JP5322368B2

JP5322368B2 - 顕微鏡システム、観察方法および観察プログラム

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Publication number: JP5322368B2
Application number: JP2005027783A
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Inventors: 哲也城田; 貴米山
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Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2013-10-23
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Description

本発明は、顕微鏡を用いて観察体である標本を観察する顕微鏡システム、観察方法および観察プログラムに関し、特に、所定時間間隔毎に観察および観察画像の記録を行う、いわゆるタイムラプス観察に利用される顕微鏡システム、観察方法および観察プログラムに関するものである。

従来、顕微鏡を用いて観察体である標本を観察する方法として、一定時刻ごとに顕微鏡画像の観察及び撮影を行い、時間的な標本の形態変化を観察する方法がある。このような観察方法の場合、一般的にまずは標本近傍に合焦を行い、標本の移動を含めた標本の変化を観察するために、光軸方向に対し座標を一定間隔で変化させながら複数枚の画像の撮影を行っている。このような方法は、特定の標本、例えば生きた細胞の時間的変化を観察する方法として極めて有効とされている。

しかしながら、標本観察時に、標本に対して対物レンズの焦点合わせを行っても、例えば、気温変化や空調設備などの作動による周囲温度の変化により各機械部品の寸法が変化し、対物レンズと標本間の距離が大きく変化するため焦点がずれてしまうという問題が発生している。そこで、これらの焦点ずれを補正するため各種の合焦装置が考えられている。ところが、一般的に標本はスライドガラスに載置あるいはスライドガラスとカバーガラスに封入されており、合焦装置はさまざまなスライドガラスやカバーガラスの厚みに対応するために、大きな駆動距離が必要となってくる。一方、光軸方向に対し距離を変化させながら複数毎の画像の撮影を行う場合は、特に蛍光標本の場合、励起光を標本に照射する時間を短くするために、極めて迅速な駆動動作をすることが望ましい。しかしながら、駆動距離が大きいものは駆動速度を速くする事が困難であり、また、駆動速度を速くしたものは駆動距離を大きくとることが困難であるという問題が発生する。

この問題を解決する技術として、粗動駆動手段と微動駆動手段を有し、粗動駆動手段で合焦を行った後、微動駆動手段で合焦を追い込むという技術が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

また、さらに微動駆動手段にピエゾ素子を採用した技術が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
特開平５−３４６５２８号公報特開２００３−１７２８７８号公報

しかしながら、従来の技術は、光軸方向の合焦動作に関する技術であり、具体的にスライドガラスに載置あるいはスライドガラスとカバーガラスとに封入された標本に対する合焦動作の改善までには至っておらず、個々のスライドガラスに載置された標本に対しての迅速かつ適切な合焦動作、あるいはスライドガラスとカバーガラスとに封入された標本に対しての迅速かつ適切な合焦動作を行うのが困難であるという問題点があった。

また、Ｘ−Ｙ方向の複数点の繰り返し合焦動作や対物レンズ、励起光の変更に伴う合焦位置の変更についても迅速かつ適切に行うのが困難であるという問題点があった。
本発明は、上記従来技術の欠点に鑑みてなされたもので、様々な厚さのスライドガラスに載置あるいはスライドガラスとカバーガラスに封入された標本に対しても、高い合焦速度を維持しつつ、迅速な合焦動作を可能とした顕微鏡システム、観察方法および観察プログラムを提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明の顕微鏡システムは、被検物を保持するための透明部材を載置するステージと、前記透明部材に保持された被検物を観察するための対物レンズと、前記被検物を撮影する撮影手段とを備え、
所定の撮影間隔時間毎に繰り返し撮影をし、時間的な標本の形態変化を観察するタイムラプス観察を行う顕微鏡システムにおいて、前記透明部材で反射した測定光に基づいて、前記透明部材に合焦するための評価信号を生成するオートフォーカス手段と、前記所定の撮影間隔時間毎に前記オートフォーカス手段によって前記透明部材に合焦するように前記対物レンズと前記ステージを光軸方向に相対的に駆動させる第１の駆動手段と、前記透明部材の合焦位置に基づいて前記被検物の光軸方向における撮影開始位置を設定する撮影条件設定手段と、前記第１の駆動手段とは異なる方法で前記対物レンズと前記ステージを光軸方向に相対的に駆動させる前記第１の駆動手段よりも駆動速度が高速である圧電素子であるピエゾ素子と、前記ピエゾ素子を駆動するためのピエゾ素子駆動回路とを備える第２の駆動手段と、前記第１の駆動手段及び前記第２の駆動手段の駆動を制御する制御手段とを備え、前記制御手段は、前記第１の駆動手段を制御して前記オートフォーカス手段による前記評価信号に基づいて前記透明部材に対し自動合焦動作を行い、前記第２の駆動手段を制御して前記透明部材の合焦位置に基づいた前記撮影開始位置から前記光軸方向に所定の撮影ピッチ毎に合焦位置を移動させながら前記撮影手段によって前記被検物を複数撮影することを、タイムラプス観察における前記所定の撮影間隔時間毎におこなうこと特徴とする。

また、本発明の顕微鏡システムは、前記第１の駆動手段は、ステッピングモータと、前記ステッピングモータを駆動するためのステッピングモータ駆動回路とを備えことが望ましい。

また、本発明の顕微鏡システムは、上記被検物を照明するための励起光を照射する励起光光源と、上記励起光光源から照射される励起光を遮光するための励起光遮光手段と、上記第２の駆動手段が駆動する際に、上記被検物に励起光が照射されるように上記励起光遮光手段を制御する励起光遮光手段制御手段とをさらに備えることが望ましい。

また、本発明の顕微鏡システムは、上記ステージが、電動でＸ方向またはＹ方向に移動可能なＸ−Ｙステージであり、上記顕微鏡システムが、上記Ｘ−Ｙステージで予め位置決めされたＸ−Ｙ座標に対しての駆動量を設定する手段をさらに備え、上記制御手段は、上記第１の駆動手段によって上記透明部材に対する合焦を行った後、上記第２の駆動手段によって上記Ｘ−Ｙステージで位置決めされた座標に対して予め定められた駆動制御を行なうことが望ましい。

また、本発明の顕微鏡システムは、光路中に複数の上記対物レンズを切換え配置することが可能な電動レボルバと、上記光路中に配置された前記対物レンズの種別を判別する対物判別手段と、上記複数の対物レンズ毎に駆動量を設定する手段とをさらに備え、上記制御手段は、選択された上記対物レンズの種別に応じた駆動量に基づいて上記第２の駆動制御を行うことが望ましい。

また、本発明の顕微鏡システムは、上記被検物に照射する励起光を切換えるための励起光選択手段と、上記励起光毎に駆動量を設定する手段とさらに備え、上記制御手段は、選択された上記励起光に応じた駆動量に基づいて上記第２の駆動手段の駆動制御を行うことが望ましい。

本発明によれば、観察対象物（被検物）の長時間観察解析を行う際、迅速な合焦動作が可能となり、励起光照射時間の短縮がはかれるとともに、良好な合焦動作観察が可能となる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第１の実施の形態の構成を示す図である。

本第１の実施の形態における技術的特徴は、準焦部モータ２２とモータ制御部２４が本発明にかかる第１の駆動手段として機能し、ピエゾ素子２１とピエゾ制御部２５が本発明にかかる第２の駆動手段として機能している点である。

図１において、本発明にかかる顕微鏡システムの１例としての倒立顕微鏡システム１Ａでは、被検物である標本２がスライドガラス３に載置され、さらに標本２を載置したスライドガラス３が電動ステージ４に固定されている。電動ステージ４は、光軸に対して直交方向であるＸ−Ｙ方向に電動制御が可能となっており、その制御はステージ制御部５によって行われる。

蛍光光源６は、標本２に対して蛍光照明を行うための光源である。蛍光光源６から出射された励起光はコレクタレンズ７で集光され、励起フィルタ８、ダイクロックミラー９、および対物レンズ１０ａを介して、電動ステージ４上に固定された標本２へ照射されることにより標本２を照明する。励起光に照明されたことによって標本２が発する蛍光は、ダイクロックミラー９および吸収フィルタ１１を通過し、光路切換え部１２によって接眼レンズ１３またはＣＣＤカメラユニット１４へ導かれる。そして、ＣＣＤカメラユニット１４によって撮像された標本２の画像は、ビデオキャプチャボード１５によりホストＰＣ１６に取得される。ホストＰＣ１６は、取得した画像を図示しない画像メモリ上に保存する。この画像メモリは通常複数の画像を保存することが可能となっている。また、電動シャッタ１７は、蛍光光源６から照射される励起光を遮光するためのシャッタで、コントロール部１８によって励起光の遮光を制御できるものとなっている。

対物レンズ１０ａは、電動レボルバ１９に装着されており、電動レボルバ１９はコントロール部１８からの信号により任意の対物レンズ１０ａまたは対物レンズ１０ｂを光路内に挿入する機能を有している。また、この電動レボルバ１９はピエゾ素子２１を介して焦準用モータ２２よって駆動させる架台２３に固定させており、コントロール部１８からの制御されるモータ制御部２４によって光軸方向（Ｚ方向）に移動させることで、標本２と対物レンズ１０ａの距離を相対的に駆動することが可能になっている。

一方、ピエゾ素子２１は、電動レボルバ１９と架台２３との間に配置させており、コントロール部１８から制御されるピエゾ駆動部２５によって電気的にピエゾ素子２１の光軸方向の厚みを変えることで、連動レボルバ１９に装着された対物レンズ１０ａの位置を光軸方向に移動させる構造のもので、同じく標本２と対物レンズ１０ａとの距離を相対的に駆動することが可能になっている。ピエゾ素子２１は、焦準用モータ２２よりも駆動範囲は短くなっている反面、高速、高分解能という特徴を持っている素子である。

図２は、電動レボルバ１９とピエゾ素子２１による駆動位置関係を示すである。
図２に示すように、電動レボルバ１９は、準焦用モータ２２によって「電レボUpper Limit」から「電レボLower Limit」の間の駆動距離Ｌの範囲が駆動可能となっており、さらにその範囲内において、ピエゾ素子２１による「ピエゾUpper Limit」から「ピエゾLower Limit」の間のＬ_ｐの範囲を、高速、高分解能駆動が可能となっている。なお、図２において、「ピエゾCenter」はピエゾ素子２１による駆動範囲Ｌ＿ｐの中心座標を示している。

図１の説明に戻る。
コントロール部１８はホストＰＣ１６に接続させており、倒立顕微鏡システム１Ａの各種制御を行うものである。また、電動レボルバ１９の駆動をユーザーが指示入力するためのジョグエンコーダ３８、パルスカウンタ３９、およびその他の各種指示を入力するための操作部４０が接続されている。

一方、合焦を行うための測定光源は可視外波長領域である赤外光半導体レーザー２６が対応しており、コントロール部１８に接続させたレーザー制御部２７によって制御されている。

半導体レーザー２６から出射されたレーザー光は、平行光を保つ為のコリメートレンズ２８を通り、光束径の半分を投光側ストッパ２９によりカットされる。その後、ＰＢＳ（偏光ビームスプリッタ：Polarization Beam Splitter）３０でＰ偏光成分のみが反射され、標本２側に導かれる。そして、集光レンズ群３１により一旦集光された光束は、色収差補正レンズ群３２を通過する。色収差補正レンズ群３２を通過した光は、λ／４板３３で４５°偏光され、ダイクロイックミラー３４に入射する。ここで、ダイクロイックミラー３４では、赤外域のみ反射される為、反射された光束は、対物レンズ１０ａによりスライドガラス３の表面にスポット形状の像を形成する。

そして、スライドガラス３により反射された光束は、今度は逆に対物レンズ１０ａ、ダイクロイックミラー３４を介し、λ／４板３３にてさらに４５°偏光され、Ｓ偏光成分に切り換わる。さらに、色収差補正レンズ群３２および集光レンズ群３１を戻り、ＰＢＳ３０へ入射される。すると、光束はＳ偏光成分になっているのでそのままＰＢＳ３０を透過し、集光レンズ群３５を通過した後に受光センサ３６に結像される。

受光センサ３６は、光軸を中心に設置された２分割（Ａ領域とＢ領域）のフォトダイオードとなっている。そして、標本２がピント位置にある場合は、図３に示す様に受光センサ３６に結像されたスポットが狭く強度の高い信号となっており、標本２がピント位置からＺ方向の上側（後ピン位置）にある場合は、図４に示す様にＢ領域の範囲に偏った信号強度分布となっており、標本２がピント位置からＺ方向の下側（前ピン位置）にある場合は、図５に示す様にＡ領域の範囲に偏った信号強度分布となっており、それぞれセンサ信号に変換される。

そして、Ａ領域とＢ領域の範囲に分割、変換された検出信号は、合焦判別部３７で、それぞれの範囲における強度の総和を算出される。すなわち、図６に示す様に、横軸を電動レボルバ１９のＺ方向、縦軸をそれぞれの受光センサ３６に入射する光強度とすると、ピント位置を挟んで左右対称なＡ範囲信号およびＢ範囲信号の２つのカーブが検出できる。次に、このＡ範囲信号およびＢ範囲信号から、図７に示すようなＡ＋Ｂの算出、および図８に示すような（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）の算出を行う。特に図８のような特性はＳ字カーブと呼ばれ、その値は評価関数値（以下、Ｅｆ値と略す）と呼ばれる。

コントロール部１８は合焦判別部３７よりのＥｆ値の符号により合焦位置方向を判定し、例えば図８中「１」の位置からＡＦを開始した場合には、Ｅｆ値の符号が負のため、電動レボルバ１９を上昇させる制御を行い、図８中「２」の位置からＡＦを開始した場合には、Ｅｆ値の符号が正のため電動レボルバ１９を下降させる制御を行い、最終的にＥｆ値が０となるように、モータ制御部２４にて対物レンズ１０ａとスライドガラス３の表面の距離を光軸方向に相対的に駆動させて合焦動作を行なっている。なお、スライドガラス３のように表面と背面２つの反射面をもつ場合のものは、２つの座標位置関係から自動的にスライドガラス３の表面に合焦を合わせる機能も有している。

続いて、本第１の実施の形態の動作について説明する。
本第１の実施の形態では、図９に示すように、標本２はスライドガラス３上の培養液内に存在する培養標本である場合について説明する。

図９において、「Center」で示した座標が標本２の観察開始時のＺ方向における観察中心座標である。「Pitch」はＺ方向に対して撮影を行う間隔である。撮影枚数を中心からの撮影枚数を３枚と設定した場合は、撮影枚数ｎは７枚となり、（１）〜（７）で示した各座標で７枚の画像の撮影を行う事を示している。図９中の「Lower Limit」はこのときの撮影開始座標であり、同じく図９中の「Upper Limit」が撮影終了座標となる。標本２はＡの位置からＢの位置に移動しているものとする。

観察を行うにあたって、ユーザーは撮影条件の設定を行う。まず、ユーザーはスライドガラス３の表面である「Base」座標の位置に合焦を行うように指示する。すると、合焦判別部３７のＥｆ値が０となるように、コントロール部１８はモータ制御部２４を介して準焦部モータ２２の駆動を行い、電動レボルバ１９をＺ方向に移動させる事により、「Base」座標に合焦を行う。

続いて、「Base」座標から、観察を行いたい座標である「Center」まで、合焦位置を移動させる。ユーザーはコントロール部１８に接続されたジョグエンコーダ３８より入力を行い、同様にモータ制御部２４を介して準焦部モータ２２の駆動を行うことにより電動レボルバ１９をＺ方向に移動させ「Center」座標に合焦を行う。「Center」座標に合焦終了後、「Base」座標から「Center」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center」-「Base」の値がオフセット量Off_1となる。

続いて、「Center」座標からの撮影ピッチｐと片側撮影枚数ｎ＿ｓの設定を行う。今回は撮影ピッチｐと撮影枚数ｎ＿ｓは「Center」位置を中心に同一で設定しているが、それぞれ別々に設定できるようになっていてもよい。本第１の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチをｐ１、片側撮影枚数を３枚に設定したものとし、総撮影数ｎは７枚する。次に、設定された撮影ピッチ及び撮影枚数より、図９に示す撮影の開始座標である「Lower Limit」座標を算出する。

次に、タイムラップス観察における撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔの設定を行う。本第１の実施の形態では撮影間隔時間をｔｐ１、撮影繰り返し回数を５回に設定したものとする。設定はホストＰＣ１６を介して行うものとする。撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔとに基づいて、撮影開始時に設定させる撮影開始時刻start_timeから撮影終了時刻end_timeが算出される。

図１０は、第１の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。
上述のように設定された倒立顕微鏡システム１Ａの動作について、図１０のフローチャートを用いて説明する。

撮影開始時、ピエゾ駆動部２５に制御されるピエゾ素子２１による駆動座標を、中央位置である「ピエゾCenter」座標に移動を行う。そして、測定が開始されると、ステップＳ１０１において、撮影終了時刻end_timeに達してタイムラプス測定が終了したかチェックする。撮影が終了した場合（ステップＳ１０１：Ｙ）には、処理は終了する。

撮影が終了していない場合（ステップＳ１０１：Ｎ）には、ステップＳ１０２において、ホストＰＣ１６で設定したタイムラプス撮影間隔時間ｔｐ１に達するまで待機する。撮影間隔時間に達すると（ステップＳ１０２：Ｙ）、ステップＳ１０３において、スライドガラス３の「Base」座標に対してＡＦ制御を行い、準焦用モータ２２の駆動によって図９に示した「Base」座標に駆動を行う。

続いて、「Base」座標に移動した後、ステップＳ１０４において、ホストＰＣ１６にて予め設定した「Center」座標、すなわちオフセット量だけ電動レボルバ１９を駆動する。さらに、ステップＳ１０５において、図９中の（１）〜（７）のＺ方向画像を取得するために、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって、合焦位置を「Lower Limit」座標へ移動させる。

その後、ステップＳ１０６において、励起光用のシャッタ１７を開けることによって励起光を通過させ、ステップＳ１０７において、標本２に励起光を照明して撮影を行う。この撮影がおこなわれた後は、ステップＳ１０９において、ピエゾ素子２１の駆動を行うことで、ホストＰＣ１６にて設定した撮影枚数ｎである７枚を、同じくホストＰＣ１６にて設定した撮影ピッチ分であるｐ１づつ、合焦位置の移動を行いながら撮影を行う。

そして、所定の撮影枚数が終了したら（ステップＳ１０８：Ｙ）、ステップＳ１１０において、シャッタ１７を閉じることにより励起光を遮光する。この動作を撮影終了時刻end_tiｍeに達して測定が終了するまで繰り返し続ける。以上の動作によって図１１に示すタイムラプス画像の取得が行われる。

以上のように構成・制御される本第１の実施の形態の倒立顕微鏡システム１Ａは、スライドガラス３にオートフォーカスをかけることにより、周囲温度の変化により対物レンズ１０ａの焦点位置が変化した場合でも基準位置が固定された状態で観察体撮影位置をオフセットで設定するため、確実に観察体である標本２の動きを測定することができ、かつＺ方向の撮影ポイントの移動はピエゾ素子２１により迅速な駆動で行うために、励起光を当てる時間を極めて短くすることが可能となる。

なお、本第１の実施の形態では、スライドガラス３の表面に合焦を合わせるものとして説明してあるが、もちろんこれに限定させるものではなく、培養シャーレ等であってもよい。

また、本第１の実施の形態の倒立顕微鏡システム１Ａは、電動レボルバ１９を上下させる機構としているが、電動ステージ４を上下する機能を有していてもよく、あるいはいわゆる正立型の顕微鏡システムであっても同様の効果を得ることが可能である。
（第２の実施の形態）
次に、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第２の実施の形態について説明する。

図１２は、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第２の実施の形態の構成を示す図である。
第１の実施の形態と同一のものは同一の符号を付加して説明を省略する。

本第２の実施の形態における顕微鏡システム１Ｂの技術的特徴は、本発明にかかるＸ方向またはＹ方向に電動で駆動可能なＸ−Ｙステージが、電動ステージ４、ステージ制御部５および光軸に対して平行方向であるＸ−Ｙ方向へ移動するものであり、ＸＹ座標記録部４３へ座標の記録を行う機能を有するＸ−Ｙ座標記記録部に対応している点である。そして、このＸ−Ｙステージはコントロール部１８に接続されている。

本第２の実施の形態では図１３に示すように、スライドガラス３上の培養液培内に標本２ａ、２ｂのように異なる座標に存在する場合に説明する。
図１３において、「Center_a」座標が標本２ａの観察開始時のＺ方向の観察中心座標、「Center_b」座標が標本２ｂの観察開始時のＺ方向の観察中心座標である。なお、標本２ａのＸ−Ｙ座標は、Ｘ−Ｙａ、標本２ｂのＸ−Ｙ座標は、Ｘ−Ｙｂであるものとする。

図１２に説明に戻る。
第１の実施の形態と同様にまずは、ユーザーは撮影条件の設定を行う。電動ステージ４によって標本２ａの座標であるＸ−Ｙａ座標に駆動を行う。ユーザーはスライドガラス３の表面である「Base」座標の位置に合焦を行う。

続いて、「Base」位置から、観察開始時の「Center_a」座標まで、合焦位置を移動させる。「Center」座標に合焦終了後、「Base」座標から「Center_a」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_a」-「Base」の値がＸ−Ｙａ座標におけるオフセット量Off_１aとなる。

続いて、「Center_a」座標からの撮影ピッチｐと片側撮影枚数ｎ＿ｓの設定を行う。今回は撮影ピッチｐと撮影枚数ｎ＿ｓは「Center」位置を中心に同一で設定しているが、それぞれＸ−Ｙ座標ごとに別々に設定できるようになっていてもよい。本第２の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチｐ１、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチ及び撮影枚数より、撮影の開始座標である「Lower Limit_a」座標を算出する。

次に、電動ステージ４によって標本２ｂの座標であるＸ−Ｙｂ座標に駆動を行う。標本２ａの時と同様にユーザーはスライドガラス３の表面である「Base」座標の位置に合焦を行う。続いて、「Base」位置から、観察を行いたい「Center_b」座標まで、合焦位置を移動させる。「Center_b」座標に合焦終了後、「Base」座標から「Center_b」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_b」-「Base」の値Ｘ−Ｙｂ座標におけるオフセット量Off_１bとなる。

続いて、「Center_b」座標からの撮影ピッチｐと片側撮影枚数ｎ＿ｓの設定を行う。ここでは標本２ａと同様に、撮影ピッチｐ１、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチｐ及び撮影枚数ｎ＿ｓに基づいて、撮影の開始座標である「Lower Limit_b」座標を算出する。

次に撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔの設定を行う。本第２の実施の形態では撮影間隔時間をｔｐ１、撮影繰り返し回数を５回として設定したものとする。設定はホストＰＣ１６を介して行うものとする。撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔとに基づいて、撮影開始時に設定させる撮影開始時刻start_timeから撮影終了時刻end_tiｍeが算出される。

図１４は、第２の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。
撮影開始時、ピエゾ素子２１による駆動座標を中央位置である「ピエゾCenter」座標に移動させる。そして、測定が開始されると、ステップＳ１０１において、撮影終了時刻end_timeに達して測定が終了したかチェックする。測定が終了した場合（ステップＳ１０１：Ｙ）には、終了する。

測定が終了していない場合（ステップＳ１０１：Ｎ）には、ステップＳ１０２において、ホストＰＣ１６で設定した測定間隔に達するまで待機する。測定間隔に達すると（ステップＳ１０２：Ｙ）、ステップＳ２０１において、複数の測定点の設定順に電動ステージ４のＸ−Ｙ駆動を行う。そして、最初の測定点であるＸ−Ｙａ座標にステージＸ−Ｙの駆動を行い、ステップＳ１０３において、そのＸ−Ｙａ座標のスライドガラス３の「Base」座標に対してＡＦ制御を行い、準焦用モータ２２の駆動によって図１３に示した「Base」座標に駆動を行う。

続いて、「Base」座標に移動した後、ステップＳ１０４において、ホストＰＣ１６にて予め設定した「Center_a」座標、すなわちオフセット量だけ電動レボルバ１９を駆動する。さらに、ステップＳ１０５において、Ｚ方向画像を取得するために、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって、合焦位置を「Lower_Limit_a」へ駆動をおこなう。

その後、ステップＳ１０６において、励起光用のシャッタ１７を開けることによって励起光を通過させ、ステップＳ１０７において、標本２に励起光を照明して撮影を行う。この撮影がおこなわれた後は、ステップＳ１０９において、ホストＰＣ１６にて設定した撮影枚数分だけ、同じくホストＰＣ１６にて設定した撮影ピッチ分だけ、ピエゾ素子２１の駆動を行うことで、合焦位置の移動を行いながら撮影を行う。

そして、撮影終了後（ステップＳ１０８：Ｙ）、シャッタ１７を閉じることにより励起光を遮光する。
その後、ステップＳ２０２において、全てのＸ−Ｙ座標についての処理が終了したか確認をし、終了していなければ（ステップＳ２０２：Ｎ）ステップＳ２０１に戻り、次の設定したＸ−Ｙｂ座標に電動ステージ４の駆動を行う。そして、同様にそのＸ−Ｙｂ座標のスライドガラス３の「Base」座標に対してＡＦ制御（ステップＳ１０３）を行い、設定した撮影枚数の測定（ステップＳ１０７）を行う。

この動作を測定が終了するまで繰り返し続ける。
以上のように構成・制御される本第２の実施の形態の倒立顕微鏡システム１Ｂは、複数の測定点毎にスライドガラス３にオートフォーカスをかけることにより、周囲温度の変化により対物レンズ１０ａの焦点位置が変化した場合でも基準位置が固定された状態で観察体撮影位置をオフセットで設定するため、観察体である標本２の動きを測定することが可能になり、また各撮影座標における撮影ポイントのＺ方向の移動はピエゾ素子２１により迅速な駆動で行うために、励起光を当てる時間を極めて短くすることが可能となる。

なお、本第２の実施の形態では電動Ｘ−Ｙステージの場合につい説明しているが、標本２のＸ−Ｙ方向の駆動を行うという観点ではこれに限定させるものではなく、たとえば回転ステージであってもよい。
（第３の実施の形態）
次に、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第３の実施の形態について説明する。

図１５は、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第３の実施の形態の構成を示す図である。
第１の実施の形態と同一のものは同一の符号を付加して説明を省略する。

本第３の実施の形態における顕微鏡システム１Ｃの技術的特徴は、本発明にかかる挿入された対物レンズ１０ａ、１０ｂの種別を判別する対物判別手段が、対物検出部２０が対応している点である。

第１の実施の形態と同様に、ユーザーは撮影条件の設定を行う。まず、観察を行いたい倍率の対物レンズ１０ａを光路中に挿入し、図１６に示すスライドガラス３の表面である「Base」座標の位置に合焦を行う。

続いて、「Base」位置から、観察を行いたい対物レンズ１０ａに対する観察中心座標である「Center_ob_a」座標まで、合焦位置を移動させる。コントロール部１８に接続されたジョグエンコーダ３８より入力を行い、同様にモータ制御部２４を介して準焦部モータ２２の駆動をおこなうことにより電動レボルバ１９をＺ方向に移動させ「Center_ob_a」座標に合焦を行う。「Center_ob_a」座標に合焦終了後、「Base」座標から「Center_ob_a」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_ob_a」-「Base」の値が選択された対物レンズ１０ａのオフセット量Off_ob_aとなる。

続いて、「Center_ob_a」座標からの撮影ピッチp_ob_aと片側撮影枚数n_s_ob_aの設定を行う。本第３の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチｐ１、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチ及び撮影枚数より、撮影の開始座標である「Lower Limit_ob_a」座標を算出する。

次に、電動レボルバ１９によって、次に観察を行いたい倍率の対物レンズ１０ｂを光路中に挿入する。続いて、先の対物レンズ１０ａの「Center_ob_a」座標から、観察を行いたい選択された対物レンズ１０ｂに対する「Center_ob_b」座標まで、合焦位置を移動させる。合焦座標への移動は、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって行う。「Center_ob_b」座標に合焦終了後、「Center_ob_a」座標から「Center_ob_b」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_ob_b」-「Center_ob_a」の値が選択させた対物レンズ１０ａのオフセット量Off_ob_bとなる。

続いて、「Center_ob_b」座標からの撮影ピッチp_ob_bと片側撮影枚数n_s_ob_bの設定を行う。本第３の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチｐ１ｂ、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチ及び撮影枚数より、撮影の開始座標である「Lower Limit_ob_b」座標を算出する。

次に、撮影間隔時刻ｔｐと撮影繰り返しｎ＿ｔ回数の設定を行う。本第３の実施の形態では撮影間隔時間をｔｐ１、撮影繰り返し回数を５回に設定したものとする。設定はホストＰＣ１６を介して行うものとする。撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔより、撮影開始時に設定させる撮影開始時刻start_timeから撮影終了時刻end_timeが算出される。

図１７は、第３の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。
測定が開始されると、ピエゾ素子２１による駆動座標を中央位置である「ピエゾCenter」座標に移動を行い、ステップＳ１０１において、撮影終了時刻end_tiｍeに応じたタイムラプス測定が終了したかチェックする。測定が終了した場合（ステップＳ１０１：Ｙ）には、終了する。

測定が終了していない場合（ステップＳ１０１：Ｎ）には、ステップＳ１０２において、ホストＰＣ１６で設定したタイムラプス測定間隔ｔｐ１に達するまで待機する。測定間隔に達すると（ステップＳ１０２：Ｙ）、ステップＳ３０１において、設定された対物レンズ１０ａを光路中に挿入する。対物レンズ１０ａが光路中に挿入されると、ステップＳ１０３において、スライドガラス３の「Base」座標に対してＡＦ制御を行い、準焦用モータ２２の駆動によって図１６に示した「Base」座標に駆動を行う。

続いて、「Base」座標に移動した後、ステップＳ１０４において、ホストＰＣ１６にて予め設定した「Center_ob_a」座標、すなわちオフセット量だけ電動レボルバ１９を駆動する。さらに、ステップＳ１０５において、Ｚ方向画像を取得するために、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって、合焦位置を「Lower_Limit_ob_a」へ駆動をおこなう。

そして、撮影終了後（ステップＳ１０８：Ｙ）、シャッタ１７を閉じることにより励起光を遮光する。
その後、ステップ３０２において、設定された対物レンズ１０ａまたは１０ｂについての処理が終了したかを確認し、終了していなければ（ステップＳ３０２：Ｎ）、ステップＳ３０３において、次に設定された対物レンズ１０ｂを光路中に挿入する。そして、対物レンズ１０ｂを光路中に挿入後、ステップＳ１０５に戻り、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによってホストＰＣ１６にて予め設定した「Lower_Limit_ob_b」座標へ移動する。続いて、ステップＳ１０６において、励起光用のシャッタ１７を開けることによって励起光を通過させ、ステップＳ１０７において、標本２に励起光を照明して撮影を行う。この撮影がおこなわれた後は、ステップＳ１０９において、ピエゾ素子２１の駆動を行うことで、ホストＰＣ１６にて設定した撮影枚数ｎである７枚を、同じくホストＰＣ１６にて設定した撮影ピッチ分であるｐ１ｂづつ、合焦位置の移動を行いながら撮影を行う。

そして、撮影終了後（ステップＳ１０８：Ｙ）、シャッタ１７を閉じることにより励起光を遮光する。この動作を撮影終了時刻end_tiｍeに達して測定が終了するまで繰り返し続ける。

以上のように構成・制御される本第３の実施の形態の倒立顕微鏡システム１Ｃは、タイムラプス測定条件において複数の対物レンズ１０ａおよび１０ｂによる観察が含まれている場合に焦点ズレが存在した場合でも基準位置が固定された状態で観察体撮影位置をオフセットで設定するため、確実に複数の測定であっても観察体である標本２の動きを測定することが可能となる。

なお、本第３の実施の形態では対物レンズ１０ａおよび１０ｂの場合について説明してあるが、連続的に倍率を可変できるズームレンズの場合であってもよい。
（第４の実施の形態）
次に、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第４の実施の形態について説明する。

図１８は、本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第４の実施の形態の構成を示す図である。
第１の実施の形態と同一のものは同一の符号を付加して説明を省略する。

本第４の実施の形態における顕微鏡システム１Ｄの技術的特徴は、本発明にかかる照射する励起光を切換えるための励起光選択手段が、複数の励起フィルタ８、ダイクロックミラー９、吸収フィルタ１１で構成させる蛍光キューブユニット４１を選択的に光路中に挿入可能な電動キューブターレット４２に対応している点である。そして、電動キューブターレット４２はコントロール部１８によって制御されている。

図１９において、標本２における「Center_q_a」座標が励起光ａによる観察中心座標を示しており、「Center_q_b」座標が励起光ｂによる観察中心座標を示している。
図１８の説明に戻る。

第１の実施の形態と同様に、ユーザーは撮影条件の設定を行う。まず、観察を行いたい倍率のキューブユニット４１を光路中に挿入し、図１９に示すスライドガラス３の表面である「Base」座標の位置に合焦を行う。続いて、「Base」位置から、観察を行いたいキューブユニット４１に対する観察中心位置である「Center_q_a」座標まで、合焦位置を移動させる。コントロール部１８に接続されたジョグエンコーダ３８より入力を行い、同様にモータ制御部２４を介して準焦部モータ２２の駆動をおこなうことにより電動レボルバ１９をＺ方向に移動させ「Center_ob_a」座標に合焦を行う。「Center_q_a」座標に合焦終了後、「Base」座標から「Center_q_a」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_q_a」-「Base」の値が選択させたキューブユニット４１におけるのオフセット量Off_q_aとなる。

続いて、「Center_q_a」座標からの撮影ピッチp_q_aと片側撮影枚数n_ s_q_aの設定を行う。本第４の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチｐ１、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチ及び撮影枚数より、撮影の開始座標である「Lower Limit_q_a」座標を算出する。

次に、電動キューブターレット４２によって、次に観察を行いたい倍率のキューブユニット４１ｂを光路中に挿入する。続いて、先のキューブユニット４１の「Center_q_a」座標から、観察を行いたい選択されたキューブユニット４１ｂに対する「Center_q_b」座標まで、合焦位置を移動させる。合焦座標への移動は、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって行う。「Center_q_b」座標に合焦終了後、「Center_q_a」座標から「Center_q_b」座標までの距離の記憶を行う。すなわち「Center_q_b」-「Center_q_a」の値が選択させたキューブユニット４１bにおけるオフセット量off_q_bとなる。

続いて、「Center_q_b」座標からの撮影ピッチp_q_bと片側撮影枚数n_s_q_bの設定を行う。本第４の実施の形態では両方向に対して、撮影ピッチｐ１ｂ、片側撮影枚数を３枚に設定したものとする。次に、設定された撮影ピッチp_q_bと片側撮影枚数n_s_q_bより、撮影の開始座標である「Lower Limt_q_b」座標を算出する。

次に撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔの設定を行う。本第４の実施の形態では撮影間隔時間をｔｐ１、撮影繰り返し回数を５回に設定したものとする。設定はホストＰＣ１６を介して行うものとする。撮影間隔時間ｔｐと撮影繰り返し回数ｎ＿ｔとに基づいて、撮影開始時に設定させる撮影開始時刻start_timeから撮影終了時刻end_timeが算出される。

図２０は、第４の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。
測定が開始されると、ピエゾ素子２１による駆動座標を中央位置である「ピエゾCenter」座標に移動を行い、ステップＳ１０１において、撮影終了時刻end_timeに達してタイムラプス測定が終了したかチェックする。測定が終了した場合（ステップS１０１：Y）には、終了する。

測定が終了していない場合（ステップS１０１：N）には、ステップＳ１０２において、ホストＰＣ１６で設定したタイムラプス測定間隔ｔｐ１に達するまで待機する。測定間隔に達すると（ステップＳ１０２：Ｙ）、ステップＳ４０１において、設定されキューブユニット４１を光路中に挿入する。キューブユニット４１が光路中に挿入されると、ステップＳ１０３において、スライドガラス３の「Base」座標に対してＡＦ制御を行い、準焦用モータ２２の駆動によって図１９に示した「Base」座標に駆動を行う。

続いて、「Base」座標に移動した後、ステップＳ１０４において、ホストＰＣ１６にて予め設定した「Center_q_a」座標、すなわちオフセット量だけ電動レボルバ１９を駆動する。さらに、ステップＳ１０５において、Ｚ方向画像を取得するために、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによって、合焦位置を「Lower_Limit_q_a」へ駆動をおこなう。

そして、撮影終了後（ステップＳ１０８：Ｙ）、シャッタ１７を閉じることにより励起光を遮光する。
その後、ステップＳ４０２において、設定されたキューブユニット４１または４１ｂについての処理が終了したかを確認し、終了していなければ（ステップＳ４０２：Ｎ）、ステップＳ４０３において、次に設定されたキューブユニット４１ｂを光路中に挿入する。そして、ステップＳ１０５に戻り、電動レボルバ１９に構成されているピエゾ素子２１を駆動することによってホストＰＣ１６にて予め設定した「Lower_Limit_q_b」座標へ移動する。続いて、ステップＳ１０６において、励起光用のシャッタ１７を開けることによって励起光を通過させ、ステップＳ１０７において、標本２に励起光を照明して撮影を行う。この撮影がおこなわれた後は、ステップＳ１０９において、ピエゾ素子２１の駆動を行うことで、ホストＰＣ１６にて設定した撮影枚数ｎである７枚を、同じくホストＰＣ１６にて設定した撮影ピッチ分であるｐ１ｂづつ、合焦位置の移動を行いながら撮影を行う。

以上のように構成・制御される本第４の実施の形態の倒立顕微鏡システム１Ｄは、タイムラプス測定条件において複数の励起光ａ、ｂによる観察が含まれている場合に焦点ズレが存在した場合でも撮影位置をオフセットで設定するため、観察体である標本２の動きを測定することが可能となるともに、各撮影座標における撮影ポイントのＺ方向の移動はピエゾ素子２１により迅速な駆動で行うために、励起光を当てる時間を極めて短くすることが可能となる。

なお、本第４の実施の形態では、合焦検出手段として本第４の実施の形態で説明した方式に限らず、周知の他の方法に適応することができる。また、本第４の実施の形態では倒立顕微鏡システム１Ｄを代表として顕微鏡装置について説明を行ったが、このような顕微鏡装置に限らず、顕微鏡装置を組み込んだライン装置といった、各種システムに適応することも可能である。

以上、本発明の各実施の形態を、図面を参照しながら説明してきたが、本発明が適用される顕微鏡システムは、その機能が実行されるのであれば、上述の各実施の形態等に限定されることなく、単体の装置であっても、複数の装置からなるシステムあるいは統合装置であってもよいことは言うまでもない。

すなわち、本発明は、以上に述べた各実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または形状を取ることができる。

本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第１の実施の形態の構成を示す図である。電動レボルバとピエゾ素子による駆動位置関係を示すである。受光センサとピント位置との関係（合焦位置）を説明するための図である。受光センサとピント位置との関係（後ピン位置）を説明するための図である。受光センサとピント位置との関係（前ピン位置）を説明するための図である。デフォーカスと入射光強度との関係を説明するための図（その１）である。デフォーカスと入射光強度との関係を説明するための図（その２）である。デフォーカスと入射光強度との関係を説明するための図（その３）である。第１の実施の形態における標本とスライドガラスとの関係を説明するための図である。第１の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。第１の実施の形態における測定処理によりタイムラプス画像の取得を説明するための図である。本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第２の実施の形態の構成を示す図である。第２の実施の形態における標本とスライドガラスとの関係を説明するための図である。第２の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第３の実施の形態の構成を示す図である。第３の実施の形態における標本とスライドガラスとの関係を説明するための図である。第３の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。本発明にかかる顕微鏡システムを適用した第４の実施の形態の構成を示す図である。第４の実施の形態における標本とスライドガラスとの関係を説明するための図である。第４の実施の形態における測定処理の流れを示すフローチャートである。

符号の説明

１Ａ倒立顕微鏡システム
１Ｂ倒立顕微鏡システム
１Ｃ倒立顕微鏡システム
１Ｄ倒立顕微鏡システム
２標本
２ａ標本
２ｂ標本
３スライドガラス
４電動ステージ
５ステージ制御部
６蛍光光源
７コレクタレンズ
８励起フィルタ
８ｂ励起フィルタ
９ダイクロックミラー
９ｂダイクロックミラー
１０ａ対物レンズ
１０ｂ対物レンズ
１１吸収フィルタ
１１ｂ吸収フィルタ
１２光路切換え部
１３接眼レンズ
１４ＣＣＤカメラユニット
１５ビデオキャプチャボード
１６ホストＰＣ
１７電動シャッタ
１８コントロール部
１９電動レボルバ
２０対物検出部
２１ピエゾ素子
２２準焦部モータ
２３架台
２４モータ制御部
２５ピエゾ制御部
２６赤外光半導体レーザー
２７レーザー制御部
２８コリメートレンズ
２９投光側ストッパ
３０ＰＢＳ
３１集光レンズ群
３２色収差補正レンズ群
３３ λ／４板
３４ダイクロイックミラー
３５集光レンズ群
３６受光センサ
３７合焦判別部
３８ジョグエンコーダ
３９パルスカウンタ
４０操作部
４１蛍光キューブユニット
４１ｂ蛍光キューブユニット
４２電動キューブターレット
４３ＸＹ座標記録部

Claims

被検物を保持するための透明部材を載置するステージと、
前記透明部材に保持された被検物を観察するための対物レンズと、
前記被検物を撮影する撮影手段とを備え、
所定の撮影間隔時間毎に繰り返し撮影をし、時間的な標本の形態変化を観察するタイムラプス観察を行う顕微鏡システムにおいて、
前記透明部材で反射した測定光に基づいて、前記透明部材に合焦するための評価信号を生成するオートフォーカス手段と、
前記所定の撮影間隔時間毎に前記オートフォーカス手段によって前記透明部材に合焦するように前記対物レンズと前記ステージを光軸方向に相対的に駆動させる第１の駆動手段と、
前記透明部材の合焦位置に基づいて前記被検物の光軸方向における撮影開始位置を設定する撮影条件設定手段と、
前記第１の駆動手段とは異なる方法で前記対物レンズと前記ステージを光軸方向に相対的に駆動させる前記第１の駆動手段よりも駆動速度が高速である圧電素子であるピエゾ素子と、前記ピエゾ素子を駆動するためのピエゾ素子駆動回路とを備える第２の駆動手段と、
前記第１の駆動手段及び前記第２の駆動手段の駆動を制御する制御手段とを備え、
前記制御手段は、前記第１の駆動手段を制御して前記オートフォーカス手段による前記評価信号に基づいて前記透明部材に対し自動合焦動作を行い、前記第２の駆動手段を制御して前記透明部材の合焦位置に基づいた前記撮影開始位置から前記光軸方向に所定の撮影ピッチ毎に合焦位置を移動させながら前記撮影手段によって前記被検物を複数撮影することを、タイムラプス観察における前記所定の撮影間隔時間毎におこなうこと特徴とする顕微鏡システム。
前記制御手段は、前記第１の駆動手段を制御して前記透明部材の合焦位置から前記被検物中の標本に合焦位置を移動させることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡システム。
前記制御手段は、前記第２の駆動手段を制御して前記標本の合焦位置から前記撮影開始位置に合焦位置を移動させることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡システム。
前記第１の駆動手段は、ステッピングモータと、前記ステッピングモータを駆動するためのステッピングモータ駆動回路とを備えることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の顕微鏡システム。
前記被検物を照明するための励起光を照射する励起光光源と、
前記励起光光源から照射される励起光を遮光するための励起光遮光手段と、
前記第２の駆動手段が駆動する際に、前記被検物に励起光が照射されるように前記励起光遮光手段を制御する励起光遮光手段制御手段と、をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の顕微鏡システム。
前記ステージは、電動でＸ方向またはＹ方向に移動可能なＸ−Ｙステージであり、
前記顕微鏡システムは、前記Ｘ−Ｙステージで予め位置決めされたＸ−Ｙ座標に対しての駆動量を設定する手段をさらに備え、
前記制御手段は、前記第１の駆動手段によって前記透明部材に対する合焦を行った後、前記第２の駆動手段によって前記Ｘ−Ｙステージで位置決めされた座標に対して予め定められた駆動制御を行なうことを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の顕微鏡システム。
光路中に複数の前記対物レンズを切換え配置することが可能な電動レボルバと、
前記光路中に配置された前記対物レンズの種別を判別する対物判別手段と、
前記複数の対物レンズ毎に駆動量を設定する手段とをさらに備え、
前記制御手段は、選択された前記対物レンズの種別に応じた駆動量に基づいて前記第２の駆動手段の駆動制御を行うことを特徴とする請求項１乃至５の何れか1項に記載の顕微鏡システム。
前記被検物に照射する励起光を切換えるための励起光選択手段と、
前記励起光毎に駆動量を設定する手段とさらに備え、
前記制御手段は、選択された前記励起光に応じた駆動量に基づいて前記第２の駆動手段の駆動制御を行うことを特徴とする請求項１乃至５の何れか1項に記載の顕微鏡システム。
前記透明部材の合焦位置は、前記透明部材と前記被検物との境界面であることを特徴とする請求項１乃至２の何れか１項に記載の顕微鏡システム。
前記撮影条件設定手段は、撮影枚数、撮影ピッチ、撮影繰り返し回数、及び撮影時間のうち少なくとも一つを設定することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。