CN104089935A - 超分辨荧光寿命相关光谱系统 - Google Patents

超分辨荧光寿命相关光谱系统 Download PDF

Info

Publication number
CN104089935A
CN104089935A CN201410332038.9A CN201410332038A CN104089935A CN 104089935 A CN104089935 A CN 104089935A CN 201410332038 A CN201410332038 A CN 201410332038A CN 104089935 A CN104089935 A CN 104089935A
Authority
CN
China
Prior art keywords
laser
fluorescence
fluorescence lifetime
super
laser instrument
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410332038.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104089935B (zh
Inventor
于建强
袁景和
方晓红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Qinghe Jingyuan Semiconductor Technology Co ltd
Original Assignee
Institute of Chemistry CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Chemistry CAS filed Critical Institute of Chemistry CAS
Priority to CN201410332038.9A priority Critical patent/CN104089935B/zh
Publication of CN104089935A publication Critical patent/CN104089935A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104089935B publication Critical patent/CN104089935B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Abstract

本发明公开了一种超分辨荧光寿命相关光谱系统。激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至显微物镜；经显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经显微物镜汇聚后经收集透镜收集后入射至光电探测器，光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；激光器a和激光器b的同步触发信号输入至光学信号采集器。本发明超分辨荧光寿命相关光谱系统，在超分辨的基础上实现荧光寿命相关光谱，减小了探测焦斑体积，提高了荧光寿命相关光谱系统的最大使用浓度；由于使用了荧光寿命分离的方法，相关分析的信噪比得到了较大的提高，提高了探测弱信号的能力。

Description

超分辨荧光寿命相关光谱系统
技术领域
本发明涉及一种超分辨荧光寿命相关光谱系统，属于显微成像领域。
背景技术
由于非侵入式、三维成像和可特异性标记成像等不可替代的优势，光学显微镜成为当今生命科学中重要的研究工具，但是由于光学衍射的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的空间分辨率，限制了它在纳米尺度对细胞内分子结构和功能研究中的应用。2006年以来各国研究人员提出了光活化定位显微镜(PALM)、随机光学重构显微镜(STORM)、受激辐射耗尽(Stimulated emission depletion-STED)显微镜等几种突破衍射极限的荧光成像新原理，其中STED显微镜以其时间分辨的优势在对动态过程的成像应用中具有很大的前景。
STED显微镜作为一种超分辨的共聚焦光学显微镜，是一种扫描成像技术，它是在传统共聚焦显微镜的基础上，添加一路STED光束，通过调制STED光束波前在物镜焦平面上形成空壳形状焦斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射态，实现了好于50纳米的空间分辨率。目前超分辨的共聚焦光学显微镜的研究还处于起步阶段，与其它探测技术的结合尚未开展。
荧光相关光谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy-FCS)是一种可以在溶液中研究荧光标记的单个或多个分子荧光特性的光学技术，通过对荧光强度波动的自相关分析可以得到细胞内荧光标记的生物大分子的浓度、扩散系数、化学反应速率常数等参数，因此FCS可以应用于研究细胞内DNA和蛋白质构象的变化、大分子的扩散和旋转、细胞膜的流动特性、细胞配体与受体的相互作用和化学反应过程分析等，成为生命科学中单分子研究的重要工具。
但是FCS有一个很大的缺点是无法区分扩散系数相近的两个分子，而且当溶液中多于两种荧光分子时的相关分析更加复杂，虽然可以使用荧光互相关光谱(Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy-FCCS)技术探测多颜色通道使相关分析简化，但是增加探测通道会增加系统的复杂性，而且还会面临串色等问题。
为了降低FCCS系统的复杂性和不确定性，荧光寿命相关光谱(FluorescenceLifetime Correlation Spectroscopy-FLCS)技术被提出来，FLCS系统最大的优点是可以使用一路激发光和一路探测装置，通过荧光寿命的不同从混合溶液中分离出不同的荧光分子，FLCS可以实现荧光自相关和互相关分析。FLCS系统不仅可以实现传统FCCS的功能，而且简化了传统FCCS装置，降低了背景信号的干扰，所以成为了生命科学中重要的研究工具。
FLCS是基于共聚焦显微术的，探测荧光的区域为一个光学衍射极限下的艾里斑体积，FLCS系统获得的光强波动来自于此焦斑内所有荧光分子辐射荧光的统计平均值，由于衍射极限的限制，共聚焦显微镜的有效焦斑体积大于0.1飞升，为了获得信噪比较好的相关曲线，通常探测体积内的平均分子数应小于10个，因此需要溶液浓度小于0.1微摩尔每升数量级，而细胞中的许多大分子通常是浓稠的，这严重限制了FLCS在研究细胞内分子的运动中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种超分辨荧光寿命相关光谱系统，通过在共聚焦光学显微镜中加入第二路调制光，实现超分辨的共聚焦光学显微成像，突破传统的光学衍射极限的限制；在此基础上实现的荧光寿命相关光谱可以在探测体积小于共聚焦衍射斑体积下探测荧光强度的波动，提高了FLCS可探测的最大浓度。
本发明所提供的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；
所述激光器a和所述激光器b的同步触发信号输入至所述光学信号采集器。
上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述激光器a输出和所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜，以调整光路对准。
上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜之前经过一反射镜和一滤波片，分别用于对准光路和滤除激发光。
上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述光学信号采集器与控制采集处理软件相连接，由所述控制采集处理软件进行重构和处理获得超分辨荧光显微图像和相关曲线。
上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述控制采集处理软件与位移控制器相连接，所述位移控制器与所述样品台相连接，用于控制所述样品台的移动。
本发明提供的超分辨荧光寿命相关光谱系统具有以下有益效果：
1、在一套成像平台上实现光学超分辨成像，提高了传统共聚焦显微镜成像的分辨率。
2、在超分辨的基础上实现荧光寿命相关光谱，减小了探测焦斑体积，提高了荧光寿命相关光谱系统的最大使用浓度。
3、由于使用了荧光寿命分离的方法，相关分析的信噪比得到了较大的提高，提高了探测弱信号的能力。
4、相比较于传统的FCS，荧光寿命相关光谱技术使用了分离荧光强度再做互相关的技术，可以消除探测器跟随脉冲对实验结果带了的干扰。
附图说明
图1为本发明提供的超分辨荧光寿命相关光谱系统的结构示意图。
图中各标记如下：1激光器a、2二向色性滤光片a、3激光器b、4位相板、5二向色性滤光片b、6反射镜a、7显微物镜、8样品台、9位移控制器、10反射镜b、11滤波片、12收集透镜、13光电探测器、14光学信号采集器、15控制采集处理软件。
图2为使用本发明系统对荧光微球溶液进行的荧光相关光谱测量，与共聚焦荧光相关光谱曲线(右侧曲线)比，超分辨荧光相关光谱的相关曲线(左侧)相关时间较短。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
本发明提供的基于受激辐射耗尽荧光显微术的荧光相关光谱系统，激光器a1输出的激光经二向色性滤光片a2滤光后经反射镜a6反射后汇聚至显微物镜7，激光器b3输出的激光依次经位相板4和二向色性滤光片b5滤光后经反射镜a6反射后汇聚至显微物镜7；经过显微物镜7汇聚的激光照射至样品台8上，待测样品的荧光信号又经显微物7汇聚后经反射镜a6、二向色性滤光片a2、二向色性滤光片b5、反射镜b10、滤波片11和收集透镜12收集后入射至光电探测器13，光电探测器13输出的光电信号输入至光学信号采集器14；光学信号采集器14和位移控制器9均与控制采集处理软件15相连接，用于控制样品台8的移动和采集光学信号采集器14的数据。同时，激光器a1和所述激光器b3的同步触发信号输入至光学信号采集器14中。
本发明提供的系统中，激发用激光器a1经过二向色性滤光片a2、反射镜a6反射入显微物镜7，经显微物镜7汇聚后，激发样品发射荧光；退激发用激光器b3，经过位相板4调整光束波前，经二向色性滤光片b5和反射镜a6反射后，经显微物镜7汇聚后形成空壳型焦斑，将激发光激发的荧光斑周围荧光分子退激发，最后只有小体积的荧光分子自发辐射荧光，实现受激辐射耗尽超分辨光学成像；样品台8连接位移控制器9，在控制采集处理软件15的控制下对样品进行扫描，同时获得不同位置的光学信号。荧光信号经显微物镜7收集后，经反射镜a6和反射镜b10反射后，由滤波片11滤除荧光以外的其它光，经收集透镜12汇聚后，由光电探测器13转换为电信号；由光电探测器13获得的电信号连接光学信号采集器13，由控制采集处理软件15进行重构和处理获得超分辨荧光显微图像。
使用上述系统对荧光标记的40纳米直径的纳米微球进行了超分辨光学成像试验，其中光学超分辨显微图像的分辨率已经达到50nm的横向空间分辨率，远远超过传统的共聚焦显微镜。
使用上述系统对40纳米荧光微球的溶液进行了超分辨荧光相关光谱实验，如图2所示，左侧曲线为超分辨荧光相关光谱相关曲线，右侧曲线为共聚焦荧光相关光谱相关曲线，从图2中可以得出超分辨荧光扩散时间小于共聚焦荧光扩散时间，这说明本发明超分辨荧光相关光谱的探测体积小于共聚焦荧光相关光谱的探测体积。

Claims (5)

1.超分辨荧光寿命相关光谱系统，其特征在于：
激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；
所述激光器a和所述激光器b的同步触发信号输入至所述光学信号采集器。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述激光器a输出和所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜之前经过一反射镜和一滤波片。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，其特征在于：所述光学信号采集器与控制采集处理软件相连接。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述控制采集处理软件与位移控制器相连接，所述位移控制器与所述样品台相连接。
CN201410332038.9A 2014-07-11 2014-07-11 超分辨荧光寿命相关光谱系统 Active CN104089935B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410332038.9A CN104089935B (zh) 2014-07-11 2014-07-11 超分辨荧光寿命相关光谱系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410332038.9A CN104089935B (zh) 2014-07-11 2014-07-11 超分辨荧光寿命相关光谱系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104089935A true CN104089935A (zh) 2014-10-08
CN104089935B CN104089935B (zh) 2018-03-13

Family

ID=51637671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410332038.9A Active CN104089935B (zh) 2014-07-11 2014-07-11 超分辨荧光寿命相关光谱系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104089935B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104515760A (zh) * 2014-12-17 2015-04-15 香港纳观生物有限公司 双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统
CN107013872A (zh) * 2017-03-07 2017-08-04 上海斐讯数据通信技术有限公司 一种节能路灯、节能路灯控制系统和控制方法
CN108181282A (zh) * 2018-01-03 2018-06-19 宁波纳美致生物科技有限公司 一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法
CN108844930A (zh) * 2018-05-14 2018-11-20 杨佳苗 分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009115244A1 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg A method and an apparatus for localization of single dye molecules in the fluorescent microscopy
CN201716464U (zh) * 2010-07-09 2011-01-19 浙江大学 基于切向偏振的超分辨荧光显微装置
US20130256564A1 (en) * 2010-11-22 2013-10-03 Deutsches Krebsforschungszentrum STED Microscopy With Pulsed Excitation, Continuous Stimulation, And Gated Registration Of Spontaneously Emitted Fluorescence Light
CN103604787A (zh) * 2013-11-14 2014-02-26 北京大学 一种激光扫描位相显微成像方法及系统
CN103676123A (zh) * 2013-12-18 2014-03-26 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 多模式光学高分辨显微镜
CN103698309A (zh) * 2013-12-26 2014-04-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于可调谐激光的sted超分辨显微镜

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009115244A1 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg A method and an apparatus for localization of single dye molecules in the fluorescent microscopy
CN201716464U (zh) * 2010-07-09 2011-01-19 浙江大学 基于切向偏振的超分辨荧光显微装置
US20130256564A1 (en) * 2010-11-22 2013-10-03 Deutsches Krebsforschungszentrum STED Microscopy With Pulsed Excitation, Continuous Stimulation, And Gated Registration Of Spontaneously Emitted Fluorescence Light
CN103604787A (zh) * 2013-11-14 2014-02-26 北京大学 一种激光扫描位相显微成像方法及系统
CN103676123A (zh) * 2013-12-18 2014-03-26 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 多模式光学高分辨显微镜
CN103698309A (zh) * 2013-12-26 2014-04-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于可调谐激光的sted超分辨显微镜

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PO-YEN LIN ET AL: "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy with Subdiffraction-Limited Resolution", 《JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS》 *
盛翠霞等: "荧光寿命相关光谱数据处理算法", 《红外与激光工程》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104515760A (zh) * 2014-12-17 2015-04-15 香港纳观生物有限公司 双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统
CN104515760B (zh) * 2014-12-17 2017-10-31 深圳市纳观生物有限公司 双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统
CN107013872A (zh) * 2017-03-07 2017-08-04 上海斐讯数据通信技术有限公司 一种节能路灯、节能路灯控制系统和控制方法
CN108181282A (zh) * 2018-01-03 2018-06-19 宁波纳美致生物科技有限公司 一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法
CN108181282B (zh) * 2018-01-03 2019-03-15 宁波纳美致生物科技有限公司 一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法
US10914680B2 (en) 2018-01-03 2021-02-09 Shenzhen Naguan Biotech Co., Ltd. Three-channel fluorescence localization super-resolution biological microscope system and method
CN108844930A (zh) * 2018-05-14 2018-11-20 杨佳苗 分光瞳共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN104089935B (zh) 2018-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108120702B (zh) 一种基于并行探测的超分辨荧光寿命成像方法和装置
CN107907513B (zh) 一种基于偏振解调的点扫描超分辨成像方法和装置
Ortega-Arroyo et al. Interferometric scattering microscopy (iSCAT): new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy
CN106290284A (zh) 结构光照明的双光子荧光显微系统与方法
CN206757171U (zh) 新型多角度环状光学照明显微成像系统
Arpali et al. High-throughput screening of large volumes of whole blood using structured illumination and fluorescent on-chip imaging
CN104089935A (zh) 超分辨荧光寿命相关光谱系统
CN103543135B (zh) 一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置
CN110907415B (zh) 一种基于并行探测的三维亚十纳米定位方法及装置
CN103616355B (zh) 超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统
CN102809672A (zh) 超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统
CN111024659B (zh) 一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法和装置
CN107014795B (zh) 一种基于均匀结构光照明的共聚焦并行显微成像系统
CN103487421A (zh) 时间门控宽场受激辐射超分辨显微方法及装置
CN111024658A (zh) 一种荧光分子定向定位方法和装置
CN111580261B (zh) 一种基于落射式照明的显微成像装置
CN101726483A (zh) 分子印迹、激光镊子及微流控对化学物的检测法及检测器
CN108107034B (zh) 基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法
CN112816396A (zh) 一种基于emccd和afm的检测成像系统
CN115753717A (zh) 一种单波长激发的荧光调制多色超分辨显微成像方法
CN107678151B (zh) 基于干涉阵列光场的共聚焦并行显微成像仪
CN106404723B (zh) 一种二次谐波高分辨率成像方法及系统
CN110907414A (zh) 一种基于并行探测的二维亚十纳米定位方法及装置
CN104390951B (zh) 一种高灵敏度全光纤反斯托克斯拉曼探测系统
CN108627494B (zh) 一种用于快速二维拉曼光谱扫描成像的系统

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230518

Address after: 100083 146, 1f, building 4, Xiaoguan (Changnan District), No. 25, Huayuan North Road, Haidian District, Beijing

Patentee after: Beijing Qinghe Jingyuan Semiconductor Technology Co.,Ltd.

Address before: 100190 No. 2 North First Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun

Patentee before: INSTITUTE OF CHEMISTRY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

TR01 Transfer of patent right