WO2017191193A1 - Vorrichtung und verfahren zur lichtblattartigen beleuchtung einer probe - Google Patents

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WO2017191193A1
WO2017191193A1 PCT/EP2017/060545 EP2017060545W WO2017191193A1 WO 2017191193 A1 WO2017191193 A1 WO 2017191193A1 EP 2017060545 W EP2017060545 W EP 2017060545W WO 2017191193 A1 WO2017191193 A1 WO 2017191193A1
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    • G02B27/283—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00 for polarising used for beam splitting or combining

Definitions

  • the invention relates to a device for illuminating a sample like a light sheet, comprising a light source for generating a lighting beam and a focusing system for focusing the illumination light beam into a light sheet-like illumination light distribution, with which a focal plane of the sample can be illuminated. Furthermore, the invention relates to a method for the light sheet-like illumination of a sample.
  • a sample is illuminated with a light sheet via an illumination objective whose optical axis is perpendicular to the optical axis of the detection optics.
  • an illumination objective whose optical axis is perpendicular to the optical axis of the detection optics.
  • US Pat. No. 7,787,179 B2 proposes the use of an adjustable deflection element for the sequential generation of different directions of incidence of the illumination sheet.
  • the deflector must be designed to achieve a sufficient speed, for example as a galvanometer and is therefore expensive.
  • the movement of the deflection element must be synchronized with the frame rate of the detection in order to avoid additional brightness artefacts.
  • the speed of the deflection element is limited to the maximum frame rate of the entire system.
  • the document US Pat. No. 7,787,179 B2 also provides for the use of cylindrical lens arrays and of a light source with low spatial coherence for producing a plurality of laterally offset light sheets.
  • the use of a light source with low spatial coherence proposed here to avoid interference artefacts between the individual sub-beams along the long lateral axis of the light sheet reduces the quality of the light sheet along the short lateral axis, since here too Coherence is reduced and so no diffraction-limited focusing is possible.
  • DE 10 2004 034 957 A1 and DE 10 2012 214 568 A1 disclose illumination systems for SPIM illumination, each of which can have birefringent light splitting, the sub-beams thus generated propagating in opposite illumination directions.
  • the opposite illumination directions require that the sample volume be reachable from three directions. Two of these directions are opposite each other while the third direction is orthogonal thereto.
  • the object of the invention is to provide an apparatus and a method for the light sheet-like illumination of a sample, which avoid the disadvantages of conventional systems described above, the occurrence of streak artifacts caused by shading of the illumination light within the sample with selective illumination of the focal plane by means of a Light sheets are caused, can be largely prevented.
  • the device provides a light source for generating an illuminating light bundle and a focusing system for focusing the illuminating light bundle to form a light-leaflet illumination light distribution with which a focal plane of the specimen can be illuminated.
  • an imaging optics is also provided, which images the light sheet-like illumination light distribution into the focal plane of the sample.
  • a polarization element is arranged, which splits the illumination light beam into two differently polarized sub-beams propagating in different propagation directions in the imaging optics, whereby the light sheet-like illumination light distribution by the imaging optics in the form of two differently polarized sheets of light in the focal plane each other are superimposed, is mappable.
  • the two partial beams generated by the polarization element propagate into the imaging optics at different angles to the optical axis of the illumination beam path, two light sheets are generated in the sample which illuminate the considered focal plane from different directions. If shading of the illumination light now occurs in one of the two illumination directions as a result of a scattering center or an absorber, sufficient illumination of the focal plane is still ensured by the other illumination direction unimpaired by the scattering center or the absorber. As a result, stripe artifacts can be reliably avoided.
  • the device according to the invention permits the coupling of illumination light into a SPIM system which has a single illumination objective.
  • the implementation of the invention is technically less expensive than conventional systems in which propagate differently polarized sub-beams in opposite directions of illumination in the sample and therefore require two separate illumination lenses.
  • the device according to the invention is particularly preferably applicable in a conventional SPIM arrangement, in which in addition to a lighting objective a separate detection lens is provided.
  • the invention is not limited to this application.
  • it can also be used in oblique plane microscopy, where a single objective is used for illumination and detection.
  • the polarization element is arranged in a position conjugate to the focal plane. This conjugate position is, for example, at the location of the light sheet primarily generated by the focusing system.
  • the polarization element is designed to deflect the two sub-beams at opposite equal angles from the optical axis of the lighting device. Designating the above-mentioned angle with ⁇ and the magnification with ⁇ caused by the imaging optics, in this embodiment two light sheets are generated in the sample which propagate at an angle ⁇ ⁇ / ⁇ to the optical axis of the illumination device within the sample.
  • the polarization element is formed so that the two sub-beams are linearly polarized, their polarization directions are perpendicular to each other.
  • the mutually perpendicular polarization directions have the advantage that an interference between the two sheets is excluded.
  • illumination with these two directions of polarization reduces photoselection effects in the excitation of fluorophores.
  • the polarization element is a Wollaston prism.
  • Such a prism consists, for example, of two right-angled caicitve prisms, which are cemented to one another at their base surfaces. The optical axes of the two prisms are perpendicular to each other.
  • the focusing system comprises an anamorphic optical element, eg a cylindrical lens.
  • an anamorphic optical element eg a cylindrical lens.
  • the anamorphic element can focus either in a plane conjugated to the object or else in a plane conjugated to the pupil.
  • the polarizing element is expediently arranged in one of the front focal planes of the anamorphic optical element conjugate plane, in the latter form in a plane conjugate to the rear focal plane of the anamorphic optical element.
  • the focusing system comprises a scanning device and a cylindrically symmetrical optics.
  • the scanning device is, for example, a scanning mirror tiltable about an axis, for example a galvanometer mirror or a mirror based on a microelectromechanical system, in short MEMS mirror, which deflects the illumination bundle as a result of its tilt within a plane in such a way that the illumination beam is in this plane build up a light sheet, as it were.
  • the cylindrically symmetric optics is eg an f-theta lens or an f-tan theta lens. A concrete realization of such a focusing system is described, for example, in US Pat. No. 8,970,950 B2.
  • the plane in which the polarization element (16) splits the illumination light bundle into the two sub-beams is perpendicular to the focusing direction of the anamorphic optical system or perpendicular to the scanning direction of the scanning device, the focusing or the scanning direction being expediently perpendicular to the optical path Axis of the lighting device is located.
  • the illumination light beam is linearly polarized.
  • the invention is not limited to such an embodiment.
  • the illumination light beam can also be unpolarized.
  • the use of circular or elliptically polarized illumination light is also possible.
  • the illumination light beam is linearly polarized, its polarization direction preferably has an angle of 45 ° with respect to the splitting direction of the polarization element. This allows a particularly simple implementation of the lighting device according to the invention.
  • the imaging optics comprise a lens, which represents the only illumination objective.
  • the invention can be used particularly profitably in a conventional SPIM microscope, which has a single illumination objective and a separate detection objective.
  • the imaging optics include an infinity lens and a tube lens. This essentially two-part structure of the imaging optics has the advantage that further optical components can be coupled in the infinity beam path adjoining the objective in a particularly simple manner, if this is necessary or helpful. This design also allows for a particular modularity of the system through the usability of the large commercially available portfolios of infinity objectives.
  • the imaging optics include a finite lens. For a particularly compact and easy to implement one-piece design of the magnification system is possible.
  • the invention further provides a method for illuminating a specimen according to claim 14, in which an illumination beam is generated and the illumination beam is focused into a light sheet-like illuminating light distribution with which a focal plane of the specimen can be illuminated, wherein the light-sheet-like illuminating light distribution into the focal plane of the specimen is imaged and the illumination beam is split into two differently polarized sub-beams, which propagate in different propagation directions in the imaging optics, and the light sheet-like illumination light distribution through the imaging optics in the form of two differently polarized sheets of light, which are superimposed on each other in the focal plane.
  • the method according to the invention is applied in a SPIM microscope or an oblique plane microscope.
  • Figure 1 is a schematic sectional view of a lighting device according to the invention as a first embodiment
  • FIG. 2 shows a further sectional view of the lighting device according to the first exemplary embodiment
  • Figure 3 is a schematic sectional view of an inventive
  • Lighting device as a second embodiment
  • FIG. 4 shows a further sectional view of the lighting device according to the second embodiment.
  • Figure 5 is a further sectional view of a lighting device according to the invention as a third embodiment.
  • FIG. 6 shows a further sectional view of the lighting device according to the third exemplary embodiment.
  • Figures 1 and 2 show sectional views of a lighting device 10, which is for example part of a SPI M microscope.
  • the SPI M microscope contains a detection unit 11, shown only schematically in FIGS. 1 and 2, with detection optics 13 and a detector 15.
  • the optical axis O 'of the detection optics 13 is arranged perpendicular to the optical axis O of the illumination device 10.
  • FIGS. 1 and 2 reference is made in each case to a rectangular coordinate system xyz whose z-axis coincides with the optical axis O. Accordingly, the lighting device 10 is shown in Figure 1 in an xz-section and in Figure 2 in a yz-section.
  • the illumination device 10 comprises a light source 12, an anamorphic focusing system 14 in the form of a cylindrical lens, a Wollaston prism 16 and an imaging optics 18, which is formed from a tube lens 20 and an infinity objective 22. Between the infinity lens 22 and the tube lens 20 is located at 24 designated entrance pupil of the infinity lens 22nd
  • the light source 12 emits a collimated illuminating light beam 26 on the cylindrical lens 14.
  • the cylinder lens 14 has the characteristic that it focuses the illuminating light beam 26 only in a direction parallel to the x-axis, while it has no optical effect on the illuminating light beam 26 in a direction parallel to the y-axis.
  • the cylindrical lens 14 generates in the region of its focal plane a light sheet-like illumination light distribution, which is focused in the direction of the x-axis and extended in the direction of the y-axis surface.
  • This illumination light distribution is imaged by the imaging optics 18 into a focal plane designated E in the figures.
  • the Wollaston prism 16 is located on the optical axis O at the point where the cylindrical lens 14 focuses the illumination light beam 26 to the light sheet-like illumination light distribution.
  • the Wollaston prism 16 consists of two right-angled prisms, eg calcite prisms 28, 30 cemented together at their base surfaces.
  • the optical axes, not shown in FIG. 2, of the two prisms 28, 30 are perpendicular to one another.
  • the Wollaston prism 16 is arranged in the beam path of the illumination device 10 so that its entrance surface 32 is aligned perpendicular to the optical axis O.
  • the incident on the entrance surface 32 illuminating light beam 26 is split by the Wollaston prism 16 in two sub-beams 34, 36 a, each having a different polarization.
  • the plane in which the Wollaston prism 16 splits the illumination beam into the two sub-beams 34, 36 is parallel to the y-axis, ie in the section of FIG. 2 in the plane of the drawing and in the section of FIG. 1 perpendicular to the plane of the drawing.
  • the splitting plane of the Wollaston prism thus runs perpendicular to the focusing direction of the cylindrical lens 14.
  • the partial bundle 34 shown by solid lines is intended to be p-polarized purely by way of example and the partial bundle 36 represented by dashed lines to be s-polarized.
  • the illuminating light bundle 26 entering the wollaston prism 16 is itself linearly polarized, the polarization direction of the illuminating light bundle 26 being perpendicular to the optical axis O and opposite to the splitting direction of the illuminating beam 26 Wollaston prism 16 has an angle of 45 °.
  • This linear polarization of the illumination light beam 26 is again to be understood purely as an example. So it is also possible that the illumination light is unpolarized, circularly polarized or elliptically polarized.
  • the Wollaston prism 16 splits the illumination light beam 26 such that the two sub-beams 34 and 36 are deflected in the sectional view of Figure 2 at opposite equal angles from the optical axis O.
  • the respective angle is designated ⁇ in FIG.
  • the angle ⁇ is chosen such that it lies within the acceptance range of the imaging optical unit 18. This ensures that the two sub-beams 34, 36 arrive in each case in the imaging optics.
  • the imaging optics 18, which images the light sheet-like illumination light distribution generated by the cylindrical lens 14 at the location of the Wollaston prism 16 in the focal plane E, produces two separate light sheets in the focal plane E, of which the light beam associated with the sub-beam 34 is p-polarized and the sub-beam 36 associated light sheet is s-polarized. As shown in FIG. 2, the two light sheets in the region of the focal plane E are superimposed on one another. Assuming that the imaging optics 18 has an enlargement ⁇ , the two polar sheets, which are polarized perpendicular to one another, propagate in the sample at an angle ⁇ ⁇ / ⁇ to the optical axis O.
  • FIGS. 3 and 4 are sectional views corresponding to FIGS. 1 and 2, respectively, and show a second exemplary embodiment which has an imaging optical unit 18 'modified in comparison with the embodiment shown in FIGS. 1 and 2. While the imaging optics 18 of the first exemplary embodiment with the tube lens 20 and the downstream infinity objective 22 is formed essentially in two parts, the imaging optics 18 'of the second exemplary embodiment represent a one-part design. Thus, the imaging optics 18 'formed only from a finite lens 22'. It comes out without a tube lens.
  • FIGS. 5 and 6 are sectional views corresponding to FIGS. 1 and 2, respectively, and show a third exemplary embodiment in which, instead of the cylindrical lens 14, a focusing system is provided which is formed by a scanning mirror 38 and a cylindrically symmetrical lens 40.
  • the scanning mirror 38 is shown only in FIG. Incidentally, in the illustrations according to FIGS. 5 and 6, the light source 12 is not shown for the sake of simplicity.
  • the scanning mirror 38 which is embodied, for example, as a galvanometer mirror or MEMS mirror, can be tilted about an axis parallel to the x-axis. As a result of this tilting, the illumination beam 26 reflected on the scanning mirror 38 performs a scanning movement in the yz plane.
  • a light-sheet-like illumination light distribution is thereby produced in the yz plane, which incidentally in the same way as in the first two Embodiments is used to produce two mutually tilted light sheets of different polarization, which are superimposed in the focal plane E each other.

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Abstract

Beschrieben ist eine Vorrichtung (10) zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe, umfassend eine Lichtquelle (12) zum Erzeugen eines Beleuchtungsbündels (26) und ein Fokussiersystem (14) zum Fokussieren des Beleuchtungsbündels (26) zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, mit der eine Fokusebene (E) der Probe beleuchtbar ist. Die Vorrichtung (10) umfasst ferner eine Abbildungsoptik (18) zum Abbilden der lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene (E) der Probe und ein zwischen dem Fokussiersystem (14) und der Abbildungsoptik (18) angeordnetes Polarisationselement (16) zum Aufspalten des Beleuchtungsbündels (26) in zwei verschieden polarisierte Teilbündel (34, 36), die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik (18) propagieren, wodurch die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik (18) in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene (E) einander überlagertsind, abbildbar ist.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe, umfassend eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Beleuchtungsbündels und ein Fokussiersystem zum Fokussieren des Beleuchtungslichtbündels zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe.
In der sogenannten Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskopie wird eine Probe über ein Beleuchtungsobjektiv, dessen optische Achse senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik liegt, mit einem Lichtblatt beleuchtet. Indem die Fokusebene, in der die Probe mit dem Lichtblatt beleuchtet wird, sukzessive längs der optischen Achse der Detektionsoptik verschoben wird, ist eine dreidimensionale Bildgebung möglich. Ein Vorteil dieser in der Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopie eingesetzten Methode ist insbesondere auch eine be- sonders geringe Lichtbelastung der Probe.
Problematisch ist jedoch, dass das Beleuchtungslicht senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik propagiert. So kann es durch Streuzentren oder Absorber innerhalb der Probe zu einer Streuung bzw. einer Absorption des Be- leuchtungslichtes kommen, was sich im resultierenden Bild in Form von Streifenartefakten in Propagationsrichtung des Beleuchtungslichts bemerkbar macht. Zur Verringerung solcher Artefakte sind im Stand der Technik verschiedene Methoden bekannt. So wird in der US 8 792 162 B2 vorgeschlagen, zwei separate Beleuchtungsstrahlengänge vorzusehen, über welche die Probe von beiden Seiten beleuchtet wird. Die vorgeschlagene beidseitige Beleuchtung der Probe hat den offensichtlichen Nachteil, dass zwei separate Beleuchtungsvorrichtungen vorzusehen sind, die zudem präzise zueinander zu justieren sind. Dies ist technisch und wirtschaftlich aufwendig. Außerdem ist diese Lösung in manchen SPIM-Techniken wie der sogenannten Schiefebenenmikroskopie, kurz OPM (oblique plane microscopy), nicht anwendbar. Ein Beispiel für ein Schiefebenenmikroskop findet sich in der US 8 582 203 B2.
In der Druckschrift US 7 787 179 B2 wird die Verwendung eines verstellbaren Ablenkelementes zur sequentiellen Erzeugung verschiedener Einfallsrichtungen des Beleuchtungslichtblatts vorgeschlagen. Das Ablenkelement muß zur Erzielung einer hinreichenden Geschwindigkeit beispielsweise als Galvanometer ausgebildet sein und ist dementsprechend teuer. Desweiteren muß die Bewegung des Ablenkelementes zur Bildrate der Detektion synchronisiert sein, um zusätzliche Helligkeitsartefakte zu vermeiden. Ferner ist die Geschwindigkeit des Ablenkelementes beschränkt auf die maximale Bildrate des Gesamtsystems.
Die Druckschrift US 7 787 179 B2 sieht ferner die Benutzung von Zylinderlinsenarrays sowie einer Lichtquelle mit geringer räumlicher Kohärenz zur Erzeugung mehrerer seitlich versetzter Lichtblätter vor. Die hier vorgeschlagene Verwendung einer Lichtquelle mit geringer räumlicher Kohärenz, um Interferenzartefakte zwischen den einzelnen Teilbündeln entlang der langen lateralen Achse des Lichtblatts zu vermeiden, vermindert die Qualität des Lichtblatts entlang der kurzen lateralen Achse, da auch hier die Kohärenz reduziert ist und so keine beugungsbegrenzte Fokussierung mehr möglich ist.
Ferner sind in der DE 10 2004 034 957 AI und der DE 10 2012 214 568 AI Beleuchtungssysteme zur SPIM-Beleuchtung offenbart, die jeweils über eine doppelbrechende Lichtaufspaltung verfügen können, wobei die so erzeugten Teilbündel in entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen propagieren. Die entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen machen es erforderlich, dass das Probenvolumen von drei Richtungen erreichbar ist. Zwei dieser Richtungen sind einander entgegengesetzt, während die dritte Richtung orthogonal dazu liegt.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur lichtblatt- artigen Beleuchtung einer Probe anzugeben, mit denen unter Vermeidung der vorstehend erläuterten Nachteile herkömmlicher Systeme das Auftreten von Streifenartefakten, die durch Abschattungen des Beleuchtungslichts innerhalb der Probe bei selektiver Beleuchtung der Fokusebene mittels eines Lichtblatts verursacht werden, weitgehend verhindert werden kann.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Vorrichtung nach Anspruch 1 und das Verfahren nach Anspruch 14. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung sieht eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Beleuchtungslichtbündels und ein Fokussiersystem zum Fokussieren des Be- leuchtungslichtbündels zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung vor, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist. Erfindungsgemäß ist ferner eine Abbildungsoptik vorgesehen, welche die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene der Probe abbildet. Zwischen dem Fo- kussiersystem und der Abbildungsoptik ist ein Polarisationselement angeordnet, welches das Beleuchtungslichtbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel aufspaltet, die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik propagieren, wodurch die lichtblattartige Beleuchtungslichtver- teilung durch die Abbildungsoptik in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene einander überlagert sind, abbildbar ist.
Da in dem einzigen Beleuchtungsstrahlengang der erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung die beiden durch das Polarisationselement erzeugten Teil- bündel unter verschiedenen Winkeln zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs in die Abbildungsoptik propagieren, werden in der Probe zwei Lichtblätter generiert, welche die betrachtete Fokusebene aus unterschiedlichen Richtungen beleuchten. Tritt nun in einer der beiden Beleuchtungsrichtungen infolge eines Streuzentrums oder eines Absorbers eine Abschattung des Beleuchtungslichtes auf, so ist durch die andere, durch das Streuzentrum oder den Absorber unbeeinträchtigte Beleuchtungsrichtung immer noch eine ausreichende Beleuchtung der Fokusebene gewährleistet. Dadurch können Streifenartefakte zuverlässig vermieden werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt insbesondere die Einkopplung von Beleuchtungslicht in ein SPIM-System, das ein einziges Beleuchtungsobjektiv aufweist. Damit ist die erfindungsgemäße Realisierung technisch weniger aufwendig als herkömmliche Systeme, in denen verschieden polarisierte Teilbündel in entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen in die Probe propagieren und die deshalb zwei separate Beleuchtungsobjektive benötigen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist besonders bevorzugt anwendbar in einer herkömmlichen SPIM-Anordnung, bei der neben einem Beleuchtungsobjektiv ein separates Detektionsobjektiv vorgesehen ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt. So ist sie beispielsweise auch in der Schiefebenen-Mikroskopie anwendbar, bei der ein einziges Objektiv zur Beleuchtung und zur Detektion eingesetzt wird.
Vorzugsweise ist das Polarisationselement in einer zu der Fokusebene konjugierten Position angeordnet. Diese konjugierte Position liegt beispielsweise an der Stelle des durch das Fokussiersystem primär erzeugten Lichtblatts. In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das Polarisationselement ausgebildet, die beiden Teilbündel unter entgegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung wegzulenken. Bezeichnet man den vorstehend genannten Winkel mit α und die durch die Abbildungsoptik bewirkte Vergrößerung mit ß, so werden in dieser Ausführungsform in der Probe zwei Lichtblätter generiert, die unter einem Winkel ± α/ß zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung innerhalb der Probe propagieren. Der Winkel 2a > 0, den die beiden Propagationsrichtungen zueinander aufweisen, reduziert die durch Streuung und Absorption verursachte Streifenbildung. Vorzugsweise ist das Polarisationselement so ausgebildet, dass die beiden Teilbündel linear polarisiert sind, wobei ihre Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander liegen. Die senkrecht zueinander liegenden Polarisationsrichtungen haben den Vorteil, dass eine Interferenz zwischen den beiden Lichtblättern ausgeschlossen ist. Außerdem werden durch eine Beleuchtung mit diesen bei- den Polarisationsrichtungen Photoselektionseffekte in der Anregung von Flu- orophoren reduziert. ln einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polarisationselement ein Wollaston-Prisma. Ein solches Prisma besteht beispielsweise aus zwei rechtwinkligen Caicit-Prismen, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die optischen Achsen der beiden Prismen liegen senkrecht zueinander.
Vorzugsweise umfasst das Fokussiersystem ein anamorphotisches optisches Element, z.B. eine Zylinderlinse. Mit einer solchen Zylinderlinse, die das Beleuchtungslichtbündel nur in einer Richtung fokussiert, kann die für die gewünschte selektive Beleuchtung der Fokusebene benötigte lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung auf besonders einfache Weise erzeugt werden. Dazu kann das anamorphotische Element entweder in eine dem Objekt konjugierte Ebene oder auch in eine der Pupille konjugierte Ebene fokussieren. In der ersten Form ist das Polarisationselement zweckmäßigerweise in einer der vorderen Brennebene der anamorphotisch optischen Elements konjugierten Ebene angeordnet, in der letzteren Form in einer der hinteren Brennebene des anamorphotisch optischen Elements konjugierten Ebene. Auch diese Ausführungsformen sind nur beispielhaft zu verstehen. So sind auch andere Realisierungen denkbar, z.B. in Form einer Powell-Linse oder dergleichen. In einer weiteren alternativen Ausführungsform umfasst das Fokussiersystem eine Abtastvorrichtung und eine zylindersymmetrische Optik. Die Abtastvorrichtung ist beispielsweise ein um eine Achse verkippbarer Abtastspiegel, etwa ein Galvanometerspiegel oder ein auf einem mikro-elektromechanischen System basierender Spiegel, kurz MEMS-Spiegel, der das Beleuchtungsbündel in- folge seiner Verkippung innerhalb einer Ebene derart ablenkt, dass das Beleuchtungsbündel in dieser Ebene gleichsam ein Lichtblatt aufbaut. Die zylindersymmetrische Optik ist z.B. eine f-Theta-Linse oder eine f-tan Theta-Linse. Eine konkrete Realisierung eines solchen Fokussiersystems ist beispielsweise in der US 8 970 950 B2 beschrieben.
Vorzugsweise liegt die Ebene, in der das Polarisationselement (16) das Beleuch- tungslichtbündel in die beiden Teilbündel aufspaltet, senkrecht zur Fokussier- richtung des anamorphotischen optischen Systems bzw. senkrecht zur Abtastrichtung der Abtastvorrichtung, wobei die Fokussierung bzw. die Abtastrichtung zweckmäßigerweise senkrecht zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung liegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist das Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert. Die Erfindung ist jedoch auf eine solche Ausführung nicht beschränkt. So kann das Beleuchtungslichtbündel auch unpolarisiert sein. Auch die Verwendung von zirkulär oder elliptisch polarisiertem Beleuchtungslicht ist möglich.
Ist das Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert, so weist dessen Polarisationsrichtung vorzugsweise gegenüber der Aufspaltungsrichtung des Polarisationselementes einen Winkel von 45° auf. Dies ermöglicht eine besonders einfache Realisierung der erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung.
In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst die Abbildungsoptik ein Objektiv, welches das einzige Beleuchtungsobjektiv darstellt. Damit ist die Erfindung besonders gewinnbringend in einem üblichen SPIM-Mikroskop an- wendbar, das ein einziges Beleuchtungsobjektiv sowie ein separates Detekti- onsobjektiv aufweist. ln einer speziellen Ausgestaltung umfasst die Abbildungsoptik ein Unendlich- Objektiv und eine Tubuslinse. Dieser im Wesentlichen zweiteilige Aufbau der Abbildungsoptik hat den Vorteil, dass in dem an das Objektiv anschließenden Unendlich-Strahlengang auf besonders einfache Weise weitere optische Kom- ponenten eingekoppelt werden können, falls dies erforderlich oder hilfreich ist. Dieser Aufbau ermöglicht auch eine besondere Modularität des Systems durch die Nutzbarkeit der großen kommerziell verfügbaren Portfolios an Unendlich- Objektiven. In einer alternativen Ausführungsform umfasst die Abbildungsoptik ein Endlich- Objektiv. Damit ist eine besonders kompakte und einfach realisierbare einteilige Ausführung des Vergrößerungssystems möglich.
Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe nach Anspruch 14 vor, bei dem ein Beleuchtungsbündel erzeugt wird und das Beleuchtungsbündel zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung fokussiert wird, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist, wobei die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene der Probe abgebildet wird und das Beleuchtungsbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel , die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik propagieren, aufgespaltet wird und die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene einander überlagert sind, abgebildet wird.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem SPIM-Mikroskop oder einem Schiefebenen-Mikroskop angewandt.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen: Figur 1 eine schematische Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung als erstes Ausführungsbeispiel; Figur 2 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel;
Figur 3 eine schematische Schnittansicht einer erfindungsgemäßen
Beleuchtungsvorrichtung als zweites Ausführungsbeispiel; und
Figur 4 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel.
Figur 5 eine weitere Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Beleuch- tungsvorrichtung als drittes Ausführungsbeispiel; und
Figur 6 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem dritten Ausführungsbeispiel. Die Figuren 1 und 2 zeigen Schnittansichten einer Beleuchtungsvorrichtung 10, die beispielsweise Teil eines SPI M-Mikroskops ist. Das SPI M-Mikroskop enthä lt eine in den Figuren 1 und 2 nur schematisch dargestellte Detektionseinheit 11 mit einer Detektionsoptik 13 und einem Detektor 15. Die optische Achse O' der Detektionsoptik 13 ist senkrecht zur optischen Achse O der Beleuchtungsvor- richtung 10 angeordnet. In den Figuren 1 und 2 wird jeweils a uf ein rechtwinkliges Koordinatensystem x-y-z Bezug genommen, dessen z-Achse mit der optischen Achse O zusammenfällt. Demnach ist die Beleuchtungsvorrichtung 10 in Figur 1 in einem x-z-Schnitt und in Figur 2 in einem y-z-Schnitt dargestellt. Die Darstellungen in den Figuren 1 und 2 sind vereinfacht und rein schematisch. So sind lediglich diejenigen Komponenten dargestellt, die für das Verständnis der Erfindung erforderlich sind. Die Beleuchtungsvorrichtung 10 umfasst eine Lichtquelle 12, ein anamorphoti- sches Fokussiersystem 14 in Form einer Zylinderlinse, ein Wollaston-Prisma 16 und eine Abbildungsoptik 18, die aus einer Tubuslinse 20 und einem U nendlich- Objektiv 22 gebildet ist. Zwischen dem Unendlich-Objektiv 22 und der Tubuslinse 20 befindet sich die mit 24 bezeichnete Eintrittspupille des Unendlich- Objektivs 22.
Die Lichtquelle 12 sendet ein kollimiertes Beleuchtungslichtbündel 26 auf die Zylinderlinse 14 aus. Die Zylinderlinse 14 hat die Eigenschaft, dass sie das Beleuchtungslichtbündel 26 lediglich in einer zur x-Achse parallelen Richtung fo- kussiert, während sie in einer zur y-Achse parallelen Richtung keine optische Wirkung auf das Beleuchtungslichtbündel 26 hat. Somit erzeugt die Zylinderlinse 14 im Bereich ihrer Brennebene eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung, die in Richtung der x-Achse fokussiert und in Richtung der y-Achse flächig ausgedehnt ist. Diese Beleuchtungslichtverteilung wird durch die Abbildungsop- tik 18 in eine in den Figuren mit E bezeichnete Fokusebene abgebildet.
Das Wollaston-Prisma 16 befindet sich auf der optischen Achse O an der Stelle, an der die Zylinderlinse 14 das Beleuchtungslichtbündel 26 zu der lichtblattarti- gen Beleuchtungslichtverteilung fokussiert. Wie in der Schnittansicht nach Figur 2 gezeigt, besteht das Wollaston-Prisma 16 aus zwei rechtwinkligen Prismen, z.B. Calcit-Prismen 28, 30, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die in Figur 2 nicht gezeigten optischen Achsen der beiden Prismen 28, 30 liegen senkrecht zueinander. Das Wollaston-Prisma 16 ist in dem Strahlengang der Beleuchtungsvorrichtung 10 so angeordnet, dass seine Eintrittsfläche 32 senkrecht zur optischen Achse O ausgerichtet ist. Das auf die Eintrittsfläche 32 fallende Beleuchtungslichtbündel 26 wird durch das Wollaston-Prisma 16 in zwei Teilbündel 34, 36 a ufgespalten, die jeweils eine unterschiedliche Polarisation aufweisen. Dabei liegt die Ebene, in der das Wollaston-Prisma 16 das Beleuchtungsbündel in die beiden Teilbündel 34, 36 aufspaltet, parallel zur y-Achse, d.h. in dem Schnitt nach Figur 2 in der Zeichenebene und in dem Schnitt nach Figur 1 senkrecht zur Zeichenebene. Die Aufspaltungsebene des Wollaston-Prismas verläuft somit senkrecht zur Fo- kussierrichtung der Zylinderlinse 14. In der Darstellung nach Figur 2 soll das mit durchgezogenen Linien dargestellte Teilbündel 34 rein beispielhaft p-polarisiert und das mit gestrichelten Linien dargestellte Teilbündel 36 s-polarisiert sein. Des Weiteren wird in dem in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführungsbei- spiel angenommen, dass das in das Wollaston-Prisma 16 eintretende Beleuchtungslichtbündel 26 seinerseits linear polarisiert ist, wobei die Polarisationsrichtung des Beleuchtungslichtbündels 26 senkrecht zur optischen Achse O liegt und gegenüber der Aufspaltungsrichtung des Wollaston-Prismas 16 einen Winkel von 45° aufweist. Diese lineare Polarisation des Beleuchtungslichtbündels 26 ist wiederum rein beispielhaft zu verstehen. So ist es ebenso möglich, dass das Beleuchtungslicht unpolarisiert, zirkulär polarisiert oder elliptisch polarisiert ist.
Das Wollaston-Prisma 16 zerlegt das Beleuchtungslichtbündel 26 derart, dass die beiden Teilbündel 34 und 36 in der Schnittdarstellung nach Figur 2 unter entgegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse O abgelenkt werden. Der jeweilige Winkel ist in Figur 2 mit α bezeichnet. Der Winkel α ist so gewählt, dass er innerhalb des Akzeptanzbereichs der Abbildungsoptik 18 liegt. Damit ist sichergestellt, dass die beiden Teilbündel 34, 36 in jedem Fall in die Abbildungsoptik gelangen. Auf diese Weise erzeugt die Abbildungsoptik 18, welche die von der Zylinderlinse 14 am Ort des Wollaston-Prismas 16 erzeugte lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene E abbildet, in der Fokusebene E zwei separate Lichtblätter, von denen das dem Teilbündel 34 zugeordnete Lichtblatt p-polarisiert und das dem Teilbündel 36 zugeordnete Lichtblatt s-polarisiert ist. Wie in Figur 2 gezeigt, sind die beiden Lichtblätter im Bereich der Fokusebene E einander überlagert. Nimmt man an, dass die Abbildungsoptik 18 eine Vergrößerung ß aufweist, so propagieren die beiden, senkrecht zueinander polarisierten Lichtblätter in der Probe unter einem Winkel ± α/ß zur optischen Achse O. Durch diese beiden unterschiedlichen Propagationsrichtungen können Streifenartefakte infolge von Streuzentren oder Absorbern, die in der Probe vorhanden sind, weitgehend vermieden werden. Tritt nämlich beispielsweise in der Propagationsrichtung des Teilbündels 34 Streuung und/oder Absorption auf, so steht mit dem anderen Teilbündel 36 immer noch eine weitere, ungestörte Propagationsrichtung für die Beleuchtung der Fokusebene E zur Verfügung, durch welche die Streifenbildung reduziert wird.
Die Figuren 3 und 4 sind den Figuren 1 bzw. 2 entsprechende Schnittdarstellungen und zeigen ein zweites Ausführungsbeispiel, das eine gegenüber der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführungsform abgewandelte Abbildungsoptik 18' aufweist. Während die Abbildungsoptik 18 des ersten Ausführungsbeispiels mit der Tubuslinse 20 und dem nachgeordneten Unendlich-Objektiv 22 im Wesentlichen zweiteilig ausgebildet ist, stellt die Abbildungsoptik 18' des zweiten Ausführungsbeispiels eine einteilige Ausführung dar. So ist die Abbildungsoptik 18' nur aus einem Endlich-Objektiv 22' gebildet. Sie kommt a lso ohne Tubuslinse aus.
Im Übrigen entspricht der Aufbau des zweiten Ausführungsbeispiels dem des ersten Ausführungsbeispiels. Hierzu wird auf die Beschreibung zu den Figuren 1 und 2 verwiesen.
Die Figuren 5 und 6 sind den Figuren 1 bzw. 2 entsprechende Schnittdarstellungen und zeigen ein drittes Ausführungsbeispiel, in dem anstelle der Zylinderlin- se 14 ein Fokussiersystem vorgesehen ist, das aus einem Abtastspiegel 38 und einer zylindersymmetrischen Optik 40 gebildet ist. Der Abtastspiegel 38 ist lediglich in Figur 6 gezeigt. Im Übrigen ist in den Darstellungen nach Figuren 5 und 6 die Lichtquelle 12 zur Vereinfachung nicht gezeigt. Wie in Figur 6 gezeigt, ist der Abtastspiegel 38, der beispielsweise als Galvanometerspiegel oder MEMS-Spiegel ausgeführt ist, um eine zur x-Achse parallelen Achse verkippbar. Infolge dieser Verkippung führt das an dem Abtastspiegel 38 reflektierte Beleuchtungsbündel 26 eine Abtastbewegung in der y-z-Ebene aus. Im Zusammenwirken mit der zylindersymmetrischen Optik 40, die z.B. eine f- Theta-Linse oder eine f-tan Theta-Linse sein kann, wird dadurch in der y-z- Ebene eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung erzeugt, die im Übrigen in gleicher Weise wie in den beiden ersten Ausführungsbeispielen dazu genutzt wird, zwei gegeneinander verkippte Lichtblätter unterschiedlicher Polarisation zu erzeugen, die in der Fokusebene E einander überlagert sind. Bezugszeichenliste
10 Beleuchtungsvorrichtung
11 Detektionseinheit
12 Lichtquelle
13 Detektionsoptik
14 Zylinderlinse
15 Detektor
16 Wollaston-Prisma
18 Abbildungsoptik
20 Tubuslinse
22 Unendlich-Objektiv
22' Endlich-Objektiv
24 Pupille des Unendlich-Objektivs 22
26 Beleuchtungslichtbündel
28, 30 rechtwinklige Prismen
32 Eintrittsfläche
34, 36 Teilbündel
38 Abtastvorrichtung
40 zylindersymmetrische Optik
0 optische Achse
0' optische Achse
E Fokusebene
α Winkel
x, y, z Achsen

Claims

Ansprüche
1. Vorrichtung (10) zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe, umfassend: eine Lichtquelle (12) zum Erzeugen eines Beleuchtungsbündels (26); und ein Fokussiersystem (14) zum Fokussieren des Beleuchtungsbündels (26) zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, mit der eine Fokusebene (E) der Probe beleuchtbar ist; gekennzeichnet durch eine Abbildungsoptik (18) zum Abbilden der lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene (E) der Probe; und ein zwischen dem Fokussiersystem (14) und der Abbildungsoptik (18) angeordnetes Polarisationselement (16) zum Aufspalten des Beleuchtungsbündels (26) in zwei verschieden polarisierte Teilbündel (34, 36), die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik (18) propagieren, wodurch die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik (18) in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene (E) einander überlagert sind, abbildbar ist.
2. Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polarisationselement (16) in einer zu der Fokusebene (E) konjugierten Position angeordnet ist.
3. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polarisationselement (16) ausgebildet ist, die beiden Teilbündel (34, 36) unter entgegengesetzt gleichen Winkeln (a) von der optischen Achse (O) der Vorrichtung (10) wegzulenken.
4. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Teilbündel (34, 36) linear polarisiert sind und ihre Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander sind.
5. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polarisationselement (16) ein Wollaston-Prisma ist.
6. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussiersystem ein anamorphotisches optisches Element, insbesondere eine Zylinderlinse (14), umfasst.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokussiersystem eine Abtastvorrichtung (38) und eine zylindersymmetrische Optik (40) umfasst.
8. Vorrichtung (10) nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ebene, in der das Polarisationselement (16) das Beleuchtungsbündel (26) in die beiden Teilbündel (34, 36) aufspaltet, senkrecht zur Fokussier- richtung des anamorphotischen optischen Elementes (14) oder senkrecht zur Abtastrichtung des Abtastsystems (38) liegt.
9. Vorrichtung (10) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsbündel (26) linear polarisiert ist.
10. Vorrichtung (10) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarisationsrichtung des linear polarisierten Beleuchtungsbündels (26) gegenüber der Aufspaltungsrichtung des Polarisationselementes (16) einen Winkel von 45° aufweist.
11. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsoptik (18) ein Objektiv (22) umfasst, welches das einzige Beleuchtungsobjektiv darstellt.
12. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsoptik (18) ein Unendlich-Objektiv (22) und eine Tubuslinse (20) umfasst.
13. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsoptik (18') ein Endlich-Objektiv (22') umfasst.
14. Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe, bei dem: ein Beleuchtungsbündel (26) erzeugt wird; und das Beleuchtungsbündel (26) zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung fokussiert wird, mit der eine Fokusebene (E) der Probe beleuchtbar ist; dadurch gekennzeichnet, dass die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene (E) der Probe abgebildet wird; und das Beleuchtungsbündel (26) in zwei verschieden polarisierte Teilbündel (34, 36), die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik (18) propagieren, aufgespaltet wird und die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik (18) in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene (E) einander überlagert sind, abgebildet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem SPIM-Mikroskop oder in einem Schiefebenen-Mikroskop angewandt wird.
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