JP5384896B2 - 照明された試料の光学的捕捉のための方法および装置 - Google Patents

照明された試料の光学的捕捉のための方法および装置 Download PDF

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Description

本発明は、照明された試料の光学的捕捉のための方法および装置に関する。
本発明の目的は、画像エリア全体の位置分解された検出を備えたライン走査型顕微鏡を提供することである。
本発明による解決策は、画像エリア全体の位置分解された検出を備えたライン走査型顕微鏡である(図1を参照)。
図1は本発明による顕微鏡の概略的な構造を示している。
(1)光学軸、(3)光源、(5)スイッチング可能な減衰器/AOM、(7)ライン成形光学系、(9)図面に垂直な回転軸を備えたスキャナ、(11)スキャン光学系、(13)図面に垂直な並進および光軸の周りの回転のための手段を備えており、試料に共役の中間画像面内にある周期パターンを備えたマスク、(15)位置分解する平面センサ、例えばCCD、(17)放出フィルタ、(19)主カラー・スプリッタ、(21)鏡筒レンズ、(27)顕微鏡対物レンズ、(29)試料。
検出用放射線経路内には対象物(29)から来る光の方向において、無限遠の放射線経路用に補正された対物レンズ(27)と、鏡筒レンズ(21)と、照明用放射線経路および検出用放射線経路を分離するための主カラー・スプリッタ(19)と、放出フィルタ(17)と、カメラ(15)、好ましくはCCDカメラとがある。光源(3)の励起用放射線経路内には放射線成形ユニット(7)があり、この放射線成形ユニットは、強度制御および波長選択のうちの少なくとも一つのための変調器(5)、例えばAOMまたはAOTFによって強度変調された光源(3)の光線をラインへと成形する。このラインは、中間画像面ZBの中または付近の、有利には回転可能で、かつ光軸に垂直な位相変位のために変位可能な、好ましくは位相格子である周期パターン(13)によって、対象面O内でパターン化される。放射線成形の後に配列され、ただし周期パターンの前に配列されたスキャナ(9)により、ライン状の光分布が、中間画像面ZBおよび対象面O内で、ラインの延びに垂直にスキャンされる。このラインは、対象面内では、図1でxとして印された方向に延びている。スキャン対物レンズ(11)はラインを周期パターン上に結像し、その際スキャナ(9)は、共役の対物レンズ(27)の瞳面の中または付近にある。
パターン(13)は、回転または並進のための手段を備えた格子の代わりに、電子的に制御可能な要素として、例えばLCDとしても実施可能である。このような要素は反射的な構成内の方が典型的には能率が良いため、このような要素の使用は、図2に概略的に示したような励起用放射線経路の改造を必要とし得る。
図2は、パターン化のための反射要素を備えた顕微鏡の概略的な構造を示している。
(1)光学軸、(3)光源、(5)スイッチング可能な減衰器/AOM、(7)ライン成形光学系、(9)図面に垂直な回転軸を備えたスキャナ、(11)スキャン光学系、(15)位置分解する平面センサ、例えばCCD、(17)放出フィルタ、(19)主カラー・スプリッタ、(21)鏡筒レンズ、(27)顕微鏡対物レンズ、(29)試料、(30)中間画像面内にあるパターン化のための反射要素(以下のさらなる描写も参照)。
上述の構成は、試料内のパターン化された照明の位相および方向を変更するために、要素(図1の13)(図2の30)のパターンを移動または修正するだけでよいという特別な利点を有している。試料上および検出器上のライン方向およびスキャン方向は変更されないままである。これは、特に仮想スリット絞り機能(図5に対する説明を参照)を使用する場合に、システム制御も画像分析も簡略化させる。同時に、試料内での照明のパターンが、試料(29)に対する要素(13)または(30)のパターンの相対的なポジションにのみ依存するので、欠陥源の可能性が排除される。
パターン、画像エリア、ライン、およびスキャン方向の相対的な方向付けが、図3a)〜図3c)に概略的に示されている。図3b)および図3c)では、パターン(13)が例示的にそれぞれ時計回りまたは反時計回りに45度回転されている。
図の下部分には、(任意のライン・ポジションにおけるスキャン・ラインの「凍結された」スナップ・ショットに関し)それぞれ瞳内に生じる回折画像が示されている。
図3は、画像面(上)および瞳面(下)内の照明のパターン化を示している。
上述の構成と、図5に描写されたような可変の部分共焦点検出を達成するための仮想スリット実現の様々な手法との組合せは、可能であり、かつ好ましい解決策の範囲に属している。これは、検出されたライン分布を、時間的にスキャン工程と同期化させて偏向するために、場合によってはカメラ(15)の前のさらなる要素の付加を含む。特殊性は、解像度向上のために照明をパターン化する場合にあるような、限界周波数付近でのラインのパターン化の際に生じる。この場合、中間画像の中または付近にあるパターンの場所では、パターンの周期およびライン幅が同じような大きさである。相応する比率が図4に概略的に示されている。
図4は、格子の2つの方向付けに関し、中間画像面内のラインとパターンの重なり(a)、および対象面内に結果として生じるパターン化されたライン(b)を示している。
これにより対象面内では、ラインおよび周期パターンの垂直な方向付けの場合の回折によって制限された結像に比べてラインの拡張が生じる。これに加え、パターンの表面に沿ってラインをスキャンする場合、回転が大きくなればなるほど、対象面内でのパターン化のコントラストが低下する。ラインの拡張が根本的な問題ではない一方で、コントラスト損失は、特定の適用に対しては不利である。しかし図5に関連して説明するような部分共焦点検出によって、このコントラスト損失は明らかに減少させることができ、なぜならライン中央部ではコントラストが最適だからである。これは図4に示されている。
図4aは、格子回転の関数としての、対象面内でのパターン化された照明内のコントラストを示している。
パターン化された照明の場合に一般的であるように、ここでも、高いNAの対物レンズで合焦する際には、偏光に注意を払うことが重要である。パターン化の最大限のコントラストのためには、偏光が画像面内のラインに垂直(図1〜図3におけるy方向)に方向付けられるべきである。ここに述べた装置の利点は、特に対物レンズ瞳に対してラインの置き方が変更されないままなので、様々な空間方向にパターン化するために偏光の回転を行う必要がないことである。
照明のパターン化の有利な実施形態
時間Δtでのスキャナの直線的なスキャン中に、カメラが同期的に少なくともΔtの露光時間で画像を取り込む場合、対象物の遠視野像と同等の結果が得られる。その際、焦点外のバックグラウンドも同様に一緒に検出される。断面画像の計算に必要なそれぞれの位相画像の記録の際に、変調器(5)によって、スキャン工程に同期して照明がy方向において同じように周期的にスイッチ・オンおよびオフされる場合、共焦点フィルタリングが可能になることが有利である。
この場合スキャナが、スイッチ・オンおよびオフを伴う連続的なスキャン移動だけでなく、スイッチ・オフされた区間内では速く、スイッチ・オンされた照明を伴う次のポジションに移動可能であり、このポジション内で、照明されたスキャン工程が続行されることも有利である。この移動は、ステッピング・モータでのようにステップ状に行ってもよいであろう。
本発明による方法によって、カメラ面内にはy方向においてパターン化された露光が生じる(図5を参照)。本発明の有利な形態では、カメラの露光された行の間隔は、試料上でのライン照明の際に、試料内の次のライン照明に相応するカメラ上の領域内への焦点外のバックグラウンドの混信が最小限になるように選択される。ナイキスト定理に基づく対象物の走査の場合(PSFの半分の幅)、経験的に、隣接する露光行の間隔M=5〜10行で十分である。この場合、カメラによって捕捉された次の画像内では、露光された行パターン(カメラ上への回折によって制限された結像の場合、ライン分布が約2つの受信行を覆う)が、好ましくは1行だけ変位されており、これは変調器のスイッチ・オンを相応に遅らせることによって達成される。
つまり、例えば最初に1行目、10行目、20行目などが露光され、次に2行目、11行目、および21行目が露光される。
この工程は、画像エリア内の試料が、一通り隙間なく走査されるまで繰り返され、その際、この記録工程の結果として、M×位相変位の数(好ましくはM×3)の画像が存在する。
代替案として、1つの行走査のために、まず周期パターンの複数の位相位置での記録を行い、次いで走査の行パターンを変位してもよいであろう。
他方でまた、これらの各画像は、既に述べた方法に加えて、好ましくは試料保護のためできるだけ低い強度で、同じスキャナ調整で記録を繰り返し、これに続き平均値を算出することによって生成してもよい。この方法は、試料内の漂白工程に基づくアーチファクトを減少させることができる。M×3個の位相画像の割振りを介し、これで共焦点性が調整され得る。
特に、個々の画像に関し、露光された受信器行の間の、受信器によって捕捉され、露光されたバックグラウンドを算出しなければならない。バックグラウンドは、受信器上で容易に識別可能である(本来は光があってはならない領域)。
全ての画像を単純に足し合わせると、遠視野像に相応する結果が得られる。対象物の焦点内での相応の照明された行に相当する行の選択に基づく画像の足し合わせが、共焦点画像を生じさせる。この工程では、選択された行に相補的な(隣接する)画像領域を、上述のようにマスキングして分析しない。利用しないマスキングされた画像領域が、焦点外の散乱光の検出場所に相応するので、これは仮想スリット絞りの機能に相当する。その際、共焦点性は、1 Airy−Unit(2行が選択される)からM Airy−Unitまで変化させ得る(仮想スリット絞り)。
図5は、変調器(AOM)がスイッチ・オンおよびオフされた場合の、共焦点検出のためのカメラ上での露光パターンを示している。
その際、画像記録の速度が、非共焦点の検出に比べて係数Mだけ減少される。50個/sの画像取込みを基礎とすると、M=5の場合、(パターン化の1つの位相位置で)完全な画像を100msで得ることができる。ただしパターン化方向N=3〜5ごとに、様々な位相位置での画像を記録しなければならないことを考慮に入れるべきである。このため、3つのパターン化方向での直線的なパターン化の場合、典型的には9個の画像が生じ[7]、これはM=5の場合、1つの面につき約1sの画像記録時間を発生させる。
スキャナ(23)が、単調に(速度Vで)画像エリアの表面に沿ってスキャンするのではなく、レーザがスイッチ・オフにされた時間内は最大速度Vmaxで移動する場合、いくらか有利な状況が生じる。これは確かに、スキャナの制御および同期に対する要求が比較的高くなるが、しかし画像記録時間を以下の係数だけ、
Figure 0005384896
つまり、およそM倍(Vmax>>Vの場合)またはカメラの最大画像記録レートまで速くする。
M個の行パターンによる順次の走査の代替案として、M個の行画像の代わりに1個だけの画像を取り込み、それにもかかわらず共焦点検出が可能な案を以下に述べる。その際、ライン・スキャナでは対象物が行ごとに順次に走査されるという事実を利用する。これは、検出用放射線経路内で、さらなる要素により、検出光の行ごとの偏向を実現することを可能にし、これにより対象物が連続的にスキャンされるにもかかわらず、検出器上には図5のような行パターンが生じる。画像全体を検出器上でこのように結像するには、検出器が、1個の画像のためよりM倍多い行を備えるという前提条件が必要である。典型的な値は、1画像につき500行である。M=5では、必要な検出器行数は2500である。行偏向のための要素として、検出器の前で例えばガルボ・スキャナを使用してもよいであろう。例えば、上述のようにY方向における偏向を担うスキャナ(9)と同じ偏向軸を備えたスキャナ(24)が、例えば10回の変位された不連続のスキャン・ジャンプを、スキャナ(9)の順次の行走査の1つの行ポジション内で、スキャナ(9)が次の検出される行ポジション内に進む前に、発生させる。その際、スキャナ(9)が連続的にスキャンすることもできる一方で、検出器前のスキャナは常に不連続に、高い偏向速度で運転されなければならない。その際、時間tでのスキャン・ジャンプの合間の時間tが、カメラ上での実質的な行積分時間に相当する。少なくともM・t<tが適用されなければならない。
このスキャン・ジャンプは、平面検出器上に、照明された試料の互いに間隔をあけた信号を発生させ、この信号は、特に図5に基づき上で詳細に説明したように、意味に即して、検出器の互いに間隔をあけた領域に相応する。
カメラ上のピクセルの大きさが5μmである場合、最大偏向角度は、上で詳述された例では、カメラ上で(2500−500)×5μm=10mmの変位が生じるような角度になる。これは、カメラとスキャナの間隔が50mmの場合、5度のスキャン角度に相当する(10度の偏向のために)。
例えば、上述のようにY方向における偏向を担うスキャナ(9)と同じ偏向軸を備えたスキャナが、例えば10回の変位された不連続のスキャン・ジャンプを、スキャン(9)の順次の行走査の1つの行ポジション内で、スキャナ(9)が次の検出される行ポジション内に進む前に、発生させる。その際、スキャナ(9)が連続的にスキャンすることもできる一方で、スキャナ(24)は常に不連続に、高い偏向速度で運転されなければならない。その際、時間tでのスキャン・ジャンプの合間の時間tが、カメラ上での実質的な行積分時間に相当する。少なくともM・t<tが適用されなければならない。
このスキャン・ジャンプは、平面検出器上に、照明された試料の互いに間隔をあけた信号を発生させ、この信号は、特に図5に基づき上で詳細に説明したように、意味に即して、検出器の互いに間隔をあけた領域に相応する。
図6には、光源LQ、放射線成形(円柱レンズ)ZL、スキャナP3、スキャン光学系SO、パターン化された要素G、レンズL、対物レンズ瞳内の主カラー・スプリッタMDB、対物レンズO、試料PR、ならびに検出側にフィルタF、レンズTL、および検出器DEから成るさらなる装置が示されている。
瞳面に共役の面内に、放射線成形のためのDOEが配置されており、このDOEは、ZLによって生成されたラインを、格子G(振幅格子)に、格子の周期に関して適合させ、これにより照明光は格子を通り抜け、かつ格子開口部で構造的な干渉が発生する。これにより、そうでなければ発生する振幅格子での50パーセントの損失が回避されることが有利である。
ビーム・スプリッタは、図7に示されたように形成されることが有利であり、かつ高反射性の領域HRを備えており、この領域HR上に、図6でのLによって回折次数が結像され、かつ試料PRの方向に達する。
ビーム・スプリッタMDBの残りの領域は透過性に形成されており、これにより試料光が検出器DEの方向に達する。
独国特許出願公開第10257237(A1)号明細書の開示を参照のこと。
図8には、図7に基づくMDBの使用の下での、パターン方向を回転させた場合の対物レンズ瞳(MDBの面)内の光分布が、図3と同じように示されている。図8a)では、パターン化方向が、試料内でのラインの方向付けに平行である。このため、共役の瞳面内の暗いラインとして示された0次の回折次数のみが有効である。パターン化を回転させた場合(そのためにGおよびDOEが一緒に回される)、さらに±1次の回折次数が発生し、この±1次の回折次数は、a)の置き方を中心に好ましい対称的な回転をさせた場合、瞳内の同じ位置にあり、かつMDBの反射的な領域によって反射され得る。
代替案として、パターン化された要素Gを位相格子として設計することもできる。この場合、図8a)に示されたようなy方向におけるパターン化は、スキャン移動に同期した照明のスイッチングによって達成しなければならない。この場合には、DOEおよび両方の隣り合ったレンズが省略可能であり、かつ要素Gを、SOによって生成された中間画像内に直接的に置くことができる。
図9では、スプリッタMDBが、DMD(digital mirror device)として形成されて瞳面内に配置されている。
マイクロ・ミラーの相応のスイッチングによって、パターンGの回転により生じる任意の光分布を試料方向に偏向させることができ(図9bのPR out−on)、一方で試料光は、スイッチングされないミラーを介して(図9bのDE out−off)検出DEの方向に達する(照明/検出のためのDMDの相応に最適化された配置の場合)。
本発明は、上述の実施形態だけに拘束されるものではない。
当業者の枠内で、本発明のアイディアの修正および変更を包括することができる。
例えば、本発明は意味に即して、多点配置(米国特許第6028306号明細書)および他の点配置のような他の照明分布に、またニポウ・ディスクおよび遠視野における検出の場合にも適用可能である。
本発明による顕微鏡の概略的な構造を示す図。 パターン化のための反射要素を備えた顕微鏡の概略的な構造を示す図。 aは画像面(上)および瞳面(下)内の照明のパターン化を示す図であり、bは画像面(上)および瞳面(下)内の照明のパターン化を示す図であり、cは画像面(上)および瞳面(下)内の照明のパターン化を示す図である。 aは中間画像面内のラインとパターンの重なりを示す図であり、bは対象面内に結果として生じるパターン化されたラインを示す図である。 格子回転の関数としての、対象面内でのパターン化された照明内のコントラストを示すグラフ。 変調器(AOM)がスイッチ・オンおよびオフされた場合の、共焦点検出のためのカメラ上での露光パターンを示す図。 光源LQ、放射線成形(円柱レンズ)ZL、スキャナP3、スキャン光学系SO、パターン化された要素G、レンズL、対物レンズ瞳内の主カラー・スプリッタMDB、対物レンズO、試料PR、ならびに検出側にフィルタF、レンズTL、および検出器DEから成るさらなる装置を示す図。 ビーム・スプリッタMDBの有利な形成を示す図。 aは図7に基づくMDBの使用の下での対物レンズ瞳(MDBの面)内の光分布を図3と同じように示す図であり、bは図7に基づくMDBの使用の下での対物レンズ瞳(MDBの面)内の光分布を図3と同じように示す図であり、cは図7に基づくMDBの使用の下での対物レンズ瞳(MDBの面)内の光分布を図3と同じように示す図である。 aはスプリッタMDBが、DMD(digital mirror device)として形成されて瞳面内に配置された装置を示す図であり、bはマイクロ・ミラーによる光の偏向を示す図である。
符号の説明
7…ライン成形光学系、11…スキャン光学系、13…マスク、30…反射要素。

Claims (29)

  1. 試料を光学的に深さ方向に分解して捕捉するための装置であって、
    照明光のライン状の放射線成形のための手段と、
    照明用放射線経路内で照明光の少なくとも1つの空間方向における周期パターンを生成するための手段と、
    対物レンズと、
    該試料から来る光を検出するための、および該試料の画像を生成するための、および該画像を基に、解像度が向上された少なくとも1つの光学的断面画像を計算するための手段と、
    スキャン手段と、を含み、
    前記周期パターンを生成するための手段が、照明方向において該スキャン手段の後ろに配列される装置において、
    該パターンを生成するための手段によって生成された回折画像が、対物レンズ瞳の中または付近で結像され、該対物レンズ瞳の中または付近には、該回折画像を試料方向に反射する0次および+/−1次の回折次数のための高反射性の領域(−1、0、+1)を備えており、かつ該領域の他では該試料から来る光を検出方向に伝達するため透過性に形成されたビーム・スプリッタ(MDB)が設けられるか、
    またはスイッチング可能なミラー・アレイであるビーム・スプリッタが設けられ、前記スイッチング可能なミラー・アレイが、第1の位置において0次および+/−1次の回折次数の該回折画像を試料方向に伝達し、かつ第2の位置において該試料光検出方向に反射することを特徴とする装置。
  2. 前記スキャン手段が、放射線成形のための手段と前記パターン化のための手段の間に配置される、請求項1に記載の装置。
  3. 前記パターンの回転および位相位置の変更のための手段が設けられる、請求項1または2に記載の装置。
  4. 前記パターンを生成するための手段が、前記スキャン手段と前記対物レンズの間の中間画像内に設けられる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の装置。
  5. 前記パターンを生成するための手段が、透過性または反射性に形成される、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の装置。
  6. 前記パターンを生成するための手段が、振幅格子または位相格子または干渉分布である、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の装置。
  7. 前記照明光の偏光が、前記周期パターンの回転と同期的に行われる、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の装置。
  8. 前記試料光の非デスキャン検出のための平面検出器またはカメラが設けられ、
    その際、照明された試料領域の間に間隙を生成するため、かつ/または該平面検出器上で、該照明された試料領域からの検出光で露光された行の間に間隙を生成するため、走査工程中に光遮断するための手段が設けられる、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の装置。
  9. 前記照明用放射線経路内に強度制御手段が設けられる、請求項8に記載の装置。
  10. 電気光学変調器または音響光学変調器が、光遮断のために設けられる、請求項8または9に記載の装置。
  11. ラインごとの走査工程中に、前記検出器上での前記試料光を、ラインごとに不連続または連続的に前記検出器上に広げるため、検出用放射線経路内にスキャナが設けられる、請求項8に記載の装置。
  12. 試料の光学的捕捉のための方法であって、
    その際、該試料または試料の少なくとも一部が、ライン状の照明で、スキャン手段によりスキャンされ、該照明光のライン状の放射線成形が行われ、
    および該照明光が、少なくとも1つの空間方向において好ましくは周期パターンを有しており、該試料から来る光が検出され、かつそれを基に該試料の画像が生成され、
    該画像を基に、該試料の少なくとも1つの光学的断面画像および解像度のうちの少なくとも一つが向上された画像が計算され、
    該照明光の該パターンの生成が、該照明光の該スキャン手段の通過後に行われる方法において、
    該パターンを生成するための手段によって生成された回折画像が、対物レンズ瞳の中または付近で結像され、該対物レンズ瞳の中または付近には、該回折画像を試料方向に反射する0次および+/−1次の回折次数のための高反射性の領域を備えており、かつ該領域の他では該試料から来る光を検出方向に伝達するため透過性に形成されたビーム・スプリッタが設けられるか、
    またはスイッチング可能なミラー・アレイであるビーム・スプリッタが設けられ、前記スイッチング可能なミラー・アレイが、第1の位置において0次および+/−1次の回折次数の該回折画像を試料方向に伝達し、かつ第2の位置において該試料光検出方向に反射することを特徴とする方法。
  13. まず放射線成形が行われ、次いで前記スキャン手段の通過、およびその後、パターン化が行われる、請求項12に記載の方法。
  14. 前記パターンの回転および位相位置の変更が行われる、請求項12または13に記載の方法。
  15. 前記パターンの生成が、透過性または反射性の手段によって行われる、請求項1乃至14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 前記照明光の偏光が、前記周期パターンの回転と同期的に行われる、請求項1乃至15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 行ごとの非デスキャン検出のための平面検出器またはカメラ上で、照明された試料領域からの検出光で露光された行の間に間隙が生成される、請求項1乃至16のいずれか1項に記載の方法。
  18. ラインごとの照明および検出の際、前記照明が何度もスイッチ・オンおよびオフされる、請求項1乃至17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 試料走査の際に、2つの照明された試料領域の間に間隙があるように光遮断が繰り返される、請求項1乃至18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記露光された試料領域の間の間隙に割り当てられたカメラ領域の、部分的または全体的なマスキングによる画像の計算が行われ、かつそのように取得された該画像の割振りが行われる、共焦点の画像生成のための、請求項1乃至19のいずれか1項に記載の方法。
  21. 隣接して走査された試料領域が、割り振られた画像内で正しくスケーリングされて隣接して割り当てられるように前記割振りが行われる、請求項20に記載の方法。
  22. 前記検出器前でのスキャン工程中に、ラインによる前記試料の走査方向へのさらなる光偏向が行われる、請求項1乃至21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記光偏向の速度が、試料と照明光の相対移動の速度より大きい、請求項1乃至22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記光偏向がステップごとに行われる、請求項1乃至23のいずれか1項に記載の方法。
  25. 前記光偏向が連続的に行われる、請求項1乃至24のいずれか1項に記載の方法。
  26. 走査型レーザ顕微鏡における、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の装置。
  27. 走査型レーザ顕微鏡における、請求項12乃至25のいずれか1項に記載の方法。
  28. 前記スイッチング可能なミラー・アレイはDMDである、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の装置。
  29. 前記スイッチング可能なミラー・アレイはDMDである、請求項12乃至25のいずれか1項に記載の方法。
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