WO2019149666A1 - Verfahren zum abbilden einer probe mittels eines lichtblattmikroskops - Google Patents

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WO2019149666A1
WO2019149666A1 PCT/EP2019/052036 EP2019052036W WO2019149666A1 WO 2019149666 A1 WO2019149666 A1 WO 2019149666A1 EP 2019052036 W EP2019052036 W EP 2019052036W WO 2019149666 A1 WO2019149666 A1 WO 2019149666A1
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light
target area
image
illumination
imaging optics
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PCT/EP2019/052036
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Theo Larrieu
Christian Schumann
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a method for imaging a specimen by means of a light-beam microscope, in which the specimen is illuminated from two different illumination directions with two light sheets which have different polarization states and are coplanarly superimposed on one another in a target region of the specimen, and by means of an imaging optics of the light sheet microscope, an image of the illuminated target area is generated. Furthermore, the invention relates to a correspondingly working light-sheet microscope.
  • a target is illuminated with a thin light sheet via a lighting optic and the target area illuminated in this way is imaged by means of imaging optics whose optical axis is perpendicular to the optical axis of the illumination optics.
  • imaging optics whose optical axis is perpendicular to the optical axis of the illumination optics.
  • This type of light sheet illumination is achieved in that an illumination light beam passes through a Wollaston prism, which splits the illumination light beam into two differently linearly polarized sub-beams, which are deflected away from the optical axis of the illumination beam path and thus from different illumination directions in the Lighting level, ie reach the target area of the sample. If shading of the illumination light now occurs in one of the two illumination directions as a result of a scattering center or an absorber, the other illumination direction, which is unimpaired by the scattering center or the absorber, still ensures adequate illumination of the target area.
  • overlap adjustment In order to ensure the sharpest possible imaging in a light-beam microscope, there is a precise spatial overlap between the illumination plane, ie the target area defined by the light-sheet thickness, which defines the sample volume excited to emit fluorescence radiation, and the focal plane, ie Depth of field specified focus range of the imaging optics required.
  • the fine adjustment required for this purpose referred to hereinafter as overlap adjustment, is used to produce the spatial overlay between the illuminated target area and the focus area of the imaging optics, usually by means of a visual assessment, eg using a Reference preparation containing small fluorescent particles.
  • the microscopically recorded sample image itself visually assessed to make the overlap adjustment.
  • such a procedure only allows a comparatively rough overlap jus- tage.
  • a comparatively complicated adjustment method provides for introducing into the illumination beam path a mirror which deflects the light sheet to a reference position of the detector arranged in the image plane of the imaging beam path, as soon as the adjustment has taken place.
  • the object of the invention is to provide a method for imaging a sample by means of a light-sheet microscope and a light-sheet microscope itself, which allow a precise and automated adjustment of the spatial overlap between the illuminated target area of the sample and the focus range of the imaging optics.
  • the invention provides a method for imaging a sample by means of a light microscope, in which the sample is illuminated from two different directions of illumination with two leaves that have different polarization states and are coplanarly superimposed on each other in a target area of the sample, and an image of the illuminated target area is generated by means of an imaging optics of the light-sheet microscope.
  • an interference pattern is generated in the illuminated target area, whereby the image of the target area is imprinted with an image modulation corresponding to the interference pattern.
  • the image modulation is evaluated and the illuminated target area is adjusted as a function of the evaluated image modulation relative to the focus range of the imaging optics.
  • the invention provides for an automatic adjustment of the illuminated target area relative to the focus area of the imaging optics, in that the image of the target area captured by the imaging optics is evaluated with regard to image modulation.
  • the latter is imprinted on the image by illuminating the reproduced target area with two interfering light sheets.
  • an interference pattern illuminating the target area is generated, which is reflected in the image of the illuminated target area in the form of the aforementioned image modulation, which is evaluated, for example, by a control unit provided for this in the light-sheet microscope and used for automatic overlap adjustment.
  • the adjustment is completed, for example, when the imprinted image of the illuminated target area image modulation is maximum.
  • the modulation present in the picture is strong It depends on how precisely the target area acted upon by the light sheet illumination and the focal range of the imaging optics are spatially superimposed on one another.
  • the image modulation is maximal when the illumination plane jointly defined by the two light sheets coincides with the focal plane of the imaging optics.
  • the light sheets are to be generated so that they have sufficient time for an interference time and spatial coherence to each other.
  • it must be ensured in particular that the two light sheets have polarization states during the adjustment which make it possible at all to interfere with the light sheets in the target area. If, for example, one assumes that the light sheets are differently linearly polarized from the outset, the light sheets in the target area then interfere with one another when their polarization directions are non-orthogonal to one another. If this is ensured, no polarization means is required, which is specially designed to ensure its ability to interfere in the target area by influencing the polarization states of the two light sheets.
  • such a polarization means provided specifically for the production of the ability to interfere with the light sheets can advantageously be used to produce a particularly pronounced interference pattern by influencing the polarization states in the target area accordingly.
  • the polarizing agent can be used to linearly parallelize the two light sheets in parallel, thereby maximizing the interference of the two light sheets.
  • Such a polarization means can be realized, for example, by a birefringent crystal placed in a suitable position in the illumination beam path or a polarizer of a different kind, for example a retardation plate.
  • the influencing of the polarization states of the light sheets can be effected by polarization-dependent properties of the illumination optics, for example by using polarization-dependent phases of interference layers or means for stress birefringence.
  • electro-optical or liquid crystal-based agent can be used.
  • the image modulation is evaluated by determining its amplitude.
  • the illuminated target area is then adjusted relative to the focus area of the imaging optics such that the amplitude of the image modulation is maximized.
  • the amplitude of the image modulation represents an easily detectable optimization parameter, on the basis of which an automatic overlap adjustment can be carried out in the light-sheet microscope.
  • a characteristic of the interference pattern is specified and the image modulation is evaluated on the basis of this predetermined characteristic.
  • the aforementioned characteristic is a characteristic of the interference pattern, which can be derived, for example, from the selected geometry of the light sheet illumination and is thus known a priori. This known property of the interference pattern can then be used in a simple manner for evaluating the image modulation.
  • f denotes the modulation period
  • l the wavelength of the light sheets and a the aforementioned angle which the illumination directions enclose with one another.
  • the modulation period f represents a previously known characteristic of the interference pattern, which results from the predetermined wavelength l of the light sheets as well as the likewise predetermined angle a between the two illumination directions of the two light sheets according to the above relationship.
  • the alignment of the interference pattern from the geometry of the light sheet illumination, ie the illumination directions of the two light sheets is also known. Due to the knowledge of the modulation period and the orientation of the interference pattern, the amplitude of the image modulation can now be determined simply and reliably, for example by means of a Fourier analysis of the image.
  • the narrowly localized modulation period of the interference fringes is convoluted with the spatial spectrum of the sample representing the a priori unknown structure of the sample.
  • the captured image of the target area is represented by positive real data
  • the sum of this data which is the DC component of the Fourier spectrum, is always positive and real, so that it is the a priori knowledge of the modulation period f of the interference pattern and its alignment allows to determine the amplitude of the image modulation reliably even with a high-frequency spatial spectrum of the sample.
  • the interference fringes of the interference pattern for not too large angle a between the illumination directions of the two light sheets on the imaging optics of the light sheet microscope can be detected easily and reliably in the form of a modulation of the recorded image.
  • the amplitude of the image modulation imposed on the image by the interference fringes can thus be used as an optimization parameter or quality criterion for the coplanarity between the illumination plane and the focal plane of the imaging optics. Since the amplitude of the image modulation is the only parameter to be optimized, the parameter space for the coplanarity adjustment is one-dimensional. Thus, simple linear search algorithms can be used to maximize the amplitude of the image modulation.
  • the two coplanar superimposed light sheets are moved together along the optical axis of the imaging optics.
  • This can be done, for example, via a deflection element arranged in the illumination beam path, which is activated as a function of the evaluated image modulation.
  • a simultaneous displacement of both the light sheets and the focus range of the imaging optics is possible.
  • the two light sheets are converted into interference-capable polarization states relative to the focus range of the imaging optics prior to the adjustment of the illuminated target area.
  • the aforementioned polarization states are chosen so that the two light sheets are polarized in the target area linear, non-orthogonal, in particular parallel to each other. This ensures that a pronounced interference pattern is formed in the target area, by means of which a corresponding strong image modulation is generated in the recorded image.
  • the two light sheets are brought into non-interference-capable polarization states after the adjustment of the illuminated target area relative to the focus area of the imaging optics. This avoids the actual imaging disturbing modulation of the microscope image.
  • This step can be automated using the Fourier analysis of the image.
  • a pre-adjustment is provided in which the illuminated target area is adjusted as a function of the brightness of the image relative to the focus area of the imaging optics.
  • Such a pre-adjustment can also be carried out in particular in the case of high-frequency local spectrum of the sample as a function of the energy content of the detected total spectrum, which results from the convolution of the location spectrum and the illumination spectrum.
  • the light-sheet microscope according to the invention comprises a lighting unit which is designed to illuminate a sample from two different illumination directions with two light sheets which have different polarization states and are coplanarly superimposed on one another in a target area of the sample Imaging optics configured to generate an image of the illuminated target area, and a control unit.
  • the control unit is designed to control the lighting unit such that an interference pattern is generated with the two light sheets in the illuminated target area, whereby an image modulation corresponding to the interference pattern is imprinted onto the image of the target area.
  • the control unit is further configured to evaluate the image modulation and to control the illumination unit and / or the imaging optics such that the illuminated target area is adjusted in dependence on the evaluated image modulation relative to the focus range of the imaging optics.
  • the illumination unit comprises a light source, which is designed to generate an illumination light beam, a first polarization element, which is designed to split the illumination light beam into two differently polarized sub-beams, and an illumination optical system, which is formed from the two sub-beams create two light sheets illuminating the target area.
  • the first polarization element is designed, for example, in such a way that it deflects the two sub-beams away from the optical axis of the illumination unit at preferably identical angles.
  • Sample generates two sheets of light that propagate at an angle ⁇ ß / 2y to the optical axis of the illumination unit within the sample.
  • the first polarization element is formed so that the two sub-beams are linearly polarized, their polarization directions are orthogonal to each other. These orthogonal polarization directions have the advantage in actual imaging that image modulation due to interference between the two light sheets is excluded.
  • illumination with these two polarization directions reduces photoselection effects in the excitation of fluorophores.
  • the first polarization element is a Wollaston prism.
  • a prism consists for example of two rectangular calcite prisms, which are cemented to one another at their base surfaces. The optical axes of the two prisms are orthogonal to each other.
  • the illumination unit preferably comprises a deflection element which can be controlled via the control unit, by means of which the two coplanarly superimposed light sheets can be displaced together along the optical axis of the imaging optics.
  • the deflection element is, for example, a mirror which is driven via a motor controlled by the control unit in order to move the two coplanar light sheets along the optical axis of the imaging optics.
  • the illumination unit comprises a second polarization element which can be controlled via the control unit and which is designed to selectively convert the two light sheets into polarization states capable of interference and polarization states which can not be interfered with.
  • this embodiment enables both a precise overlap adjustment and a high-resolution imaging, which in particular is not disturbed by image modulations as a result of interference effects.
  • the light-beam microscope according to the invention has two separate, the sample-facing lenses, one of which is assigned to the illumination unit and the other of the imaging optics and their optical axes perpendicular to each other.
  • the objective assigned to the illumination unit preferably directs the two light sheets from the same side onto the target area of the sample.
  • the light-sheet microscope can also be designed as a so-called oblique plane microscope, which has a single sample-facing objective both for the illumination and the detection.
  • the imaging optics of the light-sheet microscope is formed in this embodiment as transport optics, which images the light sheets in the target area of the sample and at the same time generates an image of the illuminated target area.
  • the transport optics preferably have a scanning device which is designed to carry out an axial and / or lateral rastering process for volume imaging by moving the light sheets through the sample accordingly.
  • Figure 1 shows an embodiment of a light sheet microscope according to the invention in a schematic sectional view
  • FIG. 2 shows a further schematic sectional view of the light-pancake microscope according to FIG. 1;
  • FIG. 3 is a flow chart which illustrates the method for the overlap adjustment according to the invention on the basis of an exemplary embodiment;
  • FIG. 4 shows a diagram which shows the amplitude of an image modulation as a function of the offset between the illuminated target area and the focus area of the imaging optics of the light-leaf microcircuit;
  • FIG. 5 shows an interference pattern generated in the target area
  • FIG. 6 shows the spatial spectrum of the interference pattern according to FIG. 5 obtained by a Fourier transformation
  • FIG. 7 shows an image of the target area which, for the purpose of overlap adjustment, has an image modulation corresponding to the interference pattern
  • FIG. 8 shows the spatial spectrum of the image according to FIG. 7 obtained by a Fourier transformation
  • FIGS. 1 and 2 show sectional views of a light-sheet microscope 10.
  • the light-sheet microscope 10 comprises a lighting unit 12 and a imaging optical system 14.
  • the lighting unit 12 and the imaging optical unit 14 are aligned in the present embodiment so that their 0 and 0 'in the region of a sample not explicitly shown in Figures 1 and 2 are perpendicular to each other.
  • FIGS. 1 and 2 reference is made in each case to a right-angled xyz coordinate system whose z-axis coincides with the optical axis 0 of the illumination unit 12. Accordingly, the light-sheet microscope 10 is shown in FIG. 1 in an xz-section and in FIG. 2 in a yz-section.
  • the illustrations according to FIGS. 1 and 2 are simplified and purely schematic. Thus, only those components are shown which are necessary for the understanding of the invention.
  • the illumination unit 12 has a light source 16 and an illumination optics generally designated 18 in FIGS. 1 and 2.
  • the illumination optics 18 comprise a first polarization element in the form of a Wollaston prism 20, a motorized second polarization element in the form of a compensator 22, an anamorphic focusing system in the form of a cylindrical lens 24, a motorized adjustment mirror 26, an eyepiece lens 28, a deflection mirror 30 Tube lens 32 and an illumination objective 34 with an objective pupil 36.
  • the aforementioned compensator is formed for example of a birefringent crystal, in particular a retardation plate.
  • the imaging optics 14 comprises an imaging objective 38 facing the sample to be imaged, a tube lens 40 and a spatially resolving detector in the form of a camera 42.
  • the light-sheet microscope 10 further includes a control unit 44 which controls the entire microscope operation. More specifically, in the present embodiment, the control unit 44 serves to control the compensator 22, the motorized adjustment mirror 26, and the camera 42 as well as those detailed below explained image evaluations. Correspondingly, the control unit 44 is connected via control lines 46, 48, 50 to the compensator 22, the input mirror 26 or the camera 42.
  • the light source 16 emits a collimated illuminating light beam 52 onto the Wollaston prism 20, which may be formed of, for example, two right-angled prisms, e.g. Calcite prisms cemented together at their base surfaces.
  • the Wollaston prism 20 splits the incident illumination beam 52 into two sub-beams 54, 56 having different polarization states, as shown in FIG.
  • the plane in which the Wollaston prism 20 splits the illumination light beam 52 into the two sub-beams 54, 56 is parallel to the y-axis, ie. in the section of Figure 2 in the plane and in the section of Figure 1 perpendicular to the plane.
  • the two sub-beams 54, 56 pass through the compensator 22, with which the polarization states of the sub-beams 54, 56 can be influenced as required.
  • a servo motor (not shown in FIGS. 1 and 2) is provided in the light-beam microscope 10, which under the control of the control unit 44 acts on the compensator 22 in such a way that the polarization states of the two sub-beams 54, 56 are in the desired manner influenced or left unchanged.
  • the sub-beams 54, 56 pass through the cylindrical lens 24.
  • the latter has the property that it focuses the sub-beams 54, 56 only in a direction parallel to the x-axis direction, while in a direction parallel to the y-axis direction no optical effect the sub-beams 54, 56 has.
  • the cylindrical lens 24 generates in the region of its focal plane from the sub-beams 54, 56 respectively a light-sheet-like illumination light distribution, which is focused in the direction of the x-axis and extended in the direction of the x-axis.
  • FIGS. 1 and 2 are simplified for the sake of clarity. For example, in FIG.
  • the foci of the two partial bundles 54, 56 emerging from the cylindrical lens 24, which correspond to the planes conjugated to the cylindrical lens 24, are arranged on the surface of the motorized adjusting mirror 26. In fact, however, one of these focuses is in the direction of light propagation and the other behind this surface. The same applies to the representation of the foci on the surface of the deflection mirror 30.
  • the light deflections made on the adjustment mirror 26 and the deflection mirror 30 are shown in FIGS. 1 and 2 in the same way, although these light deflections are shown in FIG Are given either only in the xz plane or in the yz plane.
  • the two sub-beams 54, 56 After reflection on the adjustment mirror 26, the two sub-beams 54, 56 pass through the eyepiece lens 28 and are reflected at the deflection mirror 30. After passing through the tube lens 32, the sub-beams 54, 56 reach the entrance pupil 36 of the illumination objective 34, which directs the sub-beams 54, 56 onto the sample in such a way that the sub-beams 54, 56 illuminate the target area E of the sample from two different illumination directions ,
  • the illumination optics 18 of the light-sheet microscope 10 generates, as explained above, two light sheets 58, 60 propagating in different illumination directions, which are superposed coplanarly in the target region E of the sample to be illuminated.
  • the two light sheets 58, 60 in the concrete exemplary embodiment are based on the assumption that the compensator 22 initially still has no influence on the polarization states of the sub-beams 54, 56 lets in the target area E polarized linearly orthogonal to each other.
  • the light beam associated with the sub-beam 54 is p-polarized
  • the light beam associated with the sub-beam 56 is s-polarized.
  • the eyepiece lens 28, the tube lens 32 and the illumination objective 34 form intermediate imaging optics which generate the light sheets that the cylinder lens 24 generates by focusing the sub-beams 54, 56 at the location of the deflecting mirror 26 depicts the target area E of the sample.
  • the two illumination directions, from which the light sheets 58, 60 are directed into the target region E of the sample enclose an angle a with one another.
  • This angle a correlates with an angle .beta.
  • step S1 of the flow diagram according to FIG. 3 an automated pre-adjustment of the light sheet illumination to the focus area F of the imaging optical system 14 is carried out.
  • the pre-adjustment can be based, for example, on the brightness of the image be taken by the camera 42 recorded image.
  • the adjustment mirror 26 is brought under the control of the control unit 44 in a position in which the light sheet illumination ensures maximum image brightness.
  • the polarization states of the sub-beams 54, 56 and thus the two light sheets 58, 60 under the control of the control unit 44 by the compensator 22 are set in step S2 so that a maximum interference of the two light sheets 58, 60 in the target area E.
  • the compensator 22 for this purpose, the polarization states of the two sub-beams 54, 56 so that they are linearly polarized parallel to each other. In this way, an interference pattern is generated in the target area E by interference between the two light sheets 58, 60, as illustrated purely by way of example in FIG.
  • FIG. 5 shows an interference pattern I under the assumption of a completely homogeneous sample.
  • the interference pattern I according to FIG. 5 has a plurality of interference fringes which extend in one direction with reference to FIG. 2, which extend in parallel to the angle bisector of the angle a.
  • the angle a is enclosed by the two illumination directions in which the two light sheets 58, 60 propagate.
  • the aforementioned bisector of the angle a therefore coincides with the optical axis O of the illumination optical system 18.
  • the interference fringes extend in the direction of the optical axis O of the illumination optics 18.
  • step S3 by the camera 42, an image of the two light sheets 58, 60th illuminated target area E of the sample recorded. Since the two light sheets generate the interference pattern I shown in FIG. 5, the image recorded by the camera 42 is impressed with an image modulation corresponding to the interference pattern. This is illustrated in FIG. 7, which shows an image of the target area recorded by the camera 42, in which the image modulation corresponding to the interference pattern I can be clearly recognized in the form of horizontal stripes.
  • step S4 the control unit 44 evaluates the image modulation included in the captured image.
  • the control unit 44 uses the a priori knowledge of the characteristic of the interference pattern I as a result of the predetermined light sheet geometry.
  • this characteristic is given by the modulation period, ie the distance between adjacent interference fringes, as well as the orientation of the fringe pattern according to FIG.
  • the orientation of the interference pattern also results directly from the given light sheet geometry.
  • the interference fringes run parallel to the optical axis O of the illumination optical system 18 in the present exemplary embodiment.
  • the characteristic of the interference pattern according to FIG. 5 is reflected in its location spectrum generated by a Fourier analysis, which is shown in FIG.
  • the horizontal spatial frequencies are indicated along the horizontal axis and the vertical local frequencies are indicated along the vertical axis.
  • the units are given by the properties of the discrete Fourier transform, and the signal intensity is represented as gray levels.
  • the local spectrum according to FIG. 6 has two signals at spatial frequencies which result from the modulation period of the interference pattern shown in FIG. More precisely, the spatial frequencies in FIG. 6 in accordance with the Fourier transformation respectively represent the inverse of the modulation period of the interference pattern I.
  • the signal intensity at zero spatial frequency which represents the DC component of the local spectrometer, is omitted in FIG since this exceeds the signal intensities shown in FIG. 6 by a multiple.
  • the DC component signal with the spatial frequency zero lies with respect to the horizontal axis between the two signals shown in FIG. It should be noted that the spatial frequencies in FIG. 6 are given in arbitrary units.
  • step S4 therefore, the image represented in FIG. 7, which has the image modulation corresponding to the interference pattern I according to FIG. 5, is subjected to a Fourier transformation and thus generates its spatial spectrum, which is shown in FIG.
  • the spatial spectrum according to FIG. 8 shows along the vertical axis two spatial frequency signals which are arranged at equal distances on both sides of a dominant central signal which, at the spatial frequency zero, represents the DC component of the local spectrum.
  • the two aforementioned signals reflect the image modulation caused by the interference pattern I.
  • the spatial frequency of these signals ie the (positive) distance
  • the the signals along the vertical axis of the central DC signal have, determined by the modulation period of the interference pattern.
  • the orientation of the two spatial frequency signals representing the image modulation in FIG. 8 corresponds to the direction of the image modula In FIG. 7, it can be seen that the horizontally extending interference strips follow one another in the vertical direction.
  • the spatial spectrum according to FIG. 8 is to be evaluated in order to detect the image modulation quantitatively.
  • the local spectrum shown in FIG. 8 is to be evaluated precisely at those points at which the signals above or below the central DC component signal are to be found (or only the upper signal with positive spatial frequency).
  • This signal represents the amplitude of the image modulation and is therefore used in the following as an optimization parameter for the overlap adjustment.
  • step S5 the motorized adjustment mirror 110 is adjusted under the control of the control unit 44 by a predetermined manipulated value, whereby the overlapping of the light sheets 58, 60 together along the optical axis 0 'of the imaging optics 14 are moved. Subsequently, the control flow returns to step S3.
  • steps S3 to S5 are performed, for example, using a linear, ie one-dimensional search algorithm (optionally with a Fieranziehung one of an appropriate termination criterion) until the optimization parameter given by the local frequency signal detected in step S4, which represents the amplitude of the image modulation, is maximized.
  • FIG. 4 shows purely by way of example how the amplitude of the image modulation changes as a function of an offset which occurs between the illuminated target region E and the sharpening region F of the imaging optical system along its optical axis 0 '. If this offset is equal to zero, the amplitude of the image modulation is maximum and the overlap adjustment is completed.
  • step S6 the compensator 22 is actuated by the control unit 44 in such a way that it transfers the sub-beams 54, 56 and thus the light sheets 58, 60 into polarization states in which the light sheets 58, 60 do not interfere with one another.
  • the light sheets 58, 60 are polarized in these polarization states linearly orthogonal to each other. This polarization adjustment causes the interference pattern in the target area E to disappear. Accordingly, in the image of the target area E taken by the camera 42, the image modulation is eliminated, as illustrated in FIG.
  • the elimination of the image modulation can likewise take place in such a way that the amplitude of the image modulation in a one-dimensional search method corresponding to steps S3 to S5 is used as the optimization parameter, with the difference that the control unit 44 in this case does not use the adjustment mirror 26 but drives the compensator 22 and does not maximize the amplitude of the image modulation, but is to be minimized.
  • the image of the target area E freed from image modulation in this way can then be used for the actual imaging.
  • the invention is not limited to the embodiment described above. It is possible, for example, to perform the overlap adjustment in a different manner than in the exemplary embodiment described, in which the two light sheets 58, 60 are displaced along the optical axis O 'of the imaging optical unit 14.
  • the polarization states of the light sheets 58, 60 can also be influenced in a different way than in the described exemplary embodiment, provided that it is ensured that the two light sheets 58, 60 interfere with one another during the pre-adjustment in the target region E.
  • the compensator 22 acts only on one of the two sub-beams 54, 56.
  • the invention is not limited to direct the two light sheets 58, 60 as in the above-described embodiment from the same side to the target area E.
  • the light microscope can also be embodied as an oblique plane microscope of the type described above, which has a single sample-facing objective for the illumination and the detection.

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Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops (10). Dabei wird die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern (58, 60) beleuchtet, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in einem Zielbereich (E) der Probe koplanar überlagert sind. Mittels einer Abbildungsoptik (14) des Lichtblattmikroskops (10) wird ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) erzeugt. Mit den beiden Lichtblättern (58, 60) wird in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (I) entsprechende Bildmodulation aufgeprägt wird. Es wird die Bildmodulation ausgewertet. In Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation wird der beleuchtete Zielebereich (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) justiert.

Description

Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Licht- blattmikroskops, bei dem die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrich- tungen mit zwei Lichtblättern beleuchtet wird, die verschiedene Polarisationszu- stände haben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar überlagert sind, und mittels einer Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops ein Bild des be- leuchteten Zielbereichs erzeugt wird. Ferner betrifft die Erfindung ein entspre- chend arbeitendes Lichtblattmikroskop.
In der sogenannten Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskopie wird ein Ziel be reich einer Probe über eine Beleuchtungsoptik mit einem dünnen Lichtblatt be- leuchtet und der so beleuchtete Zielbereich mittels einer Abbildungsoptik, deren optische Achse senkrecht zur optischen Achse der Beleuchtungsoptik liegt, abge- bildet. Indem der idealerweise mit dem Schärfebereich der Abbildungsoptik zu- sammenfallende, mit dem Lichtblatt beleuchtete Zielbereich sukzessive längs der optischen Achse der Abbildungsoptik durch die Probe verschoben wird, ist eine dreidimensionale Bildgebung möglich. Ein Vorteil dieser in der Weitfeld-Fluores- zenzmikroskopie eingesetzten Methode ist insbesondere auch eine besonders geringe Lichtbelastung der Probe.
Problematisch ist jedoch, dass das Beleuchtungslicht senkrecht zur optischen Achse der Abbildungsoptik propagiert. So kann es durch Streuzentren oder Ab- sorber innerhalb der Probe zu einer Streuung bzw. einer Absorption des Beleuch- tungslichtes kommen, was sich im resultierenden Bild in Form von Streifenarte- fakten in Propagationsrichtung des Beleuchtungslichts bemerkbar macht. Zur Verringerung solcher Artefakte wird in dem Patent DE 10 2016 108 384 B3 vorgeschlagen, den Zielbereich der Probe nicht nur mit einem, sondern mit zwei Lichtblättern zu beleuchten, die von derselben Seite, aber aus verschiedenen Be- leuchtungsrichtungen auf den Zielbereich gerichtet werden und dort einander koplanar, d.h. in einer gemeinsamen Beleuchtungsebene überlagert sind. Diese Art der Lichtblattbeleuchtung wird dadurch erreicht, dass ein Beleuchtungslicht- bündel durch ein Wollaston-Prisma tritt, welches das Beleuchtungslichtbündel in zwei unterschiedlich linear polarisierte Teilbündel aufspaltet, die von der opti schen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs weggelenkt werden und so aus ver- schiedenen Beleuchtungsrichtungen in die Beleuchtungsebene, d.h. in den Ziel bereich der Probe gelangen. Tritt nun in einer der beiden Beleuchtungsrichtun- gen infolge eines Streuzentrums oder eines Absorbers eine Abschattung des Be- leuchtungslichtes auf, so ist durch die andere, durch das Streuzentrum bzw. den Absorber unbeeinträchtigte Beleuchtungsrichtung immer noch eine ausrei- chende Lichtblattbeleuchtung des Zielbereichs gewährleistet.
Um eine möglichst scharfe Bildgebung in einem Lichtblattmikroskop zu gewähr- leisten, ist ein präziser räumlicher Überlapp zwischen der Beleuchtungsebene, d.h. dem durch die Lichtblattdicke festgelegten Zielbereich, der das zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregte Probenvolumen definiert, und der Fokus- ebene, d.h. dem durch die Schärfentiefe festgelegten Schärfebereich der Abbil- dungsoptik erforderlich. Im Stand der Technik erfolgt die hierfür erforderliche, im Weiteren als Überlappjustage bezeichnete Feineinstellung, mit der die räum- liche Überlagerung zwischen dem beleuchteten Zielbereich und dem Schärfebe- reich der Abbildungsoptik hergestellt wird, meist im Wege einer visuellen Beur- teilung, z.B. unter Verwendung eines Referenzpräparats, das kleine Fluoreszenz- teilchen aufweist. Auch kann das mikroskopisch aufgenommene Probenbild selbst visuell beurteilt werden, um die Überlappjustage vorzunehmen. Ein sol- ches Vorgehen ermöglicht jedoch nur eine vergleichsweise grobe Überlappjus- tage. Insbesondere spiegelt das Einbringen eines Referenzpräparats nicht die ei- gentliche Abbildungssituation wider, in der beispielsweise probenbedingte Aber- rationen infolge einer Brechungsindexfehlanpassung auftreten. Ein vergleichs- weise aufwendiges Justageverfahren sieht demgegenüber vor, in den Beleuch- tungsstrahlengang einen Spiegel einzubringen, der das Lichtblatt auf eine Refe- renzposition des in der Bildebene des Abbildungsstrahlengangs angeordneten Detektors ablenkt, sobald die Justage erfolgt ist.
Allen vorgenannten Verfahren ist gemein, dass sie keine automatisierte Über- lappjustage ermöglichen. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass eine Justage auf Ba- sis einer automatisierten Auswertung der Schärfe des Probenbildes mit der Schwierigkeit verbunden ist, dass das Ortsspektrum der abzubildenden Probe, das sich aus der Fourier-Transformation des Probenbildes ergibt, in der Regel un- bekannt ist. Dies bedeutet insbesondere, dass a priori keine Kenntnis darüber vorhanden ist, ob das Ortsspektrum der Probe überhaupt hohe Ortsfrequenzen aufweist, die auf feine und damit justagetaugliche Probenstrukturen zurückge- hen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops sowie ein Lichtblattmikroskop selbst anzugeben, die eine präzise und automatisierte Justage der räumlichen Überlagerung zwischen dem beleuchteten Zielbereich der Probe und dem Schärfebereich der Abbil- dungsoptik ermöglichen. Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen An- sprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen an- gegeben.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Licht blattmikroskops vor, bei dem die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungs- richtungen mit zwei Lichtblättern beleuchtet wird, die verschiedene Polarisati onszustände haben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar über- lagert sind, und mittels einer Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops ein Bild des beleuchteten Zielbereichs erzeugt wird. Mit den beiden Lichtblättern wird in dem beleuchteten Zielbereich ein Interferenzmuster erzeugt, wodurch dem Bild des Zielbereichs eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation auf- geprägt wird. Die Bildmodulation wird ausgewertet, und der beleuchtete Ziel be reich wird in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik justiert.
Die Erfindung sieht eine selbsttätige Justage des beleuchteten Zielbereichs rela- tiv zum Schärfebereich der Abbildungsoptik vor, indem das durch die Abbil- dungsoptik aufgenommene Bild des Zielbereichs hinsichtlich einer Bildmodula- tion ausgewertet wird. Letztere wird dem Bild dadurch aufgeprägt, dass der ab- gebildete Zielbereich mit zwei interferierenden Lichtblättern beleuchtet wird. Auf diese Weise wird ein den Zielbereich beleuchtendes Interferenzmuster ge- neriert, das sich in dem Bild des beleuchteten Zielbereichs in Form der vorge- nannten Bildmodulation widerspiegelt, die beispielsweise von einer hierfür in dem Lichtblattmikroskop vorgesehenen Steuereinheit ausgewertet und zur selbsttätigen Überlappjustage genutzt wird. Die Justage ist beispielsweise dann abgeschlossen, wenn die dem Bild des beleuchteten Zielbereichs aufgeprägte Bildmodulation maximal ist. So ist die in dem Bild vorhandene Modulation stark davon abhängig, wie präzise der mit der Lichtblattbeleuchtung beaufschlagte Zielbereich und der Schärfebereich der Abbildungsoptik einander räumlich über- lagert sind. Vereinfacht gesagt ist die Bildmodulation dann maximal, wenn die durch die beiden Lichtblätter gemeinsam definierte Beleuchtungsebene mit der Fokusebene der Abbildungsoptik zusammenfällt.
Zum Zwecke der Überlappjustage ist zu gewährleisten, dass die beiden Lichtblät ter in dem beleuchteten Zielbereich miteinander interferieren. Somit sind die Lichtblätter so zu erzeugen, dass sie eine für eine Interferenz ausreichende zeit liche und räumliche Kohärenz zueinander aufweisen. Darüber hinaus ist insbe- sondere sicherzustellen, dass die beiden Lichtblätter während der Justage Pola- risationszustände aufweisen, die eine Interferenz der Lichtblätter in dem Zielbe reich überhaupt ermöglichen. Geht man beispielsweise davon aus, dass die bei den Lichtblätter von vornherein unterschiedlich linear polarisiert sind, so inter- ferieren die Lichtblätter in dem Zielbereich dann miteinander, wenn ihre Polari sationsrichtungen nicht-orthogonal zueinander sind. Sofern dies gewährleistet ist, ist kein Polarisationsmittel erforderlich, das eigens dafür vorgesehen ist, durch Beeinflussung der Polarisationszustände der beiden Lichtblätter deren In- terferenzfähigkeit in dem Zielbereich sicherzustellen. Ein solches eigens für die Herstellung der Interferenzfähigkeit der Lichtblätter vorgesehenes Polarisations- mittel kann jedoch in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, durch eine entspre- chende Beeinflussung der Polarisationszustände in dem Zielbereich ein beson- ders ausgeprägtes Interferenzmuster zu erzeugen. Beispielsweise kann das Pola- risationsmittel dazu genutzt werden, die beiden Lichtblätter parallel linear zu po- larisieren, wodurch die Interferenz der beiden Lichtblätter maximiert wird. Ein solches Polarisationsmittel kann beispielsweise durch einen in dem Beleuch- tungsstrahlengang an geeigneter Stelle eingebrachten doppelbrechenden Kris tall oder einen Polarisator anderer Art, z.B. eine Verzögerungsplatte, realisiert sein. Ebenso kann die Beeinflussung der Polarisationszustände der Lichtblätter durch polarisationsabhängige Eigenschaften der Beleuchtungsoptik bewirkt wer- den, indem beispielsweise polarisationsabhängige Phasen von Interferenzschich- ten oder Mittel zur Spannungsdoppelbrechung genutzt werden. Weiterhin sind elektro-optische oder auf Flüssigkristallbasis arbeitende Mittel nutzbar.
Vorzugsweise wird die Bildmodulation ausgewertet, indem deren Amplitude be- stimmt wird. Der beleuchtete Zielbereich wird dann relativ zu dem Schärfebe- reich der Abbildungsoptik derart justiert, dass die Amplitude der Bildmodulation maximiert wird. Somit stellt die Amplitude der Bildmodulation einen in einfacher Weise erfassbaren Optimierungsparameter dar, auf dessen Grundlage in dem Lichtblattmikroskop eine selbsttätige Überlappjustage vorgenommen werden kann.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird eine Charakteristik des Interferenz- musters vorgegeben und die Bildmodulation anhand dieser vorgegebenen Cha- rakteristik ausgewertet. Die vorgenannte Charakteristik ist eine Eigenschaft des Interferenzmusters, die sich beispielsweise aus der gewählten Geometrie der Lichtblattbeleuchtung ableiten lässt und damit a priori bekannt ist. Diese be- kannte Eigenschaft des Interferenzmusters kann dann in einfacher Weise zur Auswertung der Bildmodulation herangezogen werden.
Beispielsweise wird das Interferenzmuster in Form eines Streifenmusters er- zeugt, dessen Interferenzstreifen parallel zu einer Winkelhalbierenden eines Winkels verlaufen, den die Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter mit- einander einschließen, wobei das Streifenmuster durch eine Modulationsperi- ode gemäß folgender Beziehung charakterisiert ist: f = l sin(ot/2)
Darin bezeichnet f die Modulationsperiode, l die Wellenlänge der Lichtblätter und a den vorgenannten Winkel, den die Beleuchtungsrichtungen miteinander einschließen.
In diesem Beispiel stellt die Modulationsperiode f eine von vornherein bekannte Charakteristik des Interferenzmusters dar, die sich aus der vorgegebenen Wel- lenlänge l der Lichtblätter sowie dem ebenfalls vorgegebenen Winkel a zwischen den beiden Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter gemäß obiger Beziehung ergibt. Neben der Modulationsperiode ist auch die Ausrichtung des Interferenzmusters aus der Geometrie der Lichtblattbeleuchtung, d.h. den Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter bekannt. Aufgrund der Kenntnis der Modulationsperiode und der Ausrichtung des Interferenzmusters lässt sich nunmehr die Amplitude der Bildmodulation beispielsweise im Wege einer Fourier-Analyse des Bildes einfach und zuverlässig bestimmen. In dem durch die Fourier-Analyse erzeugten Frequenzraum ist die eng lokalisierte Modulationsperiode der Interferenzstreifen mit dem Ortsspektrum der Probe gefaltet, das die a priori nicht bekannte Struktur der Probe repräsentiert. Da jedoch das aufgenommene Bild des Zielbereichs durch positive reelle Daten repräsentiert ist, ist die Summe dieser Daten, die den Gleichanteil der Fourier- Spektrums ausmacht, auch stets positiv und reell, so dass es die a priori-Kenntnis der Modulationsperiode f des Interferenzmusters und dessen Ausrichtung erlaubt, die Amplitude der Bildmodulation auch bei einem hochfrequenten Ortsspektrum der Probe zuverlässig zu bestimmen.
In dem vorgenannten Beispiel lassen sich also die Interferenzstreifen des Interferenzmusters für nicht zu große Winkel a zwischen den Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter über die Abbildungsoptik des Lichtblattmikroskops einfach und zuverlässig in Form einer Modulation des aufgenommenen Bildes detektieren. Die Amplitude der dem Bild durch die Interferenzstreifen aufgeprägten Bildmodulation lässt sich somit als Optimierungsparameter bzw. Gütekriterium für die Koplanarität zwischen der Beleuchtungsebene und der Fokusebene der Abbildungsoptik nutzen. Da die Amplitude der Bildmodulation den einzigen zu optimierenden Parameter darstellt, ist der Parameterraum für die Einstellung der Koplanarität eindimensional. Somit können einfache lineare Suchalgorithmen angewandt werden, um die Amplitude der Bildmodulation zu maximieren.
Vorzugsweise werden zum Zwecke der Überlappjustage die beiden koplanar überlagerten Lichtblätter gemeinsam längs der optischen Achse der Abbildungsoptik verschoben. Dies kann beispielsweise über ein in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnetes Ablenkelement erfolgen, das in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation angesteuert wird. Es ist jedoch ebenso möglich, anstelle der Lichtblattbeleuchtung die Abbildungsoptik längs ihrer optischen Achse zu bewegen, um den Schärfebereich in räumliche Koinzi- denz mit dem beleuchteten Zielbereich zu bringen. Auch eine gleichzeitige Verschiebung sowohl der Lichtblätter als auch des Schärfebereichs der Abbildungsoptik ist möglich. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die beiden Lichtblätter vor der Justage des beleuchteten Zielbereichs relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik in interferenzfähige Polarisationszustände überführt. Beispielsweise werden die vorgenannten Polarisationszustände so gewählt, dass die beiden Lichtblätter in dem Zielbereich linear, nicht-orthogonal, insbesondere parallel zueinander polarisiert sind. Dadurch ist gewährleistet, dass sich im Ziel bereich ein stark ausgeprägtes Interferenzmuster ausbildet, durch das in dem aufgenommenen Bild eine entsprechende starke Bildmodulation generiert wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung werden die beiden Lichtblätter nach der Justage des beleuchteten Zielbereichs relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik in nicht-interferenzfähige Polarisationszustände gebracht. Dadurch wird eine die eigentliche Bildgebung störende Modulation des Mikroskopbildes vermieden. Dieser Schritt lässt sich anhand der Fourier-Analyse des Bildes automatisieren.
Vorzugsweise ist eine Vorjustage vorgesehen, in der der beleuchtete Zielbereich in Abhängigkeit der Helligkeit des Bildes relativ zu dem Schärfenbereich der Abbildungsoptik eingestellt wird. Eine solche Vorjustage kann insbesondere bei hochfrequentem Ortsspektrum der Probe auch in Abhängigkeit des Energiegehalts des detektierten Gesamtspektrums, das sich aus der Faltung des Ortsspektrums und des Beleuchtungsspektrums ergibt, vorgenommen werden.
Das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop umfasst eine Beleuchtungseinheit, die ausgebildet ist, eine Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern zu beleuchten, die verschiedene Polarisationszustände ha- ben und einander in einem Zielbereich der Probe koplanar überlagert sind, eine Abbildungsoptik, die ausgebildet ist, ein Bild des beleuchteten Zielbereichs zu er- zeugen, und eine Steuereinheit. Die Steuereinheit ist ausgebildet, die Beleuch- tungseinheit derart zu steuern, dass mit den beiden Lichtblättern in dem be- leuchteten Zielbereich ein Interferenzmuster erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation auf- geprägt wird. Die Steuereinheit ist ferner ausgebildet, die Bildmodulation auszu- werten und die Beleuchtungseinheit und/oder die Abbildungsoptik derart zu steuern, dass der beleuchtete Zielbereich in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation relativ zu dem Schärfebereich der Abbildungsoptik justiert wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Beleuchtungseinheit eine Licht quelle, die ausgebildet ist, ein Beleuchtungslichtbündel zu erzeugen, ein erstes Polarisationselement, das ausgebildet ist, das Beleuchtungslichtbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel aufzuspalten, und eine Beleuchtungsoptik, die ausgebildet ist, aus den beiden Teilbündeln die beiden den Zielbereich be- leuchtenden Lichtblätter zu erzeugen. Das erste Polarisationselement ist bei spielsweise so ausgeführt, dass es die beiden Teilbündel unter vorzugsweise ent- gegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse der Beleuchtungseinheit weglenkt. Bezeichnet man den Winkel, den die beiden Teilbündel miteinander einschließen, mit ß (d.h. die entgegengesetzt gleichen Winkel bezüglich der opti schen Achse mit ± ß/2) und die durch die Abbildungsoptik bewirkte Vergröße- rung mit g, so werden in dieser Ausführungsform in der Probe zwei Lichtblätter generiert, die unter einem Winkel ± ß/2y zur optischen Achse der Beleuchtungs- einheit innerhalb der Probe propagieren. Der Winkel ß > 0, den die beiden Pro- pagationsrichtungen zueinander aufweisen, reduziert die durch Streuung und Absorption verursachte Bildung von Streifenartefakten. Vorzugsweise ist das erste Polarisationselement so ausgebildet, dass die beiden Teilbündel linear polarisiert sind, wobei ihre Polarisationsrichtungen orthogonal zueinander liegen. Diese orthogonalen Polarisationsrichtungen haben in der ei- gentlichen Bildgebung den Vorteil, dass eine Bildmodulation infolge einer Inter- ferenz zwischen den beiden Lichtblättern ausgeschlossen ist. Außerdem werden durch eine Beleuchtung mit diesen beiden Polarisationsrichtungen Photoselekti- onseffekte in der Anregung von Fluorophoren reduziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erste Polarisationselement ein Wollaston-Prisma. Ein solches Prisma besteht beispielsweise aus zwei rechtwink- ligen Calcit-Prismen, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die op- tischen Achsen der beiden Prismen liegen orthogonal zueinander.
Vorzugsweise umfasst die Beleuchtungseinheit ein über die Steuereinheit steu- erbares Ablenkelement, durch das die beiden koplanar überlagerten Lichtblätter gemeinsam längs der optischen Achse der Abbildungsoptik verschiebbar sind. Das Ablenkelement ist beispielsweise ein Spiegel, der über einen durch die Steu- ereinheit angesteuerten Motor angetrieben wird, um die beiden koplanaren Lichtblätter längs der optischen Achse der Abbildungsoptik zu bewegen.
In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst die Beleuchtungseinheit ein über die Steuereinheit steuerbares zweites Polarisationselement, das ausgebil- det ist, die beiden Lichtblätter wahlweise in interferenzfähige Polarisationszu- stände und nicht-interferenzfähige Polarisationszustände zu überführen. Insbe- sondere im Zusammenwirken mit dem vorgenannten ersten Polarisationsele- ment ermöglicht diese Ausführungsform sowohl eine präzise Überlappjustage als auch eine hochauflösende Bildgebung, die insbesondere nicht durch Bildmodu- lationen infolge von Interferenzeffekten gestört ist. Vorzugsweise hat das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop zwei separate, der Probe zugewandte Objektive, von denen eines der Beleuchtungseinheit und das andere der Abbildungsoptik zugeordnet ist und deren optischen Achsen senk- recht zueinander liegen. Dabei richtet das der Beleuchtungseinheit zugeordnete Objektiv vorzugsweise die beiden Lichtblätter von derselben Seite auf den Ziel bereich der Probe.
Das Lichtblattmikroskop kann auch als sogenanntes Schiefebenenmikroskop aus- geführt sein, das ein einziges probenzugewandtes Objektiv sowohl für die Be- leuchtung als auch die Detektion aufweist. Die Abbildungsoptik des Lichtblatt mikroskops ist in dieser Ausführungsform als Transportoptik ausgebildet, welche die Lichtblätter in den Zielbereich der Probe abbildet und zugleich ein Bild des beleuchteten Zielbereichs erzeugt. Die Transportoptik hat vorzugsweise eine Ab- tastvorrichtung, die ausgebildet ist, einen axialen und/oder lateralen Rasterpro- zess zur Volumenbildgebung auszuführen, indem sie die Lichtblätter entspre- chend durch die Probe bewegt.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zei- gen:
Figur 1 ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtblatt mikroskops in einer schematischen Schnittansicht;
Figur 2 eine weitere schematische Schnittansicht des Lichtblattmikro- skops nach Figur 1; Figur 3 ein Flussdiagramm, welches das Verfahren zur erfindungsgemä- ßen Überlappjustage anhand eines Ausführungsbeispiels veran- schaulicht;
Figur 4 ein Diagramm, das die Amplitude einer Bildmodulation in Ab- hängigkeit des Versatzes zwischen dem beleuchteten Zielbereich und dem Schärfebereich der Abbildungsoptik des Lichtblattmik roskops zeigt;
Figur 5 ein in dem Zielbereich erzeugtes Interferenzmuster;
Figur 6 das durch eine Fourier-Transformation gewonnene Ortsspekt- rum des Interferenzmusters nach Figur 5;
Figur 7 ein Bild des Zielbereichs, das zum Zwecke der Überlappjustage eine dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation auf- weist;
Figur 8 das durch eine Fourier-Transformation gewonnene Ortsspekt- rum des Bildes nach Figur 7; und
Figur 9 das Bild des Zielbereichs nach Beseitigung der Bildmodulation.
Die Figuren 1 und 2 zeigen Schnittansichten eines Lichtblattmikroskops 10.
Das Lichtblattmikroskop 10 umfasst eine Beleuchtungseinheit 12 und eine Abbil- dungsoptik 14. Die Beleuchtungseinheit 12 und die Abbildungsoptik 14 sind in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel so aufeinander ausgerichtet, dass ihre optischen Achsen 0 bzw. 0' im Bereich einer in den Figuren 1 und 2 nicht explizit dargestellten Probe senkrecht zueinander liegen. In den Figuren 1 und 2 wird jeweils auf ein rechtwinkliges xyz-Koordinatensystem Bezug genommen, dessen z-Achse mit der optischen Achse 0 der Beleuchtungseinheit 12 zusammenfällt. Demnach ist das Lichtblattmikroskop 10 in Figur 1 in einem x-z-Schnitt und in Figur 2 in einem y-z-Schnitt dargestellt. Die Darstellungen gemäß den Figuren 1 und 2 sind vereinfacht und rein schematisch. So sind lediglich diejenigen Kompo- nenten dargestellt, die für das Verständnis der Erfindung erforderlich sind.
Die Beleuchtungseinheit 12 weist eine Lichtquelle 16 und eine in den Figuren 1 und 2 allgemein mit 18 bezeichnete Beleuchtungsoptik auf. Die Beleuchtungsop- tik 18 umfasst ein erstes Polarisationselement in Form eines Wollaston-Prismas 20, ein motorisiertes zweites Polarisationselement in Form eines Kompensators 22, ein anamorphotisches Fokussiersystem in Form einer Zylinderlinse 24, einen motorisierten Einstellspiegel 26, eine Okularlinse 28, einen Umlenkspiegel 30, eine Tubuslinse 32 und ein Beleuchtungsobjektiv 34 mit einer Objektivpupille 36. Der vorgenannte Kompensator ist beispielsweise aus einem doppelbrechenden Kristall, insbesondere einer Verzögerungsplatte gebildet.
Die Abbildungsoptik 14 umfasst ein der abzubildenden Probe zugewandtes Ab- bildungsobjektiv 38, eine Tubuslinse 40 und einen ortsauflösenden Detektor in Form einer Kamera 42.
Das Lichtblattmikroskop 10 enthält ferner eine Steuereinheit 44, die den gesam- ten Mikroskopbetrieb steuert. Insbesondere dient die Steuereinheit 44 in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel dazu, den Kompensator 22, den motorisierten Einstellspiegel 26 und die Kamera 42 zu steuern sowie die weiter unten im Detail erläuterten Bildauswertungen vorzunehmen. Dementsprechend ist die Steuer- einheit 44 über Steuerleitungen 46, 48, 50 mit dem Kompensator 22, dem Ein stei Ispiegel 26 bzw. der Kamera 42 verbunden.
Die Lichtquelle 16 sendet ein kollimiertes Beleuchtungslichtbündel 52 auf das Wollaston-Prisma 20 aus, das beispielsweise aus zwei rechtwinkligen Prismen, z.B. Calcit-Prismen besteht, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Das Wollaston-Prisma 20 spaltet das einfallende Beleuchtungslichtbündel 52 in zwei Teilbündel 54, 56 auf, die verschiedene Polarisationszustände aufweisen, wie in Figur 2 gezeigt ist. Dabei liegt die Ebene, in der das Wollaston-Prisma 20 das Beleuchtungslichtbündel 52 in die beiden Teilbündel 54, 56 aufspaltet, paral lel zur y-Achse, d.h. in dem Schnitt nach Figur 2 in der Zeichenebene und in dem Schnitt nach Figur 1 senkrecht zur Zeichenebene.
Anschließend treten die beiden Teilbündel 54, 56 durch den Kompensator 22, mit dem sich die Polarisationszustände der Teilbündel 54, 56 nach Bedarf beein- flussen lassen. Hierzu ist in dem Lichtblattmikroskop 10 ein in den Figuren 1 und 2 nicht gezeigter Stellmotor vorgesehen, der unter der Kontrolle der Steuerein- heit 44 so auf den Kompensator 22 einwirkt, dass dieser die Polarisationszu- stände der beiden Teilbündel 54, 56 in der gewünschten Weise beeinflusst oder unverändert lässt.
Anschließend treten die Teilbündel 54, 56 durch die Zylinderlinse 24. Letztere hat die Eigenschaft, dass sie die Teilbündel 54, 56 jeweils lediglich in einer zur x- Achse parallelen Richtung fokussiert, während sie in einer zur y-Achse parallelen Richtung keine optische Wirkung auf die Teilbündel 54, 56 hat. Somit erzeugt die Zylinderlinse 24 im Bereich ihrer Brennebene aus den Teilbündeln 54, 56 jeweils eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung, die in Richtung der x-Achse fo- kussiert und in Richtung der x-Achse flächig ausgedehnt ist. In diesem Zusam- menhang ist darauf hinzuweisen, dass die diesbezüglichen Darstellungen in den Figuren 1 und 2 der Verständlichkeit halber vereinfacht sind. So sind beispiels weise in Figur 2 die Foki der beiden aus der Zylinderlinse 24 austretenden Teil- bündel 54, 56, die mit den zu der Zylinderlinse 24 konjugierten Ebenen korres- pondieren, auf der Oberfläche des motorisierten Einstellspiegels 26 angeordnet. Tatsächlich befindet sich jedoch in Lichtausbreitungsrichtung einer dieser Foki vor und der andere hinter dieser Oberfläche. Entsprechendes gilt für die Darstel- lung der Foki an der Oberfläche des Umlenkspiegels 30. Zudem sind die an dem Einstellspiegel 26 und dem Umlenkspiegel 30 vorgenommenen Lichtumlenkun- gen in den Figuren 1 und 2 in gleicher Weise dargestellt, obgleich diese Lichtum- lenkungen in der dargestellten Weise entweder nur in der x-z-Ebene oder in der y-z-Ebene gegeben sind.
Nach Reflexion an dem Einstellspiegel 26 treten die beiden Teilbündel 54, 56 durch die Okularlinse 28 und werden an dem Umlenkspiegel 30 reflektiert. An- schließend gelangen die Teilbündel 54, 56 nach Durchtritt durch die Tubuslinse 32 in die Eintrittspupille 36 des Beleuchtungsobjektivs 34, das die Teilbündel 54, 56 so auf die Probe richtet, dass die Teilbündel 54, 56 aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen Zielbereich E der Probe beleuchten.
Die Beleuchtungsoptik 18 des Lichtblattmikroskops 10 generiert in vorstehend erläuterter Weise zwei in verschiedenen Beleuchtungsrichtungen propagierende Lichtblätter 58, 60, die in dem zu beleuchtenden Zielbereich E der Probe einan- der koplanar überlagert sind. Dabei sind die beiden Lichtblätter 58, 60 in dem konkreten Ausführungsbeispiel unter der Annahme, dass der Kompensator 22 die Polarisationszustände der Teilbündel 54, 56 zunächst noch unbeeinflusst lässt, in dem Zielbereich E linear orthogonal zueinander polarisiert. So ist bei spielsweise das dem Teilbündel 54 zugeordnete Lichtblatt p-polarisiert, während das dem Teilbündel 56 zugeordnete Lichtblatt s-polarisiert ist. Die Okularlinse 28, die Tubuslinse 32 und das Beleuchtungsobjektiv 34 bilden innerhalb der Beleuch- tungsoptik 18 eine Zwischenabbildungsoptik, welche die Lichtblätter, die die Zy- linderlinse 24 im Wege der Fokussierung der Teilbündel 54, 56 am Ort des Ab- lenkspiegels 26 generiert, in den Zielbereich E der Probe abbildet.
In dem Ausführungsbeispiel nach Figur 2 schließen die beiden Beleuchtungsrich- tungen, aus denen die Lichtblätter 58, 60 in den Zielbereich E der Probe gerichtet werden, miteinander einen Winkel a ein. Dieser Winkel a korreliert mit einem Winkel ß, den die beiden Teilbündel 54, 56 nach Aufspaltung durch das Wollas- ton-Prismas 22 miteinander einschließen. Konkret ergibt sich der Winkel a nach der Beziehung a = ß/g, wobei g die Vergrößerung der aus der Okularlinse 28, der Tubuslinse 32 und dem Beleuchtungsobjektiv 34 gebildeten Zwischenabbil- dungsoptik bezeichnet.
Im Weiteren wird unter Bezugnahme auf das Flussdiagramm nach Figur 3 anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert, wie mit dem Lichtblatt 10 ein Überlappjus- tage vorgenommen werden kann, die darauf abzielt, den mit den beiden koplanaren Lichtblättern 58, 60 beleuchteten Zielbereich E der Probe in räumli- che Koinzidenz mit einem Schärfebereich F der Abbildungsoptik 14 zu bringen, der gemäß Figur 1 längs der optischen Achse 0' der Abbildungsoptik 14 im Be- reich des Fokus eines Detektionsstrahlenbüschels 62 liegt.
In Schritt S1 des Flussdiagrams nach Figur 3 erfolgt zunächst eine automatisierte Vorjustage der Lichtblattbeleuchtung auf den Schärfebereich F der Abbil- dungsoptik 14. Die Vorjustage kann beispielsweise auf Basis der Helligkeit des von der Kamera 42 aufgenommenen Bildes vorgenommen werden. Hierzu wird der Einstellspiegel 26 unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 in eine Stellung gebracht, in der die Lichtblattbeleuchtung für eine maximale Bildhelligkeit sorgt.
Nach erfolgter Vorjustage werden in Schritt S2 die Polarisationszustände der bei den Teilbündel 54, 56 und damit der beiden Lichtblätter 58, 60 unter der Kon- trolle der Steuereinheit 44 durch den Kompensator 22 so eingestellt, dass sich eine maximale Interferenz der beiden Lichtblätter 58, 60 in dem Zielbereich E ergibt. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel stellt der Kompensator 22 hierzu die Polarisationszustände der beiden Teilbündel 54, 56 so ein, dass diese linear parallel zueinander polarisiert sind. Auf diese Weise wird in dem Zielbe reich E durch Interferenz der beiden Lichtblätter 58, 60 ein Interferenzmuster generiert, wie es rein beispielhaft in Figur 5 veranschaulicht ist. Dabei zeigt die Figur 5 der Einfachheit halber ein Interferenzmuster I unter der Annahme einer vollständig homogenen Probe.
Das Interferenzmuster I nach Figur 5 weist eine Vielzahl von Interferenzstreifen auf, die sich unter Bezugnahme auf Figur 2 in einer Richtung erstrecken, die pa- rallel zur Winkelhalbierenden des Winkels a verlaufen. Der Winkel a wird von den beiden Beleuchtungsrichtungen eingeschlossen, in denen die beiden Licht blätter 58, 60 propagieren. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel fällt die vorge- nannte Winkelhalbierende des Winkels a deshalb mit der optischen Achse O der Beleuchtungsoptik 18 zusammen. Somit erstrecken sich die Interferenzstreifen, wie in Figur 5 angedeutet, in Richtung der optischen Achse O der Beleuchtungs- optik 18.
In den folgenden Schritten S3 bis S5 erfolgt die eigentliche Justage. Zunächst wird in Schritt S3 durch die Kamera 42 ein Bild des mit den beiden Lichtblättern 58, 60 beleuchteten Zielbereichs E der Probe aufgenommen. Da die beiden Lichtblätter das in Figur 5 gezeigte Interferenzmuster I generieren, ist dem von der Kamera 42 aufgenommenen Bild eine mit dem Interferenzmuster entsprechende Bildmodulation aufgeprägt. Dies ist in Figur 7 veranschaulicht, die ein von der Kamera 42 aufgenommenes Bild des Zielbereichs zeigt, in dem die dem Interfe- renzmuster I entsprechende Bildmodulation in Form von horizontalen Streifen deutlich zu erkennen ist.
In Schritt S4 wertet die Steuereinheit 44 die in dem aufgenommenen Bild enthaltene Bildmodulation aus. Hierzu nutzt die Steuereinheit 44 die a priori- Kenntnis der Charakteristik des Interferenzmusters I infolge der vorgegebenen Lichtblattgeometrie. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist diese Charakteristik durch die Modulationsperiode, d.h. den Abstand zwischen benachbarten Interferenzstreifen, sowie die Ausrichtung des Interferenzmusters nach Figur 5 gegeben. Die Modulationsperiode ergibt sich nach folgender Beziehung: f = l sin(ot/2) worin f die Modulationsperiode, l die Wellenlänge der Lichtblätter und a den Winkel zwischen den Ausbreitungsrichtungen der beiden Lichtblätter 58, 60 be- zeichnet. Auch die Ausrichtung des Interferenzmusters ergibt sich unmittelbar aus der vorgegebenen Lichtblattgeometrie. Wie schon weiter oben erwähnt, ver- laufen in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel die Interferenzstreifen parallel zur optischen Achse 0 der Beleuchtungsoptik 18. Die Charakteristik des Interferenzmusters nach Figur 5 spiegelt sich in dessen durch eine Fourier-Analyse generiertem Ortsspektrum wider, das in Figur 6 ge- zeigt ist. In dem Diagramm nach Figur 6 sind längs der horizontalen Achse die horizontalen Ortsfrequenzen und längs der vertikalen Achse die vertikalen Orts- frequenzen angegeben. Die Einheiten sind durch die Eigenschaften der diskreten Fourier-Transformation gegeben, und die Signalintensität ist als Graustufen dar- gestellt. Das Ortsspektrum nach Figur 6 weist zwei Signale bei Ortsfrequenzen auf, die sich aus der Modulationsperiode des in Figur 5 gezeigten Interferenz- musters ergeben. Genauer gesagt, stellen die Ortsfrequenzen in Figur 6 gemäß der Fourier-Transformation jeweils den Kehrwert der Modulationsperiode des Interferenzmusters I dar. Aus Gründen der einfacheren Darstellung ist in Figur 6 die Signalintensität bei der Ortsfrequenz Null, die den Gleichanteil des Ortspekt- rums repräsentiert, weggelassen, da dieser die in Figur 6 gezeigten Signalinten- sitäten um ein Vielfaches übersteigt. Das Gleichanteil-Signal mit der Ortsfre- quenz Null liegt bezogen auf die horizontale Achse zwischen den beiden in Figur 6 gezeigten Signalen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Ortsfrequenzen in Fi- gur 6 in willkürlichen Einheiten angegeben sind.
In Schritt S4 wird also das in Figur 7 dargestellte Bild, das die dem Interferenz- muster I nach Figur 5 entsprechende Bildmodulation aufweist, einer Fourier- Transformation unterzogen und so dessen Ortsspektrum erzeugt, das in Figur 8 dargestellt ist. Das Ortsspektrum nach Figur 8 zeigt längs der vertikalen Achse zwei Ortsfrequenzsignale, die in gleichen Abständen beiderseits eines dominie- renden zentralen Signals angeordnet sind, das bei der Ortsfrequenz Null den Gleichanteil des Ortsspektrums repräsentiert. Die beiden vorgenannten Signale spiegeln die durch das Interferenzmuster I bewirkte Bildmodulation wider. Ins besondere ist die Ortsfrequenz dieser Signale, d.h. der (positive) Abstand, den die Signale längs der vertikalen Achse von dem zentralen Gleichanteil-Signal auf- weisen, durch die Modulationsperiode des Interferenzmusters festgelegt. Je grö- ßer diese Ortsfrequenz ist, desto kleiner ist die Modulationsperiode des Interfe- renzmusters I, d.h. desto kleiner ist der Abstand benachbarter Interferenzstrei- fen in Figur 7. Die Ausrichtung der beiden die Bildmodulation repräsentierenden Ortsfrequenzsignale in Figur 8 korrespondiert mit der Richtung der Bildmodula- tion in Figur 7. So erkennt man in Figur 7, dass die horizontal verlaufenden Inter- ferenzstreifen in vertikaler Richtung aufeinanderfolgen.
Aufgrund der durch die Lichtblattgeometrie vorgegebenen Charakteristik des In- terferenzmusters I ist a priori bekannt, an welcher Stelle, d.h. bei welcher Orts- frequenz das Ortsspektrum nach Figur 8 auszuwerten ist, um die Bildmodulation quantitativ zu erfassen. In dem vorliegenden Beispiel ist das in Figur 8 darge- stellte Ortsspektrum gerade an den Stellen auszuwerten, an denen sich die bei den Signale oberhalb bzw. unterhalb des zentralen Gleichanteilsignals zu finden sind (bzw. nur das obere Signal mit positiver Ortsfrequenz). Dieses Signal reprä- sentiert die Amplitude der Bildmodulation und wird deshalb im Weiteren als Op- timierungsparameter für die Überlappjustage genutzt.
In Schritt S5 wird der motorisierte Einstellspiegel 110 unter der Kontrolle der Steuereinheit 44 um einen vorbestimmten Stellwert verstellt, wodurch die bei den einander überlagerten Lichtblätter 58, 60 gemeinsam längs der optischen Achse 0' der Abbildungsoptik 14 verschoben werden. Anschließend kehrt der Steuerablauf zurück zu Schritt S3.
Die Schritte S3 bis S5 werden beispielsweise unter Anwendung eines linearen, d.h. eindimensionalen Suchalgorithmus (gegebenenfalls unter Fieranziehung ei- nes geeigneten Abbruchkriteriums) solange wiederholt, bis der Optimierungspa- rameter, der durch das in Schritt S4 erfasste, die Amplitude der Bildmodulation repräsentierende Ortfrequenzsignal gegeben ist, maximiert ist.
Figur 4 zeigt rein beispielhaft, wie sich die Amplitude der Bildmodulation in Ab- hängigkeit eines Versatzes ändert, der zwischen dem beleuchteten Zielbereich E und dem Schärfenbereich F der Abbildungsoptik längs deren optischer Achse 0' auftritt. Ist dieser Versatz gleich Null, so ist die Amplitude der Bildmodulation maximal und die Überlappjustage abgeschlossen.
In Schritt S6 wird schließlich der Kompensator 22 durch die Steuereinheit 44 so angesteuert, dass er die Teilbündel 54, 56 und damit die Lichtblätter 58, 60 in Polarisationszustände überführt, in denen die Lichtblätter 58, 60 nicht miteinan- der interferieren. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die Lichtblätter 58, 60 in diesen Polarisationszuständen linear orthogonal zueinander polarisiert. Durch diese Polarisationseinstellung wird das Interferenzmuster in dem Ziel be reich E zum Verschwinden gebracht. Dementsprechend wird in dem von der Ka- mera 42 aufgenommenen Bild des Zielbereichs E die Bildmodulation beseitigt, wie in Figur 9 veranschaulicht ist. Dabei kann die Beseitigung der Bildmodulation ebenfalls in der Weise erfolgen, dass die Amplitude der Bildmodulation in einem den Schritten S3 bis S5 entsprechenden eindimensionalen Suchverfahren als Op- timierungsparameter genutzt wird, selbstverständlich mit dem Unterschied, dass die Steuereinheit 44 in diesem Fall nicht den Einstellspiegel 26, sondern den Kompensator 22 ansteuert und die Amplitude der Bildmodulation nicht zu maxi- mieren, sondern zu minimieren ist. Das in dieser Weise von der Bildmodulation befreite Bild des Zielbereichs E kann dann zur eigentlichen Bildgebung herange- zogen werden. Die Erfindung ist nicht auf das vorstehend erläuterte Ausführungsbeispiel be- schränkt. Es ist beispielsweise möglich, die Überlappjustage in anderer Weise als in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel vorzunehmen, in dem die beiden Lichtblätter 58, 60 längs der optischen Achse 0' der Abbildungsoptik 14 verscho- ben werden. So ist es z.B. ebenso möglich, den Schärfebereich F der Abbil- dungsoptik 14 zum Zwecke der Überlappjustage zu verschieben. Auch können die Polarisationszustände der Lichtblätter 58, 60 in anderer Weise als in dem be- schriebenen Ausführungsbeispiel beeinflusst werden, sofern gewährleistet ist, dass die beiden Lichtblätter 58, 60 während der Vorjustage in dem Zielbereich E miteinander interferieren. Insbesondere ist es möglich, dass der Kompensator 22 nur auf eines der beiden Teilbündel 54, 56 einwirkt. Auch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt, die beiden Lichtblätter 58, 60 wie in dem vorbeschriebenen Ausführungsbeispiel von derselben Seite auf den Zielbereich E zu richten. So ist es z.B. auch möglich, die beiden Lichtblätter 58, 60 mittels geeigneter Umlen- kelemente von verschiedenen Seiten in den Zielbereich zu fokussieren. Solche Umlenkelemente können z.B. durch sogenannte Spiegelkappen realisiert wer- den, die an dem probenzugewandten Beleuchtungsobjektiv 34 angebracht sind.
Das Lichtmikroskop kann auch als Schiefebenenmikroskop oben beschriebener Art ausgeführt sein, das ein einziges probenzugewandtes Objektiv für die Be- leuchtung und die Detektion aufweist.
Bezugszeichenliste
10 Lichtblattmikroskop
12 Beleuchtungseinheit
14 Abbildungsoptik
16 Lichtquelle
18 Beleuchtungsoptik
20 Wollaston-Prisma
22 motorisierter Kompensator
24 Zylinderlinse
26 motorisierter Einstellspiegel
28 Okularlinse
30 Umlenkspiegel
32 Tubuslinse
34 Beleuchtungsobjektiv
36 Objektivpupille
38 Abbildungsobjektiv
40 Tubuslinse
42 Kamera
44 Steuereinheit
46 Steuerleitung
48 Steuerleitung
50 Steuerleitung
52 Beleuchtungslichtbündel
54 Teilbündel
56 Teilbündel
58 Lichtblatt
60 Lichtblatt 62 Detektionsstrahlenbüschel
0 optische Achse der Beleuchtungseinheit
0' optische Achse der Abbildungsoptik
E Zielbereich
F Schärfebereich
a Winkel
ß Winkel
I Interferenzmuster

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Abbilden einer Probe mittels eines Lichtblattmikroskops (10), bei dem
die Probe aus zwei verschiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Licht blättern (58, 60) beleuchtet wird, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in einem Zielbereich (E) der Probe koplanar überla- gert sind, und
mittels einer Abbildungsoptik (14) des Lichtblattmikroskops (10) ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) erzeugt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
mit den beiden Lichtblättern (58, 60) in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (I) entsprechende Bildmodulation aufge- prägt wird,
die Bildmodulation ausgewertet wird, und
der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängigkeit der ausgewerteten Bild modulation relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) jus tiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildmodu- lation ausgewertet wird, indem deren Amplitude bestimmt wird, und der beleuchtete Zielbereich (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbil- dungsoptik (14) derart justiert wird, dass die Amplitude maximiert wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Charakteristik des Interferenzmusters (I) vorgegeben und die Bildmodulation an Fland dieser vorgegebenen Charakteristik aus- gewertet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass das Interferenzmuster (I) in Form eines Streifenmusters er- zeugt wird, dessen Interferenzstreifen parallel zu einer Winkelhalbieren- den eines Winkels verlaufen, den die Beleuchtungsrichtungen der beiden Lichtblätter (58, 60) miteinander einschließen, wobei das Streifenmuster durch eine Modulationsperiode gemäß folgender Beziehung charakteri- siert ist: f = l sin(ot/2) worin
f die Modulationsperiode,
l die Wellenlänge der Lichtblätter, und
a den genannten Winkel bezeichnet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Bildmodulation ausgewertet wird, indem das Bild einer Fourier-Analyse unterzogen wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass zum Justieren des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) die beiden einander koplanar überlagerten Lichtblätter (58,60) gemeinsam längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) verschoben werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass die beiden Lichtblätter (58, 60) vor der Justage des beleuch- teten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfenbereich (F) der Abbildungsop- tik (14) in interferenzfähige Polarisationszustände überführt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Licht blätter (58) vor der Justage des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfenbereich (F) der Abbildungsoptik (14) nicht-orthogonal zueinander linear polarisiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die bei den Lichtblätter (58, 60) nach der Justage des beleuchteten Zielbereichs (E) relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) in nicht-interfe- renzfähige Polarisationszustände gebracht werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Vorjustage, in der der beleuchtete Zielbereich (E) in Abhängig- keit der Helligkeit des Bildes relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbil- dungsoptik (14) eingestellt wird.
11. Lichtblattmikroskop (10), umfassend:
eine Beleuchtungseinheit (12), die ausgebildet ist, eine Probe aus zwei ver- schiedenen Beleuchtungsrichtungen mit zwei Lichtblättern (58, 60) zu be- leuchten, die verschiedene Polarisationszustände haben und einander in ei- nem Zielbereich (E) der Probe koplanar überlagert sind, eine Abbildungsoptik (14), die ausgebildet ist, ein Bild des beleuchteten Zielbereichs (E) zu erzeugen, und
eine Steuereinheit (44),
dadurch gekennzeichnet, dass
die Steuereinheit (44) ausgebildet ist, die Beleuchtungseinheit (12) derart zu steuern, dass mit den beiden Lichtblättern (58, 60) in dem beleuchteten Zielbereich (E) ein Interferenzmuster (I) erzeugt wird, wodurch dem Bild des Zielbereichs (E) eine dem Interferenzmuster (E) entsprechende Bildmodu- lation aufgeprägt wird,
die Steuereinheit (44) ausgebildet ist, die Bildmodulation auszuwerten, und die Steuereinheit (44) ausgebildet ist, die Beleuchtungseinheit (12) und/o- der die Abbildungsoptik (14) derart zu steuern, dass der beleuchtete Ziel bereich (E) in Abhängigkeit der ausgewerteten Bildmodulation relativ zu dem Schärfebereich (F) der Abbildungsoptik (14) justiert wird.
12. Lichtblattmikroskop (11) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) umfasst:
eine Lichtquelle (16), die ausgebildet ist, ein Beleuchtungslichtbündel (52) zu erzeugen,
ein erstes Polarisationselement (20), das ausgebildet ist, das Beleuchtungs- lichtbündel (52) in zwei verschieden polarisierte Teilbündel (54, 56) aufzu- spalten, und
eine Beleuchtungsoptik (14), die ausgebildet ist, aus den beiden Teilbün- deln (54, 56) die beiden den Zielbereich (E) beleuchtenden Lichtblätter (58, 60) zu erzeugen.
13. Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinheit (12) ein durch die Steuereinheit (44) steuerbares Ablenkelement (26) umfasst, durch das die beiden einander koplanar über- lagerten Lichtblätter (58, 60) gemeinsam längs der optischen Achse (O') der Abbildungsoptik (14) verschiebbar sind.
14. Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeich- net, dass die Beleuchtungseinheit (12) ein durch die Steuereinheit (44) steu- erbares zweites Polarisationselement (22) umfasst, das ausgebildet ist, die beiden Lichtblätter (58, 60) wahlweise in interferenzfähige Polarisationszu- stände und nicht-interferenzfähige Polarisationszustände zu überführen.
15. Lichtblattmikroskop (10) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polarisationselement (22) eine Verzögerungsplatte ist.
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