JP5199407B2 - 顕微鏡システム及び観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡を用いて標本を自動検査・自動画像記録を行う装置等に利用される顕微鏡オートフォーカス装置を含む顕微鏡システムに関するものである。

近年、顕微鏡を用いた検査装置は、各種機能面の自動化が進んでおり、標本にピント合わせを行うオートフォーカス機能も自動化項目の必須機能となっている。

スライドガラスに封入された標本に対する検査装置にも顕微鏡オートフォーカスが採用されており、例えば特開昭５８−８３９０６号公報では標本を封入するスライドガラスやカバーガラスに赤外線反射膜を施し、その膜に対してピント合わせを行う方法が記載されている。また、特開平８−８２７４７号公報では特に赤外線反射膜の構成に関する記載がされている。さらに特開２００１−９１８２１号公報では、同じくスライドガラスやカバーガラスにアクティブＡＦ方式によりピント合わせをした後、パッシブＡＦ方式を用いて、標本に正確にピント合わせを行う方法が記載されている。
特開昭５８−８３９０６号公報 特開平８−８２７４７号公報 特開２００１−９１８２１号公報

上記のようなオートフォーカスシステムを、高倍率の対物レンズを用いて標本内の対象物の動きを長時間にわたり解析する場合には、以下のような問題が生じる。

図１３Ａは、赤外線反射膜を施したスライドガラス上にその内部にいくつかの核をもつような標本を載せ、その核のうち、注目する１つの核の観察を行う場合のモデル図である。

図１３Ａに示されるように、スライドガラス２０１の上には赤外線反射膜２０２が設けられており、赤外線反射膜２０２の上には標本である細胞２０３が載せられている。細胞２０３は、検査対象である核２０４を含んでいる。図１３Ａにおいて、網目で示された核２０４は、着目する核であることを表現している。

特開昭５８−６３９０６号公報、特開平８−８２７４７号公報で記載されている方法では、図１３Ａに一点鎖線で示される赤外線反射膜にピントを合わせるため、図１３Ａで示される着目する核が、図１３Ａに二点鎖線で示される焦点深度領域外となるため、観察することができない可能性が生じる。

また、特開２００１−９１８２１号公報で記載されているパッシブＡＦを用いた方法では、図１３Ｂにおいて破線で示される核２０４が実線で示されるように動くと、コントラスト最大の位置が破線の位置から例えば一点鎖線の位置に動いてしまうため、着目する核の動きを観察することができない可能性がある。

さらに、蛍光観察のように照射する励起光により、発光する標本の部位が、例えば図１３Ｃに示される部位２０５と部位２０６のように、異なる場合には、励起光毎に着目する位置が変化することになる。

上記のようなオートフォーカスシステムを用いない場合には、観察はさらに困難となり、例えば対物レンズの周囲温度が変化して対物レンズ自体の温度変化が発生し、それによる焦点位置ずれなどにより焦準部を固定していてもピントずれを生じてしまう。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は、長時間観察解析において標本の動きを確実に測定することが可能な顕微鏡システムを提供することである。

本発明の顕微鏡システムは、透明体と該透明体上に載置された観察体とからなる観察試料を載せるステージと、該ステージに載せられた前記観察試料と対峙するように前記ステージより下方に配置される対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズのうち少なくとも一方を観察光軸と平行方向に駆動させる焦準駆動部と、前記試料を照明するための観察用光源と、前記対物レンズを介して前記観察試料の撮影を行う撮像装置と、前記観察光源とは異なる光源で、前記対物レンズの下方から前記観察試料に対してオートフォーカス用の検出光を出射する焦点検出光源と、前記観察試料における前記透明体から反射した前記検出光を対物レンズを介して受光する受光手段と、前記受光手段の結果から前記焦準駆動部を制御することで前記透明部材の所定の位置にオートフォーカスをすることが可能なオートフォーカス部と、前記所定の位置から一定量離れた前記観察体の撮影領域を設定する撮影条件設定部と、前記撮影手段の間欠撮影時間間隔であるタイムラプス測定時間間隔を設定するタイムラプス測定間隔設定部と、を備え、前記タイムラプス測定時間間隔毎に前記オートフォーカス部により前記透明部材から前記焦点検出光が反射される位置である前記所定の位置に対してオートフォーカスを行い、前記所定の位置へのオートフォーカス終了後、前記撮影領域で少なくとも２枚の焦点位置が異なる前記観察試体の画像を撮影することを特徴とする。

本発明によれば、長時間観察解析において標本の動きを確実に測定することが可能な顕微鏡システムが提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

第一実施形態
本実施形態は、正立型顕微鏡を含む顕微鏡システムに向けられている。図１は、本発明の第一実施形態の顕微鏡システムの構成を示している。図１に示されるように、本実施形態の顕微鏡システム１００は、観察試料１０２を積載するステージ１０１と、ステージ１０１に載置された観察試料１０２と対峙するように配置される対物レンズ１０９とを備えている。

対物レンズ１０９はレボルバ１０８に装着されている。レボルバ１０８は電動駆動可能であり、図示しないレボルバ駆動制御部によりレボルバ１０８の回転を制御することにより、所望の倍率の対物レンズ１０９を光路中に配置させることが可能となっている。

ステージ１０１はＸ−Ｙ−Ｚ方向の位置が電動制御可能であり、顕微鏡システム１００は、ステージ１０１のＸ−Ｙ方向の位置を制御するステージＸ−Ｙ制御部１１５と、ステージ１０１のＺ方向の位置を制御するステージＺ駆動制御部１１６とを備えている。ステージＺ駆動制御部１１６は、ステージと対物レンズの少なくとも一方を焦準のために駆動する焦準駆動部を構成している。

観察試料１０２は、例えば、図２Ａに示されるように、スライドガラス１０２Ａと、カバーガラス１０２Ｂと、それらの間に封入された観察体とからなる。観察体は例えば標本（例えば細胞）と培養液とからなる。従って、観察体はスライドガラス１０２Ａとカバーガラス１０２Ｂの間に位置し、対物レンズ１０９はカバーガラス１０２Ａの上方に位置している。

図１に戻り、顕微鏡システム１００は、公知の顕微鏡用アクティブ型のオートフォーカスユニット１１８を備えている。オートフォーカスユニット１１８は、いわゆるＴＴＬ（Through The Lens）方式により焦準駆動部すなわちステージＺ駆動制御部１１６を制御する。つまり、オートフォーカスユニット１１８は、公知の技術により、対物レンズ１０９を含む観察光学系のピント位置を、対物レンズ１０９を介して光学的に検出し、その情報をステージＺ駆動制御部１１６に送る。ステージＺ駆動制御部１１６は、オートフォーカスユニット１１８からの情報に従って、観察試料１０２をピント位置へ移動させる。

さらに、顕微鏡システム１００は、観察試料１０２を透過照明するための光源１０３または蛍光照明を行うための光源１０３’を備えている。透過観察では、光源１０３からの照明光は、減光するためのＮＤフィルタ１０４、視野絞り（ＦＳ）１０５、開口絞り（ＡＳ）を内蔵したコンデンサ１０６を介して観察試料１０２に照射される。一方、蛍光観察では、光源１０３’からの照明光は、蛍光キューブ１０７により、折り返され観察試料１０２に励起光として照射される。各光学素子は、図示しないそれぞれの駆動制御部により、光学素子変換が電動で行えるようになっている。これにより、光源１０３’と蛍光キューブ１０７を含む蛍光観察用の照明光学系は、波長の異なる励起光を選択的に照射し得る。言い換えれば、蛍光観察用の照明光学系は、励起光を選択可能となっている。

観察試料１０２からの透過照明像または蛍光像は、対物レンズ１０９を通過して、鏡筒１１０により、その一部が接眼レンズ１１１に導かれ、その他の光束はＴＶカメラ１１２に入射する。

顕微鏡の制御は、ホストＰＣ１１３から顕微鏡コントローラ１１４を介して行われ、顕微鏡コントローラ１１４は電動制御部位に対して、それぞれの制御部を介して実際の駆動制御を行う。

光源１０３およびＮＤ、ＡＳ、ＦＳは、図示しないそれぞれの制御部により、顕微鏡コントローラ１１４から制御可能となっており、光源電圧や絞り径などが制御される。

一方、ＴＶカメラ１１２によって撮像された観察試料１０２の画像は、ビデオキャプチャボード１１７によりホストＰＣ１１３に取得される。ホストＰＣ１１３は、取得した画像を図示しない画像メモリに複数の画像を保存することが可能となっている。

図２Ａは、標本の動きを長時間観察するいわゆるタイムラプスのモデルである。図２Ａは、スライドガラス１０２Ａとカバーガラス１０２Ｂに封入された観察体中の標本（または標本中の核などの特定部位）が時間をかけて位置Ａから位置Ｂへ移動することを示している。観察は、一点鎖線で示された図２Ａ中の撮影領域中心位置から所定量だけステージをＺ方向に駆動し、撮影領域上限から撮影領域下限まで、二点鎖線で示された位置で撮影を設定された間欠時間毎に行われる。

上記の条件により撮影時間ｔ０からｔ４までの期間撮影した観察画像のモデルを図３に示す。図３において、縦軸方向の各画像情報は、網掛けされた丸で示される標本がステージＺ方向に動いた距離を示しており、ｔ０からｔ４までの間にＺ４だけ標本が動いたことを示している。同様に各画像内のＸ−Ｙ位置は、標本がＸ−Ｙ方向に動いたことを示しており、図３のモデルでは、ｔ０で画像中央に存在した標本が、ｔ４までの間に右方向に動いたことを示している。

図２Ｂは、上記のような撮影を行うための顕微鏡システム１００におけるホストＰＣ１１３の設定画面を示している。設定画面は、ＴＶカメラ１１２からの標本画像を表示するＧ１と、顕微鏡の制御に関する操作表示部Ｇ２と、標本画像の撮影条件を設定する表示部Ｇ３とで構成されている。

撮影条件設定方法を図２Ａと図２Ｂを用いて説明する。

撮影条件設定に際して、まず、スライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂに対してＧ４ボタンでオートフォーカス（ＡＦ）を行う。図２Ａはカバーガラス１０２Ｂに対してＡＦを行った場合を示しており、ＡＦが完了するとステージ１０１は図２Ａの基準位置となる。観察者は撮影対象である標本にピントを合わせるため、Ｇ５ボタンを用いてステージ１０１を上下駆動させる。Ｇ６は現在のステージ位置のアドレスを表示しており、カバーガラス位置（ＡＦが完了した位置）から標本の位置までの距離などが読みとれるようになっている。標本にピントを合わせた後、Ｇ１０ボタンを用いて図２Ａの撮影カウント３のような撮影するステージＺ方向の撮影領域中心位置登録を行う。このカバーガラス位置と中心位置の距離がオフセットとなる。撮影領域中心位置を登録した後、Ｇ７およびＧ９ボタンを用いて、図２Ａの撮影Ｚ間隔、撮影カウントで示されるような標本に対するＺ方向スライス撮影を行うためのステージＺ方向のピッチと撮影枚数を設定する。撮影枚数やピッチの設定は、撮影するＺ方向の範囲と枚数でも設定可能となっており、その場合にはＧ８およびＧ９ボタンを用いて設定を行う。撮影するＺ方向の範囲がスライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂを越えて設定された場合には、その設定条件に対する警告表示を行う。Ｚ撮影枚数および二方向ピッチを設定した後は、撮影する時間間隔をＧ１１で、また撮影期間に対してはＧ１２を用いて設定する。撮影間隔がＧ７およびＧ９で設定したＺ方向に対する撮影時間より、短く設定された場合には、撮影間隔の設定に対する警告表示を行う。

本実施形態では、カバーガラス１０２Ｂにオートフォーカスを行った後、撮影対象物の位置設定を行ったが、これを撮影対象物の位置設定を行った後、カバーガラス１０２Ｂにオートフォーカスを行っても同様である。

上記のように設定された顕微鏡システム１００の動作を図４を用いて説明する。

測定が開始されると（Ｓ１）、所定枚数の撮影が完了し、ホストＰＣ設定の撮影時間（合計）に応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする（Ｓ２）。測定が終了した場合には、終了する（Ｓ１０）。測定が終了していない場合には、ホストＰＣ設定のタイムラプス間隔で設定したタイムラプス測定間隔に達するまで待機する（Ｓ３）。

測定間隔に達するとカバーガラス１０２Ｂに対してＡＦ制御を行い、図２Ａで示した基準位置に位置制御を行う（Ｓ４）。基準位置に駆動した後、ホストＰＣで予め設定した撮影領域中心位置すなわちオフセット量だけステージ１０１を駆動する（Ｓ５）。

つまり、オートフォーカスユニット１１８によりカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスを行った後、ステージＺ駆動制御部１１６によりステージ１０１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。

さらに、Ｚ方向画像を取得するために撮影領域上限へ駆動して（Ｓ６）、撮影を行う（Ｓ７）。Ｓ５、Ｓ６は予め撮影領域中心位置の設定値から撮影領域上限を算出しておくことにより、Ｓ５動作を省略する（内部処理する）ことも可能である。また、これらの駆動はいわゆるバックラッシュによる位置ズレが極力発生しないように、一方向から位置制御することが望ましい。

撮影が行われた後はホストＰＣで設定した撮影カウント枚数分だけ、同じくホストＰＣで設定した撮影Ｚ間隔分だけ駆動しながら行い（Ｓ８、Ｓ９）、この動作を測定が終了するまで繰り返し続ける（Ｓ２）。

以上のように構成・制御される本実施形態の顕微鏡システム１００は、カバーガラス１０２Ｂにオートフォーカスをかけることにより、周囲温度の変化により対物レンズ焦点位置が変化した場合でも、基準位置が固定された状態で標本撮影位置をオフセットで設定するため、標本の動きを確実に測定することが可能となる。

本実施形態の顕微鏡システム１００は、ステージ１０１を上下させる構成となっているが、対物レンズ１０９を上下させる構成であってもよく、その場合にも、同様の効果を得ることが可能である。また、本実施形態の顕微鏡システム１００では、顕微鏡は、正立型の顕微鏡であるが、ステージ１０１の下に対物レンズが設置されているいわゆる倒立型の顕微鏡であってもよく、その場合にも、同様の効果を得ることが可能である。さらに、本実施形態では、オートフォーカスは、アクティブ型のオートフォーカスであるが、公知のパッシブ型のオートフォーカスであってもよく、その場合にも、同様の効果を得ることが可能である。

本実施形態においては、カバーガラス１０２Ｂまたはスライドガラス１０２Ａに一旦オートフォーカスを行った後、予め設定された所定量の駆動を行い、撮影するという目的を逸脱しないかぎり種々の変形が可能である。

本実施形態では、ステージ１０１は必ずしもＸ−Ｙ方向に移動可能である必要はない。つまり、ステージ１０１がＺ方向のみに移動可能であって、ステージＸ−Ｙ制御部１１５が省かれてもよい。また、対物レンズ１０９は必ずしも交換可能である必要はない。つまり、顕微鏡は、複数の対物レンズを回転可能に保持し、それらのひとつを選択的に光路中に配置し得るレボルバの機能を有していなくてもよい。

第二実施形態
本実施形態は、Ｘ−Ｙ位置の異なる複数の測定点に対するタイムラプス測定に向けられている。本実施形態の顕微鏡システムの構成は、第一実施形態と同様のため省略する。本実施形態では、標本のＸ−Ｙ位置毎のオフセット駆動動作を行う。

図５は、スライドガラス１０２Ａとカバーガラス１０２Ｂで封入された観察体内に複数の測定点ＸＹ１、ＸＹ２、ＸＹ３があるモデルを示している。このモデルにおいて、測定点ＸＹ１、ＸＹ２、ＸＹ３のカバーガラス１０２Ｂに対するＺ方向位置Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３はそれぞれ異なっている。これらの各測定点の動きをタイムラプス測定する際の手順を示す。

図６は本実施形態で示すＸ−Ｙ位置毎のオフセット駆動を設定するホストＰＣ設定画面であり、図６は第一実施形態に対していくつかの機能追加がされたものであり、その追加機能を説明する。

Ｇ２０は、スライドガラス１０２Ａの全体の画像であり、観察者はＧ２３ボタンを用いてステージ１０１をＸ−Ｙ方向に動かし、タイムラプス観察を行う核などの測定点を決定する。Ｇ２４にはステージ１０１のＸ−Ｙ位置の情報が表示され、測定点の決定はステージＸ−Ｙ位置を静止させ、Ｇ２１のボタンで行う。位置設定を行うと登録された測定点はＧ２０の観察体全体画像中にＸ点で示される。各測定点のオフセット量設定、撮影条件設定は第一実施形態に示した手順と同様に行う。またすでに別の測定点で登録した条件設定と同じ撮影条件とする場合には、撮影条件を登録しておけばＧ２２ボタンで呼び出すことも可能であり、全測定点あるいは特定測定点の撮影条件を統一することが可能となっている。

以上のように設定された顕微鏡システムの動作を図７を用いて説明する。

測定が開始されると（Ｓ２０）、所定枚数の撮影が完了し、ホストＰＣ設定の撮影時間（合計）に応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする（Ｓ２１）。測定が終了した場合には、終了する（Ｓ３１）。測定が終了していない場合には、ホストＰＣ設定のタイムラプス間隔で設定したタイムラプス測定間隔に達するまで待機する（Ｓ２２）。

測定間隔に達すると複数の測定点の設定用にステージＸ−Ｙ駆動を行う（Ｓ２３）。各測定点のステージＸ−Ｙ位置に駆動されると、そのステージＸ−Ｙ位置のカバーガラス１０２Ｂに対してＡＦ制御を行い、カバーガラス位置である基準位置に位置制御を行う（Ｓ２４）。基準位置に駆動した後、ホストＰＣで予め設定した各撮影中心領域位置にすなわちオフセット量だけステージ１０１を駆動する（Ｓ２５）。

つまり、オートフォーカスユニット１１８によりカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスを行った後、ステージＺ駆動制御部１１６によりステージ１０１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。

さらに、Ｚ方向画像を取得するために撮影領域上限へ駆動して（Ｓ２６）、撮影を行う（Ｓ２７）。Ｓ２５、Ｓ２６は第一実施形態と同様に予め撮影領域中心位置の設定値から撮影領域上限を算出しておくことにより、Ｓ２５動作を省略する（内部処理する）ことも可能である。

撮影が行われた後はホストＰＣで設定した撮影カウント枚数分だけ、同じくホストＰＣで設定した撮影Ｚ間隔分だけ駆動しながら行い（Ｓ２８、Ｓ２９）、全測定点での撮影が終了し、かつタイムラプス測定終了条件に達するまで絞り返し続ける（Ｓ３０、Ｓ３１）。

以上のように構成・制御される本実施形態の顕微鏡システムは、複数の測定点毎にカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスをかけることにより、周囲温度の変化により対物レンズ焦点位置が変化した場合でも、基準位置が固定された状態で標本撮影位置をオフセットで設定するため、複数の測定であっても標本の動きを確実に測定することが可能となる。

またＸ−Ｙの複数の測定点において、例えば標本をサーチする範囲を決定する領域など前回のタイムラブス時に取得したオートフォーカス条件を図７のＳ２４に示したＡＦ制御中に更新すれば、より高速かつ高信頼度でＡＦ制御を行うことが可能となる。

本実施形態では、対物レンズ１０９は必ずしも交換可能である必要はない。つまり、顕微鏡は、複数の対物レンズを回転可能に保持し、それらのひとつを選択的に光路中に配置し得るレボルバの機能を有していなくてもよい。

第三実施形態
本実施形態は、対物レンズの交換を含むタイムラプス測定に向けられている。本実施形態の顕微鏡システムの構成は、第一実施形態と同様のため省略する。

タイムラプス測定の条件とひとつとして対物レンズの変換が含まれた場合、結像レンズが異なるため、オフセット量を変更しなければならない可能性がある。本実施形態では、対物レンズ毎のオフセット量を設定してタイムラプス測定を行う。

対物レンズ毎のオフセット量の設定は、第一実施形態または第二実施形態と同様にホストＰＣ画面で図示しない対物レンズ毎のオフセット量設定ボタンで行う。

図８は対物レンズ毎のオフセット量が設定された顕微鏡システムの動作制御を示している。

測定が開始されると（Ｓ４０）、所定枚数の撮影が完了し、ホストＰＣ設定の撮影時間（合計）に応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする（Ｓ４１）。測定が終了した場合には、終了する（Ｓ５１）。測定が終了していない場合には、ホストＰＣ設定のタイムラプス間隔で設定したタイムラプス測定間隔に達するまで待機する（Ｓ４２）。

測定間隔に達すると設定された対物レンズを光路中に挿入する（Ｓ４３）。対物レンズが光路中に挿入されると、カバーガラス１０２Ｂに対してＡＦ制御を行い、カバーガラス位置である基準位置に位置制御を行う（Ｓ４４）。基準位置に駆動した後、ホストＰＣで予め設定した対物レンズ毎に設定されたオフセット量だけステージ１０１を駆動する（Ｓ４５）。

つまり、オートフォーカスユニット１１８によりカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスを行った後、ステージＺ駆動制御部１１６によりステージ１０１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。

さらに、Ｚ方向画像を取得するために撮影領域上限へ駆動して（Ｓ４６）、撮影を行う（Ｓ４７）。

撮影が行われた後はホストＰＣで設定した撮影カウント枚数分だけ、同じくホストＰＣで設定した撮影Ｚ間隔分だけ駆動しながら行い（Ｓ４８、Ｓ４９）、設定された全対物レンズでの撮影が終了し、かつタイムラプス測定終了条件に達するまで絞り返し続ける（Ｓ５０、Ｓ５１）。

以上のように構成・制御される本実施形態の顕微鏡システムは、タイムラプス測定条件において複数の対物レンズによる観察が含まれている場合に各光路中の対物レンズを用いてオートフォーカスをかけることにより、対物レンズ間にオートフォーカス側を含む焦点ズレが存在した場合でも、基準位置が固定された状態で標本撮影位置をオフセットで設定するため、複数の測定であっても標本の動きを確実に測定することが可能となる。

本実施形態では、ステージ１０１は必ずしもＸ−Ｙ方向に移動可能である必要はない。つまり、ステージ１０１がＺ方向のみに移動可能であって、ステージＸ−Ｙ制御部１１５が省かれてもよい。

第四実施形態
本実施形態は、励起光変換を含むタイムラプス測定に向けられている。本実施形態の顕微鏡システムの構成は、第一実施形態と同様のため省略する。

タイムラプス測定の条件とひとつとして蛍光キューブ変換すなわち励起光変換が含まれた場合、標本の発光部位が異なるため、オフセット量を変更しなければならない可能性である。本実施形態では、励起光変換毎のオフセット量を設定してタイムラプス測定を行う。

図９は励起光変換毎のオフセット量が設定された顕微鏡システムの動作制御を示している。

測定が開始されると（Ｓ６０）、所定枚数の撮影が完了し、ホストＰＣ設定の撮影時間（合計）に応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする（Ｓ６１）。測定が終了した場合には、終了する（Ｓ７１）。測定が終了していない場合には、ホストＰＣ設定のタイムラプス間隔で設定したタイムラプス測定間隔に達するまで待機する（Ｓ６２）。

測定間隔に達すると設定された蛍光キューブを光路中に挿入する（Ｓ６３）蛍光キューブが光路中に挿入され、励起光が切り替わると、カバーガラス１０２Ｂに対してＡＦ制御を行い、カバーガラス位置である基準位置に位置制御を行う（Ｓ６４）。基準位置に駆動した後、ホストＰＣで予め設定した励起光毎に設定されたオフセット量だけステージ１０１を駆動する（Ｓ６５）。

つまり、オートフォーカスユニット１１８によりカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスを行った後、ステージＺ駆動制御部１１６によりステージ１０１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。

さらに、Ｚ方向画像を取得するために撮影領域上限へ駆動して（Ｓ６６）、撮影を行う（Ｓ６７）。

撮影が行われた後はホストＰＣで設定した撮影カウント枚数分だけ、同じくホストＰＣで設定した撮影Ｚ間隔分だけ駆動しながら行い（Ｓ６８、Ｓ６９）、設定された全励起光での撮影が終了し、かつタイムラプス測定終了条件に達するまで繰り返し続ける（Ｓ７０、Ｓ７１）。

以上のように構成・制御される本実施形態の顕微鏡システムは、蛍光観察のタイムラプス測定条件において励起光毎に標本の発光点が異なる対象物の動きを観測する場合に、スライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスをかけることにより、基準位置が固定された状態で標本撮影位置をオフセットで設定するため、各励起光毎に標本の動きを確実に測定することが可能となる。

本実施形態では、観察を行う毎に、スライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂに対してオートフォーカスを行っているが、これを間欠時間経過ごとに一度だけ行うことにより、撮影時間の短縮を図ってもよい。

これまで、第二実施形態のステージＸ−Ｙ毎のオフセット、第三実施形態の対物レンズ毎のオフセット、第四実施形態の励起光毎のオフセットは、単独で行うものとして説明したが、それらのいずれか二つを組み合わせて行ったり、それらの三つをすべて組み合わせ行ったりしてもよく、その場合には、より高精度な測定を行うことが可能となる。

第五実施形態
本実施形態は、スライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂに対して行うＡＦ制御に向けられている。本実施形態の顕微鏡システムの構成は、第一実施形態と同様のため省略する。

図１０は本実施形態で用いるスライドガラス１０２Ａのモデル図である。図１０に示されるように、スライドガラス１０２ＡはＡＦ用マーキング１０２Ｃを有している。ＡＦ用マーキング１０２Ｃは、観察体１０２Ｄに影響がない範囲に位置し、オートフォーカス制御の精度を向上させる処理が施されている。本実施形態では、アクティブＡＦを例に挙げ、ＡＦ用マーキング１０２Ｃは、アクティブＡＦで用いられるレーザー光を高い反射率で反射する膜のコーティング処理が施されている。

図１１は上述の顕微鏡システムの動作制御を説明したものである。

測定が開始されると（Ｓ８０）、所定枚数の撮影が完了し、ホストＰＣ設定の撮影時間（合計）に応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする（Ｓ８１）、測定が終了した場合には、終了する（Ｓ８１）。測定が終了していない場合には、ホストＰＣ設定のタイムラプス間隔で設定したタイムラプス測定間隔に達するまで待機する（Ｓ８２）。

測定間隔に達するとＡＦ用マーキング位置にステージＸ−Ｙ駆動を行う（Ｓ８３）。ＡＦ用マーキング位置に移動すると、オートフォーカス制御を行い、カバーガラス位置である基準位置に位置制御を行う（Ｓ８４）。基準位置に位置制御を行った後、実際に測定を行うステージＸ−Ｙ位置に移動する（Ｓ８５）。基準位置に駆動した後、ホストＰＣで予め設定されたオフセット量だけステージ１０１を駆動する（Ｓ８６）。

つまり、オートフォーカスユニット１１８によりスライドガラス１０２ＡのＡＦ用マーキング１０２Ｃに対してオートフォーカスを行った後、ステージＺ駆動制御部１１６によりステージ１０１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。

さらに、Ｚ方向画像を取得するために撮影領域上限へ移動して（Ｓ８７）、撮影を行う（Ｓ８８）。

撮影が行われた後はホストＰＣで設定した撮影カウント 枚数分だけ、同じくホストＰ
Ｃで設定した撮影Ｚ間隔分だけ駆動しながら行い（Ｓ８９、Ｓ９０）、設定された全励起光での撮影が終了し、かつタイムラプス測定終了条件に達するまで繰り返し続ける（Ｓ９０、Ｓ８１）。

本実施形態の顕微鏡システムでは、スライドガラス１０２Ａに対して高精度なＡＦが可能となるため、測定の精度を向上することができる。さらに、オートフォーカスの対象が周知のものとなるため、最適なオートフォーカス条件を設定することができる。これにより、ピント合わせ時間の短縮が可能となり、測定のスループットが向上する。

また、本実施形態では、オートフォーカスがアクティブ方式のＡＦであり、これに対応してＡＦ用マーキング１０２Ｃが反射膜である例について述べたが、オートフォーカスはパッシブ方式のＡＦであってもよく、その場合には、ＡＦ用マーキング１０２Ｃを高コントラストのマーキングとし、公知の山登り方式などのオートフォーカス制御を行えばよい。

第六実施形態
本実施形態は、倒立型顕微鏡を含む顕微鏡システムに向けられている。図１２は、本発明の第六実施形態の顕微鏡システムの構成を示している。

図１２に示されるように、本実施形態の顕微鏡システム６００は、観察試料６１０を載せるためのステージ６２１と、ステージ６２１に載せられた観察試料６１０と対峙するように配置される対物レンズ６３１を含む観察光学系とを備えている。

観察試料６１０は観察体６１１とこれを収容する容器６１２（いわゆるディッシュ）とからなる。観察体６１１は例えば標本（例えば細胞）と培養液とからなる。容器６１２は、底部に開口を持つ皿状の透明な容器本体６１３と、容器本体６１３の開口を塞いでいるカバーガラス６１４とから構成されている。従って、観察体６１１はカバーガラス６１４の上に位置し、対物レンズ６３１はカバーガラス６１４の下方に位置している。

ステージ６２１はＸ−Ｙ方向に移動可能である。顕微鏡システム６００は、ステージ６２１のＸ−Ｙ方向の位置を電動制御するため、ステージ６２１をＸ−Ｙ方向に移動させるためのステージ駆動用モータ６２２と、ステージ６２１のＸ−Ｙ方向の位置を制御するステージＸ−Ｙ制御部６２３とを備えている。

対物レンズ６３１は電動レボルバに装着されている。電動レボルバは、複数の対物レンズ６３１を保持できるレボルバ本体６３２と、レボルバ本体６３２を回転させるためのレボルバ用モータ６３３と、レボルバ用モータ６３３を制御するためのレボルバ用モータ駆動部６３４とを備えている。

電動レボルバは、レボルバ用モータ駆動部６３４によってレボルバ本体６３２の回転を制御することにより、レボルバ本体６３２に保持された対物レンズ６３１の一つを選択的に光路上に配置させることができる。

レボルバ本体６３２は、対物レンズ６３１を取り付けることのできる複数の対物レンズ取付穴を有しており、電動レボルバはさらに、光路上に配置されている対物レンズ６３１が取り付けられているレボルバ本体６３２の対物レンズ取付穴を検出するための取付穴位置検出部６１８を有している。

レボルバ本体６３２は観察光軸に沿って移動可能であり、顕微鏡システム６００はさらに、照準のためにレボルバ本体６３２を観察光軸に沿って移動させるための照準用モータ６３６と、照準用モータ６３６を制御するための焦準用モータ駆動部６３７とを備えている。照準用モータ６３６と焦準用モータ駆動部６３７は、ステージと対物レンズの少なくとも一方を焦準のために駆動する焦準駆動部を構成している。

顕微鏡システム６００は、アクティブ瞳分割法によるアクティブ方式のＡＦ装置を備えている。ＡＦ装置は、基準光源６７１と、レーザー駆動部６７２と、コリメートレンズ６７３と、投光側ストッパ６７４と、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）６７５と、集光レンズ群６７６と、色収差補正レンズ群６７７と、λ／４板６７８と、ダイクロイックミラー６７９と、受光センサー６８１と、信号処理部６８２と、色収差補正レンズ群駆動用モータ６８３と、色収差レンズ駆動部６８４とから構成されている。

顕微鏡システム６００は、ステージＸ−Ｙ制御部６２３とレボルバ用モータ駆動部６３４と焦準用モータ駆動部６３７と色収差レンズ駆動部６８４を制御するための顕微鏡コントローラ６９１を備えている。顕微鏡コントローラ６９１は周知のＣＰＵ回路である。顕微鏡コントローラ６９１には、各種操作ＳＷを有する操作部６９２が接続されている。観察者は操作部６９２を介して、ＡＦ開始／停止や対物レンズの切り替えなどの操作や、ガラス厚などのＡＦに関する必要情報の入力などを行える。また顕微鏡コントローラ６９１には、パルスカウンタ６９５とジョグエンコーダ６９４を介して、ジョグダイヤル６９３が接続されている。観察者はジョグダイヤル６９３によってレボルバ本体６３２を上下移動させることができる。

顕微鏡システム６００は、観察試料６１０を透過照明するための透過照明光学系を備えている。透過照明光学系は、照明用光源６４１と、レンズ６４２と、ミラー６４３と、レンズ６４４とを有している。

また顕微鏡システム６００は蛍光観察用の照明光学系を備えている。蛍光照明光学系は、励起光を発する光源６５１と、蛍光キューブ６５２とを有している。蛍光キューブ６５２は電動制御によって交換可能である。これにより、蛍光観察用の照明光学系は、波長の異なる励起光を選択的に照射し得る。言い換えれば、蛍光観察用の照明光学系は、励起光を選択可能となっている。

顕微鏡システム６００は、必ずしも透過照明光学系と蛍光観察用の照明光学系の両方を備えている必要はなく、観察目的に合ったどちらか一方の照明光学系を備えているだけであってもよい。

顕微鏡システム６００はさらに、観察像を撮像するためのＴＶカメラ６６１と、ビデオキャプチャボード６６２と、ホストＰＣ６６３とを備えている
透過照明観察において、照明用光源６４１からの照明光は、レンズ６４２を通り、ミラー６４３によって反射され、レンズ６４４によって集光され、観察試料６１０を上方から照明する。観察試料６１０を透過した光は、対物レンズ６３１を通り、ダイクロイックミラー６７９を透過して、ＴＶカメラ６６１に入射する。

また蛍光観察において、光源６５１から発せられた励起光は、蛍光キューブ６５２で反射され、対物レンズ６３１を通して観察試料６１０に照射される。観察試料６１０から発生した蛍光は、対物レンズ６３１を通り、蛍光キューブ６５２によって波長選択され、ダイクロイックミラー６７９を透過して、ＴＶカメラ６６１に入射する。

ＴＶカメラ６６１によって撮像された画像は、第一実施形態と同様に、ビデオキャプチャボード６６２によりホストＰＣ６６３に取得される。ホストＰＣ６６３は、取得した画像を図示しない画像メモリーに複数の画像を保存することが可能となっている。

本実施形態の顕微鏡システム６００において、アクティブ瞳分割法のＡＦ装置は、レーザー光を観察試料に照射し、その反射光を検出することによって、ピント合わせを行う。

基準光源６７１は、可視外の波長領域の光を発する光源、例えば赤外線レーザーで構成される。基準光源６７１はレーザー駆動部６７２によって制御される。レーザー駆動部６７２は、基準光源６７１のパルス点灯などを行い、基準光源６７１の強弱を制御する。

基準光源６７１から発せられたレーザー光は、コリメートレンズ６７３を通過することにより平行光束になり、投光側ストッパ６７４によって光束径の半分がカットされ、その後、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）６７５によってＰ偏光成分だけが反射される。

偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）６７５からの光束は、集光レンズ群６７６によって一旦収束された後、色収差補正レンズ群６７７を通過する。色収差補正レンズ群６７７を通過した光は、λ／４板６７８を通過する際に４５度偏光され、ダイクロイックミラー６７９に入射する。ダイクロイックミラー６７９は、赤外域の光だけ反射するため、レーザー光束は反射される。反射された光束は、対物レンズ６３１を通って観察試料６１０に照射され、光スポットを形成する。

観察試料６１０によって反射された光束は、対物レンズ６３１に入射し、ダイクロイックミラー６７９によって反射される。反射された光束は、λ／４板６７８を再び通過する際にさらに４５度偏光され、Ｓ偏光成分に変わる。光束はさらに、色収差補正レンズ群６７７と集光レンズ群６７６を通過し、ＰＢＳ６７５に入射する。光束は、Ｓ偏光成分になっているので、ＰＢＳ６７５を透過する。透過した光束は、集光レンズ群６８０を通過した後に受光センサー６８１に結像される。

受光センサー６８１は、隣接した二つの受光部を持つ二分割フォトダイオードであり、二つの受光部の境界線上に光軸が位置するように配置されている。信号処理部６８２は、受光センサー６８１からの出力に基づいて、ピント位置とピント合わせ方向とを判断できるいわゆるＳ字カーブを取得する。顕微鏡コントローラ６９１は、信号処理部６８２で得られた情報（Ｓ字カーブ）に基づいて焦準用モータ駆動部６３７を制御することにより、観察光学系のオートフォーカス制御を行う。

このＡＦ装置は、色収差補正レンズ群駆動用モータ６８３によって色収差補正レンズ群６７７を光軸に沿って移動させることによって、赤外線レーザーの色収差補正が可能であるとともに、ピント位置をずらすいわゆる光学的なオフセット駆動が可能である。これにより、例えば温度変化に起因して発生する観察光学系とＡＦ光学系のフォーカスドリフトの差を補償する、言い換えれば両者のフォーカスドリフトを同一にすることが可能である。

本実施形態の顕微鏡システム６００において、第一実施形態と同様に、アクティブＡＦによってカバーガラス６１４に対してオートフォーカスを行った後、焦準用モータ駆動部６３７によりレボルバ本体６３２を移動させて対物レンズ６３１を予め定めた一定量すなわちオフセット量の分だけ移動させる。これにより、第一実施形態と同様の利点が得られる。

さらに、第一実施形態に対して第二実施形態〜第五実施形態が適用されたのと同様に、本実施形態の顕微鏡システム６００に対しても第二実施形態〜第五実施形態が適用されてもよい。それらの場合にもそれぞれ第二実施形態〜第五実施形態と同様の利点が得られる。

これまで、図面を参照しながら本発明のいくつかの実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

つまり、本発明の顕微鏡システムは、透明体（スライドガラス１０２Ａまたはカバーガラス１０２Ｂまたはカバーガラス６１４）に一旦オートフォーカスを行い、予め設定された測定点までのオフセット量を駆動させて、撮影を行うという制御に関して、上述の実施形態に限定されることはなく、種々の変形が可能である。

本発明の第一実施形態の顕微鏡システムの構成を示している。 観察体の動きを長時間観察するタイムラプスのモデルを示している。 本発明の第一実施形態の顕微鏡システムにおけるホストＰＣの設定画面を示している。 所定の撮影期間の間に撮影した観察画像のモデルを示している。 本発明の第一実施形態の顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。 スライドガラスとカバーガラスで封入された観察体内に複数の測定点があるモデルを示している。 本発明の第二実施形態の顕微鏡システムにおけるホストＰＣ設定画面を示している。 本発明の第二実施形態の顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。 本発明の第三実施形態の顕微鏡システムの動作制御を示すフローチャートである。 本発明の第四実施形態の顕微鏡システムの動作制御を示すフローチャートである。 本発明の第五実施形態の顕微鏡システムにおけるスライドガラスのモデル図である。 本発明の第五実施形態の顕微鏡システムの動作制御を示すフローチャートである。 本発明の第六実施形態の顕微鏡システムの構成を示している。 赤外線反射膜を施したスライドガラス上に載せられた標本の内部のいくつかの核のひとつに対して観察を行うモデル図である。 観察において着目する核が移動することに伴って、コントラスト最大の位置が移動する様子を示している。 蛍光観察において発光する標本の部位が異なる様子を示している。

１００…顕微鏡システム、１０１…ステージ、１０２…標本、１０２Ａ…スライドガラス、１０２Ｂ…カバーガラス、１０２Ｃ…ＡＦ用マーキング、１０３…光源、１０４…ＮＤフィルタ、１０６…コンデンサ、１０７…蛍光キューブ、１０８…レボルバ、１０９…対物レンズ、１１０…鏡筒、１１１…接眼レンズ、１１２…カメラ、１１３…ホストＰＣ、１１４…顕微鏡コントローラ、１１５…ステージＸ−Ｙ制御部、１１６…ステージＺ駆動制御部、１１７…ビデオキャプチャボード、１１８…オートフォーカスユニット、６００…顕微鏡システム、６１０…観察試料、６１１…観察体、６１２…容器、６１３…容器本体、６１４…カバーガラス、６１８…取付穴位置検出部、６２１…ステージ、６２２…ステージ駆動用モータ、６２３…ステージＸ−Ｙ制御部、６３１…対物レンズ、６３２…レボルバ本体、６３３…レボルバ用モータ、６３４…レボルバ用モータ駆動部、６３６…照準用モータ、６３７…焦準用モータ駆動部、６４１…照明用光源、６４２…レンズ、６４３…ミラー、６４４…レンズ、６５１…光源、６５２…蛍光キューブ、６６１…ＴＶカメラ、６６２…ビデオキャプチャボード、６６３…ホストＰＣ、６７１…基準光源、６７２…レーザー駆動部、６７３…コリメートレンズ、６７４…投光側ストッパ、６７５…偏光ビームスプリッター、６７６…集光レンズ群、６７７…色収差補正レンズ群、６７８…λ／４板、６７９…ダイクロイックミラー、６８０…集光レンズ群、６８１…受光センサー、６８２…信号処理部、６８３…色収差補正レンズ群駆動用モータ、６８４…色収差レンズ駆動部、６９１…顕微鏡コントローラ、６９２…操作部、６９３…ジョグダイヤル、６９４…ジョグエンコーダ、６９５…パルスカウンタ。

Claims (6)

1. 透明体と該透明体上に載置された観察体とからなる観察試料を載せるステージと、
   該ステージに載せられた前記観察試料と対峙するように前記ステージより下方に配置される対物レンズと、
   前記ステージと前記対物レンズのうち少なくとも一方を観察光軸と平行方向に駆動させる焦準駆動部と、
   前記試料を照明するための観察用光源と、
   前記対物レンズを介して前記観察試料の撮影を行う撮像装置と、
   前記観察光源とは異なる光源で、前記対物レンズの下方から前記観察試料に対してオートフォーカス用の検出光を出射する焦点検出光源と、
   前記観察試料における前記透明体から反射した前記検出光を対物レンズを介して受光する受光手段と、
   前記受光手段の結果から前記焦準駆動部を制御することで前記透明部材の所定の位置にオートフォーカスをすることが可能なオートフォーカス部と、
   前記所定の位置から一定量離れた前記観察体の撮影領域を設定する撮影条件設定部と、
   前記撮影手段の間欠撮影時間間隔であるタイムラプス測定時間間隔を設定するタイムラプス測定間隔設定部と、を備え、
   前記タイムラプス測定時間間隔毎に前記オートフォーカス部により前記透明部材から前記焦点検出光が反射される位置である前記所定の位置に対してオートフォーカスを行い、前記所定の位置へのオートフォーカス終了後、前記撮影領域で少なくとも２枚の焦点位置が異なる前記観察試体の画像を撮影することを特徴とする顕微鏡システム。
2. 観察光軸と垂直にステージを駆動制御するＸ−Ｙステージ駆動部を更に備えており、前記一定量は、Ｘ−Ｙステージ駆動部により予め位置決めされたステージＸ−Ｙアドレス毎に設定されることを特徴する請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記撮影条件設定部は、前記所定の位置を基準とした前記焦準駆動部のピッチ又は撮影枚数のうち少なくとも何れか１つを設定することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記観察光源は、前記観察試料の蛍光を励起する蛍光観察用励起光源であることを特徴とする請求項１から請求項３のうち何れか１項に記載の顕微鏡システム。
5. 前記撮影条件設定部は、前記タイムラプス測定時間間隔毎に前記撮影領域を前記所定の位置を基準にして設定していることを特徴とする請求項1から請求項４のうち何れか１項に記載の顕微鏡システム。
6. 前記撮影条件設定部は、前記タイムラプス測定時間間隔毎に前記撮影領域を前記所定の位置から一定量オフセットした位置を基準にして設定していることを特徴とする請求項１から請求項４のうち何れか１項に記載の顕微鏡システム。

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