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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Strahlabschaltung bei einem Laser Scanning
Mikroskop mit einer Ablenkeinrichtung, die einen Laserstrahl rasternd über eine Bildfläche führt
sowie ein Verfahren zum Betreiben eines Laser Scanning Mikroskopes, bei dem eine
Strahlabschaltung eines Laserstrahls erfolgt.
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In der Laser Scanning Mikroskopie wird ein Flächenbereich eines Objektes punktweise mit
einem Laserstrahl rasterartig abgetastet. Dabei wird ein paralleler Laserstrahl mit wenigen
Millimetern Durchmesser im allgemeinen mittels einer Ablenkeinrichtung gemäß einem
gewünschten Muster rasterartig abgelenkt - z. B. ähnlich einem Elektronenstrahl in einer
Brown'schen Röhre. Dieser abgelenkte Laserstrahl wird durch ein optisches System-
Scanobjektiv genannt - in einer Zwischenbildebene des Laser Scanning Mikroskopes fokussiert
und durch ein Objektiv des Mikroskopes auf bzw. in das Objekt abgebildet. Bei der
Strahlablenkung wird eine Objektfläche einstellbarer Größe abgerastert, die aus optischen
Gründen eine vorgegebene maximale Abmessung besitzt. Der Laserstrahl überstreicht dabei
ein Feld, während er das Objekt abrastert. Je nach Abstand von der Zwischenbildebene ist der
Laserstrahl unterschiedlich aufgeweitet.
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Die fokussierte Laserstrahlung tritt mit dem Objekt in Wechselwirkung und kann als reflektierte
oder Fluoreszenzstrahlung denselben Weg, den die beleuchtende Strahlung genommen hat,
zurücklaufen.
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Zwischen Laser und Ablenkeinrichtung befindet sich im allgemeinen ein Strahlenteiler, der die
vom Objekt aufgenommene Strahlung je nach Anwendungsfall mehr oder weniger vollständig in
einen Detektorstrahlengang lenkt.
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Im Detektorstrahlengang befinden sich prinzipiell mindestens ein abbildendes System, das die
Strahlung in einer weiteren Bildebene fokussiert. In dieser Ebene liegt mindestens eine Pinhole
genannte kleine Blende und hinter dieser Blende ein Detektor. Je nach Anwendungsfall können
sich im Detektorstrahlengang auch noch weitere Elemente befinden.
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Da die im negativ unendlichen liegende Taille des Lasers, das Objekt und das Pinhole in
optisch konjugierten Ebenen liegen, nennt man solche Anordnungen konfokal. Sie weisen
besondere vorteilhafte Abbildungseigenschaften auf.
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Ein Hauptanwendungsgebiet der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie sind
Fluoreszenzuntersuchungen, da diese Methode in der Lage ist, eine sehr dünne Schicht eines
Objektes aufzulösen. Strahlung, die aus anderen Ebenen herrührt, wird sehr stark gedämpft.
Ähnlich verhält es sich bei reflektierenden Objekten. Außerdem wird Streustrahlung, die von
Grenzflächen und Fassungen der verwendeten Optikbauteile herrührt, stark unterdrückt.
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Für diese bekannte Art der Mikroskopie eignen sich deshalb besonders Objekte, die bei
Bestrahlung Fluoreszenzeigenschaften zeigen. Besonders fluoreszierende Objekte sind aber
lichtempfindlich, d. h. ihre Fähigkeit zu fluoreszieren nimmt mit zunehmender
Bestrahlungsdauer ab, so daß man vermeiden möchte, sie unnötig zu bestrahlen, wenn kein
Bild aufgenommen wird. Würde die Laserstrahlung während der Positionierung des Objektes
und der Einstellung des Mikroskopes ständig das Objekt treffen, so würde man nicht mehr
fluoreszierende Spuren oder Löcher in das Objekt "brennen". Dies ist z. B. der Fall, wenn die
Lage der Fokusebene auf einen neuen Schnitt eingestellt wird.
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Es ist deshalb bei Laser Scanning Mikroskopen üblich, den Laserstrahl abzuschalten, wenn
keine Bildaufnahme stattfinden soll. Man spricht dabei von "Strahlabschaltung".
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Prinzipiell könnte man dazu den Laser abschalten. Da dies bei den üblicherweise verwendeten
Lasern zu instabilen Betriebsbedingungen und zur Verkürzung der Lebensdauer führt, ist dieses
Vorgehen meist nicht zweckmäßig. Eine Abschaltung mittels mechanischer Shutter ist zu
langsam.
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Es ist bekannt zur Strahlabschaltung des Lasers, wenn die Strahlung Bereiche des Objektes
träfe, die nicht dargestellt werden sollen, den Strahl mittels akusto-optischen Modulatoren
(AOM) oder akusto-optischen, abstimmbaren Filtern (AOTF) abzuschalten. Diese Baueinheiten
werden meist im parallelen Teil eines nicht aufgeweiteten Laserstrahles angeordnet und
gestatten mit extrem kurzer Reaktionszeit den Laserstrahl ein- und auszuschalten. Solche
akusto-optischen Baueinheiten sind jedoch relativ kostenaufwendige Bauteile.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Strahlabschaltung bei
einem Laser Scanning Mikroskop bzw. ein Verfahren zum Betreiben eines Laser Scanning
Mikroskops mit Strahlabschaltung anzugeben, bei dem auf aufwendige akusto-optische
Modulatoren verzichtet werden kann.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einer Vorrichtung zur Strahlabschaltung bei einem
Laser Scanning Mikroskop mit einer Ablenkeinrichtung, die einen Laserstrahl rasternd über ein
Objekt führt, wobei der Laserstrahl innerhalb eines Feldes geführt wird, dadurch gelöst, daß
eine Blende vorgesehen ist, die neben dem Feld liegt und auf die die Ablenkeinrichtung den
Laserstrahl lenkt, wenn er nicht auf das Objekt treffen soll.
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Die Erfindung nimmt also vom bisherigen Prinzip, den Laserstrahl durch ein steuerbares, immer
in Strahlengang liegendes Element derart abzuschalten, so daß er aus diesem Element nicht
mehr austritt, Abstand. Stattdessen wird der Laserstrahl auf eine Blende gelenkt, auf der er
absorbiert wird. Dazu wird die Ablenkeinrichtung, die ohnehin zum rasternden Ablenken des
Laserstrahls ein wesentlicher Bestandteil eines Laser Scanning Mikroskopes ist, geeignet
angesteuert. Somit wird die Ablenkeinrichtung dazu verwendet, eine Beleuchtung des Objektes
mit dem Laserstrahl zu verhindern. Es erfolgt also keine Abschaltung mehr im üblichen Sinne.
Der Laserstrahl wird auf eine außerhalb des Feldes, das der Laserstrahl bei der Abrasterung
des Objektes überstreicht, liegende Blende geführt und dort absorbiert. Dann ist der Laserstrahl
am Erreichen des Objektes gehindert, und es kann keine Schädigung des Objektes eintreten.
Dies wird in Fortführung der eingeführten Terminologie in Zusammenhang mit dieser Erfindung
ebenfalls als Strahlabschaltung bezeichnet.
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Die Geschwindigkeit, mit der diese Strahlabschaltung erfolgt, ist durch die Ablenkeinrichtung
vorgegeben, die üblicherweise bei einem Laser Scanning Mikroskop sehr schnell arbeitet, da
dies aus anderen Gründen (Zeit zur Aufnahme eines Bildes) ohnehin erforderlich ist.
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Die Blende, auf die der Laserstrahl zur Strahlabschaltung gerichtet wird, kann prinzipiell im
Strahlengang an beliebiger Stelle nach der Ablenkeinrichtung sitzen. Je näher die Blende an
der Zwischenbildebene liegt, desto kleiner ist in der Blendenebene der Strahldurchmesser des
Laserstrahls und um so rascher erfolgt bei der Strahlabschaltung der Übergang von voller
Beleuchtung des Objektes zu voller Strahlabschaltung. An der Zwischenbildebene des
optischen Systems hat der Querschnitt des Laserstrahles die Größe des Spotdurchmessers, d.
h. die engste Einschnürung. Der Laserstrahl wird dann, wenn er rasternd auf den Rand einer in
der Zwischenbildebene liegenden Blende geführt wird, sehr rasch abgeschattet, im Extremfall
von einem Bildpunkt zum anderen. Es ist daher vorteilhaft, die Blende so nahe es konstruktiv
möglich ist, an bzw. in die Zwischenbildebene des Mikroskopes zu legen.
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Bei dieser Ausgestaltung ergibt sich nicht nur der Vorteil, daß das Abschalten besonders
schnell erfolgt, da der Laserstrahl bei gegebener Ablenkgeschwindigkeit sehr schnell mit dem
gesamten Strahlquerschnitt von der Bildfläche auf die Blende überführt werden kann, sondern
daß die Blende sehr klein gehalten werden kann, insbesondere nur die Größe des
Laserstrahldurchmessers haben muß, da der Laserstrahl einen nahezu minimalen
Durchmesser hat, wenn er die Blende trifft. Weiter ist es möglich, das Objekt während der
ohnehin im Bild nicht dargestellten Umkehrphasen der Ablenkeinrichtung vor Laserstrahlung zu
schützen oder während der Scanpausen.
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Die Blende muß lediglich so gestaltet sein, daß auf ihr der gesamte Laserstrahl plaziert werden
kann. Sie ist dabei so zu gestalten, daß sie mindestens die Fläche abdeckt, auf die die
Ablenkeinrichtung dauerhaft einen Strahl richten kann. Prinzipiell genügt somit eine
kreisförmige Blende geeigneter Größe, die nahe des Feldes so angeordnet ist, daß die
Ablenkeinrichtung den Laserstrahl darauf richten kann. Vorteilhafterweise liegt eine kleine
kreisförmige Blende am Ort der sog. Parkposition des Laserstrahles auf die der Laserstrahl in
den Scanpausen gerichtet ist, d. h. an einem Ort außerhalb des darzustellenden Feldes.
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Die Erfindung benutzt zur Strahlabschaltung vorteilhafterweise eine ohnehin vorhandene
Ablenkeinrichtung. Deren Ausgestaltung ist dabei weitgehend beliebig, solange sie in der Lage
ist, den Laserstrahl auf die neben dem abzutastenden Feld liegende Blende zu richten. In der
Regel bewirkt die Ablenkeinrichtung eine zweiachsige Ablenkung. Üblicherweise werden in der
Laser Scanning Mikroskopie zwei Kippspiegel verwendet, da damit maximale Freiheit bei der
Führung des Laserstrahls über die auf dem Objekt abgerasterte Bildfläche gegeben ist. Bei
einer solchen Ablenkeinrichtung, die in der Lage ist den Laserstrahl dauerhaft auf einen Punkt
zu richten, genügt ebenfalls eine einfache Kreisblende zur Strahlabschaltung.
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Bei einer Ablenkeinrichtung mit einem Kipp- und einem rotierenden Polygonspiegel ist dagegen
eine linien- bzw. zeilenförmige Blende erforderlich.
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Eine übliche Scanbewegung startet normalerweise in einer Ecke des auf dem Objekt
abgerasterten Bildfensters und führt zur diagonal Gegenüberliegenden. Der nächste Scan
beginnt dann wieder am Startpunkt des vorherigen Scans. Um das Objekt zwischen zwei
Scanvorgängen vor ungewollter Bestrahlung zu schützen, ist es zu bevorzugen, daß die Blende
L-förmig ausgebildet ist und dem Feld an zwei Rändern benachbart liegt, so daß sich die
Innenkanten der Blende am Rande des darzustellenden Feldes befinden, da dann der
Laserstrahl auf der L-förmigen Blende vom Endpunkt eines Scans zum Startpunkt des nächsten
Scans zurückgeführt werden kann, so daß er vor dem Beginn des Scans auf der Blende nahe
des Startpunktes für diesen Scan liegt. Dabei führt man den Laserstrahl zunächst parallel einer,
dann parallel zur anderen Blendenkante außerhalb des Bildfeldes zur Startposition. Nach dem
Abschalten des Laserstrahls ist dann ein wiederholtes Einschalten durch einfaches Führen des
Laserstrahls von der Blende auf den Startpunkt möglich. Dies kann sehr schnell erfolgen.
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In einer anderen Ausgestaltung ist die Blende als das Feld umgebendes Fenster ausgebildet,
da dann von jedem Punkt der abgerasterten Bildfläche der kürzestmögliche Abstand zur Blende
besteht. Damit kann eine besonders schnelle Abschaltung erreicht werden bzw. der Strahl
während der Umkehrphasen abgeschaltet werden.
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Beim Betrieb eines Laser Scanning Mikroskopes kann es aus untersuchungstechnischen
Gründen notwendig sein, die Größe des abgerasterten Feldes zu verkleinern
(optoelektronischer Zoom) und/oder die Mitte eines aktuell gescannten Bereiches innerhalb des
maximal möglichen Feldes zu verschieben (Offset). Dazu kann die Blende fest dimensioniert
der maximalen Größe des abzurasternden Feldes angepaßt sein. Sie kann aber besonders
vorteilhaft in Ort und Größe verstellbar ausgeführt werden, so daß sie in Abhängigkeit vom
gewählten Ablenkmuster (innerhalb der maximal möglichen Größe des Feldes) angepaßt
werden kann. Dazu ist vorteilhafterweise vorgesehen, daß die Ränder des Fensters durch
verstellbare Lamellen gebildet werden.
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Die Aufgabe wird bei einem Verfahren zum Betreiben eines Laser Scanning Mikroskops, bei
dem ein Objekt mit einem Laserstrahl abgerastert wird, dadurch gelöst, daß der Laserstrahl zur
Abschaltung des Laserstrahls auf eine neben einem bei der Objektabrasterung überstrichenen
Feld liegende Blende abgelenkt wird, wenn er das Objekt nicht erreichen soll. Dieses Verfahren
besitzt die eingangs anhand der Vorrichtung geschilderten Vorteile und ermöglicht eine schnelle
Laserstrahlabschaltung. Weiter muß zur Abschaltung lediglich die Ansteuerung der
Ablenkeinrichtung geändert werden, eine separate Ansteuerung eines Abschaltelementes
entfällt.
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Bei einem Verfahren, bei dem der Lichtstrahl während eines Scanvorganges von einem
Startpunkt auf dem Objekt zu einem Endpunkt geführt wird, ist es zweckmäßig, den Bildstrahl
vom Endpunkt auf die Blende zu lenken und auf der Blende zu einem Punkt nahe des
Startpunktes zurückzuführen. Dann ist einerseits eine sehr schnelle Abschaltung nach Ende
eines Scanvorgangs erreicht. Andererseits ist es möglich, zum Beginn eines Scanvorgangs den
Laserstrahl schnell wieder einzuschalten.
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Prinzipiell kann der Laserstrahl zur Abtastung des Objektes beliebig geführt werden. Eine
besonders zweckmäßige Ausgestaltung mit einer schnellen Abrasterung einer rechteckigen
Fläche ergibt sich jedoch, wenn der Laserstrahl hin- und hergehend in einer ersten Richtung
und senkrecht dazu in einer zweiten Richtung über das Objekt abgelenkt wird.
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Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung noch näher erläutert. In
der Zeichnung zeigt:
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Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Laser Scanning Mikroskops,
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Fig. 2a-e verschiedene Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Blende,
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Fig. 3 die erforderliche Form der Blende 2c bei Anordnung außerhalb der
Zwischenbildebene,
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Fig. 4 die prinzipielle Ausgestaltung der Blende 2c zur Berücksichtigung von Zoom und
Offset beim Scannvorgang und
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Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Abtastvorganges mit der Bahn des
Laserstrahles gegenüber der Blende und dem dargestellten Bildfeld.
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In Fig. 1 ist ein Laser Scanning Mikroskop schematisch dargestellt. Ein aus einem Laser oder
einer Faser austretender paralleler Laserstrahl 1 wird an einem Hauptstrahlteiler 2 in Richtung
einer zweiachsigen Ablenkvorrichtung mit Scanner-(Kipp-)Spiegeln 3 und 4 (x- und y-Achse)
reflektiert und in Ruhestellung beider Spiegel in Richtung der optischen Achse zu einem
Scanningobjektiv 5 gelenkt. Von diesem als 7b dargestellten Lichtbündel entsteht ein Laserspot
in einem Zentrum eines Zwischenbildes 8.
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Eine gestrichelte Linie 8a in der Ebene des Zwischenbildes 8 stellt die optisch bedingte Größe
eines maximal darstellbaren Feldes dar, das der maximalen Größe eines abzurasternden
Objektes zugeordnet ist. Der Verlauf des Strahlenbündels 7b ist weiter in Richtung eines
Objektivs 9 dargestellt. Von diesem Lichtbündel entsteht schließlich ein kleiner Laserspot auf
oder in einem Objekt 10.
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In die Ebene des Zwischenbildes 8 ist eine erfindungsgemäße Blende 6 in Form eines L (siehe
Fig. 2c) angeordnet, deren Funktion noch erläutert wird. Ein Lichtbündel 7a stellt schematisch
den Strahlverlauf für den Anfangspunkt eines Scanvorganges dar, während ein Lichtbündel 7c
die Lage des Laserstrahles nach der Beendigung eines Scanvorganges zeigt.
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Die vom Objekt 10 zurückkehrende Strahlung durchläuft in umgekehrter Richtung die Elemente
9, 5, 4, 3 und wird schließlich, je nach Anwendungsfall, am Hauptstrahlteiler 2 teilweise oder
nahezu vollständig in einen Detektionsstrahlengang zu einer Optik 11 (Pinholeobjektiv)
transmittiert und von dieser Optik 11 in der Ebene einer Blende 12 (Pinhole) fokussiert.
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Das durch das Pinhole getretene Licht wird schließlich von einem Detektor 13 in elektrische
Signale umgewandelt.
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Die Blende 6 dient zum schnellen Abschalten des Laserstrahls. Dabei wird der Laserstrahl auf
die Blende gerichtet. Der Begriff "Abschalten" ist aus Sicht des Objektes 10 zu verstehen, d. h.
der Laserstrahl 1 beleuchtet zwar bei Abschaltung die Scanner-Spiegel 3, 4, wird jedoch dann
auf der Blende 6 absorbiert, so daß er nicht auf das Objekt 10 fällt.
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In Fig. 1 sind schematisch drei verschiedene Ablenkungen des Laserstrahls 1 eingezeichnet.
Der mit 7a bezeichnete Laserstrahl fällt auf einen Punkt der abzutastenden Bildfläche 4, der der
Startpunkt eines Scanvorganges ist. Der mit 7b bezeichnete Laserstrahl befindet sich mitten in
einem Scanvorgang. Der mit 7c bezeichnete Laserstrahl ist auf die Blende 6 gerichtet und trifft
somit nicht auf das Objekt 10. Dadurch ist eine Abschaltung des Laserstrahls 1 erreicht, bei der
das Objekt nicht mit dem Laserstrahl 1 beleuchtet wird.
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Die Fig. 2a-c zeigen beispielhaft verschiedene Ausgestaltungen der Blende:
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In Fig. 2a ist eine kreisförmige Blende 14 dargestellt, die nahe der Startposition des
Laserstrahles liegt. Damit kann verhindert werden daß die Laserstrahlung während der
Einstellvorgänge bzw. in den Scanpausen das Objekt erreicht. Dazu werden die Scannerspiegel
so angesteuert, daß die Laserstrahlung ein kleines Stück diagonal nach links oben einen Punkt
außerhalb des maximal darstellbaren Feldes, die sog. Parkposition 20 in Fig. 5 und dort die
kleine kreisförmige Blende 14 der Fig. 2a trifft.
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Die Fig. 2b zeigt die auch in der Ausgestaltung der Fig. 1 verwendete L-förmige Blende 6, die
das max. darstellbare Feld an zwei Kanten begrenzt. Damit ist verhindert, daß die
Laserstrahlung auf dem Rückweg vom Endpunkt 23 in Fig. 5 des abgetasteten Feldes zum
Startpunkt das Objekt trifft.
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Bei einem Scannvorgang mit mäanderförmiger Abtastung eines Scanfeldes (Hin- und
Herbewegung des Abtaststrahles in einer Richtung und langsames Fortschreiten in der
senkrecht dazu liegenden Richtung) müssen die Scannerspiegel an den Zeilenanfängen und -
enden 22 von einer Bewegungsrichtung in die andere umgesteuert werden, wie in Fig. 5 zu
sehen ist. In diesen Phasen würden Verzerrungen bei der Bilddarstellung auftreten. Man führt
die Scanner deshalb etwas über das maximal darstellbare Feld hinaus und stellt die dabei
auftretenden Signale nicht mit dar. Um zu verhindern, daß das Objekt 10 in diesen
Umkehrphasen bestrahlt wird, ist die in Fig. 2c gezeigte Blende mit einer quadratischen Öffnung
geeignet, so daß der Laserstrahl diese Blende 15 nur für solche Bereiche des abgetasteten
Bildfeldes passieren kann, die auch ausreichend verzerrungsfrei dargestellt werden.
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Beim Abtasten der Objekte ist es üblich, zur vergrößerten Darstellung kleiner Details das
abgetastete Feld zu verkleinern, das Bild dieses kleineren Feldes aber in der Größe des vollen
Bildes darzustellen (optoelektronischer Zoom). In einem solchen Fall ist es zur Verhinderung
der Bestrahlung nicht dargestellter Objektbereiche zweckmäßig, die Blende 15 aus beweglichen
geraden Lamellen 16-19 herzustellen, wobei jede Lamelle 16-19 eine Kante des von der Blende
15 freigelassenen Feldes bildet. Diese Lamellen werden dann so eingestellt, daß nur der im
Bildfeld darzustellende Bereich 8b freigelassen wird (siehe Fig. 4).
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Ebenso ist es möglich, daß bei eingestelltem opto-elektronischem Zoom ein Detail außerhalb
der Feldmitte interessiert. Durch geeignete Einstellung der Lamellen 16-19 kann ein kleinerer
Feldbereich exzentrisch zur Feldmitte ausgewählt werden. Mit der oben beschriebenen
Ausgestaltung der Blende 15 ist es ohne weiteres möglich, einen symmetrisch zur neuen
Bildmitte 8c liegenden kleineren Objektbereich 8b mit Laserstrahlung zu bestrahlen.
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Die Möglichkeit zur paßgenauen Einstellung der Lamellen 16-19 für diese Fälle sind vielfältig.
Die Parameter für ihren erforderlichen Ort können aus den Ansteuerparametern der Scanner
gewonnen werden. Die Verfahrensweise ist aus dem Stand der Technik bekannt.
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Es ist apparativ nicht in jedem Fall möglich, die Blende 6, 14, 15 exakt in der
Zwischenbildebene 8 anzuordnen. Muß man die Blende in einer anderen Ebene positionieren,
so hat der Laserstrahl 7a, 7b, 7c noch nicht die engste Einschnürung erreicht. Um in diesem
Fall die Randbereiche des dargestellten Objektfeldes mit voller Intensität zu beleuchten, muß
die Blende um den Durchmesser des Strahlenbündels am Ort der Blende größer, als das
darzustellende Bildfeld gemacht werden und die Bildecken können mit dem Radius des
Strahlenbündels in der besagten Ebene gerundet sein. Diese Verhältnisse sind für die
Blendenform 15 nach Fig. 2c in Fig. 3 dargestellt.
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In Fig. 5 ist der Abtastvorgang eines rechteckigen Feldes schematisch dargestellt.
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Der Laserstrahl ist vor dem Scanvorgang durch entsprechende Ansteuerung der
Scannerspiegel in die Parkposition 20 gelenkt. Bei Scanbeginn wird er in die Position 21 zum
ersten Punkt des darzustellenden Feldes 8 geführt und gelangt sehr rasch zu dem
Umkehrpunkt 22, von dem aus er in entgegengesetzte Richtung zum anderen Umkehrpunkt 22
geführt wird. Diese Umkehrpunkte liegen außerhalb des darzustellenden Feldes. Während des
Vorganges der Umsteuerung der Scannerspiegel trifft der Laserstrahl die Blende 15, so daß
das Objekt 10 dann nicht bestrahlt wird.
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Hat der Laserstrahl den letzten Umkehrpunkt 23 am unteren Bildrand erreicht, so wird er
außerhalb des darzustellenden Feldes auf der Blende auf einer als 24 dargestellten Bahn in die
Parkposition 10 zurückgeführt.