CN112444505A - 一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米生物材料技术领域，公开一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。该方法包括将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，采用双激发光，通过监测纳米探针发光强度来检测待测目标物的浓度；纳米探针为染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；待测目标物选自细胞内与众多生理和病理有关活性氧、活性氮，或者细胞内的金属离子。该方法利用染料高效敏化上转换纳米颗粒的能量传递过程，提高检测的灵敏度；提供双激发比率探针模型，作为设置参比，减少因为细胞内复杂环境、探针分布、仪器设备引起的检测偏差；提供近红外双激发共聚焦显微镜系统的设计方案，为检测细胞内物质提供新思路。

Description

一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，尤其是涉及一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。
背景技术
发展非入侵性荧光探针，监测活细胞内的生物分子或生理过程，对了解细胞生物学、病理学和其他生物医学相关科学至关重要。然而，当前胞内分析主要通过靶向成像或非定量荧光标记，不能达到实际需求。其中的一个原因是探针的灵敏度低。例如，细胞里次氯酸浓度很低，如果没有外界的刺激，一般探针很难检测到内源性次氯酸。虽然一些染料探针的体外检测限也可以达到很低，但是它们水溶性差、发射波长短，限制了其在细胞检测中的应用。另一方面，这些染料探针在细胞中单波长检测，无法提供内置校准以校正各种与分析物无关的因素，例如仪器效率、样品微环境和探针分子的局部浓度，因此无法实现精确和定量特定分析物。
稀土掺杂上转换荧光标记材料(UCNPs)具有近红外激发、无荧光背景、穿透深度深、低毒性和较小的光损伤等优点，是一种理想的生物标记材料。但上转换材料发光效率低，检测灵敏度低，制约其实际应用。由于染料分子吸收峰宽、吸收截面大，可以作为“天线分子”，吸收近红外光再将能量传递给稀土离子，可以大大提高上转换纳米颗粒的发光效率。2012年，荷兰的Hummelen课题组利用染料IR-806敏化稀土掺杂纳米晶，使得720-1000nm处总的上转换发光效率提高了3300倍。这种从有机染料到UCNPs有效能量传递为细胞内灵敏检测提供了新方法。最近，刘志宏课题组设计的近红外染料敏化NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd探针，信背比达到30倍，可灵敏监测细胞内的谷胱甘肽。但是，目前染料敏化上转换纳米颗粒探针还不能对细胞内物质进行比率定量检测。除此之外，传统的共聚焦显微镜不能实现双激发，限制了近红外染料敏化上转换纳米颗粒的胞内比率型检测。
发明内容
为了解决现有技术中染料敏化上转换纳米探针无法实现精确胞内定量检测的问题，本发明提供了一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。
一种基于纳米探针的胞内检测方法，该方法包括将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，采用双激发光，通过监测纳米探针发光强度来检测待测目标物的浓度；
所述纳米探针为染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；
所述待测目标物选自细胞内与众多生理和病理有关活性氧、活性氮，或者细胞内的金属离子。
根据本发明的技术方案，所述双激发光由两个独立的光源产生，光源一产生的上转换光强度与待测目标物浓度呈线性关系，而光源二产生的上转换光不受待测目标物浓度的影响，作为内置参比。
根据本发明的技术方案，所述活性氧和活性氮可以为次氯酸根(ClO-)、超氧阴离子自由基(O2·-)、过氧化亚硝酸离子(ONOO-)、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)等中的至少一种，例如可以为ClO-、O2·或·OH；示例性地，所述活性氧为ClO-。
根据本发明的技术方案，所述细胞内的金属离子可以选自Na+、Ag+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cr3+和Al3+等中的至少一种。
根据本发明的技术方案，所述染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒为水溶性的染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒。
根据本发明的技术方案，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)以化学式AREF4:Yb,Er@AREF4:B表示；其中，A为碱金属元素，选自锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)或铯(Cs)；RE为稀土元素，选自钇(Y)、钪(Sc)、镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)或镥(Lu)中的至少一种；B可以选自稀土元素Yb、Nd中的一种或两种。例如，A为Na或K，RE为Y、Gd、Er中的至少一种，B选自Yb或Nd。示例性地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为NaGdF4:Yb,Er@NaYF4:Yb或NaGdF4:Yb,Er@NaYF4:Nd。
进一步地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒的平均粒径为5～100nm，如10～50nm；示例性地，平均粒径可以为20nm、27nm、30nm、40nm。
根据本发明的技术方案，所述染料为近红外染料分子，其发射波长在700-1000nm范围，其能与待测目标物发生特异性反应，并且与Yb或Nd的吸收匹配；例如选自IR-895、IR-820、IR-806、IR-797、IR-783、IR-775和IR-808等中的至少一种；优选选自IR-895、IR-820、IR-806或IR-808；示例性地，染料可以选择IR-808。其中，所述染料能与待测目标物发生特异性反应；示例性地，IR-808能与次氯酸发生特异性反应，方程式如图2所示。
根据本发明的技术方案，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒表面修饰有两亲性分子，例如所述两亲性分子可以选自F127(EO-PO型聚醚)、DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、DSPE-mPEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)、DSPE-NHS(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺改性琥珀酰亚胺酯)、DSPE-PEG-NH2(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物)、DSPE-PEG-COOH(二硬脂酸酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇羧基)、NH2-PEG-NH2(二氨基聚乙二醇)等中的至少一种；例如，所述两亲性分子选自F127、DSPE、DSPE-mPEG2000、DSPE-PEG2000-NH2或DSPE-PEG-COOH；示例性地，两亲性分子可以为F127。示例性地，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒可以为F127修饰的水溶性染料敏化上转换纳米颗粒(dye-UCNPs-F127)。
根据本发明的实施方案，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒可以为IR808-UCNPs@Yb-F127或IR808-UCNPs@Nd-F127。
根据本发明的技术方案，所述水溶性染料敏化上转换纳米颗粒是由油溶性的染料敏化上转换纳米颗粒(dye-UCNPs)采用表面吸附的方法制备得到。进一步地，所述制备方法包括如下步骤：
a)将油溶性的UCNPs和染料分散在溶剂二氯甲烷中，混匀，得到溶液一；
b)将所述染料均匀分散在二氯甲烷中，在不断搅拌状态下将所述染料的二氯甲烷溶液逐滴加入所述溶液一中，得到溶液二；
c)所述溶液二旋蒸除去溶剂二氯甲烷；待二氯甲烷挥发完毕，将产物重新分散在水溶液中；
d)步骤(c)完成后，离心、洗涤，得到所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒。其中，所述油溶性的UCNPs和染料的摩尔比为(1～1000):1，如(1～500):1、(1～200):1、(1～10):1，示例性地为200:1、100:1、10:1、5:1、1:1。
根据本发明的技术方案，该方法还包括将所述待测目标物与所述纳米探针的水溶液混合，配制成不同浓度的待测目标物的混合液，测定所述混合液的发光强度，绘制所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线，计算所述待测目标物在水溶液中检测限。进一步地，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线的绘制方法包括以下步骤：
1)将所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒分散于水(优选为超纯水)中；
2)将所述待测目标物与步骤1)的水溶液混合，配制成不同浓度的待测目标物的混合液，待测目标物与染料敏化上转换纳米颗粒反应一段时间；
3)所述反应完成后，测定步骤(2)中混合液的上转换发光强度。
其中，步骤1)中，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒在水中的浓度为10～500mM；例如10-300mM；示例性地，为200mM。
其中，所述待测目标物的浓度能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可，例如待测目标物的浓度为0～500μM，例如0～200μM、0～30μM。
其中，所述反应一段时间为0～60min；例如10-40min，示例性地，为30min。其中，所述上转换发光强度可以通过荧光光谱仪进行测定，例如FLS980荧光光谱仪。
其中，所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线是以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的上转换发光强度为纵坐标进行绘制的。
其中，根据待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算水溶液中检测限，检测限为三倍偏差所对应待测目标物的浓度。
根据本发明的技术方案，所述方法还包括绘制细胞内待测目标物的浓度依赖型标准曲线；其中，所述标准曲线以待测目标物的浓度为横坐标，以上转换发光强度与参比发光强度的比值为纵坐标。例如，所述绘制方法包括以下步骤：
A.配制不同浓度的水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒的水溶液；
B.将所述待测目标物与步骤A的水溶液混合，配制成不同浓度的待测目标物的混合液，待测目标物与染料敏化上转换纳米颗粒反应一段时间；
C.反应完成后，将步骤B中的混合液在近红外双激发共聚焦显微系统中测定上转换发光强度。
其中，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒的浓度能够得到测得上转换发光即可。例如其浓度为0～200mM，又如10-100mM，示例性地为16、32或42mM。其中，所述待测目标物溶液的浓度能够得到绘制待测目标物的浓度依赖型标准曲线即可。例如其浓度为0～50μM，又如0～10μM、0～20μM。
其中，所述反应一段时间为0～60min；例如10～40min；示例性地，为30min。
根据本发明的技术方案，所述近红外双激发共聚焦显微系统包括至少两个独立的激发光源；优选为两个独立的激发光源；示例性地，所述激发光源为980nm激光器和808nm激光器。进一步地，所述系统还包括激光扫描共聚焦显微镜和荧光信号采集装置，所述激光扫描共聚焦显微镜包括顺次排列的油镜、二向色镜和反光镜，所述荧光信号采集装置包括光谱仪和图像控制器，所述光谱仪用于提供全谱信息，所述图像控制器用于提供成像照片。具体的，激发光源发出的激发光由油镜聚焦至所要观察的待测物(细胞)，待测物内的纳米探针发出的上转换光经油镜、二向色镜和反射镜，进入光谱仪和图像控制器。
其中，所述激发光源优选为两个独立激发光源，物镜不仅可以聚焦激发光至所要观察的细胞，而且能收集细胞内纳米颗粒发出来的上转换光。上转换光经过油镜、二向色镜和反射镜，最后被光谱仪和图像控制器捕获。光谱仪可以提供全谱信息；图像控制器可以提供成像照片。通过该系统，利用图像控制器找好要测定的细胞位置；然后在不同激发光作用下，利用光谱仪分别检测细胞中同一个位置的染料敏化上转换发光。示例性地，可以检测到980/808nm激发下，细胞同一个位置的上转换发光。每一个上转换发射光谱可以在0～1000ms内获得。优选地，每一个上转换发射光谱可以在100ms内获得。其中，所述图像控制器可以为CCD相机。
根据本发明，在近红外双激发共聚焦显微系统不同的激发光源里，其中特定的激发光作用下，染料上转换纳米探针的发光不受待测目标物浓度的影响，可以作为内置参比，减少因为细胞内复杂环境、探针分布、仪器设备引起的检测偏差。优选地，特定的激发光可以选择一种或两种；示例性地，选择980nm的激发下的上转换发光作为参比。
根据本发明的技术方案，所述将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，可以为依次采用含有纳米探针的培养液和采用含有待测目标物的培养液对细胞进行孵育。
根据本发明的实施方案，所述基于纳米探针的胞内检测方法包括以下步骤：
(Ⅰ)将细胞接种到培养液中进行孵育，使其贴壁生长；
(Ⅱ)用磷酸盐缓冲溶液洗涤步骤(Ⅰ)培育的细胞，而后换为含有所述纳米探针的培养液，继续孵育；
(Ⅲ)步骤(Ⅱ)孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤待测细胞，以除去未被细胞吞入的纳米探针；
(IV)步骤(Ⅲ)完成后，用含有不同浓度的待测目标物的培养液孵育细胞；
(V)步骤(IV)孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞，以除去未反应的待测目标物；
(VI)在所述近红外双激发共聚焦显微镜系统进行胞内待测目标物浓度检测。
其中，所述细胞可以为人乳腺癌细胞、人外周血白血病T细胞、人结肠癌细胞、小鼠骨髓瘤细胞、小鼠成纤维细胞等；示例性地，为人乳腺癌细胞。
其中，所述培养液可以为RPMI-1640培养基、MEM培养基、IMDM培养基、TC-100培养基、L-15培养基等；示例性地，为RPMI-1640培养基。
其中，所述孵育条件包括：3-7％CO2，36-38℃；例如5％CO2，37℃。进一步地，步骤(Ⅰ)中孵育时间为20-30h，例如22-28h，示例性地，孵育24h。步骤(Ⅱ)中孵育时长为1～12小时；优选地，时长为3-8小时；示例性地，孵育时长为4小时。步骤(4)中孵育时长为0.5-2小时，例如1-1.5小时，示例性地，时长为1小时。
其中，所述含有纳米探针的培养液中，纳米探针的浓度为0-2000μg·mL-1，如0-1000μg·mL-1、10-500μg·mL-1，示例性地为300μg·mL-1。进一步地，所述含有纳米探针的培养液的用量为0.5-2mL，例如1-1.5mL，示例性地为1mL。
其中，步骤(IV)中，所述待测目标物的浓度为0-10μM，例如0-5μM，示例性地，所述待测目标物的浓度为0、0.5、1和2μM。进一步地，所述含有待测目标物的培养液的用量为0.5-2mL，例如1-1.5mL，示例性地为1mL。
其中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0-7.5，例如7.1-7.4，示例性地，pH为7.2。
根据本发明示例性的技术方案，所述基于纳米探针的胞内检测方法包括如下步骤：
I)使用RPMI-1640作为培养液，将人乳腺癌细胞(MCF-7)接种到培养皿中，在培养箱中(5％CO2，37℃)培育24h，使其贴壁生长；
II)用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.2)洗涤数次，加入含有水溶性染料敏化上转换纳米颗粒dye-UCNPs-F127的RPMI-1640培养液，继续在37℃下进行孵育数小时；
III)用PBS洗涤数次以除去未被细胞吞入的纳米颗粒；
IV)使用含有不同浓度的待测目标物孵育细胞1小时；
V)用PBS洗涤数次以除去未反应的待测目标物；
VI)用所述近红外双激发共聚焦显微镜系统进行胞内检测。
本发明还提供了一种近红外双激发共聚焦显微镜系统；优选地，所述的近红外双激发共聚焦显微镜系统具有如上文所述含义。
本发明提供的检测方法原理如图1所示，染料可以敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒发光，待测目标物通过与染料发生反应，从而影响染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒的发光，即可通过监测染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒发光强度来监测细胞内待测目标物的浓度。而由另外一个激发光源产生的上转换发光不受待测目标物浓度的影响，可以作为内置参比。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于双激发比率型上转换荧光探针检测细胞内待测目标物的方法，特别是提供一种基于双激发近红外染料敏化上转换纳米探针dye-UCNPs-F127检测细胞内次氯酸的方法。该方法通过近红外双激光共聚焦显微镜系统，利用染料敏化上转换荧光探针，可以实现对胞内物质精确定量检测。与传统的荧光探针检测方法相比，本发明所述的方法可以利用染料高效敏化上转换纳米颗粒的能量传递过程，提高检测的灵敏度；提供双激发比率探针模型，作为设置参比，减少因为细胞内复杂环境、探针分布、仪器设备引起的检测偏差；提供一种近红外双激发共聚焦显微镜系统，为检测细胞内物质提供新思路。
本发明可以用于细胞内次氯酸的精确检测，也可以进一步实现对细胞内其它活性氧和活性氮、金属离子等的检测，例如超氧阴离子自由基(O2·-)，过氧化亚硝酸离子(ONOO-)，一氧化氮(NO)，过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、Mn2+，Zn2+，Cr3+，Al3+等。
附图说明
图1为本发明所述的一种基于双激发比率型上转换荧光探针胞内检测方法的原理示意图。
图2为本发明所述近红外染料IR-808和次氯酸发生特异性反应的原理图；
图3为本发明实施例3所述近红外双激发共聚焦显微镜系统的光路结构图；
附图标记：1-激光器一，2-激光器二，3-光谱仪，4-CCD相机，5-油镜，6-二向色镜一，7-二向色镜二，8-反射镜，9-针孔，10-滤光片，11-透镜一，12-透镜二，13-透镜三，14-透镜四。
图4为本发明实例1所述水溶性纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Yb的透射电镜图。
图5为本发明实例1所述不同次氯酸作用下近红外染料敏化上转换纳米探针dye-UCNPs-F127的光谱图和浓度依赖响应曲线。
图6为本发明实例2所述水溶性纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd的透射电镜图。
图7为本发明实例2所述不同次氯酸作用下近红外染料敏化上转换纳米探针dye-UCNPs-F127的光谱图和浓度依赖响应曲线。
图8为本发明实例4、5所述细胞内次氯酸依赖响应曲线和细胞内次氯酸的浓度。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，实施例中所记载的原料及试剂均为市售产品。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例利用染料敏化Yb掺杂的上转换纳米颗粒IR808-UCNP@Yb-F127检测次氯酸：
(1)将1mmol油溶性纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Yb和1μmol的染料IR808分散在20mL溶剂二氯甲烷中，混匀一小时，得到溶液一；
(2)将400mg F127溶解在2mL二氯甲烷中，超声混匀2min，在不断搅拌状态下逐滴加入溶液一中，得到溶液二；
(3)所述溶液二旋蒸除去溶剂二氯甲烷，待二氯甲烷挥发完毕，重新分散在水溶液中；
(4)步骤(3)完成后，离心，用去离子水洗涤2次，得到所述水溶性的染料敏化上转换纳米探针。
(5)将步骤(4)中的纳米探针与0-100μM的目标检测物(次氯酸)反应30分钟；
(6)将步骤(5)中的溶液在FLS980荧光光谱仪上测上转换发光强度；
(7)以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的上转换发光强度为纵坐标绘制所述次氯酸的浓度依赖型标准曲线，计算检测限。
从图4中可以看出，该水溶性的纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Yb是六方相，分散性好、形貌均一。
如图5所示，在0-30μM范围内，次氯酸的浓度越高，相对应的混合溶液上转换发光强度也越低。从图5中附图可以明显得知在一定浓度范围内，次氯酸的浓度与上转换发光强度呈良好的线性关系。探针对次氯酸的检测限为16.1nM。
实施例2
本实施例利用染料敏化Nd掺杂的上转换纳米颗粒IR808-UCNP@Nd-F127检测次氯酸：
(1)将1mmol油溶性的纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd和1μmol的染料IR808分散在20mL二氯甲烷中，混匀一小时，得到溶液一；
(2)将400mg的F127溶解在2mL二氯甲烷中，超声混匀2min，在不断搅拌状态下逐滴加入溶液一中，得到溶液二；
(3)所述溶液二旋蒸除去溶剂二氯甲烷，待二氯甲烷挥发完毕，重新分散在水溶液中；
(4)步骤(3)完成后，离心，用去离子水洗涤2次，得到水溶性的染料敏化上转换纳米探针；
(5)将步骤(4)中的纳米探针与0-100μM的目标检测物(次氯酸)反应30分钟；
(6)将步骤(5)中的溶液在FLS980荧光光谱仪上测上转换发光强度。
(7)以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的上转换发光强度为纵坐标绘制所述次氯酸的浓度依赖型标准曲线和检测限，计算检测限。
从图6中可以看出，该水溶性的纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd是六方相，分散性好、形貌均一。
如图7所示，在0-30μM范围内，次氯酸的浓度越高，相对应的混合溶液上转换发光强度也越低。从图7中附图可以明显得知在一定浓度范围内，次氯酸的浓度与上转换发光强度呈良好的线性关系。探针对次氯酸的检测限为85.4nM。
实施例3
参考图3，近红外双激发共聚焦显微系统，包括2个独立的激光器(980nm激光器一1和808nm激光器二2)、激光扫描共聚焦显微镜和荧光信号采集装置。其中，激光扫描共聚焦显微镜包括油镜5、二向色镜一6、二向色镜二7和反射镜8等基本组件；荧光信号采集装置包括光谱仪3和CCD相机4(作为图像控制器)。
激发光源发出的激发光由油镜聚焦至所要观察的待测细胞，待测细胞内的纳米探针发出的上转换光依次经油镜5、二向色镜一6、二向色镜二7、反射镜8、透镜一11、针孔9、透镜二12、滤光片10和透镜三13，被光谱仪3捕获。待测细胞内的纳米探针发出的上转换光依次经油镜5、二向色镜一6、二向色镜二7、反射镜8和透镜四14，被CCD相机4捕获。光谱仪可以提供全谱信息，CCD相机可以提供成像照片。
具体操作过程为：通过该系统，利用CCD相机找好要测定的细胞位置；然后在980/808nm激发光作用下，利用光谱仪分别检测细胞中同一个位置的染料敏化上转换发光。980nm的激发下的上转换发光作为参比。
实施例4
本实施例提供细胞内待测目标物次氯酸的浓度依赖型标准曲线：
(1)配制10-100mM水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒的超纯水溶液；
(2)将步骤(1)中的溶液与0-10μM的目标检测物(次氯酸根)混合反应1小时；
(3)将步骤(2)中的溶液在实施例3提供的近红外双激发共聚焦显微系统上用980/808nm的光激发，进行测上转换发光强度；
(4)以待测目标物在混合液中的浓度为横坐标，对应的上转换发光强度与参比发光强度的比值UCL980nm/UCL808nm为纵坐标进行绘制，得到待测目标物的浓度依赖型标准曲线。
从图8中可以得到本方法用于细胞内次氯酸的浓度依赖型标准曲线。
实施例5
本实施例提供检测细胞内待测目标物的浓度：
a)使用RPMI-1640作为培养液，将人乳腺癌细胞(MCF-7)接种到培养皿中，在培养箱中(5％CO2，37℃)培育24h，使其贴壁生长；
b)用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.2)洗涤数次，加入含有1mL水溶性染料敏化上转换纳米颗粒dye-UCNPs-F127(0.2mg·mL-1)的RPMI-1640培养液，继续在37℃下进行孵育数小时；
c)用PBS洗涤数次以除去未吞入的纳米颗粒；
d)使用含有不同浓度【0、0.5、1和2μM，分别对应样品(1)、(2)、(3)、(4)】的待测目标物(次氯酸根)孵育细胞1小时；
e)用PBS洗涤数次以除去未反应的待测目标物；
f)把细胞培养皿放在实施例3提供的近红外双激发共聚焦显微系统上用980/808nm的光激发，进行测上转换发光强度；
g)把上转换发光强度与参比发光强度的比值UCL980nm/UCL808nm带入实施例4中所述标准曲线，计算得到待测目标物的浓度。
最后计算出待测目标物的浓度如图8所示，样品(1)、(2)、(3)、(4)分别为0.28±0.10μM，0.82±0.07μM，1.43±0.14μM和2.31±0.25μM。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，该方法包括将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，采用双激发光，通过监测纳米探针发光强度来检测待测目标物的浓度；
所述纳米探针为染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；
所述待测目标物选自细胞内与众多生理和病理有关活性氧、活性氮，或者细胞内的金属离子。
2.根据权利要求1所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述双激发光由两个独立的光源产生，光源一产生的上转换光强度与待测目标物浓度呈线性关系，而光源二产生的上转换光不受待测目标物浓度的影响，作为内置参比。
3.根据权利要求1或2所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述活性氧和活性氮为次氯酸根(ClO-)、超氧阴离子自由基(O2·-)、过氧化亚硝酸离子(ONOO-)、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)中的至少一种；
所述细胞内的金属离子选自Na+、Ag+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cr3+和Al3+中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒为水溶性的染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；
优选地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)以化学式AREF4:Yb,Er@AREF4:B表示；其中，A为碱金属元素，选自锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)或铯(Cs)；RE为稀土元素，选自钇(Y)、钪(Sc)、镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)或镥(Lu)中的至少一种；B选自稀土元素Yb、Nd中的一种或两种；
优选地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒的平均粒径为5～100nm；
其中，所述染料为近红外染料分子，其发射波长在700-1000nm范围，其能与待测目标物发生特异性反应，并且与Yb或Nd的吸收匹配；
优选地，所述水溶性的染料敏化上转换纳米颗粒表面修饰有两亲性分子，所述两亲性分子选自F127(EO-PO型聚醚)、DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、DSPE-mPEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)、DSPE-NHS(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺改性琥珀酰亚胺酯)、DSPE-PEG-NH2(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基交连物)、DSPE-PEG-COOH(二硬脂酸酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇羧基)、NH2-PEG-NH2(二氨基聚乙二醇)中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，该方法还包括将所述待测目标物与所述纳米探针的水溶液混合，配制成不同浓度的待测目标物的混合液，测定所述混合液的发光强度，绘制所述待测目标物的浓度依赖型标准曲线，计算所述待测目标物在水溶液中检测限。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述方法还包括绘制细胞内待测目标物的浓度依赖型标准曲线；其中，所述标准曲线以待测目标物的浓度为横坐标，以上转换发光强度与参比发光强度的比值为纵坐标。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，为依次采用含有纳米探针的培养液和采用含有待测目标物的培养液对细胞进行孵育。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述基于纳米探针的胞内检测方法包括以下步骤：
(Ⅰ)将细胞接种到培养液中进行孵育，使其贴壁生长；
(Ⅱ)用磷酸盐缓冲溶液洗涤步骤(Ⅰ)培育的细胞，而后换为含有所述纳米探针的培养液，继续孵育；
(Ⅲ)步骤(Ⅱ)孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤待测细胞，以除去未被细胞吞入的纳米探针；
(IV)步骤(Ⅲ)完成后，用含有不同浓度的待测目标物的培养液孵育细胞；
(V)步骤(IV)孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞，以除去未反应的待测目标物；
(VI)在所述近红外双激发共聚焦显微镜系统进行胞内待测目标物浓度检测。
9.根据权利要求8所述的基于纳米探针的胞内检测方法，其特征在于，所述近红外双激发共聚焦显微系统包括至少两个独立的激发光源；优选为两个独立的激发光源；更优选所述激发光源为980nm激光器和808nm激光器；
优选地，所述系统还包括激光扫描共聚焦显微镜和荧光信号采集装置，所述激光扫描共聚焦显微镜包括顺次排列的油镜、二向色镜和反光镜，所述荧光信号采集装置包括光谱仪和图像控制器，所述光谱仪用于提供全谱信息，所述图像控制器用于提供成像照片。
10.一种近红外双激发共聚焦显微系统，其具有如权利要求9所述的结构。
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