JP2021529991A - フォトスイッチング及び定在波照明技術を用いた顕微鏡における改善された軸分解能のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
フォトスイッチング定在波照明
フォトスイッチング技術を用いて、定在波照明を蛍光励起及び読み出しから分離する
定在波照明器/反射器
i 試料は、rsEGP2などの可逆的に切り替え可能な蛍光マーカーで標識される。
ii そして、G1及びG2を適切に調節することによって、試料は中間周期性定在波で活性化される。
iii 試料は、ベース光学顕微鏡、例えば、インスタントSIMを用いて画像化される。
iv ステップii)及びiii)は、圧電アクチュエータ/ミラー配置を平行移動することによって達成される、定在波の他の2つの位相で繰り返される。
v 試料はまた、最大周期性定在波(つまり、θ=0度でのコリメートされた入射ビーム及び反射ビーム)で活性化される。
vi 次に、試料は、ベース光学顕微鏡、例えばインスタントSIM顕微鏡システムを用いて画像化される。
vii ステップv、viは、圧電アクチュエータ/ミラーを平行移動することによって達成される定在波の付加的な位相について繰り返される。
viii ステップii〜viiは、例えば、3Dイメージングスタックを取得するために、試料中の異なる焦点面で必要に応じて繰り返される。
ix 画像を、Richardson-Lucyデコンボリューションを用いて、合成、デコンボリューションすることで、軸分解能が向上する。
空間光変調器を用いた定在波照明パターンを達成するための顕微鏡システム
軸方向超解像を達成するための鋭い軸方向照明構造を生成するための顕微鏡システム
Claims (41)
- a)可逆的に切り替え可能なマーカーで試料を標識し、
b)中間周期性定在波で前記試料を照明し、
c)第1過程(instance)で前記試料を撮像し、
d)前記中間周期性定在波の他の2つのそれぞれの位相でステップb)及びc)を繰り返し、
e)第2過程で前記試料を撮像し、
f)最大周期性定在波で前記試料を照明し、
g)第3過程で前記試料を撮像し、
h)前記最大周期性定在波の付加的な位相でステップf)及びg)を繰り返し、
i)前記試料の3次元画像を取得するために、該試料に対して異なる焦点面で1回以上ステップb)〜h)を繰り返す、
ことを含む、方法。 - 前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記可逆的に切り換え可能なマーカーがrsEGP2マーカーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項1に記載の方法。
- ステップb)〜h)を繰り返すステップは、ステップb)〜h)を5回繰り返して、焦点面あたり5つの画像を得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項1に記載の方法。
- コリメート光ビーム(102)を生成するための照明源と、
送信された前記コリメート光ビーム(102)を受光する対物レンズ(104)と、
送信された前記コリメート光ビーム(102A)を反射して、反射コリメート光ビーム(102B)を生成し、その結果、試料を照明する定在波パターン(116)を生成する、前記対物レンズ(104)と動作可能に関連するミラー(106)と、
を含む、顕微鏡システム(100)。 - 前記試料が配置される面を定める、カバースリップ(114)をさらに含む、
請求項8に記載の顕微鏡システム(100)。 - 送信された前記コリメート光ビーム(102A)と前記反射コリメート光ビーム(102B)との間の干渉が前記定在波パターン(116)を生成する、
請求項8に記載の顕微鏡システム(100)。 - 前記試料に対してミラー(106)を平行移動させる、該ミラーに結合された圧電素子(110)をさらに含む、
請求項8に記載の顕微鏡システム(100)。 - 焦点面ごとに前記試料の5つの画像を取得する撮像システムをさらに備える、
請求項8に記載の顕微鏡システム(100)。 - 前記試料中に蛍光励起を生成する、前記試料に関連して少なくとも1つの可逆的に切り換え可能な蛍光分子をさらに備える、
請求項8に記載の顕微鏡システム(100)。 - 光ビーム(204)を送信する照明源(202)と、
試料(218)に共役な位置に配置され、送信された前記光ビーム(204)を反射して第2走査ミラー(207)へと入射させる第1走査ミラー(205)であって、反射し送信された前記光ビーム(204)は対物レンズを通過して試料(218)を照明し、該試料から照明が発生し、
前記試料(218)からの照明を反射して該試料(218)上に戻し、定在波を発生させるミラー(220)と、
を含む顕微鏡システム(200)。 - 第1レンズ(206)が第2レンズ(208)を有する4f構成である、
請求項14記載の顕微鏡システム(200)。 - 前記第1走査ミラー(205)は、前記試料(218)の試料面(218)において定在波パターンを傾斜させ、定在波の定在波周期性を変更する、
請求項14に記載の顕微鏡システム(200)。 - 前記ミラー(220)は、前記試料(218)に対して軸に沿って平行移動する、
請求項1に記載の顕微鏡システム(200)。 - 第2ミラースキャナ(207)が前記対物レンズ(216)の後焦点面(214)に共役であることを確実にする、前記対物レンズ(216)と動作可能に関連する中間レンズ配置をさらに含む、
請求項14に記載の顕微鏡システム(200)。 - 焦点面ごとに前記試料(218)の5つの画像を取得する撮像装置をさらに含む、
請求項14に記載の顕微鏡システム(200)。 - 前記ミラー(220)はダイクロイックミラーを含む、
請求項14に記載の顕微鏡システム(200)。 - a)可逆的に切り替え可能な傾向マーカーで試料を標識し、
b)鋭い正弦波照明を表示するために、空間光変調器を使用することによって、中間周期性定在波で前記試料を照明し、
c)第1過程で前記試料を撮像し、
d)前記空間光変調器上に適当なパターンを表示することによって達成される中間周期性定在波の他の2つのそれぞれの位相でステップb)及びc)を繰り返し、
e)第2過程で前記試料を撮像し、
f)前記空間光変調器上で均一なパターンに変化することによって最大周期性定在波で前記試料を照明し、
g)第3過程で前記試料を撮像し、
h)圧電アクチュエータ/ミラーを平行移動することによって達成される最大周期性定在波の付加的な位相でステップf)及びg)を繰り返し、
i)前記試料の3次元画像を取得するために、該試料に対して異なる焦点面で1回以上ステップb)〜h)を繰り返す、
ことを含む、方法。 - 前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記可逆的に切り換え可能なマーカーがrsEGP2マーカーを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記試料はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項21に記載の方法。
- ステップb)〜h)を繰り返すステップは、ステップb)〜h)を5回繰り返して、焦点面あたり5つの画像を得ることを含む、請求項21に記載の方法。
- Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項1に記載の方法。
- コリメート光ビーム(303)を生成する照明源(302)と、
送信された前記コリメート光ビーム(303)を受光する対物レンズ(314)と、
送信された前記コリメート光ビーム(303)を反射して、反射コリメート光ビーム(303A)を生成し、その結果、定在波パターンが試料(316)を照明する、対物レンズ(314)と動作可能に関連する空間光変調器(304)と、
を含む顕微鏡システム(300)。 - 前記試料(316)が配置される面を定める、カバースリップをさらに含む、
請求項28に記載の顕微鏡システム(300)。 - 送信された前記コリメート光ビーム(303)と前記反射コリメート光ビーム(303A)との間の干渉が前記定在波パターンを生成する、
請求項28に記載の顕微鏡システム(300)。 - 前記試料に対してミラー(318)を平行移動させる、該ミラーに結合された圧電素子をさらに含む、
請求項28に記載の顕微鏡システム(300)。 - 焦点面ごとに前記試料(316)の5つの画像を取得する撮像システムをさらに備える、
請求項28に記載の顕微鏡システム(300)。 - 前記試料(316)中に蛍光励起を生成する、前記試料(316)に関連して少なくとも1つの可逆的に切り換え可能な蛍光分子をさらに備える、
請求項38に記載の顕微鏡システム(300)。 - a)可逆的に切り替え可能な傾向マーカーで試料440を標識し、
b)第1、第2及び第3レーザビームが前記試料440で鋭い正弦波照明の表示を可能にするために、中間周期性定在波で前記試料440を活性化し、
c)第1過程で前記試料440を撮像し、
d)ガルバノミラーを回転させることによって達成される中間周期性定在波の他の4つのそれぞれの位相でステップb)及びc)を繰り返し、
e)光チョッパを使用して、最大周期性定在波で前記試料440を活性化し、
f)第2過程で前記試料440を撮像し、
g)前記定在波の付加的な位相e)及びf)を繰り返し、
h)前記試料440の3次元画像を取得するために、該試料440に対して異なる面でステップa)〜g)を繰り返す、
ことを含む、方法。 - 前記可逆的に切り換え可能なマーカーが、可逆的に切り換え可能な蛍光マーカーを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記可逆的に切り換え可能なマーカーがrsEGP2マーカーを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料440はインスタント構造化照明顕微鏡を用いて画像化される、請求項34に記載の方法。
- Richardson-Lucy又は他のデコンボリューションプロセスを使用して、各画像を合成及びデコンボリューションして、合成画像を生成することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料を照明することは、前記試料面に対して定在波パターンの角度を変化させ、各定在波の位相の周期性を変えることを含む、請求項34に記載の方法。
- 光ビーム(402)を生成するための照明源(403)と、
光ビーム(403)を第1分割光ビーム(403A)、第2分割光ビーム(403B)及び第3分割光ビーム(403C)に分割するための、照明源(402)と動作可能に関連する第1偏光ビームスプリッタ(406)及び第2偏光ビームスプリッタ(410)と、
前記第1、第2、及び第3光ビーム(403A、403B、及び403C)を再結合するための第1非偏光ビームスプリッタ(412)及び第2非偏光ビームスプリッタ(414)と、
第1及び第2非偏光ビームスプリッタ(412、414)と動作可能に関連するガルバノミラー(426)と、
送信された前記第1、第2、及び第3分割光ビーム(403A、403B及び403C)を受信するための対物レンズ(438)と、
送信されたコリメート光ビーム(403)を反射して、反射されたコリメート光ビーム(403D)を生成し、その結果、定在波パターンが試料(440)を照明する、対物レンズ(438)と動作可能に関連する光チョッパ(434)と、
を含む、顕微鏡システム(400)。 - 前記第1、第2及び第3分割光ビーム(403A、403B及び403C)は、前記試料(440)のより高い軸分解能を生成するための、より低い空間周波数の軸方向フリンジを生成するように、十分に干渉する相互にコヒーレントな光ビームを含む、
請求項40に記載の顕微鏡システム。
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