CN111670398B - 用于借助光片显微镜对样本成像的方法 - Google Patents

Abstract

介绍一种用于借助光片显微镜(10)对样本成像的方法。其中，利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对所述样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠。借助所述光片显微镜(10)的成像光学机构(14)产生被照明的所述目标区域(E)的图像。利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此对所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制。分析所述图像调制。根据所分析的所述图像调制，相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)。

Description

用于借助光片显微镜对样本成像的方法

技术领域

本发明涉及一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法，其中，利用两个光片从两个不同的照明方向对样本照明，并且借助光片显微镜的成像光学机构产生被照明的目标区域的图像，这些光片具有不同的偏振状态，并且在样本的目标区域中彼此共面地重叠。本发明还涉及一种相应地工作的光片显微镜。

背景技术

在所谓的光片或光板显微术中，通过照明光学机构利用薄光片对样本的目标区域予以照明，并借助成像光学机构对被如此照明的目标区域予以成像，该成像光学机构的光轴垂直于照明光学机构的光轴。通过使得理想地与成像光学机构的清晰区域叠合的、利用光片予以照明的目标区域连续地沿着成像光学机构的光轴移动经过样本，可以实现三维的成像。在宽视野-荧光显微术中采用的这种方法的优点尤其也是样本的光负荷特别小。

但问题是，照明光垂直于成像光学机构的光轴传播。因而会因样本内部的散射中心或吸收体而使得照明光出现散射或吸收，这在所产生的图像中沿照明光的传播方向以条纹伪像的形式能发觉到。

为了减小这种伪像，在专利DE 10 2016 108 384 B3中提出，并非仅用一个光片，而是用两个光片对样本的目标区域照明，这些光片从同一侧，但从不同的照明方向，朝向目标区域，并在那里彼此共面地即在一个共同的照明平面中重叠。这种光片照明的实现方式为，使得照明光束穿过Wollaston-棱镜，该棱镜把照明光束分成两个不同地线性偏振的分光束，这些分光束偏转离开照明光路的光轴，因而从不同的照明方向进入到照明平面中，即进入到样本的目标区域中。现在如果在两个照明方向之一上因散射中心或吸收体而出现照明光遮暗，则通过未受散射中心或吸收体影响的另一个照明方向始终都确保对目标区域的充分的光片照明。

为了保证在光片显微镜中尽量清晰的成像，在照明平面即由光片厚度确定的目标区域与焦点平面即成像光学机构的由清晰深度确定的清晰区域之间需要有精确的空间上的交叠。在现有技术中，大多通过视觉上的评估，例如使用具有小荧光粒子的参考标本，进行为此所需要的、下面称为交叠调节的细微调节，通过该细微调节在被照明的目标区域与成像光学机构的清晰区域之间产生空间上的重叠。也可以在视觉上评估被显微地摄像的样本图像本身，以便进行交叠调节。但这种做法只能实现比较粗略的交叠调节。特别地，引入参考标本并不反映真实的成像状况，在真实的成像状况中，由于折射率错误调整例如因样本引起出现像差。相比之下，一种比较麻烦的调节方法规定，将一个反射镜引入到照明光路中，一旦进行调节，该反射镜就使得光片偏转到在成像光路的图像平面中布置的探测器的参考位置。

所有前述方法的共同之处是，它们不能实现自动的交叠调节。这里要考虑到，基于对样本图像清晰度的自动分析的调节牵涉到如下困难：待成像的样本的由样本图像的傅里叶变换产生的空间频谱通常是未知的。这尤其意味着，事先不了解样本的空间频谱到底是否具有高的空间频率，所述空间频率归因于微小的进而适合于调节的样本结构。

发明内容

本发明的目的是，提出一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法以及一种光片显微镜本身，它们能实现精确地且自动地调节在样本的被照明的目标区域与成像光学机构的清晰区域之间的空间上的重叠。

本发明通过独立权利要求的主题来实现该目的。有利的改进在从属权利要求中给出。

本发明规定了一种用于借助光片显微镜对样本成像的方法，其中，利用两个光片从两个不同的照明方向对样本照明，并且借助光片显微镜的成像光学机构产生被照明的目标区域的图像，这些光片具有不同的偏振状态，并且在样本的目标区域中彼此共面地重叠。利用两个光片在被照明的目标区域中产生干涉图案，由此对目标区域的图像施加与干涉图案相应的图像调制。分析图像调制，并且根据所分析的图像调制，相对于成像光学机构的清晰区域来调节被照明的目标区域。

本发明规定相对于成像光学机构的清晰区域自动地调节被照明的目标区域，其方式为，针对图像调制来分析目标区域的通过成像光学机构摄取的图像。通过利用两个干涉的光片对成像的目标区域予以照明，对图像施加图像调制。通过这种方式，产生了对目标区域照明的干涉图案，该干涉图案以前述的图像调制的形式反映在被照明的目标区域的图像中，该图像调制例如被为此设置在光片显微镜中的控制单元予以分析，并且被用于自动的交叠调节。例如当给被照明的目标区域的图像施加的图像调制最大时，调节结束。图像中存在的调制因而在很大程度上取决于被施加以光片照明的目标区域和成像光学机构的清晰区域在空间上彼此重叠的精确度有多大。简单地说，当通过两个光片共同地规定的照明平面与成像光学机构的焦点平面叠合时，图像调制最大。

为了交叠调节，要保证两个光片在被照明的目标区域中相互干涉。因而要这样产生这些光片：使得它们具有对于干涉来说足够的在时间和空间上的彼此相关度。此外，特别是要保证两个光片在调节期间具有完全能实现使得这些光片在目标区域中干涉的偏振状态。如果例如认为两个光片从一开始就不同地线性偏振，则这些光片在它们的偏振方向并非彼此正交时在目标区域中相互干涉。只要保证了这一点，就不需要专门被设置用于通过影响两个光片的偏振状态来确保这些光片的在目标区域中的干涉能力的偏振器件。这种专门被设置用于产生各光片的干涉能力的偏振器件却可以按有利的方式用来通过相应地影响偏振状态而在目标区域中产生特别显眼的干涉图案。例如，偏振器件可以用于使得两个光片平行地线性偏振，由此使得两个光片的干涉最大。

这种偏振器件例如可以通过在照明光路中安置在合适位置的双折射晶体来实现，或者通过其它类型的偏振器比如延迟板来实现。同样可以通过照明光学器件的与偏振有关的特性来实现对光片偏振状态的影响，其方式为，例如使用干涉层的与偏振有关的相，或者使用应力双折射的器件。此外，可使用电光学的器件或基于液晶工作的器件。

优选地，分析图像调制，其方式为，确定图像调制的幅度。于是相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域，使得图像调制的幅度最大。由此，图像调制的幅度形成了能以简单的方式检测的优化参数，基于该优化参数可以在光片显微镜中进行自动的交叠调节。

在一种有利的实施方式中，规定干涉图案的特征并且借助该规定的特征来分析图像调制。前述特征是干涉图案的特性，该特性例如可以由光片照明的所选造型导出，进而是预先已知的。干涉图案的这种已知的特性于是可以按简单的方式被考虑用于分析图像调制。

例如，干涉图案以条纹图案的形式产生，该条纹图案的干涉条纹平行于由两个光片的照明方向相互夹成的角度的角平分线伸展，其中，条纹图案按如下关系式以调制周期为特点：f＝λsin(α/2)。其中，f是调制周期，λ是光片的波长，α是那些照明方向相互夹成的前述角度。

在这个例子中，调制周期f是干涉图案的从一开始就已知的特征，该特征由这些光片的规定的波长λ以及由在两个光片的两个照明方向之间的同样规定的角度α产生。除了调制周期外，干涉图案的方向由光片照明的造型即两个光片的照明方向也是已知的。由于了解调制周期和干涉图案的方向，所以现在可以例如通过对图像的傅里叶-分析而简单且可靠地确定图像调制的幅度。在通过傅里叶-分析而产生的频域内，干涉条纹的被窄小地定位的调制周期与样本的空间频谱卷积，该空间频谱表示样本的事先未知的结构。但由于目标区域的所摄取的图像通过正实数的数据来表示，这些数据的占据傅里叶频谱的恒定分量的总和也始终都是正实数，从而对干涉图案的调制周期f及其方向的预先了解允许即使在样本的高频率的空间频谱情况下也可靠地确定图像调制的幅度。

在前述例子中，因而可以针对在两个光片的照明方向之间的不太大的角度α，通过光片显微镜的成像光学机构，简单且可靠地以所摄取的图像的调制的形式探测干涉图案的干涉条纹。通过干涉条纹施加给图像的图像调制的幅度因而可以用作在照明平面与成像光学机构的焦点平面之间的共面性的优化参数或者品质标准。由于图像调制的幅度是唯一要优化的参数，用于调节共面性的参数空间是一维的。因而可以使用简单的线性搜索算法来使得图像调制的幅度最大。

优选地，为了交叠调节，两个共面地重叠的光片共同地沿着成像光学机构的光轴移动。这例如可以通过设置在照明光路中的偏转部件来进行，该偏转部件根据所分析的图像调制予以控制。但同样可行的是，代替光片照明而使得成像光学机构沿着其光轴移动，以便使得清晰区域在空间上与被照明的目标区域重合。也可以同时既移动光片，又移动成像光学机构的清晰区域。

在一种优选的设计中，在相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域之前，使得两个光片过渡至能干涉的偏振状态下。例如，前述的偏振状态经过选取，使得两个光片在目标区域中线性地、非正交地、特别是相互平行地偏振。由此确保在目标区域中形成非常显眼的干涉图案，通过该干涉图案在所摄取的图像中产生相应的明显的图像调制。

在另一有利的设计中，在相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域之后，把两个光片带到不能干涉的偏振状态下。由此避免显微镜图像的干扰真正的成像的调制。这个步骤可以借助对图像的傅里叶-分析而自动化。

优选规定预先调节，在该预先调节中，根据图像亮度相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域。这种预先调节尤其可以在样本的高频的空间频谱情况下也根据所探测的由空间频谱和照明频谱的卷积产生的总频谱的能量含量来进行。

根据本发明的光片显微镜包括：照明单元，其被设计用于利用两个光片从两个不同的照明方向对样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在样本的目标区域中彼此共面地重叠；成像光学机构，其被设计用于产生被照明的目标区域的图像；和控制单元。该控制单元被设计用于控制照明单元，从而利用两个光片在被照明的目标区域中产生干涉图案，由此给目标区域的图像施加与干涉图案相应的图像调制。控制单元还被设计用于分析图像调制，并且控制照明单元和/或成像光学机构，从而根据所分析的图像调制相对于成像光学机构的清晰区域调节被照明的目标区域。

在一种优选的设计中，照明单元包括：光源，其被设计用于产生照明光束；第一偏振部件，其被设计用于把照明光束分成两个不同地偏振的分光束；和照明光学机构，其被设计用于由两个分光束产生两个对目标区域照明的光片。第一偏振部件例如经过设计，从而它使得两个分光束优选以相反的相等角度偏转离开照明单元的光轴。如果两个分光束相互夹成的角度用β(也就是说，参照光轴相反的相等角度用±β/2)表示，并且由成像光学机构引起的放大率用γ表示，则在该实施方式中在样本内产生两个光片，这些光片相对于照明单元的光轴以±β/2γ的角度在样本内部传播。两个传播方向相互间具有的角度β>0减小了因散射和吸收引起形成条纹伪像。

第一偏振部件优选设计成使得两个分光束线性地偏振，其中，它们的偏振方向彼此正交。正交的这些偏振方向在真正的成像中具有如下优点：避免因两个光片之间的干涉所致的图像调制。此外，通过具有这两个偏振方向的照明，减小了在荧光团的激发中的光选择效应。

在一种优选的实施方式中，第一偏振部件是Wollaston-棱镜。这种棱镜例如由两个垂直的在其基面上相互胶合的Calcit-棱镜构成。两个棱镜的光轴相互正交。

优选地，照明单元包括可通过控制单元予以控制的偏转部件，通过该偏转部件可使得两个共面地重叠的光片共同地沿着成像光学机构的光轴移动。偏转部件例如是反射镜，该反射镜通过由控制单元予以控制的电机来驱动，以便使得两个共面的光片沿着成像光学机构的光轴移动。

在一种特别优选的设计中，照明单元包括可通过控制单元予以控制的第二偏振部件，该第二偏振部件被设计用于使得两个光片有选择地过渡到能干涉的偏振状态和不能干涉的偏振状态下。特别是结合前述的第一偏振部件，该实施方式既能实现精确的交叠调节，又能实现高分辨率的成像，该成像特别是不会通过图像调制因干涉效应而受到干扰。

优选地，根据本发明的光片显微镜具有两个分开的面向样本的物镜，其中的一个物镜指配给照明单元，另一个物镜指配给成像光学机构，并且它们的光轴相互垂直。在此，指配给照明单元的物镜优选使得两个光片从同一侧朝向样本的目标区域。

光片显微镜也可以设计成所谓的倾斜平面显微镜，该倾斜平面显微镜具有唯一的面向样本的既用于照明又用于探测的物镜。光片显微镜的成像光学机构在该实施方式中设计成传输光学机构，其使得光片成像到样本的目标区域中，且同时产生被照明的目标区域的图像。传输光学机构优选具有扫描装置，该扫描装置被设计用于为了立体成像而进行轴向的和/或横向的扫描过程，其方式为，该扫描装置使得光片相应地移动经过样本。

附图说明

下面借助附图详述本发明。其中：

图1以示意性的剖视图示出根据本发明的光片显微镜的一个实施例；

图2为根据图1的光片显微镜的另一示意性的剖视图；

图3为流程图，其借助一个实施例示出用于根据本发明的交叠调节的方法；

图4为曲线图，其与在光片显微镜的被照明的目标区域与成像光学机构的清晰区域之间的偏移相关地示出图像调制的幅度；

图5示出在目标区域中产生的干涉图案；

图6示出根据图5的干涉图案的通过傅里叶-变换得到的空间频谱；

图7示出目标区域的图像，该图像为了交叠调节而具有与干涉图案相应的图像调制；

图8示出根据图7的图像的通过傅里叶-变换得到的空间频谱；和

图9示出在消除图像调制之后的目标区域图像。

具体实施方式

图1和2所示为光片显微镜10的剖视图。

光片显微镜10包括照明单元12和成像光学机构14。在当前的实施例中，照明单元12和成像光学机构14彼此相对定向成使得它们的光轴O或O'在图1和2中未明确示出的样本的区域内相互垂直。在图1和2中分别参照了垂直的xyz-坐标系，其z-轴与照明单元12的光轴O叠合。因此，光片显微镜10在图1中以x-z-剖视图示出，且在图2中以y-z-剖视图示出。根据图1和2的视图是简化的和纯示意性的。因而仅仅示出了对于理解本发明所需要的那些组件。

照明单元12具有光源16和在图1和2中整体标有18的照明光学机构。照明光学机构18包括Wollaston-棱镜20形式的第一偏振部件、补偿器22形式的机动的第二偏振部件、柱面透镜24形式的变形的聚焦系统、机动的调整反射镜26、目镜透镜28、偏转反射镜30、管式透镜32和带有物镜光瞳36的照明物镜34。前述的补偿器例如由双折射的晶体特别是延迟板构成。

成像光学机构14包括面向待成像的样本的成像物镜38、管式透镜40和摄像机42形式的位置分辨的探测器。

光片显微镜10还含有控制单元44，该控制单元控制整个显微镜运行。在当前的实施例中，控制单元44特别是用于控制补偿器22、机动的调整反射镜26和摄像机42，以及进行下面详述的图像分析。相应地，控制单元44通过控制线路46、48、50与补偿器22、调整反射镜26或摄像机42连接。

光源16把准直的照明光束52发出到Wollaston-棱镜20上，该棱镜例如由两个垂直的在其基面上相互胶合的棱镜比如Calcit-棱镜构成。Wollaston-棱镜20把入射的照明光束52分成两个具有不同偏振状态的分光束54、56，如图2中所示。在一个平面内，Wollaston-棱镜20把照明光束52分成两个分光束54、56，该平面在此平行于y-轴，即在根据图2的剖视图中处于图面内，且在根据图1的剖视图中垂直于图面。

随后，两个分光束54、56穿过补偿器22，利用该补偿器可以根据需要来影响分光束54、56的偏振状态。为此在光片显微镜10中设置了在图1和2中未示出的伺服电机，该伺服电机在控制单元44的控制下作用到补偿器22上，从而该补偿器按所希望的方式影响两个分光束54、56的偏振状态或者使其不变。

接下来，分光束54、56穿过柱面透镜24。该柱面透镜具有如下特性：它使得分光束54、56分别仅在平行于x-轴的方向上聚焦，而它在平行于y-轴的方向上对分光束54、56没有光学作用。因此，柱面透镜24在其焦平面的区域中由分光束54、56分别产生光片式的照明光分布，该照明光分布在x-轴的方向上聚焦且在x-轴的方向上平面地延展。相关地要指出，为便于理解，图1和2中的相关附图被简化。因而例如在图2中，从柱面透镜24射出的两个分光束54、56的焦点布置在机动的调整反射镜26的表面上，这些分光束对应于同柱面透镜24共轭的平面。但实际上，在光传播方向上，这些焦点之一位于该表面之前，另一个焦点位于该表面之后。相应的情况适用于在偏转反射镜30的表面上的焦点图示。此外，在调整反射镜26和偏转反射镜30上进行的光偏转在图1和2中以相同的方式示出，尽管这种光偏转按所示方式要么仅在x-z-平面中产生，要么在y-z-平面中产生。

在调整反射镜26上反射之后，两个分光束54、56穿过目镜透镜28，且在偏转反射镜30上反射。随后，分光束54、56在穿过管式透镜32之后进入到照明物镜34的入射光瞳36中，该照明物镜使得分光束54、56朝向样本，从而分光束54、56从两个不同的照明方向对样本的目标区域E照明。

光片显微镜10的照明光学机构18按前述方式产生两个在不同的照明方向上传播的光片58、60，这些光片在样本的待照明的目标区域E中共面地相互重叠。在此，在该具体的实施例中，假定补偿器22起初尚未影响分光束54、56的偏振状态，两个光片58、60在目标区域E中彼此线性正交地偏振。因而例如指配给分光束54的光片发生p-偏振，而指配给分光束56的光片发生s-偏振。目镜透镜28、管式透镜32和照明物镜34在照明光学机构18内部形成中间成像光学机构，柱面透镜24通过使得分光束54、56在调整反射镜26的位置聚焦而产生光片，该中间成像光学机构使得这些光片成像到样本的目标区域E中。

在根据图2的实施例中，两个照明方向相互间夹成一个角度α，光片58、60由这些照明方向朝向样本的目标区域E。该角度α与两个分光束54、56在被Wollaston-棱镜22分开之后相互间夹成的角度β相关。具体地，根据关系式α＝β/γ得到角度α，其中，γ是指由目镜透镜28、管式透镜32和照明物镜34构成的中间成像光学机构的放大率。

下面将参照根据图3的流程图，借助一个实施例介绍利用光片10如何能够进行交叠调节，该交叠调节是指使得样本的用两个共面的光片58、60照明的目标区域E在空间上与成像光学机构14的清晰区域F重合，该清晰区域根据图1沿着成像光学机构14的光轴O'位于探测光束62的焦点区域中。

在根据图3的流程图的步骤S1中，首先将光片照明自动地预先调节到成像光学机构14的清晰区域F上。该预先调节例如可以基于由摄像机42摄取的图像的亮度进行。为此，在控制单元44的控制下把调整反射镜26带到一个位置，光片照明在该位置负责最大的图像亮度。

在进行预先调节之后，在步骤S2中，在控制单元44的控制下通过补偿器22来调节两个分光束54、56的偏振状态，进而调节两个光片58、60的偏振状态，从而两个光片58、60在目标区域E中产生最大的干涉。在当前的实施例中，补偿器22为此调节两个分光束54、56的偏振状态，使得这些分光束线性地相互平行地偏振。通过这种方式，在目标区域E中通过两个光片58、60的干涉产生干涉图案，如在图5中纯示范性地示出。在此，为明了起见，图5在假定样本完全均匀的情况下示出干涉图案I。

根据图5的干涉图案I具有多个干涉条纹，这些干涉条纹参照图2在一个方向上伸展，该方向平行于角度α的角平分线延伸。角度α由两个照明方向夹成，两个光片58、60在这些照明方向上传播。在所示的实施例中，角度α的前述角平分线因而与照明光学机构18的光轴O叠合。因而如图5中所示，干涉条纹在照明光学机构18的光轴O的方向上伸展。

在后续步骤S3～S5中进行真正的调节。首先在步骤S3中通过摄像机42摄取样本的利用两个光片58、60照明的目标区域E的图像。由于两个光片产生在图5中示出的干涉图案I，所以对由摄像机42摄取的图像施加与干涉图案相应的图像调制。这在图7中示出，该图示出了目标区域的由摄像机42摄取的图像，在该图像中可清楚地看到水平条纹形式的与干涉图案I相应的图像调制。

在步骤S4中，控制单元44分析在所摄取的图像中含有的图像调制。为此，控制单元44利用了由于规定的光片造型对干涉图案I的特征的先验了解。在当前的实施例中，该特征通过调制周期即相邻干涉条纹之间的间距以及通过根据图5的干涉图案的方向而给定。调制周期按如下关系式得到：f＝λsin(α/2)，其中，f是调制周期，λ是光片的波长，α是两个光片58、60的传播方向之间的角度。干涉图案的方向也直接由规定的光片造型产生。如上已述，在当前实施例中，干涉条纹平行于照明光学机构18的光轴O伸展。

根据图5的干涉图案的特征反映在其通过傅里叶-分析产生的在图6中示出的空间频谱上。在根据图6的曲线图中，沿着水平轴标出了水平的空间频率，且沿着竖直轴标出了竖直的空间频率。单位由离散傅里叶-变换的特性给定，且把信号强度表示为灰度。在由图5中所示的干涉图案的调制周期产生的空间频率情况下，根据图6的空间频谱具有两个信号。准确地说，图6中的空间频率按照傅里叶变换分别形成干涉图案I的调制周期的倒数。为明了起见，在图6中省去了空间频率为零时的、表示空间频谱恒定分量的信号强度，因为该恒定分量远远超过了图6中所示的信号强度。参照水平轴，空间频率为零的恒定分量-信号位于图6中所示的两个信号之间。这里要考虑到，图6中的空间频率是以任意单位给出的。

在步骤S4中，因而对图7中所示的图像进行傅里叶变换，从而产生其在图8中示出的空间频谱，该图像具有与根据图5的干涉图案I相应的图像调制。根据图8的空间频谱沿着竖直轴示出了两个空间频率信号，这些空间频率信号以相等的间距布置在主要的中央信号的两侧，该中央信号在空间频率为零时表示空间频谱的恒定分量。前述两个信号反映了由干涉图案I引起的图像调制。特别地，这些信号的空间频率，即这些信号沿着竖直轴相距中央的恒定分量-信号所具有的(正的)间距，是通过干涉图案的调制周期确定的。该空间频率越大，干涉图案I的调制周期就越小，也就是说，图7中的相邻干涉条纹的间距就越小。图8中的表示图像调制的两个空间频率信号的方向相应于图7中的图像调制的方向。因而在图7中可看到，水平伸展的各干涉条纹在竖直方向上彼此相继。

基于干涉图案I的通过光片造型规定的特征，先验地已知的是，在哪个位置即在哪个空间频率分析根据图8的空间频谱，以便定量地检测图像调制。在当前的例子中，恰好在如下位置分析图8中所示的空间频谱：在这些位置发现两个信号位于中央的恒定分量信号之上或之下(例如仅仅上面的信号具有正的空间频率)。该信号表示图像调制的幅度，因此在以后用作交叠调节的优化参数。

在步骤S5中，机动的调整反射镜110在控制单元44的控制下，移调预定的阈值，由此使得两个彼此重叠的光片58、60共同地沿着成像光学机构14的光轴O'移动。接下来，控制流程返回至步骤S3。

步骤S3～S5例如采用直线的即一维的搜索算法(必要时考虑到合适的中断标准)重复一段时间，直至通过在步骤S4中检测的、表示图像调制幅度的空间频率信号给定的优化参数最大。

图4纯示范性地示出，图像调制的幅度根据在被照明的目标区域E与成像光学机构的清晰区域F之间沿着该成像光学机构的光轴O'出现的偏移而变化。如果该偏移等于零，则图像调制幅度最大，并且结束交叠调节。

最后在步骤S6中，利用控制单元44来控制补偿器22，从而该补偿器使得分光束54、56，进而使得光片58、60过渡至偏振状态，光片58、60在所述偏振状态下并不相互干涉。在当前的实施例中，光片58、60在所述偏振状态下彼此线性正交地偏振。通过这种偏振调节，使得干涉图案在目标区域E中消失。相应地，在目标区域E的由摄像机42摄取的图像中，消除了图像调制，如图9中所示。在此，对图像调制的消除同样可以按如下方式进行：在步骤S3～S5之一中，按照一维的搜索方法把图像调制的幅度用作优化参数，区别当然是，控制单元44在这种情况下并不控制调整反射镜26，而是控制补偿器22，并且图像调制的幅度不应最大，而是最小。目标区域E的按此方式被去除图像调制的图像于是可以被考虑用于真正的图像产生。

本发明不局限于上述实施例。例如可行的是，按照不同于所述实施例的方式进行交叠调节，在该实施例中，两个光片58、60沿着成像光学机构14的光轴O'移动。因而例如同样可行的是，为了交叠调节，移动成像光学机构14的清晰区域F。也可以按照不同于所述实施例的方式来影响光片58、60的偏振状态，只要保证两个光片58、60在预先调节期间在目标区域E中相互干涉。尤其可行的是，补偿器22仅作用于两个分光束54、56之一。本发明也不局限于使得两个光片58、60像前述实施例中那样从同一侧朝向目标区域E。因而例如也可行的是，两个光片58、60借助合适的偏转部件从不同侧聚焦到目标区域中。这种偏转部件例如可以通过安置在面向样本的照明物镜34上的所谓的反射镜盖罩来实现。

光显微镜也可以设计成上述类型的倾斜平面显微镜，该倾斜平面显微镜具有用于照明和探测的唯一的面向样本的物镜。

附图标记清单

10 光片显微镜

12 照明单元

14 成像光学机构

16 光源

18 照明光学机构

20 Wollaston-棱镜

22 机动的补偿器

24 柱面透镜

26 机动的调整反射镜

28 目镜透镜

30 偏转反射镜

32 管式透镜

34 照明物镜

36 物镜光瞳

38 成像物镜

40 管式透镜

42 摄像机

44 控制单元

46 控制线路

48 控制线路

50 控制线路

52 照明光束

54 分光束

56 分光束

58 光片

60 光片

62 探测光束

O 照明单元的光轴

O' 成像光学机构的光轴

E 目标区域

F 清晰区域

α 角度

β 角度

I 干涉图案

Claims (12)

1.一种用于借助光片显微镜(10)对样本成像的方法，其中，

利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对所述样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠；并且，

借助所述光片显微镜(10)的成像光学机构(14)产生被照明的所述目标区域(E)的图像，

其中，利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此对所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制，

其特征在于，

分析所述图像调制，并且，

根据所分析的所述图像调制，相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)，

其中，在相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)之前，使得两个所述光片(58、60)过渡至能干涉的偏振状态下，并且

在相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)之后，把两个所述光片(58、60)带到不能干涉的偏振状态下。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分析所述图像调制，其方式为，确定该图像调制的幅度，并且相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)，使得所述幅度最大。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，规定所述干涉图案(I)的特征，并且借助该规定的特征来分析所述图像调制，其中，所述特征由调制周期和干涉图案的方向产生。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干涉图案(I)以条纹图案的形式产生，该条纹图案的干涉条纹平行于由两个所述光片(58、60)的照明方向相互夹成的角度的角平分线伸展，其中，所述条纹图案按如下关系式以调制周期为特点：f＝λsin(α/2)，其中，f是调制周期，λ是所述光片的波长，α是所述角度。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，分析所述图像调制，其方式为，对所述图像进行傅里叶-分析。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，为了相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)来调节被照明的所述目标区域(E)，使得两个彼此共面地重叠的所述光片(58、60)共同地沿着所述成像光学机构(14)的光轴(O')移动。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)之前，使得两个所述光片(58、60)彼此非正交地线性地偏振。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于预先调节，在该预先调节中，根据所述图像的亮度相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)。

9.一种光片显微镜(10)，包括：

照明单元(12)，其被设计用于利用两个光片(58、60)从两个不同的照明方向对样本照明，这些光片具有不同的偏振状态，并且在所述样本的目标区域(E)中彼此共面地重叠；

成像光学机构(14)，其被设计用于产生被照明的所述目标区域(E)的图像；和

控制单元(44)，

其特征在于，

所述控制单元(44)被设计用于控制所述照明单元(12)，从而利用两个所述光片(58、60)在被照明的所述目标区域(E)中产生干涉图案(I)，由此给所述目标区域(E)的图像施加与所述干涉图案(I)相应的图像调制，

所述控制单元(44)被设计用于分析所述图像调制，并且所述控制单元(44)被设计用于控制所述照明单元(12)和/或所述成像光学机构(14)，从而根据所分析的所述图像调制相对于所述成像光学机构(14)的清晰区域(F)调节被照明的所述目标区域(E)，

其中，所述照明单元(12)包括可通过所述控制单元(44)予以控制的第二偏振部件(22)，该第二偏振部件被设计用于使得两个所述光片(58、60)有选择地过渡到能干涉的偏振状态和不能干涉的偏振状态下。

10.如权利要求9所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述照明单元(12)包括：

光源(16)，其被设计用于产生照明光束(52)；

第一偏振部件(20)，其被设计用于把所述照明光束(52)分成两个不同地偏振的分光束(54、56)；和

照明光学机构(14)，其被设计用于由两个所述分光束(54、56)产生两个对所述目标区域(E)照明的光片(58、60)。

11.如权利要求9所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述照明单元(12)包括可通过所述控制单元(44)予以控制的偏转部件(26)，通过该偏转部件可使得两个彼此共面地重叠的所述光片(58、60)共同地沿着所述成像光学机构(14)的光轴(O')移动。

12.如权利要求9所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述第二偏振部件(22)是延迟板。