JP2001083391A - 顕微鏡のフォーカス装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 顕微鏡で、被観察物と対物レンズとの間の相
対距離を一定に保つ。 【解決手段】 試料（被観察物）１３は、底面の開口部
にカバーガラス１４の貼り付けられたチェンバ１１に収
容され、チェンバ１１内にはチェンバ溶液１２が入れら
れる。このチェンバ溶液１２は、不図示の循環装置によ
り循環されている。チェンバ１１内のチェンバ溶液の量
が変化すると重量が変化し、カバーガラス１４や蛇の目
リング１５等の弾性変形量が変化して試料１３と対物レ
ンズ１６との間の相対距離が変化する。この相対距離の
変化は接触子１８および変位センサ１９で検出される。
ＣＰＵ２２は、変位センサ１９から出力される信号に基
づいてアクチュエータ１１３を駆動し、レボルバ１７を
上下動させる。これにより、試料１３の所望の観察面に
対物レンズ１６のピントを合わせ続けることが可能とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、顕微鏡のフォーカ
ス装置に関し、さらに詳しくは、被観察物と対物レンズ
との間の相対距離の変化を検出し、検出された相対距離
の変化に基づいて上記相対距離を調節する顕微鏡のフォ
ーカス装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】たとえば、倒立型の顕微鏡を用いて生き
ているサンプル（細胞）を観察対象とする場合、観察対
象を底面のカバーガラスに保持した特殊なチェンバに溶
液類を還流させるのが一般的である。このときカバーガ
ラスは、チェンバ内の溶液類の重量によってたわみを生
じる。溶液類を循環させる際の流量が経時的に変化する
と、チェンバ内の溶液類の体積（重量）も変化するの
で、カバーガラスのたわみ量も変化する。すると、対物
レンズと観察対象との相対距離が変化してしまう。ま
た、上述のような観察状況でなくとも、たとえば液浸対
物レンズを用いて、対物レンズの光軸方向に所定間隔を
空けて観察面を順次変更しながら観察する、いわゆる連
続的セクショニング観察を行う場合も同様のことが起き
得る。すなわち、観察面を順次変更して観察する際に、
対物レンズとカバーガラスとの間の間隔が変化する。こ
のとき、対物レンズとカバーガラスとの間に介在するオ
イルの粘性によってカバーガラスが引っ張られ、変形を
生じる。この変形により、対物レンズと観察対象との間
の相対距離が変化することがある。

【０００３】以上のような理由で観察途中の像が変化し
てしまった場合、実験者はモニタ等を観察しながら観察
面の位置を再調整する必要を生じる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述のように
観察面の位置を再調整することは以下のような問題があ
った。 （１） 共焦点顕微鏡、あるいはコンフォーカル顕微鏡
と呼ばれる顕微鏡を用いて観察対象を観察する際には蛍
光観察、つまり励起光を観察対象に照射し、観察対象か
ら発せられる蛍光を観察することが多い。このとき、観
察中にサンプル内の蛍光色素が光ダメージ等によって消
光してしまったり、あるいは何らかのサンプル自身のダ
メージによって蛍光色素が漏れ出てしまう場合があっ
た。 （２） 観察対象のサンプルの形状が一定の場合はよい
が、特に生きている細胞の場合は観察中にその形状を変
化させるケースが多々あった。つまり、たとえ対物レン
ズと観察対象との相対距離が変化しなかったとしても、
上述した（１）および（２）の要因によって、モニタに
映し出された画像が変化する可能性が大きい。このた
め、観察途中の像の変化が、サンプルの本来の正常な現
象による結果なのか、あるいは上述したカバーガラスの
変形具合の変化等の外部要因によるものなのかを判断す
ることは難しく、モニタによる観察だけでは観察結果の
信頼度が低いという問題点を有していた。以上の問題点
に加えて、下記（３）および（４）に示すような問題点
も有していた。 （３） 実験者は、チェンバ溶液の交換、画像の観察、
観察対象のサンプルの位置ずれの再調整等の作業を行わ
ねばならず、加えて上述した観察面の再調整を行うこと
は実験者の集中力を欠きかねない。 （４） 連続的セクショニング観察を行う場合、断層面
を変えることによっておのずとその画像が変化するた
め、観察面の位置がずれた場合にモニタ等を観察しなが
ら観察面を調節することは、現実的には非常に困難であ
る。理由は、観察面の位置がずれる前の画像を正確に記
憶していないと、元の観察面の位置に戻すことはできな
いからである。

【０００５】本発明の目的は、外部要因により変化した
被観察物と対物レンズとの間の相対距離を容易に補正す
ることの可能な顕微鏡のフォーカス装置を提供すること
にある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】一実施の形態を示す図１
に対応付けて以下の発明を説明する。 （１） 請求項１に記載の発明に係る顕微鏡のフォーカ
ス装置は、被観察物１３と対物レンズ１６との間の相対
距離の変化を検出可能な変位センサ１９と；変位センサ
１９で検出された相対距離の変化に基づき、被観察物１
３と対物レンズ１６との相対距離を調節する距離調節手
段２２および１１３を有することにより上述した目的を
達成する。 （２） 請求項２に記載の発明に係る顕微鏡のフォーカ
ス装置は、距離調節手段２２および１１３が、被観察物
１３と対物レンズ１６との相対距離を調節する際に駆動
される駆動対象物１７の実際の移動量をフィードバック
して駆動対象物１７の駆動量を制御するフィードバック
ループをさらに有するものである。 （３） 一実施の形態を示す図６に対応付けて説明する
と、請求項３に記載の発明に係る顕微鏡のフォーカス装
置は、対物レンズ１６Ｂの周縁部に、対物レンズ１６Ｂ
の光軸とほぼ平行な方向に移動可能な接触子６２をさら
に有し；変位センサ１９は、接触子６２の変位量を検出
するものである。 （４） 一実施の形態を示す図１に対応付けて説明する
と、請求項４に記載の発明に係る顕微鏡のフォーカス装
置は、被観察物１３を載置する載置基板１４の、被観察
物１３が載置される側と対向する側の面に接触する接触
子１８をさらに有し；変位センサ１９は、接触子１８の
変位量を検出するものである。

【０００７】なお、本発明の構成を説明する上記課題を
解決するための手段の項では、本発明を分かり易くする
ために発明の実施の形態の図を用いたが、これにより本
発明が実施の形態に限定されるものではない。

【０００８】

【発明の実施の形態】− 第１の実施の形態 − 図１は、本発明の第１の実施の形態に係る顕微鏡のフォ
ーカス装置が倒立型のコンフォーカル顕微鏡に組み込ま
れている様子を概略的に示す。以下では、この顕微鏡を
用いて連続的セクショニングを行う場合を例にとって説
明する。蛇の目リング１５は環状の板で、中央部には観
察孔が空けられている。この蛇の目リング１５は不図示
のステージの上に固定されている。蛇の目リング１５の
上には、底部開口にカバーガラス１４を貼り付けたチェ
ンバ１１が載置される。カバーガラス１４の上には被観
察物である試料１３が保持されており、チェンバ１１内
にはチェンバ溶液１２が入れられている。このチェンバ
溶液１２は、不図示の循環装置によってチェンバ１１の
内外を循環している。

【０００９】試料１３を下方より拡大して観察するため
の対物レンズ１６は、レボルバ１７に固定されている。
レボルバ１７は、アクチュエータ１１３によって対物レ
ンズ１６の光軸に沿う方向に駆動可能となっている。レ
ボルバ１７には接触子１１１が接触しており、レボルバ
１７、すなわち対物レンズ１６の上下動に追従して動作
する。接触子１１１の動く距離は変位センサ１１２で検
出される。つまり、レボルバ１７（対物レンズ１６）の
移動量が変位センサ１１２によって検出可能となってい
る。なお、アクチュエータ１１３の動きをレボルバ１７
の動きに変換する不図示の駆動機構は、センサ１１２と
ともに顕微鏡のベース部分に固定される。

【００１０】カバーガラス１４の下面、すなわち試料１
３が載置されている面と対向する側の面には接触子１８
が接触しており、カバーガラス１４の変位に追従してこ
の接触子１８が動く。変位センサ１９は、顕微鏡のベー
ス部分に固定されていて、接触子１８の動きを検出す
る。以上のような構成により、対物レンズ１６と被観察
物である試料１３との間の相対距離に変化を生じた場合
に、変位センサ１９はこの変化を検出することができ
る。

【００１１】変位センサ１９および１１２で検出された
変位量はＣＰＵ２２に入力される。ＣＰＵ２２は、変位
センサ１９から入力された変位量に基づき、アクチュエ
ータ１１３に駆動信号を発する。このときＣＰＵ２２
は、変位センサ１１２から出力される信号をフィードバ
ックして、対物レンズ１６の移動方向、移動量、移動速
度等を制御する

【００１２】図２は、本発明の第１の実施の形態に係る
顕微鏡でチェンバ溶液１２の量が増してチェンバ１１、
１４および蛇の目リング１５の変形量が増し、試料１３
と対物レンズ１６との間の相対距離が変化した様子を誇
張して示している。この図２を参照し、上述した相対距
離の変化により変動してしまった観察面が対物レンズ１
６で再び捕らえられるようになるまでの動作について説
明する。

【００１３】チェンバ溶液１２の重量の増加によってチ
ェンバ１１、カバーガラス１４、蛇の目リング１５のた
わみ量が増す。すると、接触子１８が下がって、変位セ
ンサ１９により上述したたわみ量の増加分Δが検出され
る。すなわち、対物レンズ１６と試料１３との間の相対
距離の変化分が変位センサ１９によって検出され、ＣＰ
Ｕ２２に出力される。なお、連続的セクショニングに際
し、これから観察を開始しようとする観察面（試料１３
の断面）が決まった時点でレボルバ１７の初期位置は変
位センサ１１２によって検出され、レボルバ１７の位置
に関する情報がＣＰＵ２２に出力される。したがって、
上述したたわみ量の増加分Δを認識したＣＰＵ２２は、
レボルバ１７を図２の下方向へΔだけ移動させるように
アクチュエータ１１３に駆動信号を発する。そして、あ
る観察面での観察を終えると、ＣＰＵ２２はアクチュエ
ータ１１３に制御信号を発して対物レンズ１６を移動さ
せ、次の観察面にピントが合うようにする。

【００１４】以上に説明したように、本発明の第１の実
施の形態に係る顕微鏡のフォーカス装置によれば、変位
センサ１９で検出された対物レンズ１６と試料１３との
間の相対距離の変化に基づいてＣＰＵ２２がアクチュエ
ータ１１３に駆動信号を発してレボルバ１７（対物レン
ズ１６）を駆動することにより、常に同じ観察面にピン
トの合った像を得ることが可能となる。

【００１５】− 第２の実施の形態 − 図３は、本発明の第２の実施の形態に係る顕微鏡のフォ
ーカス装置が倒立型のコンフォーカル顕微鏡に組み込ま
れている様子を概略的に示す。第２の実施の形態におい
ては、液浸対物レンズを用いて連続的セクショニングを
行う場合を例にとって説明する。なお、図３において、
本発明の第１の実施の形態を示す図１または図２と同様
の構成要素には同じ番号を付してその説明を省略する。

【００１６】第１の実施の形態との相違点は、被観察物
がチェンバ溶液に浸されていない点と、液浸対物レンズ
が用いられる点にある。図３において、蛇の目リング１
５の上にカバーガラス３２が載置され、その上にサンプ
ル３３が載置される。このサンプル３３は、カバーガラ
ス３２とスライドガラス３１との間に挟まれている。液
浸対物レンズ１６Ａ（以下では単に「対物レンズ１６
Ａ」と称する）の先端部とカバーガラス３２との間には
オイル、水、あるいはグリセリン等の液体３４が介在し
ている。

【００１７】以上のような構成の顕微鏡において、最初
の観察面にピントが合うように対物レンズ１６Ａの位置
が定められた後、レボルバ１７の初期位置が変位センサ
１１２によって計測され、その計測結果がＣＰＵ２２に
出力される。最初の観察面での観察が終わった後、対物
レンズ１６Ａをたとえば所定ストロークＳだけ下げて次
の観察面にピントが合うようにすると、液体３４の粘性
によってカバーガラス３２が図３の下方に引っ張られ
る。すると、カバーガラス３２および蛇の目リング１５
が図３に誇張して描かれているようにたわむので、サン
プル３３と対物レンズ１６Ａとの間の相対距離の変化は
上述した所定ストロークＳに達しない。

【００１８】このとき、蛇の目リング１５およびカバー
ガラス３２の変形にともなうサンプル３３の移動量Δが
変位センサ１９で測定され、その測定結果がＣＰＵ２２
に出力される。このΔが予定していた所定ストロークＳ
に対する不足分である。ＣＰＵ２２は、アクチュエータ
１１３に指令信号を発してレボルバ１７を図３の下方に
Δだけ移動させる。ＣＰＵ２２は、このときにも変位セ
ンサ１９からの出力を監視しており、レボルバ１７（対
物レンズ１６Ａ）をΔ下げたときに蛇の目リング１５お
よびカバーガラス３２がさらに変形した場合にはアクチ
ュエータ１１３に対して再度指令信号を発する。また、
対物レンズ１６Ａの移動を完了して新たな観察面を観察
している最中に、何らかの要因でサンプル３３と対物レ
ンズ１６Ａとの間の相対距離が変化したことを検出した
場合にもＣＰＵ２２はアクチュエータ１１３に対して指
令信号を発する。

【００１９】アクチュエータ１１３がレボルバ１７（対
物レンズ１６Ａ）を駆動している最中におけるレボルバ
１７の実際の移動量はセンサ１１２によって検出され、
ＣＰＵ２２にフィードバックされるのは第１の実施の形
態と同様である。

【００２０】上述のように、ＣＰＵ２２がアクチュエー
タ１１３に指令信号を発し、これに応答してアクチュエ
ータ１１３がレボルバ１７を駆動している最中は、対物
レンズ１６Ａを介して得られる拡大像は観測または記録
するには当たらないものである。加えて、サンプル３３
をなるべく良好な状態に保つためには、サンプル３３に
対する照明光（励起光）の照射時間をできるだけ短くす
ることが望ましい。そこで、図４に示すようにレーザ光
等を発する光源４２の光路上にシャッタ４３を配設し、
ＣＰＵ２２がこのシャッタ４３の開平を制御するように
してもよい。なお、図４は、図３に示される顕微鏡に上
記光源４２、シャッタ４３、そして２枚のダイクロイッ
クミラー４５および４７が設けられる様子を説明する図
である。

【００２１】図４に示すような構成とすることで、アク
チュエータ１１３によって対物レンズ１６Ａとサンプル
３３との間の相対距離を調節している間はＣＰＵ２２が
シャッタ４３を閉じておくことができ、サンプル３３を
長時間にわたって良好な状態に保つことができる。

【００２２】また、同一のサンプルを観察する際に、複
数種類の波長の励起光を用いることにより、たとえば細
胞内の核、リボソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体など
のように、サンプル内の異なる組織を区別して観察する
手法が知られている。このような場合、図４における光
源４２として、異なる波長を有する複数種類の励起光を
出射可能なものを用いる。ダイクロイックミラー４５お
よび４７は、光源４２から出射される励起光を反射して
対物レンズ１６Ａに導く一方、サンプル３３から出射さ
れ、対物レンズ１６Ａを透過して図４の下方に向かって
進む蛍光を透過する特性を有している。これらのダイク
ロイックミラー４５および４７は、不図示の切換機構に
よっていずれかが光源４２から出射されるレーザ光の光
路中に位置するように位置決めされる。図４において
は、ダイクロイックミラー４５が上記光路中に位置して
いる状態が示されている。なお、ダイクロイックミラー
４５の下方には、ダイクロイックミラー４５または４７
を透過した蛍光を集光して検出するための共焦点光学系
等が配設されるが、図４ではその図示を省略する。

【００２３】上述のように、複数の波長の励起光を用い
て同一のサンプルを観察する場合、たとえば以下のよう
な手順で観察を行うことにより作業効率を高めることが
できる。

【００２４】先ず、ダイクロイックミラー４５が上記光
路中に位置するように位置決めされる。この状態で一回
目の連続的セクショニングが一通り行われる。このとき
ＣＰＵ２２は、各観察面に対物レンズ１６Ａのピントが
合うようにアクチュエータ１１３を駆動する都度、変位
センサ１９で検出された変位量ΔをＣＰＵ２２に接続さ
れるメモリ（不図示）に記憶しておく。つまり、上述し
たカバーガラス３２や蛇の目リング１５の変形等の影響
を排除して、連続的セクショニングで各観察面に対物レ
ンズ１６Ａのピントが正確に合うようにするために必要
な補正量を、ＣＰＵ２２は各観察面に対応して記憶して
おく。

【００２５】ダイクロイックミラー４５を用いての一通
りの連続的セクショニングが完了した後、ダイクロイッ
クミラー４７が上記光路中に位置するように位置決めさ
れ、再度一連の連続的セクショニングが行われる。この
ときＣＰＵ２２は、上述した補正量を加味してアクチュ
エータ１１３に制御信号を発することにより、各観察面
に対物レンズ１６Ａのピントを合わせる動作を速やかに
行うことができる。したがって、観察に要する時間を短
縮することが可能になるとともに、サンプルの損傷も最
小限に抑制することができるので信頼度の高い観察結果
を得ることができる。

【００２６】以上では、１回目の連続的セクショニング
に際して得られた補正量に基づいて２回目、あるいはそ
れ以降の連続的セクショニングを行う例について説明し
たが、連続的セクショニングを行う前に予備測定のみを
行なって上述した補正量を求めてもよい。予備測定は、
たとえば以下のように行う。

【００２７】先ず、連続的セクショニングの開始観察面
にピントが合うように対物レンズ１６Ａを位置決めした
後、ＣＰＵ２２はシャッタ４３を閉じる。このとき、Ｃ
ＰＵ２２は光源４２の発光を停止してもよい。その後Ｃ
ＰＵ２２は、対物レンズ１６Ａを所定のステップで駆動
する都度、そのときの変位センサ１９からの出力を入力
し、蛇の目リング１５およびカバーガラス３２のたわみ
量の変化による影響を排除するための補正量を求める。
予備測定に際しては、後で行われる連続的セクショニン
グと同じ移動ピッチで対物レンズ１６Ａを駆動してもよ
いし、それよりも粗いピッチで予備測定し、後で補間に
よって各観察面に対応する補正量を求めてもよい。上述
した予備測定方法によれば、予備測定中に励起光を照射
する必要がなく、その後の連続的セクショニングも速や
かに行うことができるので、励起光の照射によるサンプ
ル３３の損傷を最小限に抑制することが可能となる。

【００２８】以上に説明したように、第２の実施の形態
に係る顕微鏡のフォーカス装置によっても被観察物の所
望の断面（観察面）に的確にピントを合わせることがで
きる。また、連続的セクショニングを行う際の観察面間
のピッチを正確に保つことができ、再現性にも優れる。
このため、複数の波長の励起光を用いて連続的セクショ
ニングを繰り返し行う場合に、毎回ほぼ同じ観察面を観
察できるので、観察結果の信頼度を維持することができ
る。加えて、観察に要する時間を短縮することができる
ので、被観察物への励起光の積算照射光量を低減するこ
とができ、被観察物の損傷を最小限に抑制することが可
能となる。

【００２９】− 第３の実施の形態 − 図５（ａ）は、本発明の第３の実施の形態に係る顕微鏡
のフォーカス装置が倒立型のコンフォーカル顕微鏡に組
み込まれている様子を概略的に示す。第３の実施の形態
においては、第１の実施の形態と同様にチェンバ１１内
に納められた試料１３について連続的セクショニングを
行う場合を例にとって説明する。なお、図５において、
本発明の第１の実施の形態を示す図１または図２と同様
の構成要素には同じ番号を付してその説明を省略する。

【００３０】図５において、第１の実施の形態との相違
点は、試料１３と対物レンズ１６との間の相対距離の変
化を検知するための変位検出装置として歪みゲージ５１
と、歪みゲージ５１の抵抗値の変化に基づいて上記相対
距離の変化を検出する変位センサ１９Ａとが図１に示す
接触子１８および変位センサ１９に置き換えられる点で
ある。

【００３１】カバーガラス１４を図５（ａ）の下方から
見た様子を表す図５（ｂ）に示されるように、たとえば
４枚の歪みゲージ５１が対物レンズ１６の視野を取り囲
むように貼り付けられている。この歪みゲージ５１に
は、変位センサ１９Ａが接続されており、チェンバ溶液
１２の増減により生じるカバーガラス１４の歪みの増減
が歪みゲージ５１の抵抗値の変化として変位センサ１９
Ａにより検出される。

【００３２】第３の実施の形態に係る顕微鏡のフォーカ
ス装置によれば、被測定物と対物レンズとの間の相対距
離の変化を非接触で測定することができるので、測定圧
力が測定結果に影響を及ぼすことがない。また、接触子
等の可動部材を有していないので、変位センサの信頼性
を向上させることができる。

【００３３】なお、図５（ａ）に示す変位検出装置とし
ての歪みゲージ５１および変位センサ１９Ａは、カバー
ガラス１４の歪みの変化を検出するものであって、被測
定物（試料１３）と対物レンズ１６との間の相対距離の
変化を直接的に測定するものではない。しかし、上記相
対距離の変化量とカバーガラス１４の歪みの変化量との
関係を予め測定しておくことにより、第１または第２の
実施の形態のものと同様に被測定物（試料１３）と対物
レンズ１６との間の相対距離の変化を測定することが可
能である。

【００３４】以上のような構成の顕微鏡において連続的
セクショニング動作を行う場合、最初の観察面にピント
が合うように対物レンズ１６Ａの位置が定められた後、
レボルバ１７の初期位置が変位センサ１１２によって計
測され、その計測結果がＣＰＵ２２に出力される。その
後、各観察面での観察を終える都度、対物レンズ１６の
ピントが次の観察面位置に合うように駆動される。この
ときに、チェンバ１１内のチェンバ溶液１２の増減があ
ると、これによって生じた試料１３と対物レンズ１６と
の相対距離の変化が変位センサ１９Ａで検出される。Ｃ
ＰＵ２２は、アクチュエータ１１３を駆動することによ
り、変位センサ１９Ａで検出された上記相対距離の変化
を補正する。

【００３５】図５（ａ）および図５（ｂ）に示す例で
は、歪みゲージ５１はカバーガラス１４のみに貼り付け
られているが、蛇の目リング１５、チェンバ１１等に貼
り付けてもよい。このとき、歪みゲージ５１の貼り付け
枚数および貼り付け位置は図５（ａ）および図５（ｂ）
に示されるものに限定されない。また、歪みゲージ５１
として、いわゆるディスクリートの部品を貼り付ける以
外に、蒸着やスパッタリングのプロセスを経てガラス基
板等に直接形成するものであってもよい。このように、
歪みゲージ５１を直接形成することにより、接着剤が剥
がれる等の不具合を抑制して変位検出装置の信頼性を向
上させることができる。

【００３６】− 第４の実施の形態 − 図６は、本発明の第４の実施の形態に係る顕微鏡のフォ
ーカス装置の要部、すなわち被観察物と対物レンズとの
間の相対距離を検出する変位検出装置のみを示す。図６
に示される以外の部分については本発明の第１の実施の
形態を示す図１または図２と同様であるのでその図示お
よび説明を省略する。

【００３７】第１の実施の形態においては、図１に示さ
れるように接触子１８がカバーガラス１４の変位に追従
して作動し、この接触子１８の動き量を変位センサ１９
が検出するものであった。これに対して、第４の実施の
形態に係る顕微鏡のフォーカス装置においては、上記接
触子１８に代わるものとして筒状の接触子６２が対物レ
ンズ１６Ｂの周縁部に設けられている。この接触子６２
は、対物レンズ１６Ｂの光軸とほぼ平行な方向に移動可
能に対物レンズ１６Ｂの鏡筒の外周にはめこまれてい
る。

【００３８】接触子６２の上部には、対物レンズ１６Ｂ
の視野を妨げることのない程度の開口６２ａが設けられ
ている。接触子６２の周囲には、飾り環６１がさらに取
り付けられており、この飾り環６１の内周にはガイド部
材６３および６４が固定されている。これらのガイド部
材６３および６４によって接触子６２の動きがガイドさ
れ、かつ接触子６２の上下ストロークが規制される。飾
り環６１の内部には、接触子６２を図６の上方向に付勢
するコイルばね６５が組み込まれている。接触子６２の
上下方向の位置（変位）は変位センサ１９で検出され
る。このように、対物レンズ１６Ｂの光軸とほぼ平行な
方向に移動可能な接触子６２を対物レンズ１６Ｂの周縁
部に設けることにより、接触子６２の配設部の占有面積
を減じることができる。

【００３９】図６に示される例においては、接触子６２
の上端部分が図１などに示されるカバーガラス１４と常
時接触する。このため、厳密には対物レンズ１６Ｂの上
下にともなって、コイルばね６５の反力が変化、すなわ
ち接触子６２がカバーガラス１４に作用する力が変化す
る。このため、キャリブレーションを予め行い、被測定
物と対物レンズ１６Ｂとの相対距離の変化量と、変位セ
ンサ１９で検出される接触子６２の変位量との関連を知
っておくことが望ましい。

【００４０】− 第５の実施の形態 − 図７は、共焦点顕微鏡システムに本発明が適用される例
を示すものである。第５の実施の形態は、第１の実施の
形態と同様にチェンバ１１内に納められた試料１３につ
いて連続的セクショニングを行うものである。なお、図
７において、本発明の第１の実施の形態を示す図１また
は図２と同様の構成要素には同じ番号を付してその説明
を省略する。

【００４１】図７において、励起光を発するレーザ発振
器７１の射出口近傍にはシャッタ４３が配設され、この
シャッタ４３の開閉はＣＰＵ２２によって制御される。
シャッタ４３が開いている状態において、レーザ発振器
７１から出射された励起光はミラー７２で反射され、ビ
ームエキスパンダ７３で光束の径が広げられてダイクロ
イックミラー４５に導かれる。

【００４２】ダイクロイックミラー４５は、励起光を反
射する分光反射特性を有しているので、ダイクロイック
ミラー４５に入射した励起光は反射されて走査ミラー７
４および７６に導かれる。走査ミラー７４および７６
は、試料１３の被観察面上で励起光を２次元方向に走査
させるためのものであり、アクチュエータ７５および７
７によって駆動される。アクチュエータ７５および７７
はＣＰＵ２２に接続されており、走査ミラー７４および
７６の走査方向、走査速度、そして走査量はＣＰＵ２２
によって制御される。

【００４３】走査ミラー７４および７６で反射された励
起光はレンズ７９で集光され、ミラー７１１で反射さ
れ、対物レンズ１６を経て試料１３の観察面に達する。
試料１３内の観察対象となる組織は、予め蛍光物質と結
合されているので、上記励起光を受けると蛍光を発す
る。

【００４４】試料１３内の蛍光物質から発せられた蛍光
は、上述した光路を逆行してダイクロイックミラー４５
に入射する。蛍光の波長は、励起光の波長に比して長
く、また、ダイクロイックミラー４５はこの蛍光を透過
する分光特性を有しているので、蛍光はダイクロイック
ミラー４５を透過して直進する。そしてこの蛍光中に含
まれる不要な波長成分の光はバリアフィルタ７１２で減
じられた後、レンズ７１３で集光され、ピンホール板７
１４を経て検出器７１５で検出される。画像信号処理部
７１７は、検出器７１５から出力される信号を入力する
とともに、ＣＰＵ２２から出力される同期信号を入力す
る。画像信号処理部７１７は、検出器７１５から出力さ
れる信号と、ＣＰＵ２２から出力される同期信号とに基
づいて２次元の画像データを生成し、これを不図示の記
録装置に記録するとともに、モニタ７２０に試料１３の
拡大像を表示する。

【００４５】以上に説明した動作の最中に、チェンバ１
１内のチェンバ溶液１２の量が変化し、これにともなっ
て試料１３と対物レンズ１６との間の相対距離が変化し
た場合、この変化は変位センサ１９で検出される。ＣＰ
Ｕ２２は、変位センサ１９から出力された信号に基づい
てアクチュエータ１１３を制御し、レボルバ１７を対物
レンズ１６の光軸に沿う方向に駆動して試料１３と対物
レンズ１６との間の相対距離を調節する。

【００４６】上述のように試料１３と対物レンズ１６と
の間の相対距離が調節されている間等において、試料１
３に励起光を照射したくない場合にはシャッタ４３を閉
じることも可能である。この場合、上記相対距離の調節
後にシャッタ４３が再度開かれる。なお、上述のように
試料１３と対物レンズ１６との間の相対距離等が調節さ
れている間、ＣＰＵ２２から画像信号処理部７１７に制
御信号を発し、画像データの記録やモニタ７２０への画
像の表示等を一時的に中断させてもよい。

【００４７】− 第６の実施の形態 − 図８は、共焦点顕微鏡システムに本発明が適用される例
を示すものである。第６の実施の形態においては、第２
の実施の形態と同様に、液浸対物レンズ１６Ａが用いら
れ、カバーガラス３２とスライドガラス３１との間に挟
まれたサンプル３３について連続的セクショニングが行
われる。なお、図８において、本発明の第２の実施の形
態を示す図３および本発明の第５の実施の形態を示す図
７と同様の構成要素には同じ符号を付してその説明を省
略する。

【００４８】図７に示される第５の実施の形態の共焦点
顕微鏡システムは、チェンバ１１内の試料１３に、レー
ザ発振器７１から発せられる単色の励起光を照射して試
料１３を拡大観察するものであった。これに対し、図８
に示す第６の実施の形態の共焦点顕微鏡システムでは、
液浸対物レンズ１６Ａが用いられ、かつレーザ発振器７
１Ａがマルチラインレーザなどと称される多波長の励起
光を出射可能なものが用いられている。そして、レーザ
発振器７１Ａから射出される励起光の波長と、サンプル
３３から発せられる蛍光の波長とに対応した特性を有す
るダイクロイックミラー４５Ａ、４５Ｂ、そしてバリア
フィルタ７１２Ａ、７１２Ｂが切換可能に組み込まれて
いる。これらのダイクロイックミラー４５Ａ、４５Ｂお
よびバリアフィルタ７１２Ａ、７１２Ｂは、不図示の切
換機構によって切換可能となっており、その切換動作は
ＣＰＵ２２によって制御される。つまり、ダイクロイッ
クミラー４５Ａとバリアフィルタ７１２Ａとの組み合わ
せ、およびダイクロイックミラー４５Ｂとバリアフィル
タ７１２Ｂとの組み合わせのうち、いずれかがレンズ７
１３と走査ミラー７４との間のレーザ光の光路中に位置
するように切り換えられる。

【００４９】以上のように構成される共焦点顕微鏡シス
テムを用いて連続的セクショニングを行う方法について
説明する。なお、以下の説明において、初期状態におい
ては図８に示されるようにダイクロイックミラー４５Ａ
およびバリアフィルタ７１２Ａがレンズ７１３と走査ミ
ラー７４との間に位置しているものとする。また、レー
ザ発振器７１Ａは二つの波長λＳａ、λＳｂの励起光を
発し、この励起光の照射にともなってサンプル３３中の
蛍光物質からは二つの波長λＥａ、λＥｂの蛍光が発せ
られるものとする。

【００５０】ダイクロイックミラー４５Ａは波長λＳａ
の励起光を反射するとともに波長λＥａの蛍光を透過す
る特性を有し、バリアフィルタ７１２Ａは波長λＥａよ
りも短い波長の光をシャープにカットする特性を有す
る。また、ダイクロイックミラー４５Ｂは波長λＳｂの
励起光を反射するとともに波長λＥｂの蛍光を透過する
特性を有し、バリアフィルタ７１２Ｂは波長λＥｂより
も短い波長の光をシャープにカットする特性を有する。

【００５１】一連の連続的セクショニングを開始するに
あたり、先ずサンプル３３の最初の観察面に対物レンズ
１６Ａのピントが合うようにレボルバ１７がアクチュエ
ータ１１３を介して駆動される。以下では、これを「対
物レンズ１６Ａを初期位置に移動させる」と称する。こ
のときの対物レンズ１６Ａの光軸方向に沿うレボルバ１
７の位置は、変位センサ１１２により検出されてＣＰＵ
２２に出力される。以降は、所定のセクショニング間隔
ｄで一連の連続的セクショニングが行われる。このと
き、ＣＰＵ２２は各観察面に対物レンズ１６Ａのピント
が合うようにレボルバ１７を駆動しつつ、変位センサ１
９から出力される信号を監視する。そしてカバーガラス
３２、蛇の目リング１５等の変形量の変化にともなう変
位が変位センサ１９で検出された場合、その変位に対応
するレボルバ１７の位置補正量Δを求め、この補正量Δ
に基づいてレボルバ１７を駆動する。ＣＰＵ２２は、各
観察面の位置に対応して上記補正量Δを記憶する。

【００５２】ＣＰＵ２２が以上の動作制御を行う間、画
像信号処理部７１７ではサンプル３３の各観察面ごとの
拡大画像データが生成され、記録される。このとき記録
される画像データは、サンプル３３に波長λＳａの励起
光が照射されてサンプル３３中の蛍光物質より発せられ
る波長λＥａの蛍光による拡大像の画像データである。

【００５３】ＣＰＵ２２は、上述の動作を完了すると対
物レンズ１６Ａを初期位置に移動させ、ダイクロイック
ミラー４５Ａ、バリアフィルタ７１２Ａをダイクロイッ
クミラー４５Ｂ、バリアフィルタ７１２Ｂに切り換え
る。そして、上述したのと同様の動作を繰り返して連続
的セクショニングを再び行う。このとき、ＣＰＵ２２は
１回目の連続的セクショニングで得られた各観察面ごと
の補正量Δを加味してレボルバ１７の移動量を制御す
る。このため、２回目の連続的セクショニングを行う際
に、変位センサ１９からの出力信号を検出してはレボル
バ１７の位置を調節する必要が無くなり、効率よく２回
目の連続的セクショニングを完了させることができる。
したがって、サンプル３３への励起光の照射時間を短く
することができ、サンプル３３の損傷を最小限にとどめ
ることができる。このとき、画像信号処理部７１７では
サンプル３３の各観察面ごとの拡大画像データが生成さ
れ、記録される。このとき記録される画像データは、サ
ンプル３３に波長λＳｂの励起光が照射されてサンプル
３３中の蛍光物質より発せられる波長λＥｂの蛍光によ
る拡大像の画像データである。

【００５４】以上のようにして得られた波長λＥａ、λ
Ｅｂの蛍光による拡大像の画像データは、後処理によっ
て３次元の画像データとして再構築される。この３次元
の画像データを元に、操作者は実際に連続的セクショニ
ングを行った断面とは異なる断面での被観察物の断面の
画像を得ることができる。このため、被観察物の３次元
的な構造を後で詳しく知ることができる。このとき、本
発明による顕微鏡のフォーカス装置を用いることによ
り、セクショニング間隔ｄを精密にコンロールすること
ができる。つまり、「断層撮影」を行う際の撮影間隔を
正確にコントロールすることができ、再構築された３次
元の画像データに基づく画像の歪みを抑制することがで
きる。したがって、より精密な観察を行うことができ
る。この点、従来のもののようにセクショニング間隔ｄ
がばらついてしまうと、連続的セクショニングを行って
得られた複数の２次元の画像そのものは問題ないもの
の、３次元の画像データを再構築する際にゆがみを生じ
てしまって精密な観察を行うことができなくなる。

【００５５】第６の実施の形態では、レーザ発振器７１
Ａが２波長の発光波長を有するものである場合を例にと
って説明したが、本発明はこれに限られるものではな
く、３つ以上の波長の光を発するものであってもよい。
あるいは、単波長のレーザ発振器を複数備えて、ミラー
等によっていずれかのレーザ発振器から出射される光を
励起光としてサンプル３３に導いてもよい。

【００５６】以上、第１〜第６の発明の実施の形態で説
明したように、連続的セクショニングの最中に被観察物
と対物レンズとの間の相対距離が変化しても、その変化
に対応して相対距離が調節されるので、所望の観察面に
ピントを合わせ続けることができる。また、連続的セク
ショニングを繰り返し行う場合の位置決めの再現性が向
上するので、複数種類の波長の励起光を用いて得られる
拡大像に基づき、被観察物の正確な３次元情報を得るこ
とができる。

【００５７】以上に説明した第１〜第６の実施の形態で
は、被観察物と対物レンズとの間の相対距離の変化を検
出するためのものとして接触子およびこの接触子の変位
を検出する変位センサを用いるもの、そして歪みゲージ
を用いるものについて説明したが、本発明はこれに限ら
れるものではない。たとえば、赤外光などを投・受光し
て変位を計測するセンサや静電容量の変化を検出するセ
ンサ、さらには差動トランスや干渉計等、非接触式のセ
ンサを用いることもできる。特に、赤外光などを投・受
光して変位を計測するセンサを用いれば、被観察物の表
面の位置を計測することもできる。このため、載置基
板、すなわちカバーガラスから被観察物が浮いてしまう
ようなことがあっても、被観察物と対物レンズとの間の
相対距離の変化を検出することが可能となる。

【００５８】また、以上の実施の形態ではレボルバを移
動させることにより被観察物と対物レンズとの間の相対
距離を調節するものについて説明したが、ステージ等、
他の部材を移動させることも可能である。

【００５９】さらに、顕微鏡の形式としては倒立型のみ
ならず、対物レンズが被観察物の上方に位置する通常の
形式のもの、そして生物顕微鏡、工業用顕微鏡の如何を
問わず本発明を適用可能である。また、以上ではカバー
ガラスや蛇の目リング等の変形量の変化を検出する例に
ついて説明したが、環境温度の変化等によってたとえば
顕微鏡のステージや鏡筒、あるいは顕微鏡本体が熱膨張
したような場合にも本発明を適用することにより、所望
の観察面に対物レンズのピントを合わせ続けることがで
きる。

【００６０】以上の発明の実施の形態と請求項との対応
において、ＣＰＵ２２およびアクチュエータ１１３が距
離調節手段を、カバーガラス１４、３２が載置基板を、
それぞれ構成する。

【００６１】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明によれば
以下の効果を奏する。 （１） 請求項１に記載の発明によれば、変位センサに
より検出された被観察物と対物レンズとの間の相対距離
の変化に基づいてこの相対距離を調節することにより、
観察対象面に対物レンズのピントを合わせ続けることが
容易となる。また、所望の観察対象面に対物レンズのピ
ントを繰り返し合わせる際の再現性が向上するので、よ
り正確な顕微鏡の観察像を得ることができる。 （２） 請求項２に記載の発明によれば、被観察物と対
物レンズとの相対距離を調節する際に駆動される駆動対
象物の実際の移動量をフィードバックして駆動対象物の
駆動量を制御するフィードバックループをさらに有する
ことにより、正確かつ迅速に相対距離の調節を行うこと
ができる。 （３） 請求項３に記載の発明によれば、対物レンズの
周縁部に、対物レンズの光軸とほぼ平行な方向に移動可
能な接触子をさらに有し、変位センサは、接触子の変位
量を検出することにより、接触子配設のためのスペース
を小さくすることが可能となる。 （４） 請求項４に記載の発明によれば、被観察物を載
置する載置基板の、被観察物が載置される側と対向する
側の面に接触子が接し、この接触子の変位量を変位セン
サが検出することにより、被観察物に接触子を触れるこ
となく被観察物と対物レンズとの間の相対距離の変化を
検出することができる。このため、被観察物が軟弱なも
のであっても、被観察物と対物レンズとの間の相対距離
の変化を正確に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の第１の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置が組み込まれる倒立型顕微鏡の一
部を概略的に説明する図である。

【図２】 図２は、本発明の第１の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置で被観察物と対物レンズとの間の
相対距離の変化が検出される様子を説明する図である。

【図３】 図３は、本発明の第２の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置が組み込まれる、液浸対物レンズ
を用いた倒立型顕微鏡の一部を概略的に説明する図であ
る。

【図４】 図４は、本発明の第２の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置で二つの波長の励起光を用いて被
観察物が観察される様子を説明する図である。

【図５】 図５は、本発明の第３の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置が組み込まれる倒立型顕微鏡の一
部を概略的に説明する図である。

【図６】 図６は、本発明の第４の実施の形態に係る顕
微鏡のフォーカス装置における接触子の構造を概略的に
説明する図である。

【図７】 図７は、本発明の第５の実施の形態を説明す
る図であり、共焦点顕微鏡システムに本発明が適用され
る例を示す図である。

【図８】 図８は、本発明の第６の実施の形態を説明す
る図であり、液浸対物レンズを用いる共焦点顕微鏡シス
テムに本発明が適用される例を示す図である。

【符号の説明】

１１ … チェンバ １２ … チェン
バ溶液 １３、３３ … 試料（被観察物） １４、３２ …
カバーガラス １５ … 蛇の目リング １６ … 対物
レンズ １６Ａ … 液浸対物レンズ １７ … レ
ボルバ １８、１１１、６２ … 接触子 １９、１９Ａ、
１１２ … 変位センサ ２２ … ＣＰＵ ４２ … 光源 ４３ … シャッタ ４５、４５Ａ、４７ … ダイクロイックミラー ５１ … 歪みゲージ ７１ … レー
ザ発振器 ７３ … ビームエキスパンダ ７４、７６ …
走査ミラー ７９、７１３ … レンズ ７１４ …
ピンホール板 ７１５ … 検出器 ７１７ … 画
像信号処理部 ７２０ … モニタ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】被観察物と対物レンズとの間の相対距離の
   変化を検出可能な変位センサと、 前記変位センサで検出された前記相対距離の変化に基づ
   き、前記相対距離を調節する距離調節手段とを有するこ
   とを特徴とする顕微鏡のフォーカス装置。
2. 【請求項２】請求項１に記載の顕微鏡のフォーカス装置
   において、 前記距離調節手段は、前記相対距離を調節する際に駆動
   される駆動対象物の実際の移動量をフィードバックして
   前記駆動対象物の駆動量を制御するフィードバックルー
   プをさらに有することを特徴とする顕微鏡のフォーカス
   装置。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載の顕微鏡のフォー
   カス装置において、 前記対物レンズの周縁部に、前記対物レンズの光軸とほ
   ぼ平行な方向に移動可能な接触子をさらに有し、 前記変位センサは、前記接触子の変位量を検出すること
   を特徴とする顕微鏡のフォーカス装置。
4. 【請求項４】請求項１または２に記載の顕微鏡のフォー
   カス装置において、 前記被観察物を載置する載置基板の、前記被観察物が載
   置される側と対向する側の面に接触する接触子をさらに
   有し、 前記変位センサは、前記接触子の変位量を検出すること
   を特徴とする顕微鏡のフォーカス装置。