JP4923541B2

JP4923541B2 - 顕微鏡

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Publication number: JP4923541B2
Application number: JP2005345313A
Authority: JP
Inventors: 高明岡本
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: US7660523B2; US20070122143A1; JP2007148221A

Description

本発明は、顕微鏡の間欠撮影装置に関するものである。

従来、特許文献１に示すような顕微鏡の間欠撮影装置が知られている。この装置は、顕微鏡の像を取り込むことが可能な撮像装置と、この撮像装置で取り込んだ像を試料の複数のサンプル点毎に所望の周期で記録する間欠記録装置とを設けることにより、同一試料の複数のサンプル点を間欠撮影ができ、欠陥撮影に要する時間を削減でき、また複数データを同一試料から同一の条件のもとで得られるようにするものである。

特開平０４−０８６６１５号公報

顕微鏡の間欠撮影において、所望の時間ごとに撮影し続けているうちに、観察対象物に焦点が合わない状態で撮影し、記録されることがある。この問題は、時間が経過するうちに温度変化により、観察対象物を載せているステージ自体が熱による膨張・収縮や、ステージの微量な自然落下等により観察対象物を光軸方向にずらしてしまうことが原因である。

本発明は、顕微鏡による観察対象物の間欠撮影において、経時的に生じる光軸方向のずれを補正し、焦点を整合させつつ撮影を行うことができる技術を提供することを目的とする。

本発明によれば、対物レンズと、観察対象物を支持する電動ステージと、前記対物レンズを介して前記観察対象物の画像を撮像する撮像装置と、前記対物レンズを含む光学系であって、フォーカス用照明光学系で形成された光像が観察対象物から反射され、前記光像の反射光を焦点検出装置に結像させるオートフォーカス結像光学系と、前記対物レンズを含む光学系であって、前記観察対象物を観察する観察光学系と、前記観察光学系を形成する光路外であって前記オートフォーカス結像光学系の光路中に、そのオートフォーカス結像光学系の結像位置を調節するオフセットレンズを備え、前記観察光学系の焦点位置に所定のオフセット量を与えるために前記オフセットレンズを調整する処理装置と、前記対物レンズ及び前記オフセットレンズを介して得られた前記反射光による前記焦点検出装置の信号に基づいて、前記ステージおよび前記対物レンズの相対位置関係を変位させてオートフォーカス動作の駆動および制御を行う駆動手段と、前記駆動手段の制御、前記撮像装置の制御、および、撮像された画像を取り込んで処理する間欠記録装置と、を備え、前記間欠記録装置は、予め設定された撮影タイミングになった後に前記撮像装置に対する間欠記録の撮影を行なうための撮像の指示の設定を受け付ける手段と、前記予め設定された前記撮像の指示が成される前の前記撮影タイミングになるまでに前記オートフォーカス動作を駆動させる前記駆動手段の制御装置と、を備えることを特徴とする顕微鏡が提供される。

本発明によれば、所望の時間ごとに観察対象物の像を撮影するために、時間が経過するに伴って生じる観察対象物の光軸方向のずれを補正することができる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。本実施形態では、透明容器に収容された観察対象物の観察を行う場合を例として説明する。しかし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

図１は、本発明の一実施形態に係る間欠撮影装置の構成を示す。図１に示す間欠撮影装置は、観察対象物Ｓの観察に用いられる顕微鏡１と、観察対象物Ｓを支持するステージ５１と、ステージ５１および顕微鏡１の相対位置関係の変位、および、オートフォーカス動作についての駆動および制御を行う駆動系２と、顕微鏡１を介して観察対象物Ｓの画像を撮像する撮像装置８と、駆動系２の制御、撮像装置８の制御、および、撮像された画像を取り込んで処理する間欠記録装置９と、を備える。また、間欠記録装置９と駆動系２との間におかれる通信インタフェース９７を有する。

間欠記録装置９は、情報処理装置９１においてユーザが指示した間欠記録の撮影タイミングの設定を受付け、駆動系２に対して、撮影タイミング毎に、観察対象物を撮影すべき複数の焦点位置を、予め定めた基準位置に対する相対位置として設定する。そして、間欠記録装置９は、各撮影タイミングに際して、オートフォーカス動作により、焦点位置を基準位置として取得させ、取得した基準位置と相対位置とに基づいて、観察対象物Ｓについて設定された撮影すべき焦点位置に、顕微鏡１およびステージ５１を相対変位させて、撮像装置８に各焦点位置における観察対象物の撮影を行わせ、撮影した画像を取り込む。機能の具体的な内容については後述する。

顕微鏡１は、何れも図示していないが、観察対象物Ｓの像を取り込む対物レンズ等のレンズ系と、レンズ系からの光を撮像装置８に導く撮像光学系とを有する。この顕微鏡１は、対物レンズを交換するレボルバ（図示せず）、観察対象物Ｓの照明を行う照明装置（図示せず）等を備えている。

駆動系２は、顕微鏡１の第１対物レンズ（図示せず）と観察対象物Ｓとの光軸（Ｚ軸）方向の相対位置関係を制御する光軸方向駆動制御部３と、第１対物レンズの観察対象物Ｓに対する自動焦点調整を行うオートフォーカス装置４と、観察対象物Ｓを支持すると共に、予め定めたシーケンスに従ってＸＹ面上でステージ５１を自動的に変位させる自動走査ＸＹステージ５と、光軸方向駆動制御部３、オートフォーカス装置４および自動走査ＸＹステージ５の駆動を制御するコントローラ６とを有する。

光軸方向駆動制御部３は、顕微鏡１と自動走査ＸＹステージ５のステージ５１とを光軸方向に変位させるための機構およびアクチェエータを含む上下動装置３２と、光軸方向の位置を計測するリニアスケール３３と、コントローラ６の指令およびリニアスケール３３の計測値に基づいて、上下動装置３２の駆動を制御するステージコントローラ部３１とを有する。また、ステージコントローラ部３１には、オートフォーカス装置４からの指令が入力され、オートフォーカス時に、ステージ５１の上下動制御を行う。リニアスケール３３は、例えば、リニアエンコーダにより構成することができる。

オートフォーカス装置４は、観察対象物Ｓを収容している透明容器の界面（底面）を焦点位置として上下動装置３２を用いて、ステージ５１を光軸（Ｚ軸）方向に移動させる機構、および、オフセットレンズ（焦点位置調節レンズ）を用いて界面位置を透明容器の界面を仮想的にシャーレ内部にさせることで透明容器内部に焦点を合わせることができるオフセットレンズ機構を有する。このオフセットレンズとは、特開２００４−７０２７６号公報に記載されているように、例えば、照明装置と第１対物レンズを結ぶ光路に設置され、この光路に沿って移動することで、焦点位置を調節可能としたものである。

また、オートフォーカス装置４は、焦点位置を界面に合わせる機能をオン・オフすることが可能である。このオン・オフの制御は、間欠記録装置９からの命令により行うことができる。さらに、オフセットレンズ位置を間欠記録装置９から指示することができる。このように構成することにより、撮影時焦点のずれを補正し、観察対象物Ｓの所望の位置を撮影し、記録することが可能となる。ここでは、透明容器を用いているが、それに限定されるわけではない。また、透明容器として、典型的に用いられるものとして、シャーレが挙げられる。

コントローラ６は、顕微鏡１に付属する電動装置、例えば、対物レンズを光軸の位置へ移動させるレボルバなどを制御する。コントローラ６は、間欠記録装置９からの指示に応じて、予め定めたプログラムにしたがって、駆動系２の制御を行う。この際、コントローラ６は、観察対象物Ｓを撮影すべき複数の焦点位置を、予め定めた基準位置に対する相対位置として設定する手段と、顕微鏡１およびステージ５１を相対変位させる手段とからの指示に応じて、光軸方向駆動制御部、オートフォーカス装置および自動走査ＸＹステージの駆動を制御する。

通信インタフェース９７は、コントローラ６と間欠記録装置９との通信の接続を行う。例えば、ケーブル、信号等の物理的不一致を整合させる。通信速度の調整、データ形式の変換等の両者間で情報を授受するために必要な処理を行う。典型的には、規格化された通信ケーブルを用いる、ＬＡＮに接続する等が挙げられる。コントローラ６と間欠記録装置９とが直接的に通信できる場合には、省略してもよい。

撮像装置８は、顕微鏡１により得た観察対象物Ｓの像を画像として取り込む。例えば、ＣＣＤを有するカメラを用いることができる。得られた画像は、ディジタル信号として、間欠記録装置９に送られる。

間欠記録装置９は、コンピュータにより構成される。具体的には、中央演算ユニット（ＣＰＵ）および記憶装置を含む情報処理装置９１と、入力装置９２と、出力装置９３とを有する。この間欠記録装置９は、撮像に関する各種指示、撮像データの記録等の制御を行う。そのために、前述した駆動系２および撮像装置８に制御指令を出力する。また、それらからの情報を取得する。入力装置９２は、操作指示、文字等の入力が行える機器により構成される。例えば、キーボード、マウス等が挙げられる。出力装置９３は、典型的には、表示装置が用いられる。この他に、印刷装置などが接続可能である。また、入力装置９２および出力装置９３として、データの入出力を行うための記憶媒体の読み書きを行う装置が挙げられる。例えば、ＵＳＢメモリの読み書きが行えるＵＳＢポート等が挙げられ得る。

間欠記録装置９は、情報処理装置９１のＣＰＵが、記憶装置にインストールされたプログラムに従って各種処理を実行する。すなわち、情報処理装置９１は、間欠記録の撮影タイミングの設定を受け付ける手段と、駆動系２に対して、撮影タイミング毎に、観察対象物Ｓを撮影すべき複数の焦点位置を、予め定めた基準位置に対する相対位置として設定する手段と、駆動系２に対して、各撮影タイミングに際して、オートフォーカス装置４のオートフォーカス動作により、焦点位置を基準位置として取得させ、取得した基準位置と相対位置とに基づいて、観察対象物Ｓについて設定された撮影すべき焦点位置に、顕微鏡１およびステージ５１の相対位置を変位させる手段と、各焦点位置における撮影の指示および撮影した画像を取り込む手段と、を具体的手段として構築して、間欠撮影動作を実行する。

情報処理装置９１は、例えば、所望の時間毎、例えば一定時間毎に、撮像装置８が撮像した画像を内蔵する記憶装置に記録する。また、情報処理装置９１は、コントローラ６と通信し、コントローラ６を介して、光軸方向駆動制御部３、オートフォーカス装置４および自動走査ステージ５について制御すると共に、位置情報等の、駆動系２の状態を示す制御情報を取得する。コントローラ６は、間欠記録装置９からの命令により、自動走査ステージ５を移動させ、同一試料（観察対象物Ｓ）の複数のサンプル点を間欠撮影する。

次に、間欠撮影装置の動作について、さらに説明する。まず、どのようなモードで撮影ができるかについて説明する。

間欠撮影のモードとしては、例えば、次の種類が挙げられる。
(A) 単一のサンプル点を所望の時間ごとに撮影する方法
(B) 観察対象物に厚みがある場合において、所望の時間ごとに焦点位置をずらし、一度の時間において複数枚撮影する方法
(C) 所望の時間ごとに複数のサンプル点を撮影する方法
(D) 所望時間ごとに複数の顕微鏡の設定を行い複数枚撮影する方法
(E) これらB，C，Dを組み合わせる方法
以下、これらの方法について説明する。これらの方法は、間欠記録装置９により、コントローラ６を介して、光軸方向駆動制御部３（ステージコントロール部３１、上下動装置３２およびリニアスケール３３）と、オートフォーカス装置４と、自動操作ステージ５とが制御されて、
（Ａ）単一のサンプル点を所望の時間ごとに撮影する方法
観察対象物Ｓについて単一のサンプル点を所望の時間ごとに撮影する場合について説明する。以下の(1)〜(3)については、処理の順序を問わない。
(1) 間欠記録装置９は、操作者からの、観察に必要な各種設定の入力を受け付ける。出力装置９３の表示装置に、撮影手順の設定を受け付ける画面を表示し、その画面の案内に従って、必要な項目の入力を入力装置９２により受け付ける。システム側で用意した標準的設定を示し、一部乃至全部の設定の変更を受け付ける。また、既に、同様の試料について行った設定を記憶させておき、それを再利用する構成とすることもできる。欠記録装置９は、操作者から撮影手順として、例えば、タイムラプス撮影の手順設定として、撮影すべき位置、順序、回数、撮影タイミング等の手順を受け付ける。所望の撮影タイミングとしては、例えば、記録開始０秒から１０秒間隔で記録するなどの設定を受け付ける。
(2) 間欠記録装置９は、顕微鏡における各装置の作動条件の入力を、同様にして受け付ける。例えば、対物レンズを10xに設定、落斜照明を光路に入れるなどの、各種、顕微鏡１の観察に必要な設定を受け付ける。間欠記録装置９は、受け付けた作動条件について、通信インタフェース９７を介し、コントローラ６に指示する。
(3) 間欠記録装置９は、操作者からの、オートフォーカス装置４をオンにする指示を受付、コントローラ６に指示を送る。コントローラ６では、オートフォーカス装置４をオンの状態にし、オフセットレンズにより観察対象物の位置に焦点を合わせるよう制御する。
(4) 間欠記録を開始する。間欠記録装置９は、設定された撮影タイミングまでの時間経過、すなわち、待ち時間を管理する。撮影タイミングになると、撮像装置８に対して撮像を指示し、撮像された画像を間欠記録装置９に取り込み、記録する。
(5) 間欠記録装置９は、間欠記録を終了する処理を行う。具体的には、前述した(1)において予め設定したタイムラプス撮影のすべてについての撮影を終えたかを判断して、すべての撮影が終わっている場合には、一連の撮影を終了する。

ここで、オートフォーカス装置４によるオートフォーカス動作の効果について説明する。図２に示す例は、オートフォーカス装置４のオートフォーカス動作をオフにして、同じ手順で間欠撮影記録を行った場合における試料ドリフトの影響を示す。図２の場合には、焦点位置が一定であるため、各撮像タイミングでの画像は、すべて焦点位置が一定である。しかし、実際には、破線で示すように、試料面がドリフトしており、焦点が試料面に合っていない。これに対して、本発明に関わる図３に示すように、オートフォーカス装置４のオートフォーカス動作をオンにした場合には、焦点位置は、光軸方向駆動制御部３により試料ドリフトに追従して、試料面に合わせた位置となっている。従って、常に試料面に合焦した状態で撮像が行われている。図４は、観察対象物のドリフトをイメージで示したものである。
（Ｂ）観察対象物に厚みがある場合において、所望の時間ごとに焦点位置をずらし、一度の時間において複数枚撮影する方法
この撮影では、前述した（Ａ）の場合と同様に、初期設定を行う。順序を問わないことも（Ａ）の場合と同様である。(1)および(2)の設定と、(5)の処理については、前述した（Ａ）と同様であるので、ここでは、(3)以降の処理について説明する。この場合にも、オートフォーカス装置を加えることにより、各時間において、観察対象物の同じ位置の画像を撮影することができる。
(3) 間欠記録装置９は、撮影ごとの焦点位置を記録する。記録する態様として、後述するように、３種類ある。
(4) 間欠記録装置９は、間欠記録を開始する。記録は、間欠的に複数回のタイミングにおいて行われる。間欠記録装置９は、撮影タイミングに合わせて記録時間になると、撮影された像を間欠記録装置９に記録する。

予め設定された複数回の撮影タイミングのそれぞれの回において、焦点位置を変えて、複数枚の撮影を行う。１回の撮影タイミングにおいて異なる焦点位置での撮影のために焦点位置を移動させる方法については、後述する２種類がある。

次に、図５（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照して、撮影ごとの焦点位置を記録する手順について説明する。
（51）焦点位置をオフセットレンズで設定する
図５（ａ）に示すように、まず、フォーカスアシストを有効とする。具体的には、オートフォーカス装置４をオンの状態にする指示を行う（ステップ５１１）。ここで、操作者が１回の撮影タイミングにおける撮影枚数分を繰り返し、オフセットレンズにより観察対象物Ｓの所望の位置に焦点を合わせる操作を行う。その位置を、操作者の指示を受け付けて、間欠記録装置９は、撮影ごとのオフセットレンズ位置およびリニアスケール３３の位置検出値として、コントローラ６を介して取り込み、オフセット量として記録する（ステップ５１２）。
（52）焦点位置をステージコントロール部で設定する（-1）
図５（ｂ）に示すように、まず、フォーカスアシストを有効とする。具体的には、オートフォーカス装置４をオンの状態にする指示を行う（ステップ５２１）。次に、操作者の操作により、焦準（焦点整合）用の上下動装置３２を駆動させ、基準（リファレンス）位置をオフセット量で設定する（ステップ５２２）。観察対象物の基準位置のオフセットレンズ位置およびリニアスケール３３で読み取り、読み取った値を含む基準位置を、コントローラ６を介して取り込み、オフセット量として記録する（ステップ５２３）。

ここで、フォーカスアシストを無効にする。すなわち、オートフォーカス装置４をオフの状態にする（ステップ５２４）。ステージコントロール部３１を用いて、操作者の指示により、予め設定された複数回の撮影タイミングの、ある１回の撮影タイミングで撮影する撮影枚数分について、上下動装置３２を移動させて（ステップ５２５）、それらの位置を設定して、それぞれの位置についてのリニアスケール３３の検出値を取り込み、前述した基準位置との差分を求めて記録する（ステップ５２６）。
（53）焦点位置をステージコントロール部で設定する（-2）
図５（ｃ）に示すように、まず、オートフォーカス装置をオンの状態にする。次に、１回の撮影タイミングにおける撮影枚数分を繰り返し、観察対象物の所望の位置との移動量（焦準用上下動の位置あるいはオフセットレンズの位置）を間欠記録装置９に記録する（ステップ５３１）。

次に、ある１回の撮影タイミングにおいて、焦点位置を移動させる方法として２種類が挙げられる。以下それについて、図６から図９を参照して説明する。

上下動装置により焦点位置を移動させる（図６、図７参照）
間欠記録装置９は、撮影動作についての初期設定を受け付ける（ステップ７１１）。この初期設定については既に述べたとおりである。その後、予め設定された手順に従って、撮影開始時刻までオートフォーカス装置４を有効状態、すなわち、オン状態（図６において、“AFS ON”）にする（ステップ７１２）。この状態で、オートフォーカス装置４を作動させ、ステージコントロール部３１を介して上下動装置３２により、ステージ５１をＺ軸方向に変位させ、顕微鏡１を合焦させる。リニアスケール３３により検出された、このときの焦点位置を、コントローラ６を介して、間欠記録装置９が取得する。取得した焦点位置を基準位置（リファレンス位置）とする。

すべての撮影タイミングについての撮影が終わったかを調べる（ステップ７１４）。終わっていなければ、次のステップ位置に移動する（ステップ７１５）。具体的には、撮影開始時刻（撮影タイミング）になると、オートフォーカス装置４をオフの状態にして（図６において、“AFS OFF”）、その位置をリニアスケール３３により読み取る。その位置と（３）において記録した位置との差分量を計算する。具体的には、前述した（53）の処理において、間欠記録装置９が記録した位置と、間欠記録装置（PC）に記録された撮影する位置からその差分量を差し引き、上下動装置３２を用いて焦点位置を移動させる。

移動した位置に置いて、観察対象物についての撮影を行う（ステップ７１６）。一方、図６に示すように、予め設定されている複数回の撮影タイミングのすべてについての撮影が終了している場合には、終了処理を行う（ステップ７１７）。
（91）オートフォーカス装置のオフセットレンズにより移動させる（図８、図９参照）
間欠記録装置９は、撮影動作についての初期設定を受け付ける（ステップ９１１）。この初期設定については既に述べたとおりである。その後、オートフォーカス装置をオンの状態（図９において、“AFS ON”）にする。図５において、焦点位置の設定が図５（ｂ）による場合、リニアスケール３３の位置をオフセットレンズに換算し移動させる。また、図５（ｃ）の場合においてオフセットレンズの位置を記録しない場合にもリニアスケール３３の位置をオフセットレンズに換算し移動させる。焦準用上下動による設定では、一度の撮影による時間において、上下動位置がずれない場合において有効である。
（Ｃ）所望の時間ごとに複数のサンプル点を撮影する方法
複数回の撮影タイミングにおいて、複数のサンプル点について撮影する場合の例について説明する。撮影手順については、前述した場合と基本的には同じである。ただ、１回の撮影タイミングにおいて複数のサンプル点について撮影を行うため、そのための設定と、撮影動作とが行われる点において相違する。以下では、相違点を中心に説明する。なお、図は、既に参照した図を基本的に同じであるので、これまでの図を参照して説明する。

この撮影では、前述した（Ａ）の場合と同様に、初期設定を行う。順序を問わないことも（Ａ）の場合と同様である。(1)および(2)の設定と、(5)の処理については、前述した（Ａ）と同様であるので、ここでは、(3)以降の処理について説明する。
(3) 間欠記録装置９は、撮影ごとのサンプル点および焦点位置を記録する。記録する態様として、前述した(51)、(52)および(53)の３種類がある。

「（51）焦点位置をオフセットレンズで設定する」では、ステップ５１２において、操作者が１回の撮影タイミングにおける撮影枚数分を、サンプル点数分繰り返し、オフセットレンズにより観察対象物Ｓの所望の位置に焦点を合わせる操作を行って、その位置を間欠記録装置９により記録する。

「（52）焦点位置をステージコントロール部で設定する（-1）」では、ステップ５２６において、ステージコントロール部３１を用いて、操作者の指示により、予め設定された複数回の撮影タイミングの、ある１回の撮影タイミングで撮影する撮影枚数分についてサンプル数分繰り返し、上下動装置３２を移動させて（ステップ５２５）、それらの位置を設定して、それぞれの位置についてのリニアスケール３３の検出値を取り込み、前述した基準位置との差分を求めて記録する。

「（53）焦点位置をステージコントロール部で設定する（-2）」では、ステップ５３１において、１回の撮影タイミングにおける撮影枚数分についてサンプル点数分を繰り返し、観察対象物の所望の位置との移動量（焦準用上下動の位置あるいはオフセットレンズの位置）を間欠記録装置９に記録する。
(4) 間欠記録装置９は、間欠記録を開始する。記録は、間欠的に複数回のタイミングにおいて行われる。間欠記録装置９は、撮影タイミングに合わせて記録時間になると、撮影された像を間欠記録装置９に記録する。

予め設定された複数回の撮影タイミングにおけるそれぞれの回において、複数のサンプル点について焦点位置を変えて、複数枚の撮影を行う。１回の撮影タイミングにおいて、各サンプル点での異なる焦点位置での撮影のために焦点位置を移動させる方法については、前述した２種類がある。それぞれの場合において、１回の撮影タイミング毎に、予め定められた複数のサンプル点に顕微鏡を移動させて、それぞれのサンプル点について、複数枚分の撮影を行う。
(5) 予め定めた回数のタイミングでの、すべてのサンプル点での撮影が終了すると、間欠記録装置９は、終了処理を行う。
（Ｄ）所望時間ごとに複数の顕微鏡の設定行い複数枚撮影する方法
これまでは、１台の顕微鏡で撮影を行う例であるが、ここでは、複数の顕微鏡に設定を行って複数枚の撮影を行う。なお、撮像装置８も対応して複数台用意される。同様に、工事好方向駆動制御部３も、顕微鏡対応に複数も受けられる。一方、ＸＹステージ５１およびそれを駆動制御する自動走査ステージ５は、複数の顕微鏡に対して共通に設けられる。このＸＹステージを移動させることで、観察対象物Ｓの複数のサンプル点を異なる顕微鏡により観察することが可能となる。
(1) 間欠記録装置９は、操作者からの、観察に必要な各種設定の入力を受け付ける。この場合には、複数の顕微鏡を用いて撮影を行うため、それぞれの顕微鏡に関する撮影手順等についての設定を受け付ける。個別的な設定の仕方については、前述した例と基本的には同じであるので、ここでは説明を省略する。
(2) 間欠記録装置９は、各顕微鏡における各種装置の作動条件の入力を、同様にして受け付ける。例えば、対物レンズを10xに設定、落斜照明を光路に入れるなどの、各種、顕微鏡１の観察に必要な設定を受け付ける。間欠記録装置９は、受け付けた作動条件について、通信インタフェース９７を介し、コントローラ６に指示する。
(3) 間欠記録装置９は、撮影すべき各タイミングにおいて、各顕微鏡により撮影する枚数分についての焦点位置について設定を行って記録しておく。この設定については、前述したように、３種類ある。この例では、前述した（Ｃ）において行った設定を、各顕微鏡について行う。それぞれの設定の詳細については、前述した手順と同じであるので、重複した説明は省略する。その位置を間欠記録装置９により記録する。
(4) 間欠記録を開始する。間欠記録装置９は、設定された撮影タイミングまでの時間経過、すなわち、待ち時間を管理する。撮影タイミングになると、複数の撮像装置８のうち、該当する撮像装置に対して撮像を指示し、撮像された画像を間欠記録装置９に取り込み、記録する。また、前述したように、サンプル点への移動と、サンプル点での、焦点位置への移動とを制御する。また、何れの兼備挙で撮影するかについての制御をも行う。
(5) 間欠記録装置９は、間欠記録を終了する処理を行う。具体的には、前述した(1)において予め設定したタイムラプス撮影のすべてについての撮影を終えたかを判断して、すべての撮影が終わっている場合には、一連の撮影を終了する。
（Ｅ）Ｂ、ＣおよびＤを組み合わせる方法
前術したように、Ｂは、観察対象物に厚みがある場合において、所望の時間ごとに焦点位置をずらし、一度の時間において複数枚撮影する方法、Ｃは、所望の時間ごとに複数のサンプル点を撮影する方法、および、Ｄは、所望時間ごとに複数の顕微鏡の設定行い複数枚撮影する方法である。これらをそれぞれ用いることができることは、既に述べたとおりであるが、適宜組み合わせることも可能である。Ｂ、ＣおよびＤの設定を行って、間欠撮影を行うことができる。例えば、次のような例があり得る。
例１）サンプル点ごとに焦点位置をずらし、各焦点位置で顕微鏡設定を変え撮影する。
例２）サンプル点ごとに顕微鏡設定を変え、焦点位置をずらし撮影する。

前述したオートフォーカス装置を搭載した顕微鏡について、図１３を用いて説明する。この例では、顕微鏡は、観察の対象物である試料である標本の拡大像を形成して観察に使用するものである。

図１３には図示しないが、観察の対象物である標本Ｓは、水等の媒質に浸された状態でカバーガラスＧ２およびスライドガラスＧ１に挟まれてステージ５１上に載置されている。

まず、本実施に係る顕微鏡の光学系について説明する。本発明に係る顕微鏡の光学系は、標本の上部に配置されている観察光学系１０と、その側方に配置されて、本実施形態に係るオートフォーカス装置の光学系であるフォーカス用照明光学系４０およびフォーカス用結像光学系７０により構成されている。

フォーカス用照明光学系４０は、その光軸上に、順に、ＬＥＤ光源４１、第１コレクタレンズ４２、スリット板４３、第２コレクタレンズ４４、第１瞳制限マスク４５、第１ハーフミラー４６、焦点位置調節レンズ４７及び可視光カットフィルタ４８が配設されて構成されている。スリット板４３の中央部には長方形の細長いスリット開孔４３ａが形成されており、スリット板４３は、スリット開孔４３ａの長手方向が図１３において紙面に垂直方向に延びるように、光軸を中心に配設されている。

ＬＥＤ光源４１から出射された赤外光（近赤外光）は、第１コレクタレンズ４２で集光されてスリット板４３に入射し、標本面（カバーガラスＧ２と標本が浸された媒質との境界面）と共役位置に配置したスリット板４３のスリット開孔４３ａを通り、第２コレクタレンズ４４で平行光に変換され、第１瞳制限マスク４５に照射される。第１瞳制限マスク４５は、瞳の半分を遮光するものであり、光軸を中心にスリット状に形成される赤外光束の長手方向の中心線にそって半分が遮光されるように配設されている。第１瞳制限マスク４５を通過した赤外光Ｌａは、第１ハーフミラー４６を透過する。なお、第１ハーフミラー４６は、フォーカス用照明光学系４０とフォーカス用結像光学系７０の光軸が交差する点に配設されており、赤外光の一部を反射して、他の一部を透過するものであり、後述するように、フォーカス用結像光学系７０でも共用されている。

フォーカス用照明光学系４０と観察光学系１０の光軸が交差する点には、ダイクロイックミラー１６が配設されており、後述するように観察光学系１０でも共用されている。ダイクロイックミラー１６は、観察光学系１０の観察光路上のアフォーカル系に配設され、赤外光を反射して可視光を透過する作用をする。第１ハーフミラー４６を透過した赤外光Ｌａは焦点位置調節レンズ４７を透過した後、可視光カットフィルタ４８で赤外光Ｌａに含まれる可視光成分が除去された後、ダイクロイックミラー１６に当たって下方に反射され（赤外光Ｌｂ）、第１対物レンズ１７によって標本に集光されて照射される。なお、第１対物レンズ１７は、後述するように、観察光学系１０でも共用されている。また、焦点位置調節レンズ４７については後述する。

第１対物レンズ１７には、駆動部３４が連結されている。駆動部３４は、対物レンズの光軸方向への変位を行うと共に、倍率変更時のターレット駆動とを行うための、機構とアクチュエータとを備える。駆動部３４は、間欠記録装置９０からの指令によって動作する。

観察光学系１０は、標本に近い方から順に、第１対物レンズ１７、ダイクロイックミラー１６、赤外光カットフィルタ１８、第２ハーフミラー１４および接眼用第２対物レンズ１３が配設されて構成されており、さらに接眼用第２対物レンズ１３の先には図示しないが接眼レンズが配設されて構成されている。

また、図示しないが、ステージ５１上に載置された標本を照明する照明装置が設けられている。この照明装置は、透過型または落射型であり、透過型の照明装置の場合はステージ５１の下方に配置され、落射型の照明装置の場合はステージ５１の上方に配置される。

ステージ５１には、それをＸＹ方向に変位させる駆動部５２が連結されている。駆動部５２は、間欠記録装置９０からの指令に応じて、ステージ５１を目的の位置に変位させる。

照明装置から照射された可視光は標本Ｓを透過して観察光となり、第１対物レンズ１７を経て、ダイクロイックミラー１６を透過し、赤外光カットフィルタ１８で赤外光が除去されて、第２ハーフミラー１４に入射する。第２ハーフミラー１４は、観察光の一部を反射して、他の一部を透過するものであり、第２ハーフミラー１４に入射した観察光は、一部が反射され接眼用第２対物レンズ１３および接眼レンズで標本の観察像が結像され、観察に供される。

第２ハーフミラー１４を透過した一部の観察光は、撮像装置８０により、画像信号に変換される。すなわち、第２ハーフミラー１４を透過した一部の観察光を、カメラ用第２対物レンズ１８とカメラ用リレーレンズ１９を通し、カメラ用ＣＣＤセンサ８１の撮像面に結像させ、カメラ用信号処理８２で処理する。得られた信号は、間欠記録装置９０に送られて処理され、入出力部９４において、標本の画像をモニタ（図示せず）に投影される。

次に、フォーカス用結像光学系７０について説明する。この光学系は、上述のように、フォーカス用照明光学系４０によりステージ５１上の標本Ｓに照射されて反射するスリット状の赤外光を受光するものである。ここで、ステージ５１上の標本ＳはカバーガラスＧ２によって覆われているため、第１対物レンズ１７で結像された赤外光は、カバーガラスＧ２の表面やカバーガラスＧ２と標本Ｓの境界面（標本面）で反射する。カバーガラスＧ２や標本面等で反射した赤外光は、第１対物レンズ１７で平行光に変換され（赤外光Ｌｃ）、ダイクロイックミラー１６に当たって側方に反射され（赤外光Ｌｄ）、さらに可視光カットフィルタ４８及びオフセットレンズ（以下、焦点位置調節レンズ）４７を通り、第１ハーフミラー４６に入射する。

第１ハーフミラー４６に入射した赤外光Ｌｄは、上方に一部が反射されフォーカス用結像光学系７０に入る。フォーカス用結像光学系７０は、光軸に沿って、第１ハーフミラー４６、オートフォーカス用第２対物レンズ７６、オートフォーカス用リレーレンズ７７、第２瞳制限マスク７８、オートフォーカス用リレーレンズ７７、シリンドリカルレンズ７９およびオートフォーカス用ＣＣＤセンサ７２が配設されて構成されている。第１ハーフミラー４６で反射された赤外光Ｌｄは、オートフォーカス用第２対物レンズ７６で集光して結像光に変換されスリット像を結像する。オートフォーカス用リレーレンズ７７，７７は、オートフォーカス用第２対物レンズ７６によって結像されたスリット像（赤外光Ｌｅ）をリレーし、シリンドリカルレンズ７９を経て、オートフォーカス用撮像装置７１に導かれる。オートフォーカス用撮像装置７１では、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ７２の撮像面にスリット像が再結像され、信号処理部７３において画像信号に変換される。画像信号は、間欠記録装置９０の情報処理装置９１に送られて、処理され、オートフォーカス動作のための指令が生成される。

なお、第２瞳制限マスク７８は、瞳の半分を遮光するように配設されており、遮光される領域は、上記に述べた第１瞳制限マスク４５によって遮光される領域に対応している。また、シリンドリカルレンズ７９は、所定方向のみに屈折作用を持つレンズであり、赤外光Ｌｅを図１３において紙面に垂直方向（スリット像の長手方向）に圧縮して、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ７２の撮像面に結像させる作用をする。また、オートフォーカス用ＣＣＤセンサ７２は、複数の受光部が１次元に配列されたラインセンサ、または、２次元に配列されたエリアセンサで構成することが可能である。

以上の説明では、フォーカス用照明光学系４０において、ＬＥＤ光源４１から出射した光をスリット板４３のスリット開孔４３ａを通してスリット状にしてスリット開孔４３ａの像を標本に照射している。これは、スポット光とした場合、標本面等に段差部分があると、その反射光が散乱して理想的な光量信号を得ることができないためである。標本面等の状態によっては、このスリット板４３を無くし、上述の方法でＬＥＤ光源４１の像を標本に照射してオートフォーカス制御をすることも可能である。また、第１コレクタレンズ４２はなくても実現可能である。

次に、本発明に係るオートフォーカス装置において使用する焦点位置調節レンズ４７について説明する。焦点位置調節レンズ４７は、例えば、図１３に、第１レンズ４７ａと第２レンズ４７ｂとにより模式的に示すように、組合せレンズにより構成することができる。この焦点位置調節レンズ４７は、ダイクロイックミラー１６と第１ハーフミラー４６との間、つまり、フォーカス用照明光学系４０とフォーカス用結像光学系７０の共通光路上に位置し、アフォーカル系に配設されている。また、焦点位置調節レンズ４７には、焦点位置調節レンズ駆動部４９が取り付けられている。この焦点位置調節レンズ駆動部４９には、図示しないが、焦点位置調節レンズ４７を光軸に沿って前後に移動可能とする焦点位置調節レンズ用ＤＣモータと、倍率の異なる複数の焦点位置調節レンズ４７を交換可能とする焦点位置調節レンズ用電動ターレットとが設けられている。

また、後述する間欠記録装置９０の入出力部９４には、焦点位置調節レンズ４７を光軸に沿って移動させる焦点位置調節操作スイッチと焦点位置調節レンズ切り替えスイッチが配設されている。観察者は焦点位置調節操作スイッチを操作すると、焦点位置調節レンズ４７を光軸にそって前後に移動させることができ、また、焦点位置調節レンズ切り替えスイッチにより、焦点位置調節レンズ用電動ターレットに装着された複数の焦点位置調節レンズ４７から任意の焦点位置調節レンズ４７を選択して切り替えることができる。

間欠記録装置９０は、情報処理装置９１と、入出力装置９４とを備えている。情報処理装置９１は、ＣＰＵ９１ａおよびメモリ９１ｂを有する。入出力部９４は、図示しないが、表示部、入力部を有する。入力部は、マウス、キーボードなどにより構成される。なお、ジョイステックなどの操作性のより入力部を有することもできる。この間欠記録装置９０は、図１に示す間欠記録装置９とは、コントローラを介さないで、直接、各駆動部３４、５２、４９を制御する構成となっている点において相違する。間欠撮影自体については、基本的に同様に行うことができる。本実施形態の場合、特にオフセットレンズを用いた動作制御を行うことに対応している。

以上述べた実施形態の効果について説明する。まず、従来の間欠撮影では、図１０に示すように、焦点位置を基準として、１回のタイミングでの複数焦点位置が絶対位置として規定される。ところが、試料の焦点を合わせるべき面が時間とともにずれる焦点（試料）ドリフト（図１０において破線で示す）が起きる。しかし、設定されている各焦点位置は絶対位置であるため、ドリフトが反映されず、間欠記録装置で記録された画像には、観察対象物Ｓの撮影すべき面における画像が記録されていないことが起こり得る。例えば、図１１に示すように、観察対象物Ｓの観察すべき位置と、設定されている焦点位置（３本の破線で示す）とが、時間の経過と共にずれてしまう。観察対象物Ｓ１については、三箇所の焦点位置の何れもが観察対象物Ｓ１の所定箇所に位置している。ところが、観察対象物Ｓ２では、その下方側については撮影がなされないこととなる。さらに、観察対象物Ｓ３では、下方側の他、中間部位についても撮影がなされないこととなる。

これに対して、本発明の実施形態によれば、オートフォーカス装置により、各撮影タイミング直前（図６参照）、または、複数のタイミングに渡って（図８参照）、オートフォーカス動作が行われる。このため、図１２に示すように、試料ドリフトが生じていても、観察対象物Ｓ１からＳ３のすべてについて、３箇所の焦点位置がカバーされる。従って、本発明の実施形態によれば、試料ドリフトが生じても、正確に観察が行える。

本発明の一実施形態に係る間欠撮影装置の概略構成を示すブロック図。オートフォーカス装置のオートフォーカス動作をオフにして、同じ手順で間欠撮影記録を行った場合における試料ドリフトの影響を示す説明図。オートフォーカス装置のオートフォーカス動作をオフにして、同じ手順で間欠撮影記録を行った場合における試料ドリフトの影響を示す説明図。観察対象物のドリフトをイメージで示した説明図。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、撮影ごとの焦点位置を記録する手順について示すフローチャート。本発明の一実施形態に係る撮影タイミング毎の複数の焦点位置と試料ドリフトとの関係を示す説明図。本発明の一実施形態における撮影の動作フローを示すフローチャート。本発明の一実施形態に係る撮影タイミング毎の複数の焦点位置と試料ドリフトとの関係を示す説明図。本発明の一実施形態における撮影の動作フローを示すフローチャート。従来の技術における撮影タイミング毎の複数の焦点位置と試料ドリフトとの関係を示す説明図。従来の技術における、観察対象物Ｓの観察すべき位置に対する設定されている焦点位置が、焦点ドリフトによりずれを生じている状況を示す説明図。本発明の実施形態における、観察対象物Ｓの観察すべき位置に対する設定されている焦点位置が、焦点ドリフトが生じていてもずれを生じていない状況を示す説明図。本発明に置いて用いることができる、オートフォーカス装置を搭載した顕微鏡の一例の構成を示す説明図。

符号の説明

１…顕微鏡、２…駆動系、３…光軸方向駆動制御部、３１…ステージコントロール部、３２…上下動装置、３３…リニアスケール、４…オートフォーカス装置、５…自動走査ステージ、５１…ステージ、６…コントローラ、８、８０…撮像装置、９、９０…間欠記録装置、９１…情報処理装置、９２…入力装置、９３…出力装置、９７…通信インタフェース。

Claims

対物レンズと、
観察対象物を支持する電動ステージと、
前記対物レンズを介して前記観察対象物の画像を撮像する撮像装置と、
前記対物レンズを含む光学系であって、フォーカス用照明光学系で形成された光像が観察対象物から反射され、前記光像の反射光を焦点検出装置に結像させるオートフォーカス結像光学系と、
前記対物レンズを含む光学系であって、前記観察対象物を観察する観察光学系と、
前記観察光学系を形成する光路外であって前記オートフォーカス結像光学系の光路中に、そのオートフォーカス結像光学系の結像位置を調節するオフセットレンズを備え、前記観察光学系の焦点位置に所定のオフセット量を与えるために前記オフセットレンズを調整する処理装置と、
前記対物レンズ及び前記オフセットレンズを介して得られた前記反射光による前記焦点検出装置の信号に基づいて、前記ステージおよび前記対物レンズの相対位置関係を変位させてオートフォーカス動作の駆動および制御を行う駆動手段と、
前記駆動手段の制御、前記撮像装置の制御、および、撮像された画像を取り込んで処理する間欠記録装置と、を備え、
前記間欠記録装置は、
予め設定された撮影タイミングになった後に前記撮像装置に対する間欠記録の撮影を行なうための撮像の指示の設定を受け付ける手段と、
前記予め設定された前記撮像の指示が成される前の前記撮影タイミングになるまでに前記オートフォーカス動作を駆動させる前記駆動手段の制御装置と、を備えることを特徴とする顕微鏡。
対物レンズと、
観察対象物を支持する電動ステージと、
前記対物レンズを介して前記観察対象物の画像を撮像する撮像装置と、
前記対物レンズを含む光学系であって、フォーカス用照明光学系で形成された光像が観察対象物から反射され、前記光像の反射光を焦点検出装置に結像させるオートフォーカス結像光学系と、
前記対物レンズを含む光学系であって、前記観察対象物を観察する観察光学系と、
前記観察光学系を形成する光路外であって前記オートフォーカス結像光学系の光路中に、そのオートフォーカス結像光学系の結像位置を調節するオフセットレンズを備え、前記観察光学系の焦点位置に所定のオフセット量を与えるために前記オフセットレンズを調整する処理装置と、
前記対物レンズ及び前記オフセットレンズを介して得られた前記反射光による前記焦点検出装置の信号に基づいて、前記ステージおよび前記対物レンズの相対位置関係を変位させてオートフォーカス動作の駆動および制御を行う駆動手段と、
前記駆動手段の制御、前記撮像装置の制御、および、撮像された画像を取り込んで処理する間欠記録装置と、を備え、
前記間欠記録装置は、
予め設定された撮影タイミングになった後に前記撮像装置に対する複数の異なる前記撮影タイミングでの間欠記録の撮像の指示の設定を受け付ける手段と、
前記予め設定された前記複数の異なる撮影タイミングでの間欠記録の撮像のタイミングに渡って各前記撮影タイミングになるまでに前記オートフォーカス動作を駆動させる前記駆動手段の制御装置と、を備えることを特徴とする顕微鏡。
前記観察対象物内部の厚み方向における異なる位置の観察を行う場合、
前記処理手段は、前記オートフォーカス動作の駆動および制御がオンの状態において、前記オフセットレンズにより前記観察対象物の観察位置に焦点を合わせ、
前記間欠記録装置は、焦点合わせされた前記オフセットレンズの位置に関わるオフセット量を記録することを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡。