DE102018102241B4

DE102018102241B4 - Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops sowie ein Lichtblattmikroskop

Info

Publication number: DE102018102241B4
Application number: DE102018102241.7A
Authority: DE
Inventors: Theo Larrieu; Christian Schumann
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2022-02-24
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: DE102018102241A1; US11586027B2; CN111670398A; JP7234243B2; JP2021514483A; CN111670398B; US20210041681A1; EP3746829A1; WO2019149666A1

Abstract

Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops (10), bei demdie Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern (58, 60) beleuchtet wird, die einander in einem Zielbereich (E) der Probe koplanar überlagert sind,mittels einer Abbildungsoptik (14) des Lichtblattmikroskops (10) ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) erzeugt wird, undmit den beiden Lichtblättern (58, 60) in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (I) entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird,dadurch gekennzeichnet, dass die Bildmodulation ausgewertet wird, und der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) justiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops, bei dem die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern beleuchtet wird, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar überlagert sind, und mittels einer Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops ein Bild des beleuchteten Zielbereichs erzeugt wird. Ferner betrifft die Erfindung ein entsprechend arbeitendes Lichtblattmikroskop.
In der sogenannten Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskopie wird ein Zielbereich einer Probe über eine Beleuchtungsoptik mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet und der so beleuchtete Zielbereich mittels einer Abbildungsoptik, deren optische Achse senkrecht zur optischen Achse der Beleuchtungsoptik liegt, abgebildet. Indem der idealerweise mit dem Schärfebereich der Abbildungsoptik zusammenfallende, mit dem Lichtblatt beleuchtete Zielbereich sukzessive längs der optischen Achse der Abbildungsoptik durch die Probe verschoben wird, ist eine dreidimensionale Bildgebung möglich. Ein Vorteil dieser in der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie eingesetzten Methode ist insbesondere auch eine besonders geringe Lichtbelastung der Probe.
Problematisch ist jedoch, dass das Beleuchtungslicht senkrecht zur optischen Achse der Abbildungsoptik propagiert. So kann es durch Streuzentren oder Absorber innerhalb der Probe zu einer Streuung bzw. einer Absorption des Beleuchtungslichtes kommen, was sich im resultierenden Bild in Form von Streifenartefakten in Propagationsrichtung des Beleuchtungslichts bemerkbar macht.
Zur Verringerung solcher Artefakte wird in dem Patent DE 10 2016 108 384 B3 vorgeschlagen, den Zielbereich der Probe nicht nur mit einem, sondern mit zwei Lichtblättern zu beleuchten, die von derselben Seite, aber aus verschiedenen Beleuchtungsrichtungen auf den Zielbereich gerichtet werden und dort einander koplanar, d.h. in einer gemeinsamen Beleuchtungsebene überlagert sind. Diese Art der Lichtblattbeleuchtung wird dadurch erreicht, dass ein Beleuchtungslichtbündel durch ein Wollaston-Prisma tritt, welches das Beleuchtungslichtbündel in zwei unterschiedlich linear polarisierte Teilbündel aufspaltet, die von der optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs weggelenkt werden und so aus verschiedenen Beleuchtungsrichtungen in die Beleuchtungsebene, d.h. in den Zielbereich der Probe gelangen. Tritt nun in einer der beiden Beleuchtungsrichtungen infolge eines Streuzentrums oder eines Absorbers eine Abschattung des Beleuchtungslichtes auf, so ist durch die andere, durch das Streuzentrum bzw. den Absorber unbeeinträchtigte Beleuchtungsrichtung immer noch eine ausreichende Lichtblattbeleuchtung des Zielbereichs gewährleistet.
Um eine möglichst scharfe Bildgebung in einem Lichtblattmikroskop zu gewährleisten, ist ein präziser räumlicher Überlapp zwischen der Beleuchtungsebene, d.h. dem durch die Lichtblattdicke festgelegten Zielbereich, der das zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregte Probenvolumen definiert, und der Fokusebene, d.h. dem durch die Schärfentiefe festgelegten Schärfebereich der Abbildungsoptik erforderlich. Im Stand der Technik erfolgt die hierfür erforderliche, im Weiteren als Überlappjustage bezeichnete Feineinstellung, mit der die räumliche Überlagerung zwischen dem beleuchteten Zielbereich und dem Schärfebereich der Abbildungsoptik hergestellt wird, meist im Wege einer visuellen Beurteilung, z.B. unter Verwendung eines Referenzpräparats, das kleine Fluoreszenzteilchen aufweist. Auch kann das mikroskopisch aufgenommene Probenbild selbst visuell beurteilt werden, um die Überlappjustage vorzunehmen. Ein solches Vorgehen ermöglicht jedoch nur eine vergleichsweise grobe Überlappjustage. Insbesondere spiegelt das Einbringen eines Referenzpräparats nicht die eigentliche Abbildungssituation wider, in der beispielsweise probenbedingte Aberrationen infolge einer Brechungsindexfehlanpassung auftreten. Ein vergleichsweise aufwendiges Justageverfahren sieht demgegenüber vor, in den Beleuchtungsstrahlengang einen Spiegel einzubringen, der das Lichtblatt auf eine Referenzposition des in der Bildebene des Abbildungsstrahlengangs angeordneten Detektors ablenkt, sobald die Justage erfolgt ist.
Allen vorgenannten Verfahren ist gemein, dass sie keine automatisierte Überlappjustage ermöglichen. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass eine Justage auf Basis einer automatisierten Auswertung der Schärfe des Probenbildes mit der Schwierigkeit verbunden ist, dass das Ortsspektrum der abzubildenden Probe, das sich aus der Fourier-Transformation des Probenbildes ergibt, in der Regel unbekannt ist. Dies bedeutet insbesondere, dass a priori keine Kenntnis darüber vorhanden ist, ob das Ortsspektrum der Probe überhaupt hohe Ortsfrequenzen aufweist, die auf feine und damit justagetaugliche Probenstrukturen zurückgehen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops sowie ein Lichtblattmikroskop selbst anzugeben, die eine präzise und automatisierte Justage der räumlichen Überlagerung zwischen dem beleuchteten Zielbereich der Probe und dem Schärfebereich der Abbildungsoptik ermöglichen.
Aus der Druckschrift WO 2017/ 060 506 A1 ist ein Lichtblattmikroskop bekannt, bei dem zwei Teilbeleuchtungslichtbündel einander in einem Zielbereich einer Probe koplanar überlagert werden, um eine strukturierte Lichtblattbeleuchtung zu generieren. Das so erzeugte Lichtblatt weist ein Interferenzmuster auf, das sich durch Verändern der Phase und der lateralen Position der sich überlagernden Teilbeleuchtungslichtbündel modifizieren lässt. Auf Basis dieser Modifizierung werden mehrere Einzelbilder erzeugt, aus deren Bilddaten ein Ergebnisbild mit höherem Kontrast mit höherer Auflösung errechnet wird.
Die Druckschrift DE 10 2014 116 174 A1 beschreibt ein Lichtblattmikroskop, bei dem zu Auswertungszwecken das Maximum der Intensität in der Lichtblattebene bestimmt wird.
Die Druckschrift DE 10 2012 214 568 A1 beschreibt ein Lichtblattmikroskop, bei dem aus zwei einander koplanar überlagerten Teillichtbündeln ein Lichtblatt generiert wird. Die beiden Teillichtbündel werden durch polarisationsoptische Aufteilung eines einzelnen Beleuchtungslichtbündels erzeugt.
Zum Stand der Technik wird ferner verwiesen auf CHANG, Bo-Jui; PEREZ MEZA, Victor Didier; STELZER Ernst H.K.: csiLSFM combines light-sheet fluorescence microscopy and coherent structured illumination for a lateral resolution below 100 nm. In: PNAS May 9, 2017. 114 (19) 4869-4874. - ISSN: 0027-8424. Dort ist die Erzeugung eines Interferenzmusters aus zwei Lichtblättern sowie die Erfassung der Periode, der Orientierung und der Phasenverschiebung des Interferenzmusters auf Basis einer Fourier-Analyse des Musterbildes offenbart.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops vor, bei dem die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern beleuchtet wird, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar überlagert sind, und mittels einer Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops ein Bild des beleuchteten Zielbereichs erzeugt wird. Mit den beiden Lichtblättern wird in dem beleuchteten Zielbereich ein Interferenzmuster erzeugt, wodurch dem Bild des Zielbereichs eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird. Die Bildmodulation wird ausgewertet, und der beleuchtete Zielbereich wird in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik justiert.
Die Erfindung sieht eine selbsttätige Justage des beleuchteten Zielbereichs relativ zum Schärfebereich der Abbildungsoptik vor, indem das durch die Abbildungsoptik aufgenommene Bild des Zielbereichs hinsichtlich einer Bildmodulation ausgewertet wird. Letztere wird dem Bild dadurch aufgeprägt, dass der abgebildete Zielbereich mit zwei interferierenden Lichtblättern beleuchtet wird. Auf diese Weise wird ein den Zielbereich beleuchtendes Interferenzmuster generiert, das sich in dem Bild des beleuchteten Zielbereichs in Form der vorgenannten Bildmodulation widerspiegelt, die beispielsweise von einer hierfür in dem Lichtblattmikroskop vorgesehenen Steuereinheit ausgewertet und zur selbsttätigen Überlappjustage genutzt wird. Die Justage ist beispielsweise dann abgeschlossen, wenn die dem Bild des beleuchteten Zielbereichs aufgeprägte Bildmodulation maximal ist. So ist die in dem Bild vorhandene Modulation stark davon abhängig, wie präzise der mit der Lichtblattbeleuchtung beaufschlagte Zielbereich und der Schärfebereich der Abbildungsoptik einander räumlich überlagert sind. Vereinfacht gesagt ist die Bildmodulation dann maximal, wenn die durch die beiden Lichtblätter gemeinsam definierte Beleuchtungsebene mit der Fokusebene der Abbildungsoptik zusammenfällt.
Zum Zwecke der Überlappjustage ist zu gewährleisten, dass die beiden Lichtblätter in dem beleuchteten Zielbereich miteinander interferieren. Somit sind die Lichtblätter so zu erzeugen, dass sie eine für eine Interferenz ausreichende zeitliche und räumliche Kohärenz zueinander aufweisen. Darüber hinaus ist insbesondere sicherzustellen, dass die beiden Lichtblätter während der Justage Polarisationszustände aufweisen, die eine Interferenz der Lichtblätter in dem Zielbereich überhaupt ermöglichen. Geht man beispielsweise davon aus, dass die beiden Lichtblätter von vornherein unterschiedlich linear polarisiert sind, so interferieren die Lichtblätter in dem Zielbereich dann miteinander, wenn ihre Polarisationsrichtungen nicht-orthogonal zueinander sind. Sofern dies gewährleistet ist, ist kein Polarisationsmittel erforderlich, das eigens dafür vorgesehen ist, durch Beeinflussung der Polarisationszustände der beiden Lichtblätter deren Interferenzfähigkeit in dem Zielbereich sicherzustellen. Ein solches eigens für die Herstellung der Interferenzfähigkeit der Lichtblätter vorgesehenes Polarisationsmittel kann jedoch in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, durch eine entsprechende Beeinflussung der Polarisationszustände in dem Zielbereich ein besonders ausgeprägtes Interferenzmuster zu erzeugen. Beispielsweise kann das Polarisationsmittel dazu genutzt werden, die beiden Lichtblätter parallel linear zu polarisieren, wodurch die Interferenz der beiden Lichtblätter maximiert wird.
Ein solches Polarisationsmittel kann beispielsweise durch einen in dem Beleuchtungsstrahlengang an geeigneter Stelle eingebrachten doppelbrechenden Kristall oder einen Polarisator anderer Art, z.B. eine Verzögerungsplatte, realisiert sein. Ebenso kann die Beeinflussung der Polarisationszustände der Lichtblätter durch polarisationsabhängige Eigenschaften der Beleuchtungsoptik bewirkt werden, indem beispielsweise polarisationsabhängige Phasen von Interferenzschichten oder Mittel zur Spannungsdoppelbrechung genutzt werden. Weiterhin sind elektro-optische oder auf Flüssigkristallbasis arbeitende Mittel nutzbar.
Vorzugsweise wird die Bildmodulation ausgewertet, indem deren Amplitude bestimmt wird. Der beleuchtete Zielbereich wird dann relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik derart justiert, dass die Amplitude der Bildmodulation maximiert wird. Somit stellt die Amplitude der Bildmodulation einen in einfacher Weise erfassbaren Optimierungsparameter dar, auf dessen Grundlage in dem Lichtblattmikroskop eine selbsttätige Überlappjustage vorgenommen werden kann.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird eine Charakteristik des Interferenzmusters vorgegeben und die Bildmodulation anhand dieser vorgegebenen Charakteristik ausgewertet. Die vorgenannte Charakteristik ist eine Eigenschaft des Interferenzmusters, die sich beispielsweise aus der gewählten Geometrie der Lichtblattbeleuchtung ableiten lässt und damit a priori bekannt ist. Diese bekannte Eigenschaft des Interferenzmusters kann dann in einfacher Weise zur Auswertung der Bildmodulation herangezogen werden.
Beispielsweise wird das Interferenzmuster in Form eines Streifenmusters erzeugt, dessen Interferenzstreifen parallel zu einer Winkelhalbierenden eines Winkels verlaufen, den die Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter miteinander einschließen, wobei das Streifenmuster durch eine Modulationsperiode gemäß folgender Beziehung charakterisiert ist: $f = λ sin (α / 2)$
Darin bezeichnet f die Modulationsperiode, λ die Wellenlänge der Lichtblätter und α den vorgenannten Winkel, den die Beleuchtungsrichtungen miteinander einschließen.
In diesem Beispiel stellt die Modulationsperiode f eine von vornherein bekannte Charakteristik des Interferenzmusters dar, die sich aus der vorgegebenen Wellenlänge λ der Lichtblätter sowie dem ebenfalls vorgegebenen Winkel α zwischen den beiden Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter gemäß obiger Beziehung ergibt. Neben der Modulationsperiode ist auch die Ausrichtung des Interferenzmusters aus der Geometrie der Lichtblattbeleuchtung, d.h. den Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter bekannt. Aufgrund der Kenntnis der Modulationsperiode und der Ausrichtung des Interferenzmusters lässt sich nunmehr die Amplitude der Bildmodulation beispielsweise im Wege einer Fourier-Analyse des Bildes einfach und zuverlässig bestimmen. In dem durch die Fourier-Analyse erzeugten Frequenzraum ist die eng lokalisierte Modulationsperiode der Interferenzstreifen mit dem Ortsspektrum der Probe gefaltet, das die a priori nicht bekannte Struktur der Probe repräsentiert. Da jedoch das aufgenommene Bild des Zielbereichs durch positive reelle Daten repräsentiert ist, ist die Summe dieser Daten, die den Gleichanteil der FourierSpektrums ausmacht, auch stets positiv und reell, so dass es die a priori-Kenntnis der Modulationsperiode f des Interferenzmusters und dessen Ausrichtung erlaubt, die Amplitude der Bildmodulation auch bei einem hochfrequenten Ortsspektrum der Probe zuverlässig zu bestimmen.
In dem vorgenannten Beispiel lassen sich also die Interferenzstreifen des Interferenzmusters für nicht zu große Winkel α zwischen den Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter über die Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops einfach und zuverlässig in Form einer Modulation des aufgenommenen Bildes detektieren. Die Amplitude der dem Bild durch die Interferenzstreifen aufgeprägten Bildmodulation lässt sich somit als Optimierungsparameter bzw. Gütekriterium für die Koplanarität zwischen der Beleuchtungsebene und der Fokusebene der Abbildungsoptik nutzen. Da die Amplitude der Bildmodulation den einzigen zu optimierenden Parameter darstellt, ist der Parameterraum für die Einstellung der Koplanarität eindimensional. Somit können einfache lineare Suchalgorithmen angewandt werden, um die Amplitude der Bildmodulation zu maximieren.
Vorzugsweise werden zum Zwecke der Überlappjustage die beiden koplanar überlagerten Lichtblätter gemeinsam längs der optischen Achse der Abbildungsoptik verschoben. Dies kann beispielsweise über ein in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnetes Ablenkelement erfolgen, das in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation angesteuert wird. Es ist jedoch ebenso möglich, anstelle der Lichtblattbeleuchtung die Abbildungsoptik längs ihrer optischen Achse zu bewegen, um den Schärfebereich in räumliche Koinzidenz mit dem beleuchteten Zielbereich zu bringen. Auch eine gleichzeitige Verschiebung sowohl der Lichtblätter als auch des Schärfebereichs der Abbildungsoptik ist möglich.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die beiden Lichtblätter vor der Justage des beleuchteten Zielbereichs relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik in interferenzfähige Polarisationszustände überführt. Beispielsweise werden die vorgenannten Polarisationszustände so gewählt, dass die beiden Lichtblätter in dem Zielbereich linear, nicht-orthogonal, insbesondere parallel zueinander polarisiert sind. Dadurch ist gewährleistet, dass sich im Zielbereich ein stark ausgeprägtes Interferenzmuster ausbildet, durch das in dem aufgenommenen Bild eine entsprechende starke Bildmodulation generiert wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung werden die beiden Lichtblätter nach der Justage des beleuchteten Zielbereichs relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik in nicht-interferenzfähige Polarisationszustände gebracht. Dadurch wird eine die eigentliche Bildgebung störende Modulation des Mikroskopbildes vermieden. Dieser Schritt lässt sich anhand der Fourier-Analyse des Bildes automatisieren.
Vorzugsweise ist eine Vorjustage vorgesehen, in der der beleuchtete Zielbereich in Abhängigkeit der Helligkeit des Bildes relativ zu dem Schärfenbereich der Abbildungsoptik eingestellt wird. Eine solche Vorjustage kann insbesondere bei hochfrequentem Ortsspektrum der Probe auch in Abhängigkeit des Energiegehalts des detektierten Gesamtspektrums, das sich aus der Faltung des Ortsspektrums und des Beleuchtungsspektrums ergibt, vorgenommen werden.
Das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop umfasst eine Beleuchtungseinheit, die ausgebildet ist, eine Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern zu beleuchten, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar überlagert sind, eine Abbildungsoptik, die ausgebildet ist, ein Bild des beleuchteten Zielbereichs zu erzeugen, und eine Steuereinheit. Die Steuereinheit ist ausgebildet, die Beleuchtungseinheit derart zu steuern, dass mit den beiden Lichtblättern in dem beleuchteten Zielbereich ein Interferenzmuster erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird. Die Steuereinheit ist ferner ausgebildet, die Bildmodulation auszuwerten und die Beleuchtungseinheit und/oder die Abbildungsoptik derart zu steuern, dass der beleuchtete Zielbereich in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik justiert wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Beleuchtungseinheit eine Lichtquelle, die ausgebildet ist, ein Beleuchtungslichtbündel zu erzeugen, ein erstes Polarisationselement, das ausgebildet ist, das Beleuchtungslichtbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel aufzuspalten, und eine Beleuchtungsoptik, die ausgebildet ist, aus den beiden Teilbündeln die beiden den Zielbereich beleuchtenden Lichtblätter zu erzeugen. Das erste Polarisationselement ist beispielsweise so ausgeführt, dass es die beiden Teilbündel unter vorzugsweise entgegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse der Beleuchtungseinheit weglenkt. Bezeichnet man den Winkel, den die beiden Teilbündel miteinander einschließen, mit β (d.h. die entgegengesetzt gleichen Winkel bezüglich der optischen Achse mit ± β/2) und die durch die Abbildungsoptik bewirkte Vergrößerung mit γ, so werden in dieser Ausführungsform in der Probe zwei Lichtblätter generiert, die unter einem Winkel ± β/2γ zur optischen Achse der Beleuchtungseinheit innerhalb der Probe propagieren. Der Winkel β > 0, den die beiden Propagationsrichtungen zueinander aufweisen, reduziert die durch Streuung und Absorption verursachte Bildung von Streifenartefakten.
Vorzugsweise ist das erste Polarisationselement so ausgebildet, dass die beiden Teilbündel linear polarisiert sind, wobei ihre Polarisationsrichtungen orthogonal zueinander liegen. Diese orthogonalen Polarisationsrichtungen haben in der eigentlichen Bildgebung den Vorteil, dass eine Bildmodulation infolge einer Interferenz zwischen den beiden Lichtblättern ausgeschlossen ist. Außerdem werden durch eine Beleuchtung mit diesen beiden Polarisationsrichtungen Photoselektionseffekte in der Anregung von Fluorophoren reduziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Polarisationselement ein Wollaston-Prisma. Ein solches Prisma besteht beispielsweise aus zwei rechtwinkligen Calcit-Prismen, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die optischen Achsen der beiden Prismen liegen orthogonal zueinander.
Vorzugsweise umfasst die Beleuchtungseinheit ein über die Steuereinheit steuerbares Ablenkelement, durch das die beiden koplanar überlagerten Lichtblätter gemeinsam längs der optischen Achse der Abbildungsoptik verschiebbar sind. Das Ablenkelement ist beispielsweise ein Spiegel, der über einen durch die Steuereinheit angesteuerten Motor angetrieben wird, um die beiden koplanaren Lichtblätter längs der optischen Achse der Abbildungsoptik zu bewegen.
In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst die Beleuchtungseinheit ein über die Steuereinheit steuerbares zweites Polarisationselement, das ausgebildet ist, die beiden Lichtblätter wahlweise in interferenzfähige Polarisationszustände und nicht-interferenzfähige Polarisationszustände zu überführen. Insbesondere im Zusammenwirken mit dem vorgenannten ersten Polarisationselement ermöglicht diese Ausführungsform sowohl eine präzise Überlappjustage als auch eine hochauflösende Bildgebung, die insbesondere nicht durch Bildmodulationen infolge von Interferenzeffekten gestört ist.
Vorzugsweise hat das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop zwei separate, der Probe zugewandte Objektive, von denen eines der Beleuchtungseinheit und das andere der Abbildungsoptik zugeordnet ist und deren optischen Achsen senkrecht zueinander liegen. Dabei richtet das der Beleuchtungseinheit zugeordnete Objektiv vorzugsweise die beiden Lichtblätter von derselben Seite auf den Zielbereich der Probe.
Das Lichtblattmikroskop kann auch als sogenanntes Schiefebenenmikroskop ausgeführt sein, das ein einziges probenzugewandtes Objektiv sowohl für die Beleuchtung als auch die Detektion aufweist. Die Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops ist in dieser Ausführungsform als Transportoptik ausgebildet, welche die Lichtblätter in den Zielbereich der Probe abbildet und zugleich ein Bild des beleuchteten Zielbereichs erzeugt. Die Transportoptik hat vorzugsweise eine Abtastvorrichtung, die ausgebildet ist, einen axialen und/oder lateralen Rasterprozess zur Volumenbildgebung auszuführen, indem sie die Lichtblätter entsprechend durch die Probe bewegt.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:

1 ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops in einer schematischen Schnittansicht;
2 eine weitere schematische Schnittansicht des Lichtblattmikroskops nach 1;
3 ein Flussdiagramm, welches das Verfahren zur erfindungsgemäßen Überlappjustage anhand eines Ausführungsbeispiels veranschaulicht;
4 ein Diagramm, das die Amplitude einer Bildmodulation in Abhängigkeit des Versatzes zwischen dem beleuchteten Zielbereich und dem Schärfebereich der Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops zeigt;
5 ein in dem Zielbereich erzeugtes Interferenzmuster;
6 das durch eine Fourier-Transformation gewonnene Ortsspektrum des Interferenzmusters nach 5;
7 ein Bild des Zielbereichs, das zum Zwecke der Überlappjustage eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation aufweist;
8 das durch eine Fourier-Transformation gewonnene Ortsspektrum des Bildes nach 7; und
9 das Bild des Zielbereichs nach Beseitigung der Bildmodulation.

Die 1 und 2 zeigen Schnittansichten eines Lichtblattmikroskops 10.
Das Lichtblattmikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungseinheit 12 und eine Abbildungsoptik 14. Die Beleuchtungseinheit 12 und die Abbildungsoptik 14 sind in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel so aufeinander ausgerichtet, dass ihre optischen Achsen O bzw. O' im Bereich einer in den 1 und 2 nicht explizit dargestellten Probe senkrecht zueinander liegen. In den 1 und 2 wird jeweils auf ein rechtwinkliges xyz-Koordinatensystem Bezug genommen, dessen z-Achse mit der optischen Achse O der Beleuchtungseinheit 12 zusammenfällt. Demnach ist das Lichtblattmikroskop 10 in 1 in einem x-z-Schnitt und in 2 in einem y-z-Schnitt dargestellt. Die Darstellungen gemäß den 1 und 2 sind vereinfacht und rein schematisch. So sind lediglich diejenigen Komponenten dargestellt, die für das Verständnis der Erfindung erforderlich sind.
Die Beleuchtungseinheit 12 weist eine Lichtquelle 16 und eine in den 1 und 2 allgemein mit 18 bezeichnete Beleuchtungsoptik auf. Die Beleuchtungsoptik 18 umfasst ein erstes Polarisationselement in Form eines Wollaston-Prismas 20, ein motorisiertes zweites Polarisationselement in Form eines Kompensators 22, ein anamorphotisches Fokussiersystem in Form einer Zylinderlinse 24, einen motorisierten Einstellspiegel 26, eine Okularlinse 28, einen Umlenkspiegel 30, eine Tubuslinse 32 und ein Beleuchtungsobjektiv 34 mit einer Objektivpupille 36. Der vorgenannte Kompensator ist beispielsweise aus einem doppelbrechenden Kristall, insbesondere einer Verzögerungsplatte gebildet.
Die Abbildungsoptik 14 umfasst ein der abzubildenden Probe zugewandtes Abbildungsobjektiv 38, eine Tubuslinse 40 und einen ortsauflösenden Detektor in Form einer Kamera 42.
Das Lichtblattmikroskop 10 enthält ferner eine Steuereinheit 44, die den gesamten Mikroskopbetrieb steuert. Insbesondere dient die Steuereinheit 44 in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel dazu, den Kompensator 22, den motorisierten Einstellspiegel 26 und die Kamera 42 zu steuern sowie die weiter unten im Detail erläuterten Bildauswertungen vorzunehmen. Dementsprechend ist die Steuereinheit 44 über Steuerleitungen 46, 48, 50 mit dem Kompensator 22, dem Einstellspiegel 26 bzw. der Kamera 42 verbunden.
Die Lichtquelle 16 sendet ein kollimiertes Beleuchtungslichtbündel 52 auf das Wollaston-Prisma 20 aus, das beispielsweise aus zwei rechtwinkligen Prismen, z.B. Calcit-Prismen besteht, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Das Wollaston-Prisma 20 spaltet das einfallende Beleuchtungslichtbündel 52 in zwei Teilbündel 54, 56 auf, die verschiedene Polarisationszustände aufweisen, wie in 2 gezeigt ist. Dabei liegt die Ebene, in der das Wollaston-Prisma 20 das Beleuchtungslichtbündel 52 in die beiden Teilbündel 54, 56 aufspaltet, parallel zur y-Achse, d.h. in dem Schnitt nach 2 in der Zeichenebene und in dem Schnitt nach 1 senkrecht zur Zeichenebene.
Anschließend treten die beiden Teilbündel 54, 56 durch den Kompensator 22, mit dem sich die Polarisationszustände der Teilbündel 54, 56 nach Bedarf beeinflussen lassen. Hierzu ist in dem Lichtblattmikroskop 10 ein in den 1 und 2 nicht gezeigter Stellmotor vorgesehen, der unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 so auf den Kompensator 22 einwirkt, dass dieser die Polarisationszustände der beiden Teilbündel 54, 56 in der gewünschten Weise beeinflusst oder unverändert lässt.
Anschließend treten die Teilbündel 54, 56 durch die Zylinderlinse 24. Letztere hat die Eigenschaft, dass sie die Teilbündel 54, 56 jeweils lediglich in einer zur x-Achse parallelen Richtung fokussiert, während sie in einer zur y-Achse parallelen Richtung keine optische Wirkung auf die Teilbündel 54, 56 hat. Somit erzeugt die Zylinderlinse 24 im Bereich ihrer Brennebene aus den Teilbündeln 54, 56 jeweils eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung, die in Richtung der x-Achse fokussiert und in Richtung der x-Achse flächig ausgedehnt ist. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass die diesbezüglichen Darstellungen in den 1 und 2 der Verständlichkeit halber vereinfacht sind. So sind beispielsweise in 2 die Foki der beiden aus der Zylinderlinse 24 austretenden Teilbündel 54, 56, die mit den zu der Zylinderlinse 24 konjugierten Ebenen korrespondieren, auf der Oberfläche des motorisierten Einstellspiegels 26 angeordnet. Tatsächlich befindet sich jedoch in Lichtausbreitungsrichtung einer dieser Foki vor und der andere hinter dieser Oberfläche. Entsprechendes gilt für die Darstellung der Foki an der Oberfläche des Umlenkspiegels 30. Zudem sind die an dem Einstellspiegel 26 und dem Umlenkspiegel 30 vorgenommenen Lichtumlenkungen in den 1 und 2 in gleicher Weise dargestellt, obgleich diese Lichtumlenkungen in der dargestellten Weise entweder nur in der x-z-Ebene oder in der y-z-Ebene gegeben sind.
Nach Reflexion an dem Einstellspiegel 26 treten die beiden Teilbündel 54, 56 durch die Okularlinse 28 und werden an dem Umlenkspiegel 30 reflektiert. Anschließend gelangen die Teilbündel 54, 56 nach Durchtritt durch die Tubuslinse 32 in die Eintrittspupille 36 des Beleuchtungsobjektivs 34, das die Teilbündel 54, 56 so auf die Probe richtet, dass die Teilbündel 54, 56 aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen Zielbereich E der Probe beleuchten.
Die Beleuchtungsoptik 18 des Lichtblattmikroskops 10 generiert in vorstehend erläuterter Weise zwei in verschiedenen Beleuchtungsrichtungen propagierende Lichtblätter 58, 60, die in dem zu beleuchtenden Zielbereich E der Probe einander koplanar überlagert sind. Dabei sind die beiden Lichtblätter 58, 60 in dem konkreten Ausführungsbeispiel unter der Annahme, dass der Kompensator 22 die Polarisationszustände der Teilbündel 54, 56 zunächst noch unbeeinflusst lässt, in dem Zielbereich E linear orthogonal zueinander polarisiert. So ist beispielsweise das dem Teilbündel 54 zugeordnete Lichtblatt p-polarisiert, während das dem Teilbündel 56 zugeordnete Lichtblatt s-polarisiert ist. Die Okularlinse 28, die Tubuslinse 32 und das Beleuchtungsobjektiv 34 bilden innerhalb der Beleuchtungsoptik 18 eine Zwischenabbildungsoptik, welche die Lichtblätter, die die Zylinderlinse 24 im Wege der Fokussierung der Teilbündel 54, 56 am Ort des Ablenkspiegels 26 generiert, in den Zielbereich E der Probe abbildet.
In dem Ausführungsbeispiel nach 2 schließen die beiden Beleuchtungsrichtungen, aus denen die Lichtblätter 58, 60 in den Zielbereich E der Probe gerichtet werden, miteinander einen Winkel α ein. Dieser Winkel α korreliert mit einem Winkel β, den die beiden Teilbündel 54, 56 nach Aufspaltung durch das Wollaston-Prismas 22 miteinander einschließen. Konkret ergibt sich der Winkel α nach der Beziehung α = β/γ, wobei γ die Vergrößerung der aus der Okularlinse 28, der Tubuslinse 32 und dem Beleuchtungsobjektiv 34 gebildeten Zwischenabbildungsoptik bezeichnet.
Im Weiteren wird unter Bezugnahme auf das Flussdiagramm nach 3 anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert, wie mit dem Lichtblatt 10 ein Überlappjustage vorgenommen werden kann, die darauf abzielt, den mit den beiden koplanaren Lichtblättern 58, 60 beleuchteten Zielbereich E der Probe in räumliche Koinzidenz mit einem Schärfebereich F der Abbildungsoptik 14 zu bringen, der gemäß 1 längs der optischen Achse O' der Abbildungsoptik 14 im Bereich des Fokus eines Detektionsstrahlenbüschels 62 liegt.
In Schritt S1 des Flussdiagrams nach 3 erfolgt zunächst eine automatisierte Vorjustage der Lichtblattbeleuchtung auf den Schärfebereich F der Abbildungsoptik 14. Die Vorjustage kann beispielsweise auf Basis der Helligkeit des von der Kamera 42 aufgenommenen Bildes vorgenommen werden. Hierzu wird der Einstellspiegel 26 unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 in eine Stellung gebracht, in der die Lichtblattbeleuchtung für eine maximale Bildhelligkeit sorgt.
Nach erfolgter Vorjustage werden in Schritt S2 die Polarisationszustände der beiden Teilbündel 54, 56 und damit der beiden Lichtblätter 58, 60 unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 durch den Kompensator 22 so eingestellt, dass sich eine maximale Interferenz der beiden Lichtblätter 58, 60 in dem Zielbereich E ergibt. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel stellt der Kompensator 22 hierzu die Polarisationszustände der beiden Teilbündel 54, 56 so ein, dass diese linear parallel zueinander polarisiert sind. Auf diese Weise wird in dem Zielbereich E durch Interferenz der beiden Lichtblätter 58, 60 ein Interferenzmuster generiert, wie es rein beispielhaft in 5 veranschaulicht ist. Dabei zeigt die 5 der Einfachheit halber ein Interferenzmuster I unter der Annahme einer vollständig homogenen Probe.
Das Interferenzmuster I nach 5 weist eine Vielzahl von Interferenzstreifen auf, die sich unter Bezugnahme auf 2 in einer Richtung erstrecken, die parallel zur Winkelhalbierenden des Winkels α verlaufen. Der Winkel α wird von den beiden Beleuchtungsrichtungen eingeschlossen, in denen die beiden Lichtblätter 58, 60 propagieren. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel fällt die vorgenannte Winkelhalbierende des Winkels α deshalb mit der optischen Achse O der Beleuchtungsoptik 18 zusammen. Somit erstrecken sich die Interferenzstreifen, wie in 5 angedeutet, in Richtung der optischen Achse O der Beleuchtungsoptik 18.
In den folgenden Schritten S3 bis S5 erfolgt die eigentliche Justage. Zunächst wird in Schritt S3 durch die Kamera 42 ein Bild des mit den beiden Lichtblättern 58, 60 beleuchteten Zielbereichs E der Probe aufgenommen. Da die beiden Lichtblätter das in 5 gezeigte Interferenzmuster I generieren, ist dem von der Kamera 42 aufgenommenen Bild eine mit dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation aufgeprägt. Dies ist in 7 veranschaulicht, die ein von der Kamera 42 aufgenommenes Bild des Zielbereichs zeigt, in dem die dem Interferenzmuster I entsprechende Bildmodulation in Form von horizontalen Streifen deutlich zu erkennen ist.
In Schritt S4 wertet die Steuereinheit 44 die in dem aufgenommenen Bild enthaltene Bildmodulation aus. Hierzu nutzt die Steuereinheit 44 die a priori-Kenntnis der Charakteristik des Interferenzmusters I infolge der vorgegebenen Lichtblattgeometrie. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist diese Charakteristik durch die Modulationsperiode, d.h. den Abstand zwischen benachbarten Interferenzstreifen, sowie die Ausrichtung des Interferenzmusters nach 5 gegeben. Die Modulationsperiode ergibt sich nach folgender Beziehung: $f = λ sin (α / 2)$
worin f die Modulationsperiode, λ die Wellenlänge der Lichtblätter und α den Winkel zwischen den Ausbreitungsrichtungen der beiden Lichtblätter 58, 60 bezeichnet. Auch die Ausrichtung des Interferenzmusters ergibt sich unmittelbar aus der vorgegebenen Lichtblattgeometrie. Wie schon weiter oben erwähnt, verlaufen in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel die Interferenzstreifen parallel zur optischen Achse O der Beleuchtungsoptik 18.
Die Charakteristik des Interferenzmusters nach 5 spiegelt sich in dessen durch eine Fourier-Analyse generiertem Ortsspektrum wider, das in 6 gezeigt ist. In dem Diagramm nach 6 sind längs der horizontalen Achse die horizontalen Ortsfrequenzen und längs der vertikalen Achse die vertikalen Ortsfrequenzen angegeben. Die Einheiten sind durch die Eigenschaften der diskreten Fourier-Transformation gegeben, und die Signalintensität ist als Graustufen dargestellt. Das Ortsspektrum nach 6 weist zwei Signale bei Ortsfrequenzen auf, die sich aus der Modulationsperiode des in 5 gezeigten Interferenzmusters ergeben. Genauer gesagt, stellen die Ortsfrequenzen in 6 gemäß der Fourier-Transformation jeweils den Kehrwert der Modulationsperiode des Interferenzmusters I dar. Aus Gründen der einfacheren Darstellung ist in 6 die Signalintensität bei der Ortsfrequenz Null, die den Gleichanteil des Ortspektrums repräsentiert, weggelassen, da dieser die in 6 gezeigten Signalintensitäten um ein Vielfaches übersteigt. Das Gleichanteil-Signal mit der Ortsfrequenz Null liegt bezogen auf die horizontale Achse zwischen den beiden in 6 gezeigten Signalen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Ortsfrequenzen in 6 in willkürlichen Einheiten angegeben sind.
In Schritt S4 wird also das in 7 dargestellte Bild, das die dem Interferenzmuster I nach 5 entsprechende Bildmodulation aufweist, einer Fourier-Transformation unterzogen und so dessen Ortsspektrum erzeugt, das in 8 dargestellt ist. Das Ortsspektrum nach 8 zeigt längs der vertikalen Achse zwei Ortsfrequenzsignale, die in gleichen Abständen beiderseits eines dominierenden zentralen Signals angeordnet sind, das bei der Ortsfrequenz Null den Gleichanteil des Ortsspektrums repräsentiert. Die beiden vorgenannten Signale spiegeln die durch das Interferenzmuster I bewirkte Bildmodulation wider. Insbesondere ist die Ortsfrequenz dieser Signale, d.h. der (positive) Abstand, den die Signale längs der vertikalen Achse von dem zentralen Gleichanteil-Signal aufweisen, durch die Modulationsperiode des Interferenzmusters festgelegt. Je größer diese Ortsfrequenz ist, desto kleiner ist die Modulationsperiode des Interferenzmusters I, d.h. desto kleiner ist der Abstand benachbarter Interferenzstreifen in 7. Die Ausrichtung der beiden die Bildmodulation repräsentierenden Ortsfrequenzsignale in 8 korrespondiert mit der Richtung der Bildmodulation in 7. So erkennt man in 7, dass die horizontal verlaufenden Interferenzstreifen in vertikaler Richtung aufeinanderfolgen.
Aufgrund der durch die Lichtblattgeometrie vorgegebenen Charakteristik des Interferenzmusters I ist a priori bekannt, an welcher Stelle, d.h. bei welcher Ortsfrequenz das Ortsspektrum nach 8 auszuwerten ist, um die Bildmodulation quantitativ zu erfassen. In dem vorliegenden Beispiel ist das in 8 dargestellte Ortsspektrum gerade an den Stellen auszuwerten, an denen sich die beiden Signale oberhalb bzw. unterhalb des zentralen Gleichanteilsignals zu finden sind (bzw. nur das obere Signal mit positiver Ortsfrequenz). Dieses Signal repräsentiert die Amplitude der Bildmodulation und wird deshalb im Weiteren als Optimierungsparameter für die Überlappjustage genutzt.
In Schritt S5 wird der motorisierte Einstellspiegel 110 unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 um einen vorbestimmten Stellwert verstellt, wodurch die beiden einander überlagerten Lichtblätter 58, 60 gemeinsam längs der optischen Achse O' der Abbildungsoptik 14 verschoben werden. Anschließend kehrt der Steuerablauf zurück zu Schritt S3.
Die Schritte S3 bis S5 werden beispielsweise unter Anwendung eines linearen, d.h. eindimensionalen Suchalgorithmus (gegebenenfalls unter Heranziehung eines geeigneten Abbruchkriteriums) solange wiederholt, bis der Optimierungsparameter, der durch das in Schritt S4 erfasste, die Amplitude der Bildmodulation repräsentierende Ortfrequenzsignal gegeben ist, maximiert ist.
4 zeigt rein beispielhaft, wie sich die Amplitude der Bildmodulation in Abhängigkeit eines Versatzes ändert, der zwischen dem beleuchteten Zielbereich E und dem Schärfenbereich F der Abbildungsoptik längs deren optischer Achse O' auftritt. Ist dieser Versatz gleich Null, so ist die Amplitude der Bildmodulation maximal und die Überlappjustage abgeschlossen.
In Schritt S6 wird schließlich der Kompensator 22 durch die Steuereinheit 44 so angesteuert, dass er die Teilbündel 54, 56 und damit die Lichtblätter 58, 60 in Polarisationszustände überführt, in denen die Lichtblätter 58, 60 nicht miteinander interferieren. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Lichtblätter 58, 60 in diesen Polarisationszuständen linear orthogonal zueinander polarisiert. Durch diese Polarisationseinstellung wird das Interferenzmuster in dem Zielbereich E zum Verschwinden gebracht. Dementsprechend wird in dem von der Kamera 42 aufgenommenen Bild des Zielbereichs E die Bildmodulation beseitigt, wie in 9 veranschaulicht ist. Dabei kann die Beseitigung der Bildmodulation ebenfalls in der Weise erfolgen, dass die Amplitude der Bildmodulation in einem den Schritten S3 bis S5 entsprechenden eindimensionalen Suchverfahren als Optimierungsparameter genutzt wird, selbstverständlich mit dem Unterschied, dass die Steuereinheit 44 in diesem Fall nicht den Einstellspiegel 26, sondern den Kompensator 22 ansteuert und die Amplitude der Bildmodulation nicht zu maximieren, sondern zu minimieren ist. Das in dieser Weise von der Bildmodulation befreite Bild des Zielbereichs E kann dann zur eigentlichen Bildgebung herangezogen werden.
Die Erfindung ist nicht auf das vorstehend erläuterte Ausführungsbeispiel beschränkt. Es ist beispielsweise möglich, die Überlappjustage in anderer Weise als in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel vorzunehmen, in dem die beiden Lichtblätter 58, 60 längs der optischen Achse O' der Abbildungsoptik 14 verschoben werden. So ist es z.B. ebenso möglich, den Schärfebereich F der Abbildungsoptik 14 zum Zwecke der Überlappjustage zu verschieben. Auch können die Polarisationszustände der Lichtblätter 58, 60 in anderer Weise als in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel beeinflusst werden, sofern gewährleistet ist, dass die beiden Lichtblätter 58, 60 während der Vorjustage in dem Zielbereich E miteinander interferieren. Insbesondere ist es möglich, dass der Kompensator 22 nur auf eines der beiden Teilbündel 54, 56 einwirkt. Auch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt, die beiden Lichtblätter 58, 60 wie in dem vorbeschriebenen Ausführungsbeispiel von derselben Seite auf den Zielbereich E zu richten. So ist es z.B. auch möglich, die beiden Lichtblätter 58, 60 mittels geeigneter Umlenkelemente von verschiedenen Seiten in den Zielbereich zu fokussieren. Solche Umlenkelemente können z.B. durch sogenannte Spiegelkappen realisiert werden, die an dem probenzugewandten Beleuchtungsobjektiv 34 angebracht sind.
Das Lichtmikroskop kann auch als Schiefebenenmikroskop oben beschriebener Art ausgeführt sein, das ein einziges probenzugewandtes Objektiv für die Beleuchtung und die Detektion aufweist.
Bezugszeichenliste

10: Lichtblattmikroskop
12: Beleuchtungseinheit
14: Abbildungsoptik
16: Lichtquelle
18: Beleuchtungsoptik
20: Wollaston-Prisma / erstes Polarisationselement
22: motorisierter Kompensator / zweites Polarisationselement
24: Zylinderlinse
26: motorisierter Einstellspiegel
28: Okularlinse
30: Umlenkspiegel
32: Tubuslinse
34: Beleuchtungsobjektiv
36: Objektivpupille
38: Abbildungsobjektiv
40: Tubuslinse
42: Kamera
44: Steuereinheit
46: Steuerleitung
48: Steuerleitung
50: Steuerleitung
52: Beleuchtungslichtbündel
54: Teilbündel
56: Teilbündel
58: Lichtblatt
60: Lichtblatt
62: Detektionsstrahlenbüschel
O: optische Achse der Beleuchtungseinheit
O': optische Achse der Abbildungsoptik
E: Zielbereich
F: Schärfebereich
α: Winkel
β: Winkel
I: Interferenzmuster

Claims

Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops (10), bei dem die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern (58, 60) beleuchtet wird, die einander in einem Zielbereich (E) der Probe koplanar überlagert sind, mittels einer Abbildungsoptik (14) des Lichtblattmikroskops (10) ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) erzeugt wird, und mit den beiden Lichtblättern (58, 60) in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (I) entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildmodulation ausgewertet wird, und der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) justiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildmodulation ausgewertet wird, indem deren Amplitude bestimmt wird, und der beleuchtete Zielbereich (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) derart justiert wird, dass die Amplitude maximiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Charakteristik des Interferenzmusters (I) vorgegeben und die Bildmodulation an Hand dieser vorgegebenen Charakteristik ausgewertet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Interferenzmuster (I) in Form eines Streifenmusters erzeugt wird, dessen Interferenzstreifen parallel zu einer Winkelhalbierenden eines Winkels verlaufen, den die Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter (58, 60) miteinander einschließen, wobei das Streifenmuster durch eine Modulationsperiode gemäß folgender Beziehung charakterisiert ist: $f = λ sin (α / 2)$
worin f die Modulationsperiode, λ die Wellenlänge der Lichtblätter, und α den genannten Winkel bezeichnet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildmodulation ausgewertet wird, indem das Bild einer Fourier-Analyse unterzogen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Justieren des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) die beiden einander koplanar überlagerten Lichtblätter (58,60) gemeinsam längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) verschoben werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Lichtblätter (58, 60) vor der Justage des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfenbereich (F) der Abbildungsoptik (14) in interferenzfähige Polarisationszustände überführt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Lichtblätter (58) vor der Justage des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfenbereich (F) der Abbildungsoptik (14) nicht-orthogonal zueinander linear polarisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Lichtblätter (58, 60) nach der Justage des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) in nicht-interferenzfähige Polarisationszustände gebracht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Vorjustage, in der der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängigkeit der Helligkeit des Bildes relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) eingestellt wird.
Lichtblattmikroskop (10), umfassend: eine Beleuchtungseinheit (12), die ausgebildet ist, eine Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern (58, 60) zu beleuchten, die einander in einem Zielbereich (E) der Probe koplanar überlagert sind, eine Abbildungsoptik (14), die ausgebildet ist, ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) zu erzeugen, und eine Steuereinheit (44),die ausgebildet ist, die Beleuchtungseinheit (12) derart zu steuern, dass mit den beiden Lichtblättern (58, 60) in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (E) entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (44) ausgebildet ist, die Bildmodulation auszuwerten, und die Steuereinheit (44) ausgebildet ist, die Beleuchtungseinheit (12) und/oder die Abbildungsoptik (14) derart zu steuern, dass der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) justiert wird.
Lichtblattmikroskop (11) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) umfasst: eine Lichtquelle (16), die ausgebildet ist, ein Beleuchtungslichtbündel (52) zu erzeugen, ein erstes Polarisationselement (20), das ausgebildet ist, das Beleuchtungslichtbündel (52) in zwei verschieden polarisierte Teilbündel (54, 56) aufzuspalten, und eine Beleuchtungsoptik (14), die ausgebildet ist, aus den beiden Teilbündeln (54, 56) die beiden den Zielbereich (E) beleuchtenden Lichtblätter (58, 60) zu erzeugen.
Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) ein durch die Steuereinheit (44) steuerbares Ablenkelement (26) umfasst, durch das die beiden einander koplanar überlagerten Lichtblätter (58, 60) gemeinsam längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) verschiebbar sind.
Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) ein durch die Steuereinheit (44) steuerbares zweites Polarisationselement (22) umfasst, das ausgebildet ist, die beiden Lichtblätter (58, 60) wahlweise in interferenzfähige Polarisationszustände und nicht-interferenzfähige Polarisationszustände zu überführen.
Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polarisationselement (22) eine Verzögerungsplatte ist.