JP2021514483A - 光シート顕微鏡によって試料を結像するための方法 - Google Patents

Abstract

記載されているのは、光シート顕微鏡（１０）によって試料を結像するための方法である。試料は、２つの光シート（５８，６０）によって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明され、２つの光シート（５８，６０）は、それぞれ異なる偏光状態を有していて、かつ試料の標的領域（Ｅ）内において互いに同一平面上で重ね合わせられている。照明された標的領域（Ｅ）の画像は、光シート顕微鏡（１０）の結像光学系（１４）によって生成される。２つの光シート（５８，６０）によって、照明された標的領域（Ｅ）内に干渉パターン（Ｉ）が生成され、それにより、干渉パターン（Ｉ）に対応する画像変調が標的領域（Ｅ）の画像に加えられる。画像変調が評価される。照明された標的領域（Ｅ）は、評価された画像変調に基づいて、結像光学系（１４）の焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整される。

Description

本発明は、光シート顕微鏡によって試料を結像するための方法であって、試料は、２つの光シートによって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明され、２つの光シートは、それぞれ異なる偏光状態を有していて、かつ試料の標的領域内において互いに同一平面上で重ね合わせられており、照明された標的領域の画像は、光シート顕微鏡の結像光学系によって生成される、方法に関する。本発明はさらに、相応に動作する光シート顕微鏡に関する。

いわゆる光シート顕微鏡法またはライトシート顕微鏡法では、試料の標的領域が、照明光学系を介して薄い光シートによって照明され、そのようにして照明された標的領域が、照明光学系の光軸に対して垂直に位置する光軸を有する結像光学系によって結像される。理想的には結像光学系の焦点距離と一致する、光シートによって照明される標的領域を、結像光学系の光軸に沿って試料を通して連続的にシフトさせることにより、３次元イメージングが可能である。広視野蛍光顕微鏡法に使用されるこの方法の利点は、とりわけ、試料の光負荷が特に少ないことでもある。

しかしながら、照明光が、結像光学系の光軸に対して垂直に伝搬することは問題である。したがって、試料内の散乱中心体または吸収体により、照明光の散乱もしくは吸収が発生することがあり、これは、結果的に得られる画像において、照明光の伝搬方向の縞模様のアーチファクトの形態で視認されることになる。

このようなアーチファクトを低減するために、独国特許発明第１０２０１６１０８３８４号明細書では、試料の標的領域を１つの光シートだけでなく２つの光シートによって照明することが提案されており、これら２つの光シートは、同一の側からではあるがそれぞれ異なる照明方向から標的領域へと向けられ、そこで互いに同一平面上で、すなわち１つの共通の照明平面上で重ね合わせられている。上記の形式の光シート照明は、照明光束がウォラストンプリズムを通過することによって実現され、このウォラストンプリズムは、照明光束を、それぞれ異なるように直線偏光された２つの部分束に分割し、これら２つの部分束は、照明光路の光軸から離れる方向に偏向され、これにより、それぞれ異なる照明方向から照明平面に、すなわち試料の標的領域に到達する。ここで、２つの照明方向のうちの一方において、散乱中心体または吸収体の結果としての照明光のシェーディングが発生した場合でも、依然として、散乱中心体または吸収体による影響を受けない他方の照明方向によって、標的領域の十分な光シート照明が保証されている。

光シート顕微鏡における可能な限り鮮明なイメージングを保証するためには、照明平面、すなわち、蛍光放射を放出するために励起される試料ボリュームを定義する、光シートの厚さによって規定される標的領域と、焦点平面、すなわち、被写界深度によって規定される結像光学系の焦点距離と、の間における、正確な空間的な重ね合わせが必要である。従来技術では、このために必要とされる、以下では重ね合わせ調整と称される微調整が実施され、この微調整によれば、通常、例えば微小な蛍光粒子が含まれた参照標本を使用しての視覚的な評価によって、照明された標的領域と、結像光学系の焦点距離と、の間の空間的な重ね合わせが形成される。重ね合わせ調整を実施するために、顕微鏡法によって撮影された試料画像自体を視覚的に評価することもできる。ただし、このような手順では、比較的大まかな重ね合わせ調整しかできない。とりわけ、参照標本を導入すると、屈折率の不一致の結果として例えば試料に起因する収差が発生するという本来の結像状況が反映されなくなる。これに対して、照明光路にミラーを挿入するという比較的手間のかかる調整方法が企図されており、このミラーは、調整が実施されるとすぐに、光シートを、結像光路の画像平面に配置されている検出器の基準位置へと偏向させる。

上述した方法はすべて、自動的な重ね合わせ調整が不可能であるという点において共通している。この場合には、試料画像の鮮明性の自動的な評価に基づく調整は、試料画像のフーリエ変換から得られる、結像されるべき試料の空間スペクトルが、基本的に未知であるという困難さに関連しているということを考慮すべきである。このことはつまり、とりわけ試料の空間スペクトルが、調整に適した微細な試料構造に由来する高い空間周波数を有しているかどうかの先験的な知識が存在しないことを意味する。

本発明の課題は、照明される試料の標的領域と、結像光学系の焦点距離と、の間の空間的な重ね合わせの正確かつ自動的な調整を可能にするような、光シート顕微鏡によって試料を結像するための方法および光シート顕微鏡自体を提供することである。

本発明は、独立請求項の対象によって上記の課題を解決する。有利な発展形態は、従属請求項に記載されている。

本発明は、光シート顕微鏡によって試料を結像するための方法であって、試料は、２つの光シートによって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明され、２つの光シートは、それぞれ異なる偏光状態を有していて、かつ試料の標的領域内において互いに同一平面上で重ね合わせられており、照明された標的領域の画像は、光シート顕微鏡の結像光学系によって生成される、方法を企図している。２つの光シートによって、照明された標的領域内に干渉パターンが生成され、それにより、干渉パターンに対応する画像変調が標的領域の画像に加えられる。画像変調が評価され、照明された標的領域は、評価された画像変調に基づいて、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整される。

本発明は、結像光学系によって撮影された標的領域の画像を、画像変調に鑑みて評価することにより、照明される標的領域を、結像光学系の焦点距離に対して相対的に自動的に調整することを企図している。画像変調は、結像される標的領域が２つの干渉し合う光シートによって照明されることにより、画像に加えられる。このようにして、標的領域を照明する干渉パターンが生成され、この干渉パターンは、照明された標的領域の画像内において、上述した画像変調の形態で反映され、この画像変調は、例えば、このために光シート顕微鏡に設けられた制御ユニットによって評価されて、自動的な重ね合わせ調整のために利用される。例えば、照明された標的領域の画像に加えられた画像変調が最大になったときに、調整が完了する。したがって、画像内に存在する変調は、光シート照明が当てられている標的領域と、結像光学系の焦点距離と、が、どのくらい正確に互いに空間的に重ね合わせられているかに大きく依存している。簡単に言えば、２つの光シートによって一緒に定義されている照明平面が、結像光学系の焦点平面と一致したときに、画像変調が最大になる。

重ね合わせ調整のためには、２つの光シートが、照明された標的領域内において互いに干渉することを保証すべきである。したがって、光シート同士が干渉のために十分な時間的および空間的コヒーレンスを有するように、光シートを生成すべきである。さらに、とりわけ２つの光シートが、標的領域内におけるこれらの光シート同士の干渉が総じて可能であるような偏光状態を、調整中に有することを保証すべきである。例えば２つの光シートが、最初からそれぞれ異なるように線形偏光されていると仮定すると、これら２つの光シートは、各自の偏光方向が互いに直交していない場合に、標的領域内において互いに干渉する。このことが保証されている限り、２つの光シートの偏光状態に影響を与えることによってこれらの光シート同士が標的領域内において干渉可能であることを保証するために特別に設けられている偏光手段は必要ない。しかしながら、光シート同士を干渉可能にするために特別に設けられているそのような偏光手段を使用して、有利には、偏光状態に相応に影響を与えることにより、標的領域内に、特に際立った干渉パターンを生成することができる。例えば、偏光手段を利用して、２つの光シートを平行に直線偏光させることができ、それにより、２つの光シート同士の干渉が最大化される。

このような偏光手段は、例えば、照明光路上の適切な箇所に挿入される複屈折結晶によって、または別の種類の偏光子、例えば遅延板によって実現可能である。同様に、照明光学系の偏光依存特性によって、例えば、干渉層の偏光依存相または応力複屈折のための手段を利用することによって、光シートの偏光状態に影響を与えることも可能である。さらに、電気光学的な手段、または液晶に基づいて動作する手段を利用することができる。

好ましくは、画像変調は、当該画像変調の振幅を特定することによって評価される。次いで、照明された標的領域は、画像変調の振幅が最大化されるように、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整される。したがって、画像変調の振幅は、簡単に検出可能な最適化パラメータであり、この最適化パラメータに基づいて、光シート顕微鏡において自動的な重ね合わせ調整を実施することができる。

有利な実施形態では、干渉パターンの特性は、予め定められ、画像変調は、当該予め定められた特性に基づいて評価される。上述した特性は、例えば光シート照明の選択された幾何形状から導出可能であって、ひいては先験的に既知である、干渉パターンの特性である。その場合、干渉パターンのこの既知の特性を、画像変調の評価のために簡単に使用することができる。

例えば、干渉パターンは、縞パターンの形態で生成され、縞パターンの干渉縞は、２つの光シートの照明方向が互いに成している角度の角二等分線に対して平行に延在しており、縞パターンは、以下の関係式：
ｆ＝λｓｉｎ（α／２）
に従う変調周期によって特徴付けられている。ここで、ｆは、変調周期を示し、λは、光シートの波長を示し、αは、照明方向が互いに成している上記の角度を示している。

この例では、変調周期ｆは、干渉パターンの、最初から既知である特性であり、この特性は、光シートの所定の波長λと、２つの光シートの２つの照明方向の間の同じく所定の角度αと、から、上記の関係式に従って得られる。変調周期の他に、干渉パターンの配向も、光シート照明の幾何形状から、すなわち２つの光シートの照明方向から既知である。今や、変調周期と干渉パターンの配向とが既知であることに基づいて、画像変調の振幅を、例えば画像のフーリエ解析によって簡単かつ確実に特定することができる。フーリエ解析によって生成された周波数空間では、干渉縞の密接に局所化された変調周期が、試料の先験的に既知でない構造を表している試料の空間スペクトルによって折り畳まれている。しかしながら、撮影された標的領域の画像は、正の実数データによって表されているので、フーリエスペクトルの直流成分を成しているこのデータの合計も、常に正の実数であり、したがって、干渉パターンの変調周期ｆと、干渉パターンの配向と、が先験的に既知であることにより、試料の高周波数の空間スペクトルにおいても、画像変調の振幅を確実に特定することが可能である。

すなわち、上述した例では、２つの光シートの照明方向の間の角度αが大き過ぎない場合に、干渉パターンの干渉縞を、光シート顕微鏡の結像光学系を介して、撮影された画像の変調の形態で簡単かつ確実に検出することができる。したがって、干渉縞によって画像に加えられた画像変調の振幅を、照明平面と結像光学系の焦点平面との間の共平面性に関する最適化パラメータまたは品質基準として利用することができる。画像変調の振幅は、最適化されるべき唯一のパラメータであるので、共平面性を調整するためのパラメータ空間は、１次元である。したがって、画像変調の振幅を最大化するために、簡単な線形の探索アルゴリズムを使用することができる。

好ましくは、重ね合わせ調整の目的で、同一平面上で重ね合わせられた２つの光シートが、結像光学系の光軸に沿って一緒にシフトされる。このことは、例えば、照明光路上に配置された偏向要素を介して実施可能であり、この偏向要素は、評価された画像変調に基づいて制御される。しかしながら、焦点距離と、照明された標的領域と、を空間的に一致させるために、光シート照明を移動させる代わりに結像光学系の方を、結像光学系の光軸に沿って移動させることも可能である。光シートと、結像光学系の焦点距離と、の両方を同時にシフトさせることも可能である。

好ましい実施形態では、照明された標的領域を、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整する前に、２つの光シートが、干渉可能な偏光状態へと移行される。例えば、上述した偏光状態は、標的領域内において２つの光シートが互いに直交しないように、とりわけ平行に直線偏光されるように選択される。これにより、標的領域内に顕著に際立った干渉パターンが形成されることが保証され、この顕著に際立った干渉パターンにより、撮影された画像内に、対応する顕著な画像変調が生成される。

さらに有利な実施形態では、照明された標的領域を、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整した後に、２つの光シートが、干渉不可能な偏光状態へと移行される。これにより、本来のイメージングを妨害する、顕微鏡画像の変調が回避される。このステップは、画像のフーリエ解析を使用して自動化することができる。

好ましくは、事前調整が実施され、当該事前調整では、照明された標的領域が、画像の輝度に基づいて、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整される。とりわけ試料の高周波数の空間スペクトルにおいては、そのような事前調整を、空間スペクトルと照明スペクトルとの折り畳みから生じる、検出されたスペクトル全体のエネルギ量に基づいて実施することも可能である。

本発明による光シート顕微鏡は、照明ユニットを含み、照明ユニットは、試料を、２つの光シートによって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明するように構成されており、２つの光シートは、それぞれ異なる偏光状態を有していて、かつ試料の標的領域内において互いに同一平面上で重ね合わせられており、当該光シート顕微鏡は、照明された標的領域の画像を生成するように構成された結像光学系を含み、当該光シート顕微鏡は、制御ユニットを含む。制御ユニットは、２つの光シートによって、照明された標的領域内に干渉パターンが生成され、それにより、干渉パターンに対応する画像変調が標的領域の画像に加えられるように、照明ユニットを制御するように構成されている。制御ユニットはさらに、画像変調を評価するように構成されており、制御ユニットはさらに、照明された標的領域が、評価された画像変調に基づいて、結像光学系の焦点距離に対して相対的に調整されるように、照明ユニットおよび／または結像光学系を制御するように構成されている。

好ましい実施形態では、照明ユニットは、照明光束を生成するように構成された光源と、照明光束を、２つのそれぞれ異なる偏光された部分束に分割するように構成された第１の偏光要素と、２つの部分束から標的領域を照明する２つの光シートを生成するように構成された照明光学系と、を含む。第１の偏光要素は、例えば２つの部分束を、好ましくは互いに逆向きの同じ角度で照明ユニットの光軸から離れるように偏向させるように構成されている。本実施形態において、２つの部分束が互いに成している角度をβとし（すなわち、光軸に対して互いに逆向きの同じ角度を±β／２とし）、結像光学系によってもたらされる倍率をγとすると、試料内に、照明ユニットの光軸に対して角度±β／２γで試料の内部を伝播する２つの光シートが生成される。２つの伝播方向が互いに成している角度βが０より大きい場合には、散乱および吸収によって引き起こされる縞模様のアーチファクトの形成が低減される。

好ましくは、第１の偏光要素は、２つの部分束が直線偏光されるように構成されており、この場合、これら２つの部分束の偏光方向は、互いに直交するように位置している。このような互いに直交する偏光方向は、本来のイメージングにおいて、２つの光シートの間の干渉の結果としての画像変調が排除されているという利点を有する。さらに、これら２つの偏光方向で照明することにより、蛍光体の励起における光選択作用が低減される。

好ましい実施形態では、第１の偏光要素は、ウォラストンプリズムである。そのようなプリズムは、例えば２つの直角の方解石プリズムからなり、これら２つの直角のプリズムは、底面同士が互いに接合されている。これら２つのプリズムの光軸は、互いに直交するように位置している。

好ましくは、照明ユニットは、制御ユニットによって制御可能な偏向要素を含み、偏向要素によって、互いに同一平面上で重ね合わせられている２つの光シートが、結像光学系の光軸に沿って一緒にシフト可能である。偏向要素は、例えば、２つの共平面の光シートを結像光学系の光軸に沿って移動させるために、制御ユニットによって制御されるモータによって駆動されるミラーである。

特に好ましい実施形態では、照明ユニットは、制御ユニットによって制御可能な第２の偏光要素を含み、第２の偏光要素は、２つの光シートを、干渉可能な偏光状態と、干渉不可能な偏光状態と、に選択的に移行させるように構成されている。とりわけ上述した第１の偏光要素と協働して、本実施形態によれば、正確な重ね合わせ調整と、とりわけ干渉作用の結果としての画像変調によって妨害されていない高解像度のイメージングと、の両方が可能となる。

好ましくは、本発明による光シート顕微鏡は、試料に面する２つの別個の対物レンズを有し、これらの対物レンズのうちの一方は、照明ユニットに対応付けられており、他方は、結像光学系に対応付けられており、これらの対物レンズの光軸は、互いに垂直に位置している。照明ユニットに対応する対物レンズは、好ましくは２つの光シートを、同一の側から試料の標的領域へと向ける。

光シート顕微鏡は、照明および検出の両方のために、試料に面するただ１つの対物レンズを有する、いわゆる斜め平面顕微鏡（oblique plane microscope）としても構成可能である。本実施形態では、光シート顕微鏡の結像光学系は、光シートを試料の標的領域内に結像すると同時に、照明された標的領域の画像を生成する伝送光学系として構成されている。伝送光学系は、好ましくは走査装置を有し、この走査装置は、試料を通して光シートを相応に移動させることにより、ボリュームイメージングのための軸方向および／または横方向の走査プロセスを実施するように構成されている。

以下では、本発明を、図面に基づいてより詳細に説明する。

本発明による光シート顕微鏡の１つの実施例の概略断面図である。 図１の光シート顕微鏡のさらなる概略断面図である。 １つの実施例に基づく本発明による重ね合わせ調整のための方法を説明するフローチャートである。 照明された標的領域と、光シート顕微鏡の結像光学系の焦点距離と、の間のオフセットに基づいて、画像変調の振幅を示す線図である。 標的領域内において生成された干渉パターンを示す図である。 フーリエ変換によって得られた、図５の干渉パターンの空間スペクトルを示す図である。 重ね合わせ調整の目的で干渉パターンに対応する画像変調を有する、標的領域の画像を示す図である。 フーリエ変換によって得られた、図７の画像の空間スペクトルを示す図である。 画像変調を除去した後の標的領域の画像を示す図である。

図１および図２は、光シート顕微鏡１０の断面図を示す。

光シート顕微鏡１０は、照明ユニット１２および結像光学系１４を含む。本実施例では、照明ユニット１２と結像光学系１４とは、各自の光軸ＯまたはＯ’が、図１および図２には明示的に図示されていない試料の領域内において互いに垂直に位置するように互いに配向されている。図１および図２では、それぞれｘｙｚ直交座標系が参照され、このｘｙｚ直交座標系のｚ軸は、照明ユニット１２の光軸Ｏと一致している。したがって、光シート顕微鏡１０は、図１ではｘ−ｚ断面で示されており、図２ではｙ−ｚ断面で示されている。図１および図２の図示は、簡略化されており、純粋に概略的である。したがって、本発明を理解するために必要とされるコンポーネントだけが図示されている。

照明ユニット１２は、光源１６と、図１および図２では全体として参照符号１８が付されている照明光学系と、を有する。照明光学系１８は、ウォラストンプリズム２０の形態の第１の偏光要素と、コンペンセータ２２の形態の電動式の第２の偏光要素と、シリンドリカルレンズ２４の形態のアナモルフィック集束系と、電動式の調整ミラー２６と、接眼レンズ２８と、偏向ミラー３０と、チューブレンズ３２と、対物レンズ瞳３６を有する照明対物レンズ３４と、を含む。上述したコンペンセータは、例えば複屈折結晶、とりわけ遅延板から形成されている。

結像光学系１４は、結像されるべき試料に面する結像対物レンズ３８と、チューブレンズ４０と、カメラ４２の形態の空間分解検出器と、を含む。

光シート顕微鏡１０はさらに、全体的な顕微鏡動作を制御する制御ユニット４４を含む。とりわけ、本実施例における制御ユニット４４は、コンペンセータ２２と、電動式の調整ミラー２６と、カメラ４２と、を制御し、以下で詳細に説明する画像評価を実施するために使用される。したがって、制御ユニット４４は、制御線路４６，４８，５０を介してコンペンセータ２２、調整ミラー２６、またはカメラ４２に接続されている。

光源１６は、コリメートされた照明光束５２をウォラストンプリズム２０に送出し、このウォラストンプリズム２０は、例えば２つの直角のプリズム、例えば方解石プリズムからなり、これら２つのプリズムは、底面同士が互いに接合されている。図２に示されているように、ウォラストンプリズム２０は、入射した照明光束５２を、それぞれ異なる偏光状態を有する２つの部分束５４，５６に分割する。ウォラストンプリズム２０が照明光束５２を２つの部分束５４，５６に分割する平面は、ｙ軸に対して平行に位置しており、すなわち、図２の断面図では図平面に位置しており、図１の断面図では図平面に対して垂直に位置している。

続いて、２つの部分束５４，５６は、コンペンセータ２２を通過し、このコンペンセータ２２により、必要に応じて部分束５４，５６の偏光状態に影響を与えることができる。このために光シート顕微鏡１０には、図１および図２には図示されていないサーボモータが設けられており、このサーボモータは、制御ユニット４４の制御下でコンペンセータ２２に作用して、このコンペンセータ２２が、２つの部分束５４，５６の偏光状態に所期のように影響を与えるように、または２つの部分束５４，５６の偏光状態を所期のように不変に維持するようにする。

続いて、部分束５４，５６は、シリンドリカルレンズ２４を通過する。シリンドリカルレンズ２４は、部分束５４，５６を、それぞれｘ軸に対して平行な方向においてのみ集束させ、その一方で、ｙ軸に対して平行な方向では、部分束５４，５６に対して光学的な作用を与えないという特性を有する。したがって、シリンドリカルレンズ２４は、自身の焦点平面の領域内に、これらの部分束５４，５６からそれぞれ１つの光シート状の照明光分布を生成し、この光シート状の照明光分布は、ｘ軸の方向には集束されていて、ｙ軸の方向には平面状に拡がっている。これに関連して、図１および図２のこれに関連する図示は、理解しやすくするために簡略化されていることに留意すべきである。したがって、例えば図２では、シリンドリカルレンズ２４に共役する平面に相当する、シリンドリカルレンズ２４から出射した２つの部分束５４，５６の焦点が、電動式の調整ミラー２６の表面上に配置されている。しかしながら実際には、これらの焦点のうちの一方が、光の伝播方向においてこの表面の表側にあり、他方がこの表面の裏側にある。偏向ミラー３０の表面における焦点の図示に関しても、同様のことが当てはまる。さらに、調整ミラー２６および偏向ミラー３０において行われる光偏向は、図１および図２に同様に図示されているが、図示されているようなこれらの光偏向は、ｘ−ｚ平面またはｙ−ｚ平面のいずれか一方のみにおいて行われている。

調整ミラー２６において反射された後、２つの部分束５４，５６は、接眼レンズ２８を通過して、偏向ミラー３０において反射される。続いて、部分束５４，５６は、チューブレンズ３２を通過した後、照明対物レンズ３４の入射瞳３６に到着し、照明対物レンズ３４は、これらの部分束５４，５６が２つのそれぞれ異なる照明方向から試料の標的領域Ｅを照明するように、これらの部分束５４，５６を試料へと向ける。

光シート顕微鏡１０の照明光学系１８は、それぞれ異なる照明方向に伝播する２つの光シート５８，６０を上述した方法で生成し、これら２つの光シート５８，６０は、照明されるべき試料の標的領域Ｅ内において互いに同一平面上で重ね合わせられている。具体的な実施例において、コンペンセータ２２が差し当たりまだ、部分束５４，５６の偏光状態に影響を与えていないと仮定すると、これら２つの光シート５８，６０は、標的領域Ｅ内において互いに直交するように直線偏光されている。したがって、例えば、部分束５４に対応する光シートは、ｐ偏光されており、その一方で、部分束５６に対応する光シートは、ｓ偏光されている。接眼レンズ２８と、チューブレンズ３２と、照明対物レンズ３４と、が照明光学系１８の内部に１つの中間結像光学系を形成しており、この中間結像光学系は、シリンドリカルレンズ２４が偏向ミラー２６の位置に部分束５４，５６を集束させることによって生成した光シートを、試料の標的領域Ｅ内に結像する。

図２による実施例では、光シート５８，６０が試料の標的領域Ｅへと向けられる２つの照明方向は、互いに角度αを成している。この角度αは、ウォラストンプリズム２２による分割後に２つの部分束５４，５６が互いに成している角度βと相関している。具体的には、角度αは、関係式α＝β／γに従って得られ、ここで、γは、接眼レンズ２８と、チューブレンズ３２と、照明対物レンズ３４と、から形成される中間結像光学系の倍率を表している。

図３のフローチャートを参照しながら、以下では、１つの実施例に基づいて、光シート１０によってどのようにして重ね合わせ調整を実施することができるかを説明する。この重ね合わせ調整の目的は、２つの共平面の光シート５８，６０によって照明される試料の標的領域Ｅを、結像光学系１４の焦点距離Ｆと空間的に一致させることであり、図１によれば、この焦点距離Ｆは、結像光学系１４の光軸Ｏ’に沿って、検出ビーム束６２の焦点の範囲内に位置している。

図３のフローチャートのステップＳ１では、まず始めに光シート照明が、結像光学系１４の焦点距離Ｆへと自動的に事前調整される。この事前調整は、例えば、カメラ４２によって撮影された画像の輝度に基づいて実施可能である。このために調整ミラー２６は、制御ユニット４４の制御下で、光シート照明が最大画像輝度をもたらすような位置へと移動される。

事前調整が実施された後、ステップＳ２において、２つの部分束５４，５６の、ひいては２つの光シート５８，６０の偏光状態が、制御ユニット４４の制御下でコンペンセータ２２により、標的領域Ｅ内における２つの光シート５８，６０の干渉が最大になるように調整される。本実施例では、このためにコンペンセータ２２は、２つの部分束５４，５６が互いに平行に直線偏光されるように、２つの部分束５４，５６の偏光状態を調整する。このようにして標的領域Ｅ内には、２つの光シート５８，６０の干渉により、図５に純粋に例として示されているような干渉パターンが生成される。簡単にするために、図５は、試料が完全に均質であると仮定した場合の干渉パターンＩを示す。

図５の干渉パターンＩは、多数の干渉縞を有し、これらの干渉縞は、図２を参照すると、角度αの角二等分線に対して平行な方向に延在している。角度αは、２つの光シート５８，６０が伝播する２つの照明方向によって成される角度である。したがって、図示の実施例では、角度αの上述した角二等分線は、照明光学系１８の光軸Ｏと一致する。したがって、干渉縞は、図５に示されているように、照明光学系１８の光軸Ｏの方向に延在している。

後続のステップＳ３〜Ｓ５において、本来の調整が実施される。まず始めにステップＳ３において、２つの光シート５８，６０によって照明される試料の標的領域Ｅの画像が、カメラ４２によって撮影される。２つの光シートは、図５に示された干渉パターンＩを生成するので、カメラ４２によって撮影された画像に、この干渉パターンに対応する画像変調が加えられる。このことは、カメラ４２によって撮影された標的領域の画像を示す図７に示されており、この画像内では、干渉パターンＩに対応する横縞の形態の画像変調を明確に認識することができる。

ステップＳ４において、制御ユニット４４は、撮影された画像内に含まれている画像変調を評価する。このために制御ユニット４４は、所定の光シート幾何形状の結果としての干渉パターンＩの特性の先験的な知識を利用する。本実施例では、この特性は、変調周期、すなわち隣り合う干渉縞同士の間の間隔と、図５の干渉パターンの配向と、によって与えられている。変調周期は、以下の関係式：
ｆ＝λｓｉｎ（α／２）
から得られ、ここで、ｆは、変調周期を表し、λは、光シートの波長を表し、αは、２つの光シート５８，６０の伝播方向の間の角度を表している。干渉パターンの配向も、所定の光シート幾何形状から直接的に得られる。既述したように本実施例では、干渉縞は、照明光学系１８の光軸Ｏに対して平行に延在している。

図５の干渉パターンの特性は、フーリエ解析によって生成された、図６に示されている当該干渉パターンの空間スペクトルに反映されている。図６の線図では、水平軸に沿って水平空間周波数が示されており、垂直軸に沿って垂直空間周波数が示されている。単位は、離散フーリエ変換の特性によって与えられており、信号強度は、グレースケールとして示されている。図６の空間スペクトルは、図５に示されている干渉パターンの変調周期から生じた空間周波数の場合には、２つの信号を有する。より正確に言えば、フーリエ変換による図６の空間周波数は、それぞれ干渉パターンＩの変調周期の逆数を表している。説明を簡単にするために、図６では、空間スペクトルの直流成分を表している空間周波数ゼロにおける信号強度が省略されている。なぜなら、図６に示されている信号強度を何倍も上回っているからである。空間周波数がゼロである直流成分の信号は、水平軸に関して、図６に示されている２つの信号の間に位置している。図６の空間周波数が、任意単位で示されていることに留意すべきである。

すなわち、ステップＳ４において、図５の干渉パターンＩに対応する画像変調を有する図７に示された画像が、フーリエ変換に供され、それにより、図８に示された空間スペクトルが生成される。図８の空間スペクトルは、垂直軸に沿って２つの空間周波数信号を示しており、これら２つの空間周波数信号は、空間周波数ゼロでの空間スペクトルの直流成分を表している支配的な中心信号の両側に、等間隔で配置されている。上述した２つの信号は、干渉パターンＩによって引き起こされた画像変調を反映している。とりわけ、これらの信号の空間周波数、すなわち、これらの信号が中央の直流成分の信号から垂直軸に沿って有する（正の）距離は、干渉パターンの変調周期によって規定されている。この空間周波数が大きければ大きいほど、干渉パターンＩの変調周期が短くなり、すなわち、図７の隣り合う干渉縞同士の間の間隔が狭くなる。画像変調を表している図８の２つの空間周波数信号の配向は、図７の画像変調の方向に対応する。したがって、図７では、水平方向に延在している干渉縞が垂直方向に連続して生じていることが認識される。

画像変調を定量的に検出するために、図８の空間スペクトルをどの箇所において、すなわちどの空間周波数において評価すべきであるかは、光シート幾何形状によって規定されている干渉パターンＩの特性に基づいて先験的に既知である。この例では、図８に示されている空間スペクトルは、中央の直流成分の信号の上または下に２つの信号が発見される正にその箇所において評価されるべきである（または正の空間周波数を有する上側の信号のみ）。この信号は、画像変調の振幅を表しており、したがって、重ね合わせ調整のための最適化パラメータとしてさらに利用される。

ステップＳ５において、電動式の調整ミラー２６が、制御ユニット４４の制御下で所定の制御値の分だけ調整され、これによって、２つの互いに重ね合わせられた光シート５８，６０は、結像光学系１４の光軸Ｏ’に沿って一緒にシフトされる。続いて、制御フローはステップＳ３に戻る。

ステップＳ３〜Ｓ５は、ステップＳ４において検出された、画像変調の振幅を表す空間周波数信号によって与えられている最適化パラメータが最大化されるまで、例えば線形の、すなわち１次元の探索アルゴリズムを使用して（場合によっては、適切な終了基準を使用して）繰り返される。

図４は、照明された標的領域Ｅと結像光学系の焦点距離Ｆとの間で結像光学系の光軸Ｏ’に沿って生じるオフセットに基づいて画像変調の振幅がどのように変化するかを、純粋に例として示す。このオフセットがゼロに等しくなると、画像変調の振幅が最大になり、重ね合わせ調整が完了する。

最後にステップＳ６において、部分束５４，５６、ひいては光シート５８，６０を、これらの光シート５８，６０同士が互いに干渉しないような偏光状態へと移行させるように、制御ユニット４４によってコンペンセータ２２が制御される。本実施例では、光シート５８，６０は、この偏光状態では、互いに直交するように直線偏光されている。この偏光調整により、標的領域Ｅ内の干渉縞が消滅する。これによって、図９に示されているように、カメラ４２によって撮影された標的領域Ｅの画像内において画像変調が除去される。画像変調の除去は、ステップＳ３〜Ｓ５に対応する１次元の探索法において画像変調の振幅を最適化パラメータとして利用することによっても実施可能であるが、もちろん、この場合には、制御ユニット４４が、調整ミラー２６ではなくコンペンセータ２２を駆動し、また、画像変調の振幅を最大化するのではなく最小化するべきであるという違いがある。このようにして画像変調から解放された標的領域Ｅの画像を、本来のイメージングのために使用することができる。

本発明は、上述した実施例に限定されているわけではない。例えば、２つの光シート５８，６０を結像光学系１４の光軸Ｏ’に沿ってシフトさせる上述した実施例とは異なる方法で、重ね合わせ調整を実施することが可能である。したがって、例えば、重ね合わせ調整の目的で、結像光学系１４の焦点距離Ｆをシフトさせることも可能である。事前調整中に２つの光シート５８，６０が標的領域Ｅ内において互いに干渉することが保証されている限り、光シート５８，６０の偏光状態に、上述した実施例とは異なる方法で影響を与えることも可能である。とりわけ、コンペンセータ２２が２つの部分束５４，５６のうちの一方のみに作用するようにすることが可能である。また、本発明は、上述した実施例の場合のように、２つの光シート５８，６０を同一の側から標的領域Ｅへと向けることに限定されているわけではない。したがって、例えば、適切な偏向要素を用いて２つの光シート５８，６０をそれぞれ異なる側から標的領域へと集束させることも可能である。このような偏向要素は、例えば、試料に面する照明レンズ３４に取り付けられているいわゆるミラーキャップによって実現可能である。

光シート顕微鏡は、照明および検出の両方のために、試料に面するただ１つの対物レンズを有する、上述した形式の斜め平面顕微鏡としても構成可能である。

１０ 光シート顕微鏡
１２ 照明ユニット
１４ 結像光学系
１６ 光源
１８ 照明光学系
２０ ウォラストンプリズム
２２ 電動式のコンペンセータ
２４ シリンドリカルレンズ
２６ 電動式の調整ミラー
２８ 接眼レンズ
３０ 偏向ミラー
３２ チューブレンズ
３４ 照明対物レンズ
３６ 対物レンズ瞳
３８ 結像対物レンズ
４０ チューブレンズ
４２ カメラ
４４ 制御ユニット
４６ 制御線路
４８ 制御線路
５０ 制御線路
５２ 照明光束
５４ 部分束
５６ 部分束
５８ 光シート
６０ 光シート
６２ 検出ビーム束
Ｏ 照明ユニットの光軸
Ｏ’ 結像光学系の光軸
Ｅ 標的領域
Ｆ 焦点距離
α 角度
β 角度
Ｉ 干渉パターン

Claims (15)

1. 光シート顕微鏡（１０）によって試料を結像するための方法であって、
   前記試料は、２つの光シート（５８，６０）によって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明され、前記２つの光シート（５８，６０）は、それぞれ異なる偏光状態を有していて、前記試料の標的領域（Ｅ）内において互いに同一平面上で重ね合わせられており、
   照明された前記標的領域（Ｅ）の画像は、前記光シート顕微鏡（１０）の結像光学系（１４）によって生成される、
   方法において、
   前記２つの光シート（５８，６０）によって、照明された前記標的領域（Ｅ）内に干渉パターン（Ｉ）が生成され、それにより、前記干渉パターン（Ｉ）に対応する画像変調が前記標的領域（Ｅ）の前記画像に加えられ、
   前記画像変調が評価され、
   照明された前記標的領域（Ｅ）は、評価された前記画像変調に基づいて、前記結像光学系（１４）の焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整される、
   方法。
2. 前記画像変調は、前記画像変調の振幅を特定することによって評価され、
   照明された前記標的領域（Ｅ）は、前記振幅が最大化されるように、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整される、
   請求項１記載の方法。
3. 前記干渉パターン（Ｉ）の特性は、予め定められ、
   前記画像変調は、前記予め定められた特性に基づいて評価される、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記干渉パターン（Ｉ）は、縞パターンの形態で生成され、
   前記縞パターンの干渉縞は、前記２つの光シート（５８，６０）の照明方向が互いに成している角度の角二等分線に対して平行に延在しており、
   前記縞パターンは、以下の関係式：
   ｆ＝λｓｉｎ（α／２）
   に従う変調周期によって特徴付けられており、
   ｆは、前記変調周期を示し、λは、前記光シートの波長を示し、αは、上記の角度を示している、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記画像変調は、前記画像をフーリエ分析に供することによって評価される、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 照明された前記標的領域（Ｅ）を、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整するために、同一平面上で重ね合わせられた前記２つの光シート（５８，６０）は、前記結像光学系（１４）の光軸（Ｏ’）に沿って一緒にシフトされる、
   請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 照明された前記標的領域（Ｅ）を、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整する前に、前記２つの光シート（５８，６０）は、干渉可能な偏光状態へと移行される、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 照明された前記標的領域（Ｅ）を、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整する前に、前記２つの光シート（５８，６０）は、互いに直交しないように直線偏光される、
   請求項７記載の方法。
9. 照明された前記標的領域（Ｅ）を、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整した後に、前記２つの光シート（５８，６０）は、干渉不可能な偏光状態へと移行される、
   請求項７または８記載の方法。
10. 事前調整が実施され、前記事前調整では、照明された前記標的領域（Ｅ）は、前記画像の輝度に基づいて、前記結像光学系（１４）の前記焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整される、
    請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
11. 光シート顕微鏡（１０）であって、
    前記光シート顕微鏡（１０）は、照明ユニット（１２）を含み、前記照明ユニット（１２）は、試料を、２つの光シート（５８，６０）によって２つのそれぞれ異なる照明方向から照明するように構成されており、前記２つの光シート（５８，６０）は、それぞれ異なる偏光状態を有していて、前記試料の標的領域（Ｅ）内において互いに同一平面上で重ね合わせられており、
    前記光シート顕微鏡（１０）は、照明された前記標的領域（Ｅ）の画像を生成するように構成された結像光学系（１４）を含み、
    前記光シート顕微鏡（１０）は、制御ユニット（４４）を含む、
    光シート顕微鏡（１０）において、
    前記制御ユニット（４４）は、前記２つの光シート（５８，６０）によって、照明された前記標的領域（Ｅ）内に干渉パターン（Ｉ）が生成され、それにより、前記干渉パターン（Ｉ）に対応する画像変調が前記標的領域（Ｅ）の前記画像に加えられるように、前記照明ユニット（１２）を制御するように構成されており、
    前記制御ユニット（４４）は、前記画像変調を評価するように構成されており、
    前記制御ユニット（４４）は、照明された前記標的領域（Ｅ）が、評価された前記画像変調に基づいて、前記結像光学系（１４）の焦点距離（Ｆ）に対して相対的に調整されるように、前記照明ユニット（１２）および／または前記結像光学系（１４）を制御するように構成されている、
    光シート顕微鏡（１０）。
12. 前記照明ユニット（１２）は、
    照明光束（５２）を生成するように構成された光源（１６）と、
    前記照明光束（５２）を、２つのそれぞれ異なる偏光された部分束（５４，５６）に分割するように構成された第１の偏光要素（２０）と、
    ２つの前記部分束（５４，５６）から前記標的領域（Ｅ）を照明する前記２つの光シート（５８，６０）を生成するように構成された照明光学系（１８）と、
    を含む、
    請求項１１記載の光シート顕微鏡（１０）。
13. 前記照明ユニット（１２）は、前記制御ユニット（４４）によって制御可能な偏向要素（２６）を含み、
    前記偏向要素（２６）によって、互いに同一平面上で重ね合わせられている前記２つの光シート（５８，６０）は、前記結像光学系（１４）の光軸（Ｏ’）に沿って一緒にシフト可能である、
    請求項１１記載の光シート顕微鏡（１０）。
14. 前記照明ユニット（１２）は、前記制御ユニット（４４）によって制御可能な第２の偏光要素（２２）を含み、
    前記第２の偏光要素（２２）は、前記２つの光シート（５８，６０）を、干渉可能な偏光状態と、干渉不可能な偏光状態と、に選択的に移行させるように構成されている、
    請求項１１または１２記載の光シート顕微鏡（１０）。
15. 前記第２の偏光要素（２２）は、遅延板である、
    請求項１４記載の光シート顕微鏡（１０）。

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