JP6023147B2 - 照明された試料を光学的に捕捉するための方法および装置 - Google Patents
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Description
図1は、本発明による顕微鏡の概略的な構造を示している。
(1)は光軸、(3)は光源、(5)は切替可能な減衰器/AOM、(8)は円筒レンズなどのライン成形光学系(7)を備えたビーム成形ユニット、(9)は図平面に垂直な回転軸を有するスキャナ、(23)は図平面に基本的に平行な回転軸(25)を有するスキャナ、(11)は走査光学系、(13)は試料と共役な中間画像面内に周期構造を有するマスク、(15)は例えばCCD受像部マトリクスなどの位置解像型平面センサ、(17)は放出フィルタ、(19)は主カラー・スプリッタ、(21)は鏡筒レンズ、(27)は顕微鏡対物レンズ、(29)は試料である。素子(7)および(13)は、機械的グループであるビーム成形ユニット(8)にまとめられており、このユニットは、好ましくは光軸(1)の周りを回転可能に配置されている。
以下では一般性を制限することなく例を考察するが、この例では、ラインは試料内でx方向に沿っており、画像視野の走査はそれに垂直なy方向に行われる。x方向にラインを方向付けするには、ビーム成形ユニット(8)の対応する方向付けも必要となる。
図2は、照明の構造化を示している。
これらの画像のそれぞれは、この場合も、既に述べた方法に加えて、好ましくは試料保全のためにできるだけ低い強度で、同じスキャナ調整で記録を繰り返し、続いで平均化することによって生じ得る。この方法は、試料内での褪色過程に基づくアーチファクトを減少させ得る。こうして1つの位相位置につきM枚の画像を差引計算することにより、共焦点性を調整することができる。
この場合、画像記録の速度は、非共焦点検出に比べてM分の1に低下する。50枚の画像の画像取り込みを基礎とすると、M=5の場合(構造化の1つの位相位置での)完全な画像は100ms後に得ることができる。ただし構造化方向ごとに、異なる位相位置でN=3〜5枚の画像を記録しなければならないことを考慮する必要がある。したがって3つの構造化方向での線形の構造化の場合、典型的には9枚の画像が生じ[7]、これはM=5の場合、1つの平面ごとに約1sの画像記録時間になる。
1次の回折次数が干渉し合うことにより、試料上に構造化されたラインが生成される。回折次数の間隔はsであり、aは瞳の大きさである。sとbの比が、限界周波数に対して正規化された構造化周波数fである。
図5は、同期した走査移動の場合(a)および1つのスキャナで走査する場合(b)のスキャナによる走査方向および位相位置の調整について説明するためのものである。
対象面内での構造化のコントラストができるだけ高い構造化された照明を得るために、顕微鏡法では通常であるような比較的高い開口数の光学系を使用する場合、偏光に留意しなければならない。最大のコントラストは、図4に示したように、照明光の偏光が、瞳面内での回折次数を結ぶ線に垂直(つまり画像面内でのラインの位置に垂直)である場合にだけ可能である。したがって照明光の相応の偏光は、ビーム成形ユニット(8)の回転と同期して、絞りの回転と一緒に回転されなければならない。前者は、線形に偏光された励起光のビーム経路内でλ/2板の回転によって生成し得ることが好ましく、その際、波長板の回転角度は、ビーム成形ユニットの回転角度の半分である。これに対応して図1および図6のビーム経路内で供給源(3)と主カラー・スプリッタ(19)の間に回転可能な波長板を設けることができる。代替案としてビーム成形ユニットが、正しい向きの線形に偏光された光だけを透過させる偏光子を備えることもできる。これは、回転に応じた光損失を引き起こし(図7を参照)、この光損失は、適切な同期化された光変調によって補償することができる。
本発明は前述の実施形態だけに関連するものではない。
したがって例えば、本発明は多点構成(米国特許第6028306号を参照のこと)および別の点構成のような別の照明分布にも適用可能であり、ニプコー円板および広視野での検出の際にも適用可能である。
Claims (22)
- 試料を深さ分解して光学的に捕捉するための方法であって、
試料またはその一部が線状の照明によって走査され、
前記試料の照明が焦点内で少なくとも1つの空間方向において周期的に構造化され、
前記試料から来る光が検出されて前記試料の画像が生成され、
前記画像を基に少なくとも1つの光学的断面画像および/または解像度が高められた画像が計算される当該方法において、
平面検出器またはカメラ上でラインごとに非デスキャン検出するために、照明された試料領域からの検出光によって露光されるラインの間に間隙が生成され、
光軸の周りでラインが回転され、様々な回転角度で画像生成および断面画像計算が行われ、ラインの回転は、前記光軸の回りを回転可能に配置された少なくとも周期的構造を用いて行われることを特徴とする方法。 - ラインごとの照明および検出の際に、前記照明が複数回スイッチオンおよびオフされる、請求項1に記載の方法。
- 照明された2つの試料部分の間に間隙が存在するように、試料走査の際に光中断が繰り返される、請求項1又は2に記載の方法。
- 画像の計算は、照明された試料領域の間の間隙に割り当てられたカメラ領域を部分的にまたは完全にマスキングし、それによって取得された画像を差引計算することによって行われる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記差引計算は、隣で走査された試料領域が、差引計算された画像内で正しくスケーリングして隣に割り当てられるように行われる、請求項4に記載の方法。
- 試料を深さ分解して光学的に捕捉するための方法であって、
前記試料またはその一部が線状の照明によって少なくとも一つのスキャナを用いて走査され、
前記試料の照明が焦点内で少なくとも1つの空間方向において周期的に構造化され、
前記試料から来る光が検出されて前記試料の画像が生成され、
前記画像を基に少なくとも1つの光学的断面画像および/または解像度が高められた画像が計算される当該方法において、
走査過程中に、ラインによる前記試料の走査方向においてさらなるスキャナにより試料光が偏向され、
光軸の周りでラインが回転され、様々な回転角度で画像生成および断面画像計算が行われ、ラインの回転は、前記光軸の回りを回転可能に配置された少なくとも周期的構造を用いて行われることを特徴とする方法。 - 試料光の偏向の速度が、試料と照明光の間の相対移動の速度より大きい、請求項6に記載の方法。
- 試料光の偏向がステップ状又は連続的に行われる、請求項6または7に記載の方法。
- 照明ラインの回転の際に、照明光の偏光が回転と同期して回転される、請求項6乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 複数回の走査が行われ、前記試料上での前記周期的構造化の位置および/または前記試料上での前記照明光の位置が変位されて、異なる画像位相を有する複数の画像が記録され、それを基に断面画像が計算される、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる画像位相を有する複数の画像の記録が、照明/検出される区間の間に一定の間隙をあけて行われるか、または、該間隙の位置が変えられることでそれぞれ1つの位置に対し異なる画像位相を有する複数の画像が記録され、それを基に断面画像が計算される、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記構造化の1つの位置で前記間隙の位置が変えられて試料画像が記録され、この過程がその後、前記構造化のさらなる位置に対して繰り返され、前記間隙の位置が本質的に全ての試料領域を次々に線状に照明するように変えられて試料光が検出される、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 光中断が、電気光学式変調器および/または音響光学式変調器による強度の低減によって行われる、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記照明を周期的に構造化するために、1つの光ビームが複数の部分光ビームに分けられ、前記複数の部分光ビームが干渉して重なり合い、1本のラインへと成形される、請求項1乃至13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記照明と前記試料またはその一部との非線形の相互作用から生じる光が検出される、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記線状の走査が、複数のラインによって同時に行われることを特徴とする請求項1乃至15のいずれか1項に記載の方法。
- 様々な変調周波数で構造を結像させることにより、光学的断面厚または光学的解像度を変化させ、複数の波長でそれぞれ照明する際に各々対応する変調周波数を適合させることによって断面厚さが同じに調整されることを特徴とする請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 試料を深さ分解して光学的に捕捉するための装置であって、
少なくとも1つの波長で前記試料を線状に照明する手段と、
少なくとも1つの平面内で照明光を空間的に構造化する手段と、
試料と照明光との間の相対移動を生じさせる手段と、
少なくとも1つの検出器上に、前記試料によって影響を及ぼされた光を結像させる手段と、
前記試料によって影響を及ぼされた光の位置情報から少なくとも1つの光学的断面画像および/または解像度が高められた画像を計算する手段と、
を含む当該装置において、
試料光を非デスキャン検出するために平面検出器またはカメラが設けられており、
照明された試料領域間に間隙を生成するため、および/または前記平面検出器上で前記照明された試料領域からの検出光によって露光されたライン間に間隙を生成するために、走査過程中に光を中断させる手段が設けられ、
光軸の周りでラインが回転され、様々な回転角度で画像生成および断面画像計算が行われ、
照明光を構造化する手段として、光軸の周りを回転可能でその透過性が構造化された光学素子が設けられていることを特徴とする装置。 - 照明用ビーム経路内に強度制御手段が設けられているとともに、前記光中断のために電気光学変調器または音響光学変調器が設けられている、請求項18に記載の装置。
- 試料を深さ分解して光学的に捕捉するための装置であって、
少なくとも1つの波長で前記試料を線状に照明する少なくとも一つのスキャナと、
少なくとも1つの平面内で照明光を空間的に構造化する手段と、
試料と照明光との間の相対移動を生じさせる手段と、
少なくとも1つの検出器上に、前記試料によって影響を及ぼされた光を結像させる手段と、
前記試料によって影響を及ぼされた光の位置情報から少なくとも1つの光学的断面画像および/または解像度が高められた画像を計算する手段と、
を含む当該装置において、
ラインごとの走査過程中に前記検出器上における試料光をラインごとに不連続的または連続的に広げるために、検出用ビーム経路内に更なるスキャナが設けられ、
照明光を構造化する手段として、光軸の周りを回転可能でその透過性が構造化された光学素子が設けられている装置。 - 前記構造化の異なる画像位相を設定するために、前記少なくとも1つのスキャナの位置が調節可能であることを特徴とする請求項20に記載の装置。
- 異なる周波数構造を設定するために、ビーム経路内に旋回可能である異なる周期性を有する複数の格子が設けられることを特徴とする請求項20または21に記載の装置。
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