WO2022116672A1 - 一种肿瘤微环境响应型off-on上转换荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Definitions
- a tumor microenvironment responsive OFF-ON up-conversion fluorescent probe Rare earth ion co-doped up-conversion fluorescent nanoparticles are wrapped with a layer of solid silicon oxide, and two-dimensional MnO 2 nanosheets are grown on the surface.
- the deionized aqueous solution of UCSs, the deionized aqueous solution of MES and the deionized aqueous solution of KMnO 4 are sequentially added to the reaction vessel; then, the two-dimensional UCSs-loaded two-dimensional solution can be obtained by ultrasonic reaction at room temperature.
- the silicon oxide-wrapped up-conversion fluorescent probe UCSs and the MnO 2 nanosheet are compounded in the same structural system to prepare a tumor microenvironment-responsive OFF-ON up-conversion fluorescent probe UCSMs.
- This novel probe can specifically respond to the acidic H 2 O 2 -rich tumor microenvironment, decompose MnO 2 and eliminate the fluorescence quenching effect of MnO 2 on the inner core of UCSs, thereby restoring and enhancing the upconversion fluorescence of UCSs, which can be used for Precise fluorescence imaging of malignant tumors.
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Abstract
一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针及其制备方法和应用。其制备方法为：通过高温热解法合成上转换荧光纳米颗粒UCNPs，通过反相微乳液法，在UCNPs表面包裹一层厚度可控的实心氧化硅，即UCSs，通过湿化学法，在UCSs表面生长MnO 2纳米片层。该探针可以特异性响应富含酸性H 2O 2的肿瘤微环境，分解MnO 2，消除MnO 2对UCSs内核的荧光淬灭作用，从而恢复并增强UCSs的上转换荧光，可用于恶性肿瘤的荧光成像。
Description
本发明属于生物医学影像材料技术，具体涉及一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针及其制备方法和应用。
癌症(恶性肿瘤)已经成为威胁人类健康的头号杀手。根据世界卫生组织(WHO)的报告称，2012年全世界新增1400万癌症患者，预计2030年全球新增癌症病例将达到2200万。在我国，癌症形势尤为严峻。目前，临床医生往往用传统的影像技术寻找可疑的病灶区，无疑存在很多缺陷，诊断效果较差，且诊断出的癌症患者多数属于中晚期，往往错过了最佳治疗的时期，导致许多肿瘤患者因治疗无效而死亡。例如，临床上常用的磁共振(MRI)影像和CT影像虽然具有很高的空间分辨率，但灵敏度较低。荧光影像虽然具有较高的灵敏度，并且便于视觉观察和手术中定位示踪，但是其激发光往往是短波长的紫外-可见光，导致皮肤组织穿透深度较浅，不利于检测组织深部肿瘤。因此，发展具有强组织穿透能力的近红外光激发的荧光成像技术，有助于及早检测出组织深部恶性肿瘤，对于癌症患者早期的精确诊断具有十分重要意义。
稀土离子掺杂的上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)作为新一代的近红外光激发的上转换荧光探针，已经引起科研工作者的广泛关注。UCNPs可以将低能量的近红外光转换为高能量的紫外光-可见光，实现上转换荧光成像。相比于传统的量子点、有机发光素等下转换荧光探针，UCNPs具有光稳定好、灵敏度高、信噪比高、无自发发光等优点；此外，由于是近红外光激发，UCNPs还可以用于皮表以下组织深部器官的荧光成像，并且适用于组织深部恶性肿瘤的荧光成像。为了进一步提高荧光成像的灵敏度，发展有针对性响应肿瘤特殊微环境的OFF-ON荧光探针，对于实现肿瘤的特异性精准荧光成像显得 尤为重要。
基于当前严峻的癌症形势以及高灵敏度荧光成像技术的发展趋势，我们设计一种基于UCNPs的肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针(UCSMs)，充分开发利用肿瘤特殊的富含H
2O
2的酸性微环境，实现上转换荧光信号由“OFF”到“ON”的转变，并且近红外光激发也克服了传统荧光成像的组织穿透深度浅的缺点，有利于肿瘤的早期高灵敏度荧光检测。这种新型荧光探针UCSMs是由氧化硅包裹的UCNPs和具有强吸光作用的MnO
2纳米片层构成。由于MnO
2对UCNPs的荧光淬灭作用，UCSMs的上转换荧光原先处于淬灭“OFF”状态，但是在富含H
2O
2的酸性肿瘤微环境中，UCSMs中的黑色MnO
2与酸性H
2O
2反应后可以被分解还原成无色Mn
2+，原先被淬灭的荧光信号重新变为“ON”状态，从而恢复并增强了UCSMs的荧光强度，可以用于特异性荧光成像精确定位肿瘤。此外，本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，在生物医学影像领域具有极高的研究价值和广阔的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单而又高效的肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs及其制备方法和应用。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针，稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒外包裹一层实心氧化硅，其表面生长有二维MnO
2纳米片层。
进一步的，所述的稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒的化学成分为NaYF
4:Yb/Er/Tm。
进一步的，所述的稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒可以在980nm近红外光激发下发出红光、绿光和约800nm的近红外光。
本发明还公开了一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，包括以下步骤：
S1、UCNPs的制备：高温热解法制备稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒NaYF
4:Yb/Er/Tm；
S2、UCSs的制备：利用反相微乳液方法对所制备的UCNPs进行实心氧化硅的包裹；
S3、UCSMs的制备：通过湿化学法，在UCSs表面生长二维MnO
2纳米片层。
进一步的，所述步骤S1中，按照各种稀土离子掺杂的比例，称取所用的稀土离子前驱体，然后在惰性气体保护气的气氛下，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，升温除去甲醇，随后再升温，进行高温热解反应，然后冷却至室温之后离心收集样品。
进一步的，高温热解法所用稀土离子前驱体均为氯化物；
加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液后搅拌至少2小时，使得油酸前驱体与氢氧化钠和氟化铵充分混合；
惰性气体为氩气；
升温除甲醇的时间为0.5～2小时；
高温热解反应温度为280～290度；
高温热解反应时间为1.5h。
进一步的，所述步骤S2中，在表面活性剂、催化剂作用下，使用注射泵匀速将硅源TEOS加入到内核UCNPs的环己烷溶液体系中，反应后收集样品。
进一步的，所述表面活性剂为CO-520，所述催化剂为氨水，反应36h后，滴加甲醇破坏反相微乳液体系，随后离心收集样品。
进一步的，所述步骤S3中，将UCSs的去离子水溶液、MES的去离子水溶液以及KMnO
4的去离子水溶液，依次加入到反应容器中；然后，室温超声反应，即可得到负载UCSs的二维MnO
2纳米片层材料UCSMs。
一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针在肿瘤的荧光成像中的应用，该新型荧光探针UCSMs注射入肿瘤后，MnO2可以与肿瘤内酸性H
2O
2充分反应，被分解还原成无色Mn2+，恢复并增强UCSMs的发光信号，实现肿瘤的高灵敏上转换荧光成像。
本发明将氧化硅包裹的上转换荧光探针UCSs与MnO
2纳米片层复合于同一个结构体系中，制备了一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs。这种新型探针可以特异性响应富含酸性H
2O
2的肿瘤微环境，分解MnO
2，消除MnO
2对UCSs内核的荧光淬灭作用，从而恢复并增强UCSs的上转换荧光，可以用于恶性肿瘤的精准荧光成像。此外，这种新型探针在分解MnO
2的过程中还可以生成O
2，有望用于氧增强型光动力学治疗和放疗，从而为恶性肿瘤的精确诊断与高效治疗提供更好、更有效的方案。
图1为肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs的合成流程图。
图2为肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs的合成示意图以及合成过程中每一步反应产物的TEM照片，其中，(a)肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs的合成示意图，(b-d)UCSMs合成过程中产物的TEM照片：(b)UCNPs，(c)UCSs，(d)UCSMs。
图3为该新型荧光探针UCSMs与酸性H
2O
2反应后的紫外-可见吸收光谱和上转换荧光发射光谱，其中，(a)UCSMs分解后UCSs的荧光由“OFF”变成“ON”的示意图，(b，c)UCSMs与H
2O
2在酸性溶液(pH＝5.5)中反应后的(b)紫外-可见吸光强度和(c)上转换发光强度。
图4为该新型荧光探针UCSMs在细胞水平的生物安全性评价，显示了4T1细胞与不同浓度的UCSMs共培养24h后的存活率。
图5为该新型荧光探针UCSMs与4T1细胞共培养后的荧光成像图，其分 别为乏氧4T1细胞与UCSMs分别共培养(a)1h、(b)8h、(c)12h后的共聚焦荧光图，细胞核被DAPI染色后发蓝光，UCSMs的内核UCNPs在近红外光的激发下发黄光(绿光和红光的叠加)。
图6为该新型荧光探针UCSMs注射入4T1肿瘤1h和12h后的肿瘤区的上转换发光成像图：(a)数码照片，(b)上转换发光图，(c)明场像图，(d)叠加图。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
上转换荧光纳米颗粒UCNPs的制备:
图1显示了制备的流程示意图，具体的步骤如下：
采用高温热分解工艺，制备2mmol NaYF
4:Yb(18％)/Er(2％)/Tm(1％)纳米晶。
首先，分别称取1.58mmol(479.31mg)YCl
3·H
2O、0.36mmol(139.50mg)YbCl
3·6H
2O、0.04mmol(15.27mg)ErCl
3·6H
2O、0.02mmol(5.51mg)TmCl
3粉末，用4mL去离子水溶解，转入100mL三口烧瓶中。向三口瓶中加入15mL油酸和30mL十八烯，混合均匀后，室温下搅拌1h。然后，开始通5min氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程。先升温到80℃，保持1h或者更长时间(将自由水除尽)；随后升到120℃，保持1h；再升到156℃左右，保持1h。最后，获得黄色澄清液，停止加热，让体系自然降至室温。分别称取200mg NaOH，296.3mg NH
4F，用10mL甲醇溶解，超声加速分散。然后加入体系中，室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成。期间将氩气撤去，塞住三口瓶。随后，体系开始进入缓慢的除甲醇环 节。先通5min氩气，然后升温到50℃，保持1h；随后升温到100～120℃，保持1h，直到体系中看不见白色气泡为止。甲醇除完之后，将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在280～290℃并保持1.5h，然后，自然降至室温。
最后是产物清洗过程。首先，向体系中加入20mL酒精，搅拌30min。然后，分装到两个50mL的离心管中，用11000r/min离心10min；收集到略带黄色的产物。随后，各加入5～10mL环己烷，小心摇晃并超声，可以发现产物迅速溶解，然后，加入15mL酒精，超声约5min，同样离心收集，重复清洗3次。最后，将产物用20mL环己烷分散，获得100mM UCNPs的无色澄清透明溶液。
UCNPs外包裹实心氧化硅UCSs:
采用反相微乳液法，在UCNPs表面包裹一层实心氧化硅。首先，将1mL CO-520加入20mL环己烷中，磁力搅拌40min。然后，将1mL 100mM UCNPs的环己烷溶液，加入到CO-520/环己烷体系中，密封搅拌3h。逐滴加入0.14mL30％氨水，密封搅拌2h。接着，通过注射泵将0.2mL TEOS，以0.2mL/h的速率引入体系中，继续搅拌36h后，加入甲醇，破坏反相微乳液体系，离心收集样品。整个过程用乙醇清洗，超声分散，重复三次，最后，将产物UCSs分散在5mL去离子水中。
肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs的制备:
采用湿化学法，在UCSs表面生长MnO
2纳米片层，制备肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针(UCSMs)。首先，将1mL UCSs的去离子水溶液、200μL 100mM的MES的去离子水溶液以及200μL 10-100mM的KMnO
4的去离子水溶液，依次加入到小试管中；然后，室温超声反应0.5h，即可得到负载UCSs的二维MnO
2纳米片层材料(UCSMs)。接着，用去离子水反复清洗三次。最后，将产物UCSMs分散至2mL去离子水中。
图2显示了肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针UCSMs的合成示意图以及合成过程中每一步反应产物的TEM照片。从图中可以看出，每一种产物都是形貌规则，尺寸均一，且分散性非常好，有利于后续的生物学应用。
该新型荧光探针UCSMs与酸性H
2O
2反应后的荧光性能表征：
将UCSMs置于pH＝5.5的H
2O
2溶液中，待黑色MnO
2完全分解后，检测溶液的紫外-可见吸收光谱以及近红外光激发的上转换荧光发射光谱。
图3为该新型荧光探针UCSMs与酸性H
2O
2反应后的紫外-可见吸收光谱和上转换荧光发射光谱。从图中可以看出，由于MnO
2可以吸收UCSs发出的所有波段的光，所以UCSMs的荧光处于“OFF”状态。但是UCSMs在酸性H
2O
2溶液中，黑色MnO
2可以被分解还原成无色Mn
2+，原先被淬灭的荧光信号重新变为“ON”状态，从而恢复并增强了UCSMs的荧光强度。
该新型荧光探针UCSMs在细胞水平的荧光成像：
首先，将不同浓度的UCSMs与4T1细胞共培养24h后，利用MTT试剂检测UCSMs的细胞相容性。其次，将UCSMs与4T1细胞分别共培养1h、8h、20h后，利用DAPI染色细胞核，然后在共聚焦显微镜下观察UCSMs在细胞水平的荧光影像。
图4为该新型荧光探针UCSMs在细胞水平的生物安全性评价。从图中可以看出，4T1细胞与不同浓度的UCSMs共培养24h后，仍然保持95％左右的存活率，表明UCSMs具有良好的生物相容性。
图5为该新型荧光探针UCSMs与4T1细胞共培养后的荧光成像图。从图中可以看出，UCSMs与4T1细胞共培养1h后，基本上观察不到光信号，可能是因为乏氧4T1细胞在短时间内对UCSMs的吞噬量较少，UCSMs还没有完全与酸性H
2O
2反应，大部分光信号仍然处于淬灭状态。但是随着共培养时间延长到8h和20h，蓝色的细胞核周围出现了越来越强的光信号，说明越来越多的UCSMs被吞入4T1细胞质中，与酸性H
2O
2充分反应，增强UCSMs 的发光信号。
该新型荧光探针UCSMs在活体水平的荧光成像：
将UCSMs通过瘤内注射方式注入4T1肿瘤内部，1h和12h后，测量肿瘤区的上转换荧光信号。
图6为该新型荧光探针UCSMs注射入4T1肿瘤后的荧光成像图。从图中可以看出，由于MnO
2的光淬灭作用，UCSMs在近红外光的激发下不发光，所以注射UCSMs 1h后，肿瘤组织中没有出现光信号。但是注射UCSMs 12h后，MnO
2可以与肿瘤内酸性H
2O
2充分反应，被分解还原成无色Mn
2+，恢复并增强UCSMs的发光信号，实现肿瘤的高灵敏上转换荧光成像。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
- 一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针，其特征在于：稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒外包裹一层实心氧化硅，其表面生长有二维MnO 2纳米片层。
- 根据权利要求项1所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针，其特征在于：所述的稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒的化学成分为NaYF 4:Yb/Er/Tm。
- 根据权利要求项1所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针，其特征在于：所述的稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒可以在980nm近红外光激发下发出红光、绿光和约800nm的近红外光。
- 一种制备权利要求1-3任一项所述的肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、UCNPs的制备：高温热解法制备稀土离子共掺杂的上转换荧光纳米颗粒NaYF 4:Yb/Er/Tm；S2、UCSs的制备：利用反相微乳液方法对所制备的UCNPs进行实心氧化硅的包裹；S3、UCSMs的制备：通过湿化学法，在UCSs表面生长二维MnO 2纳米片层。
- 根据权利要求4所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于：所述步骤S1中，按照各种稀土离子掺杂的比例，称取所用的稀土离子前驱体，然后在惰性气体保护气的气氛下，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，升温除去甲醇，随后再升温，进行高温热解反应，然后冷却至室温之后离心收集样品。
- 根据权利要求5所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于：高温热解法所用稀土离子前驱体均为氯化物；所述惰性气体为氩气；加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液后搅拌至少2小时，使得油酸前驱体与氢氧化钠和氟化铵充分混合；升温除甲醇的时间为0.5～2小时；高温热解反应温度为280～290度；高温热解反应时间为1.5h。
- 根据权利要求4所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于：所述步骤S2中，在表面活性剂、催化剂作用下，使用注射泵匀速将硅源TEOS加入到内核UCNPs的环己烷溶液体系中，反应后收集样品。
- 根据权利要求7所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于：所述表面活性剂为CO-520，所述催化剂为氨水，反应36h后，滴加甲醇破坏反相微乳液体系，随后离心收集样品。
- 根据权利要求4所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针的方法，其特征在于：所述步骤S3中，将UCSs的去离子水溶液、MES的去离子水溶液以及KMnO 4的去离子水溶液，依次加入到反应容器中；然后，室温超声反应，即可得到负载UCSs的二维MnO 2纳米片层材料UCSMs。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的一种肿瘤微环境响应型OFF-ON上转换荧光探针在肿瘤的荧光成像中的应用。
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