行移動させることによって達成される。

さらに示すように、例えば、照明ビーム１０２Ａ（暗青色線）は、対物レンズ１０４とカバースリップ１１４とを透過し、カバースリップ１１４に平行に配置されたミラー１０６は、コリメートビーム１０２Ｂを反射して戻す（より明るい線）。２つのビーム間の干渉はビーム重複領域の定在波パターン１１６（赤色線）を生成する。いくつかの実施態様において、ミラー１０６に取り付けられた圧電素子（piezoelectric device）１１０は、ミラー１０６平行移動させ、定在波パターン１１６の位相の微細な制御を提供する。

上述のように、λ_{ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ}よりも実質的に小さい明／暗フリンジ間隔（例えば、上記の７６ｎｍ間隔）を生成する単一の軸上定在波パターンは、空間周波数ギャップを犠牲にしてより高い分解能を可能にし、再構成された画像にアーチファクトをもたらす。しかし、中間周波数ギャップ内に存在するより粗い間隔を有する追加パターンが用いられる場合、図４に示すように、周波数ギャップは「埋め」られ得る。現在のシステム及び方法では、それぞれ異なる周期性を持つ複数のパターンを使用して、中間空間周波数を「埋め」ている。図４の左端の列は、従来のインスタントＳＩＭシステム（示されない）において、光伝達関数（ＯＴＦ、楕円）が軸分解能を〜５００ｎｍに制限することを示す。図４の中央左の列は、周期性１５０ｎｍの定在波を使用すると、軸空間周波数が増加するが、周期性（青い点）がインスタントＳＩＭカットオフのかなり外側にあるため、中間空間周波数でギャップが生じることを示している。図４の右中央の列は、ＯＴＦコピーが周波数空間において重複するので、粗い定在波パターン（例えば、３００ｎｍ）を使用すると、周波数ギャップなしで分解能が増大することを示している。ただし、最大分解能は、細かいパターンを使用する場合よりも低くなる。図４の右端の列は、より微細な及びより粗いパターンは空間周波数を失うことなく最良の軸分解能をもたらすことを示している。

ここでの問題は、適切な周期性の追加パターンをどのように生成し、適用するかということである。本発明のシステム及び方法によれば、フリンジ間隔を変更する１つの簡単な方法は、θを変化させることである。例えば、４０５ｎｍの照明（すなわち、λ_{ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ}）、ｎ＝１．３３の場合、θ＝０度は１５２ｎｍ（フリンジ間隔７６ｎｍ）の周期性を意味し、θ=６０度は３０４ｎｍ（フリンジ間隔１５２ｎｍ）の周期性を意味する。試料面でθを迅速に変化させるために、以下のような照明設定が考案された。

図５に示すように、フォトスイッチング及び定在波照明技術を利用する顕微鏡システムの第２実施形態は２００で示され、第１ガルバノミラースキャナ（Ｇ１）２０５で反射され、第１レンズ２０６を通過し、第２ガルバノミラースキャナ（Ｇ２）２０７で反射された後、第２レンズ２０８、第３レンズＦＴＵＢＥ２１２からなる望遠鏡を介して対物レンズ（ＦＯＢＪ）２１６の後焦点面上に中継され、最終的に試料２１８に焦点を合わせる、レーザビーム２０４を生成するレーザのような照明源２０２を含む。そして、ミラー２２０は、図４のように、照明を反射して試料上に戻す。一構成では、第１ガルバノミラースキャナ（Ｇ１）２０５は、試料２１８に共役な位置に配置され、すなわち、一対のレンズ、第１レンズＦ１２０６及び第２レンズＦ２２０８（４ｆ構成で）によって、第１から中間像面ＩＩＰ２１０までが結像され、そして、一対のレンズ、ＦＴＵＢＥ２１２及びＦＯＢＪ２１６（また４ｆ構成で）によって試料２１８までが結像される。重要なことに、第１ガルバノミラー（Ｇ１）２０５を走査すると、定在波パターンが試料面２１８（θの変化）において傾斜し、これにより定在波の周期性が変化する。

中間レンズＦ２２０８及びＦＴＵＢＥ２１２は、第２ガルバノミラースキャナ（Ｇ２）２０７が対物レンズ（ＢＦＰ）２１４の後焦点面に共役であることを保証し、コリメートされたビームをＢＦＰ２１４で傾斜させるか、又はそれを試料２１８で平行移動させ、定在波が試料２１８の中心に留まることを保証する。ＩＩＰ２１０の近傍に配置されたダイクロイックミラー（不図示）は、例えば、異なる波長の励起照明及び空間的パターニングを提供し、試料からの蛍光を撮像システム（不図示）に向けるために、インスタントＳＩＭ経路に出し入れされる。

いくつかの実施形態では、第１ガルバノスキャナ（Ｇ１）２０５及び第２ガルバノスキャナ（Ｇ２）２０７は、後焦点面２１４におけるコリメート光２０４の位置及び角度の独立した制御を提供し、試料面内の角度又は位置をそれぞれ変化させる。第１ガルバノミラースキャナ（Ｇ１）２０５の角度を適切に変化させることにより、λ_{ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ}／２ｎからλ_{ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ}／（２ｎｃｏｓθＭＡＸ）の範囲の周期性のパターンを、顕微鏡システム２００によって試料面２１８で生成することができる。ここで、θＭＡＸは対物レンズによって許容される最大半角である（例えば、６４．５度（６０×１．２ＮＡの水レンズの場合））。第２ガルバノミラースキャナ（Ｇ２）２０７の角度を適切に変化させることによって、パターンを試料面２１８で平行移動させ、これらのパターンが試料２２０を確実に照らすようにすることができる。

ミラー反射器を備えた顕微鏡システム２００のこの「単一対物レンズ」セットアップのさらなる利点は、顕微鏡システム２００のアラインメントが、古典的な２対物レンズセットアップ（例えば、Ｉ５Ｓ又は４Ｐｉ顕微鏡システムで使用される）よりもはるかに、安定し、機械的／熱的ドリフトに対して耐性がある可能性が高いことである。直接ビームと反射ビームの両方に共通の光路が使用されるため、試料からミラーまでの距離のみをλ内に安定して保つ必要がある。

それにもかかわらず、セットアップは、いくつかの実施形態において、対物又は資料ステージに追加され得るオートフォーカス又は「フォーカスロック」モジュール（自作又は市販）から利益を得ることができる。

最後に、フォトスイッチング技術と、上記概説した顕微鏡システム２００の照明／反射器のセットアップとを組み合わせることができる取得及び処理スキームのいくつかの実施形態を、以下でより詳細に説明する。
ｉ試料は、ｒｓＥＧＰ２などの可逆的に切り替え可能な蛍光マーカーで標識される。
ｉｉそして、Ｇ１及びＧ２を適切に調節することによって、試料は中間周期性定在波で活性化される。
ｉｉｉ試料は、ベース光学顕微鏡、例えば、インスタントＳＩＭを用いて画像化される。
ｉｖステップｉｉ）及びｉｉｉ）は、圧電アクチュエータ／ミラー配置を平行移動することによって達成される、定在波の他の２つの位相で繰り返される。
ｖ試料はまた、最大周期性定在波（つまり、θ=０度でのコリメートされた入射ビーム及び反射ビーム）で活性化される。
ｖｉ次に、試料は、ベース光学顕微鏡、例えばインスタントＳＩＭ顕微鏡システムを用いて画像化される。
ｖｉｉステップｖ、ｖｉは、圧電アクチュエータ／ミラーを平行移動することによって達成される定在波の付加的な位相について繰り返される。
ｖｉｉｉステップｉｉ〜ｖｉｉは、例えば、３Ｄイメージングスタックを取得するために、試料中の異なる焦点面で必要に応じて繰り返される。
ｉｘ画像を、Richardson-Lucyデコンボリューションを用いて、合成、デコンボリューションすることで、軸分解能が向上する。

焦点面ごとに得られた５つの画像は、図６Ａ〜図６Ｅに示されるようなシミュレーションで検証したように、基礎となる顕微鏡の軸分解能を著しく向上させるのに十分であることがわかった。５つの画像すべての迅速な取得が、動きのぼやけを防止するために必要であり、インスタントＳＩＭ顕微鏡システムに照明器／反射器を構築すると、高速画像取得が保証されることに留意されたい。

軸分解能の漸進的な改善を示すシミュレーションが、図６に再現されている。図６Ａにから始めると、これは、様々な距離に配置された一連の特徴（線、点の対）を含む物体の「完全な」画像である。図６Ｂは、光活性化又は定在波なしで、インスタントＳＩＭで撮影された物体の画像である。図６Ｃは、インスタントＳＩＭシステムで撮影され、その後デコンボリューションされた、１５０ｎｍの周期性定在波（３相）で光活性化された物体の画像である。特徴ははるかによく解決されますが、アーチファクト（リンギング）は、特に離れた点対の場合に明らかであることに留意されたい。図６Ｄは、インスタントＳＩＭ顕微鏡システムで画像化された後、デコンボリューションされた、３００ｎｍの周期性定在波（３相）で光活性化された物体の画像である。アーチファクトは減少したが、最も細かい間隔の点対は解消されなかった。図６Ｅは、３００ｎｍ及び１５０ｎｍの両方の周期性定在波で連続して（上述の５つの位相）光活性化された物体の画像である。特徴は、アーチファクトなしで十分に解決されていることに留意されたい。
空間光変調器を用いた定在波照明パターンを達成するための顕微鏡システム

３００で示される、フォトスイッチング及び定在波照明技術を利用するための顕微鏡システムの第３実施形態が図７に示される。いくつかの実施形態では、顕微鏡システム３００は、図５に示す顕微鏡システム２００の第２実施形態と同様の光学レイアウトを含むが、空間光変調器（ＳＬＭ）３０４が試料３１６と共役に配置され、Ｆ１レンズ３０６及びＦ２レンズ３１０は顕微鏡システム３００における任意の倍率を提供する。追加の光学系をＦ１レンズ３０６とＦ２レンズ３１０との間に配置して、レーザビーム３０３を対物レンズ３１４に入射する前にフィルタリング又は調整することもできる。特に、図７に示すように、顕微鏡システム３００は、レーザ光源３０２がレーザビーム３０３Ａを放射し、それがＳＬＭ３０４によって反射され、第１Ｆ１レンズ３０６を通過し、平行移動反射ミラー３０８で、第２Ｆ２レンズ３１０と第３ＦＴＵＢＥレンズ３１２で構成される望遠鏡を通過して、対物レンズ（ＦＯＢＪ）３１４の後焦点面上に反射され、最終的に試料３１６に焦点を合わせる。ミラー３１８は、照明を反射して試料３１６に戻す。

ＳＬＭ３０４は、試料面に、中間及び微細（例えば、図４の３００ｎｍ、１５０ｎｍパターン）の両方を導入するための簡単で柔軟な方法を提供する。ＳＬＭ上の異なる位相で鋭い正弦波パターンを表示し（図８Ａ、左）、試料で３ビーム干渉（図８Ｂ、左）を可能にすることによって、回折限界の軸方向変調を伴う照明を導入し、試料で変化させることができる（図８Ｃ）。代わりに、ＳＬＭ上に均一なパターンを表示することによって（図８Ａ、右；試料における軸上照明又は後焦点面における単一の中心照明スポットに対応、図８Ｂ、右）、コリメートされた軸上照明が対物レンズを介して伝達され、ミラーで反射され、試料で鋭く変化する干渉を生じる（例えば、図１Ｂのように）。

様々なＳＬＭパターンが図８Ａに示されており、同様に、対応する後焦点面（図８Ｂ）及び試料（図８Ｃ）強度パターンが示されている。対物レンズ３１４の後焦点面３２２における図８Ｂ（左）に示される３つのビーム照明に対応する図８Ａの３つの画像に示される異なる位相で鋭い正弦波照明を表示することによって、鋭い軸方向照明が試料（図８Ｃ）に導入される。対照的に、均一な照明（図８Ａ、図８Ｂ右）が使用される場合、均一な照明が対物レンズを通して伝達され、その結果、ミラーでの反射後、図１Ｂと同様の鮮明な照明パターンが得られる。図８Ｂにおいて、青色の円は対物後焦点面を表し、赤色の点は後焦点面における照明パターンを表す。図８Ｃでは、照明パターンはGustafsson、２００８から再現されている。

顕微鏡システム３００によって実施される取得手順は、２ガルバノメータ（Two-Galvanometer）のセットアップに類似している。

ステップ１：試料３１６は、ｒｓＥＧＰ２のような可逆的に切り替え可能な蛍光マーカーで標識されている。

ステップ２：試料３１６は、ＳＬＭ３０４を使用して中間周期性定在波で活性化され、鋭い正弦波照明を表示する。

ステップ３：試料３１６は、ベース光学顕微鏡装置、例えばインスタントＳＩＭを用いて画像化される。

ステップ４：ステップ２）及び３）は、ＳＬＭ３０４に適切なパターンを表示することによって達成される定在波の他の２つの位相で繰り返される。

ステップ５：試料３１６は、最大周期性定在波（すなわち、Θ＝０°でのコリメート入射及び反射ビーム）で、ＳＬＭ３０４上の均一パターンに変化することによって活性化される。

ステップ６：試料３１６は、ベース光学顕微鏡、例えばインスタントＳＩＭを用いて画像化される。

ステップ７：ステップ５）及び６）は、圧電アクチュエータ／ミラーを平行移動させることによって達成される定在波の付加的な位相で繰り返される。

ステップ８：ステップ２）〜７）は、例えば、３Ｄイメージングスタックを取得するために、試料中の異なる焦点面で必要に応じて繰り返される。

ステップ９：画像を、Richardson-Lucyデコンボリューションを用いて、合成、デコンボリューションすることで、軸分解能が向上する。
軸方向超解像を達成するための鋭い軸方向照明構造を生成するための顕微鏡システム

４００で示される、軸方向超解像を達成するための鋭い軸方向照明構造を生成する顕微鏡システムの第４実施形態が、図９に示されている。この実施形態では、３重ビーム分割構成を使用して、試料で干渉する単一の光ビームから分割された３つの互いにコヒーレントな光ビームを生成し、より高い軸分解能を達成するために必要な軸方向フリンジを生成する。一態様では、例えば波長４０５ｎｍの単一の光ビーム４０３で送信するレーザである、レーザ４０２は、３つに分割されたコヒーレント光ビーム４０３Ａ、４０３Ｂ及び４０３Ｃに分割され、第１ビームスプリッタ４０６及び第２ビームスプリッタ４１０を通過し、そして、第１非偏光ビームスプリッタ４１２及び第２非偏光ビームスプリッタ４１４を通過して再結合される。焦点距離Ｆ１を有する第１レンズ４２０、第２レンズ４２２及び第３レンズ４２４は、第１非偏光ビームスプリッタ４１２及び第２非偏光ビームスプリッタ４１４の前に配置され、第１分割光ビーム４０３Ａ、第２分割光ビーム４０３Ｂ及び第３分割光ビーム４０３Ｃが、対物レンズ４３８の後焦点面４３６に共役に配置されたガルバノミラー４２６に焦点が合うことを確実にする。

第１分割光ビーム４０３Ａ、第２分割光ビーム４０３Ｂ及び第３分割光ビーム４０３Ｃの偏光状態は、第１半波長板４０４及び第２半波長板４０８を用いて制御することができる。第１分割光ビーム４０３Ａ、第２分割光ビーム４０３Ｂ及び第３分割光ビーム４０３Ｃは、後焦点面４３６において、図８Ｃに示すような鋭い軸方向構造を有する照明を提供し、ガルバノミラー４２６を回転させると、図８Ａに示すような照明構造の位相が変化する。図示のように、ダイクロイックミラー４２８は、顕微鏡システムの他の構成要素との一体化を可能にする。さらに、光チョッパ４３４が、ＦＴＵＢＥレンズ４３２と対物レンズ４３８との間に配置され、外側の２つのレーザビーム、例えば第１分割光ビーム４０３Ａ、第３分割光ビーム４０３Ｃを選択的に遮断するために使用され、それによって、第２分割光ビーム４０３Ｂによる軸上照明を可能にする。第２分割光ビーム４０３Ｂによる軸上照明は、試料４４０の反対側、対物レンズ４３８及び試料４４０が載っているカバースリップの反対側に位置するミラー４１９からの反射光ビーム４０３Ｄとの干渉後、より高い空間周波数の軸方向フリンジを可能にする。結果として生じる干渉パターンは、試料４４０内に最大の周期性を有する定在波を生成する。

顕微鏡システム４００によって実行される取得手順は、２ガルバノメータ顕微鏡セットアップ又は空間光変調器（ＳＬＭ）顕微鏡セットアップに非常に類似している。

ステップ１：試料４４０は、ｒｓＥＧＰ２などの可逆的に切り替え可能な蛍光マーカーで標識されている。

ステップ２：第１光ビーム４０３Ａ、第２光ビーム４０３Ｂ及び第３光ビーム４０３Ｃが顕微鏡システム４００を通って伝播し、それによって試料４４０で正弦波照明を可能にすることによる中間周期性定在波で試料４４０を活性化する。

ステップ３：試料４４０は、インスタント選択照明顕微鏡などのベース光学顕微鏡（不図示）を用いて画像化される。

ステップ４：ステップ２及び３を、ガルバノミラー４２６を適切に回転させることによって達成される定在波の他の４つの位相で繰り返す。

ステップ５：試料４４０は、光チョッパ４３６を用いて、例えばコリメートされた入射及びΘ＝０°で反射された定在波の最大周期で活性化され、外側の２つのレーザビーム、例えば第１光ビーム４０３Ａ及び第２光ビーム４０３Ｃをブロックする。

ステップ６：試料４４０は、インスタント選択照明顕微鏡などのベース光学顕微鏡（不図示）を用いて画像化される。

ステップ７：ステップ５及び６は、それによって、圧電アクチュエータ（不図示）を用いてミラー４１９を移動させることによって達成される、定在波の付加的な位相で繰り返される。

ステップ８：ステップ２から７は、例えば、３次元画像化スタックを取得することによって、試料４４０内の異なる焦点面で必要に応じて繰り返される。

最後に、撮像画像を、Richardson‐Lucyデコンボリューションを用いて、合成、デコンボリューションすることで、軸分解能が向上する。

本明細書に開示されている顕微鏡システム１００、２００、３００及び４００では非線形遷移（フォトスイッチング）が使用されているため、理論的には、ＯＮ状態またはＯＦＦ状態のいずれかを「飽和させる（saturating）」ことによって「無制限の」分解能が可能であることに留意されたい。４０５ｎｍレーザーを活性化することにより、原理的に飽和を達成することは簡単であり、ＯＮ状態を飽和させる１つの方法であり、各軸方向スライスの高調波につながる。しかし、この分解能の向上を読み取るために払わなければならないコストは、より多くの生の画像を取得することになるが、十分に光安定性のある試料があれば、原理的に可能である。

一態様において、本明細書に記載のフォトスイッチング及び定在波照明の技術を他の顕微鏡システムに適用して、軸分解能を改善することができる。例えば、軸分解能を改善するために、上述の技術を任意のタイプの広視野蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡システムで使用することができる。

以上のことから、特定の実施形態が例示及び説明されているが、当業者に明らかであるように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を加えることができることを理解されたい。そのような変更及び修正は、本明細書に添付された特許請求の範囲で定義された本発明の範囲および教示の範囲内である。

Claims

ａ）可逆的に切り替え可能なマーカーで試料を標識し、
ｂ）中間周期性定在波で前記試料を照明し、
ｃ）第１過程（instance）で前記試料を撮像し、
ｄ）前記中間周期性定在波の他の２つのそれぞれの位相でステップｂ）及びｃ）を繰り返し、
ｅ）第２過程で前記試料を撮像し、
ｆ）最大周期性定在波で前記試料を照明し、
ｇ）第３過程で前記試料を撮像し、
ｈ）前記最大周期性定在波の付加的な位相でステップｆ）及びｇ）を繰り返し、
ｉ）前記試料の３次元画像を取得するために、該試料に対して異なる焦点面で１回以上ステップｂ）〜ｈ）を繰り返す、
ことを含む、方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーがｒｓＥＧＰ２マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
前記試料はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項１に記載の方法。
ステップｂ）〜ｈ）を繰り返すステップは、ステップｂ）〜ｈ）を５回繰り返して、焦点面あたり５つの画像を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項１に記載の方法。
コリメート光ビーム（１０２）を生成するための照明源と、
送信された前記コリメート光ビーム（１０２）を受光する対物レンズ（１０４）と、
送信された前記コリメート光ビーム（１０２Ａ）を反射して、反射コリメート光ビーム（１０２Ｂ）を生成し、その結果、試料を照明する定在波パターン（１１６）を生成する、前記対物レンズ（１０４）と動作可能に関連するミラー（１０６）と、
を含む、顕微鏡システム（１００）。
前記試料が配置される面を定める、カバースリップ（１１４）をさらに含む、
請求項８に記載の顕微鏡システム（１００）。
送信された前記コリメート光ビーム（１０２Ａ）と前記反射コリメート光ビーム（１０２Ｂ）との間の干渉が前記定在波パターン（１１６）を生成する、
請求項８に記載の顕微鏡システム（１００）。
前記試料に対してミラー（１０６）を平行移動させる、該ミラーに結合された圧電素子（１１０）をさらに含む、
請求項８に記載の顕微鏡システム（１００）。
焦点面ごとに前記試料の５つの画像を取得する撮像システムをさらに備える、
請求項８に記載の顕微鏡システム（１００）。
前記試料中に蛍光励起を生成する、前記試料に関連して少なくとも１つの可逆的に切り換え可能な蛍光分子をさらに備える、
請求項８に記載の顕微鏡システム（１００）。
光ビーム（２０４）を送信する照明源（２０２）と、
試料（２１８）に共役な位置に配置され、送信された前記光ビーム（２０４）を反射して第２走査ミラー（２０７）へと入射させる第１走査ミラー（２０５）であって、反射し送信された前記光ビーム（２０４）は対物レンズを通過して試料（２１８）を照明し、該試料から照明が発生し、
前記試料（２１８）からの照明を反射して該試料（２１８）上に戻し、定在波を発生させるミラー（２２０）と、
を含む顕微鏡システム（２００）。
第１レンズ（２０６）が第２レンズ（２０８）を有する４ｆ構成である、
請求項１４記載の顕微鏡システム（２００）。
前記第１走査ミラー（２０５）は、前記試料（２１８）の試料面（２１８）において定在波パターンを傾斜させ、定在波の定在波周期性を変更する、
請求項１４に記載の顕微鏡システム（２００）。
前記ミラー（２２０）は、前記試料（２１８）に対して軸に沿って平行移動する、
請求項１に記載の顕微鏡システム（２００）。
第２ミラースキャナ（２０７）が前記対物レンズ（２１６）の後焦点面（２１４）に共役であることを確実にする、前記対物レンズ（２１６）と動作可能に関連する中間レンズ配置をさらに含む、
請求項１４に記載の顕微鏡システム（２００）。
焦点面ごとに前記試料（２１８）の５つの画像を取得する撮像装置をさらに含む、
請求項１４に記載の顕微鏡システム（２００）。
前記ミラー（２２０）はダイクロイックミラーを含む、
請求項１４に記載の顕微鏡システム（２００）。
ａ）可逆的に切り替え可能な傾向マーカーで試料を標識し、
ｂ）鋭い正弦波照明を表示するために、空間光変調器を使用することによって、中間周期性定在波で前記試料を照明し、
ｃ）第１過程で前記試料を撮像し、
ｄ）前記空間光変調器上に適当なパターンを表示することによって達成される中間周期性定在波の他の２つのそれぞれの位相でステップｂ）及びｃ）を繰り返し、
ｅ）第２過程で前記試料を撮像し、
ｆ）前記空間光変調器上で均一なパターンに変化することによって最大周期性定在波で前記試料を照明し、
ｇ）第３過程で前記試料を撮像し、
ｈ）圧電アクチュエータ／ミラーを平行移動することによって達成される最大周期性定在波の付加的な位相でステップｆ）及びｇ）を繰り返し、
ｉ）前記試料の３次元画像を取得するために、該試料に対して異なる焦点面で１回以上ステップｂ）〜ｈ）を繰り返す、
ことを含む、方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項２１に記載の方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーがｒｓＥＧＰ２マーカーを含む、請求項２１に記載の方法。
前記試料はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項２１に記載の方法。
ステップｂ）〜ｈ）を繰り返すステップは、ステップｂ）〜ｈ）を５回繰り返して、焦点面あたり５つの画像を得ることを含む、請求項２１に記載の方法。
Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項１に記載の方法。
コリメート光ビーム（３０３）を生成する照明源（３０２）と、
送信された前記コリメート光ビーム（３０３）を受光する対物レンズ（３１４）と、
送信された前記コリメート光ビーム（３０３）を反射して、反射コリメート光ビーム（３０３Ａ）を生成し、その結果、定在波パターンが試料（３１６）を照明する、対物レンズ（３１４）と動作可能に関連する空間光変調器（３０４）と、
を含む顕微鏡システム（３００）。
前記試料（３１６）が配置される面を定める、カバースリップをさらに含む、
請求項２８に記載の顕微鏡システム（３００）。
送信された前記コリメート光ビーム（３０３）と前記反射コリメート光ビーム（３０３Ａ）との間の干渉が前記定在波パターンを生成する、
請求項２８に記載の顕微鏡システム（３００）。
前記試料に対してミラー（３１８）を平行移動させる、該ミラーに結合された圧電素子をさらに含む、
請求項２８に記載の顕微鏡システム（３００）。
焦点面ごとに前記試料（３１６）の５つの画像を取得する撮像システムをさらに備える、
請求項２８に記載の顕微鏡システム（３００）。
前記試料（３１６）中に蛍光励起を生成する、前記試料（３１６）に関連して少なくとも１つの可逆的に切り換え可能な蛍光分子をさらに備える、
請求項３８に記載の顕微鏡システム（３００）。
ａ）可逆的に切り替え可能な傾向マーカーで試料４４０を標識し、
ｂ）第１、第２及び第３レーザビームが前記試料４４０で鋭い正弦波照明の表示を可能にするために、中間周期性定在波で前記試料４４０を活性化し、
ｃ）第１過程で前記試料４４０を撮像し、
ｄ）ガルバノミラーを回転させることによって達成される中間周期性定在波の他の４つのそれぞれの位相でステップｂ）及びｃ）を繰り返し、
ｅ）光チョッパを使用して、最大周期性定在波で前記試料４４０を活性化し、
ｆ）第２過程で前記試料４４０を撮像し、
ｇ）前記定在波の付加的な位相ｅ）及びｆ）を繰り返し、
ｈ）前記試料４４０の３次元画像を取得するために、該試料４４０に対して異なる面でステップａ）〜ｇ）を繰り返す、
ことを含む、方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項３４に記載の方法。
前記可逆的に切り換え可能なマーカーがｒｓＥＧＰ２マーカーを含む、請求項３４に記載の方法。
前記試料４４０はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項３４に記載の方法。
Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項３４に記載の方法。
光ビーム（４０２）を生成するための照明源（４０３）と、
光ビーム（４０３）を第１分割光ビーム（４０３Ａ）、第２分割光ビーム（４０３Ｂ）及び第３分割光ビーム（４０３Ｃ）に分割するための、照明源（４０２）と動作可能に関連する第１偏光ビームスプリッタ（４０６）及び第２偏光ビームスプリッタ（４１０）と、
前記第１、第２、及び第３光ビーム（４０３Ａ、４０３Ｂ、及び４０３Ｃ）を再結合するための第１非偏光ビームスプリッタ（４１２）及び第２非偏光ビームスプリッタ（４１４）と、
第１及び第２非偏光ビームスプリッタ（４１２、４１４）と動作可能に関連するガルバノミラー（４２６）と、
送信された前記第１、第２、及び第３分割光ビーム（４０３Ａ、４０３Ｂ及び４０３Ｃ）を受信するための対物レンズ（４３８）と、
送信されたコリメート光ビーム（４０３）を反射して、反射されたコリメート光ビーム（４０３Ｄ）を生成し、その結果、定在波パターンが試料（４４０）を照明する、対物レンズ（４３８）と動作可能に関連する光チョッパ（４３４）と、
を含む、顕微鏡システム（４００）。
前記第１、第２及び第３分割光ビーム（４０３Ａ、４０３Ｂ及び４０３Ｃ）は、前記試料（４４０）のより高い軸分解能を生成するための、より低い空間周波数の軸方向フリンジを生成するように、十分に干渉する相互にコヒーレントな光ビームを含む、
請求項４０に記載の顕微鏡システム。