CN109154716B - 用于光片式地照明样本的装置和方法 - Google Patents

Abstract

介绍一种用于光片式地照明样本的装置(10)，其包括用于产生照明光束(26)的光源(12)和用于将所述照明光束(26)聚焦成光片式的照明光分支的聚焦系统(14)，利用该照明光分支可对所述样本的聚焦平面(E)照明。该装置(10)还包括用于将光片式的所述照明光分支成像到所述样本的聚焦平面(E)中的成像光学机构(18)和设置在所述聚焦系统(14)和所述成像光学机构(18)之间的偏光部件(16)，该偏光部件用于把所述照明光束(26)分开成两个不同地偏光的部分光束(34、36)，所述部分光束沿不同的传播方向传播到所述成像光学机构(18)中，光片式的所述照明光分支由此可通过所述成像光学机构(18)以两个不同地偏光的光片形式成像，所述光片在所述聚焦平面(E)中彼此叠置。

Description

用于光片式地照明样本的装置和方法

本发明涉及一种用于光片式地照明样本的装置，包括用于产生照明光束的光源和用于将该照明光束聚焦成光片式的照明光分支的聚焦系统，利用该照明光分支可对样本的聚焦平面照明。本发明还涉及一种用于光片式地照明样本的方法。

在所谓的光片或光盘片显微镜中，样本通过照明物镜利用光片被照明，该照明物镜的光学轴线垂直于探测光学机构的光学轴线。在聚焦平面中，样本利用光片予以照明，通过使得样本平面连续地沿着探测光学机构的光学轴线移动，可以实现三维的成像。在广角荧光显微镜中采用的这种方法的优点尤其也是，样本的光载荷特别小。

但问题是，照明光垂直于探测光学机构的光学轴线传播。因而会因样本内部的散射中心或吸收物而造成照明光的散射或吸收，这在所得到的图像中在照明光的传播方向上以条纹伪影的形式体现出来。

为了减少这种伪影，在现有技术中已知有各种不同的方法。因而在US 8 792 162B2中提出，设置两个单独的照明光路，通过这些光路从两侧对该样本照明。所提出的对样本的双侧照明具有显然的缺点：要设置两个单独的照明装置，这些照明装置还要精确地予以相互调节。这在技术和经济上都是耗费的。此外，在有些SPIM-技术比如所谓的斜面显微镜—简写为OPM(oblique plane microscopy)—中，这种方案不可用。斜面显微镜的一个例子参见US 8 582 203 B2。

在文献US 7 787 179 B2中提出了使用可调节的转向部件来顺序地产生照明光片的不同的入射方向。为了实现足够的速度，转向部件必须例如构造成检流计，因而昂贵。此外，转向部件的移动必须与探测的帧速率同步，以便避免额外的亮度伪影。另外，转向部件的速度局限于整个系统的最大帧速率。

文献US 7 787 179 B2还规定了使用柱面透镜阵列以及空间相干性较小的光源来产生多个侧向地错开的光片。这里提出使用空间相干性较小的光源，以便避免沿着光片的长的侧向轴线在各个部分光束之间出现干涉伪影，这使得光片质量沿着短的横向轴线降低，因为这里也减小了相干性，进而无法再实现限制衍射的聚焦。

此外在DE 10 2004 034 957 A1和DE 10 2012 214 568 A1中公开了用于SPIM-照明的照明系统，这些照明系统可以分别具有双折射的光分开部，其中，如此产生的部分光束沿着相反的照明方向传播。相反的照明方向需要能够从三个方向到达立体样本。这些方向中的两个方向彼此相反，而第三个方向与其垂直。

本发明的目的是，提出用于光片式地照明样本的装置和方法，借此在避免传统系统的上述缺点的情况下可以在很大程度上防止出现条纹伪影，所述条纹伪影是在借助光片有选择地照明聚焦平面时因照明光线被遮暗而在样本内部引起的。

本发明利用根据权利要求1的装置和根据权利要求14的方法实现该目的。由从属权利要求以及后续的说明可得到有利的改进。

本发明的装置设置了用于产生照明光束的光源和用于将该照明光束聚焦成光片式的照明光分支的聚焦系统，利用该照明光分支可对样本的聚焦平面照明。根据本发明还设置了成像光学机构，其将光片式的照明光分支成像到样本的聚焦平面中。在聚焦系统和成像光学机构之间设置了偏光部件，该偏光部件把照明光束分开成两个不同地偏光的部分光束，这些部分光束沿不同的传播方向传播到成像光学机构中，光片式的照明光分支由此可通过成像光学机构以两个不同地偏光的光片形式成像，这些光片在聚焦平面中彼此叠置。

由于在本发明的照明装置的唯一的照明光路中，两个通过偏光部件产生的部分光束传播到成像光学机构中，并与照明光路的光学轴线形成不同的角度，所以在样本中产生了两个光片，这些光片从不同的方向对所观察的聚焦平面照明。于是如果在两个照明方向之一上因散射中心或吸收物而出现照明光遮暗，则通过不受散射中心或吸收物影响的另一照明方向始终仍保证对聚焦平面的充足照明。由此能够可靠地避免条纹伪影。

本发明的装置特别是允许照明光射入到具有唯一的照明物镜的SPIM-系统中。本发明的实现方案的技术耗费由此小于传统的系统，在传统的系统中，不同地偏光的部分光束沿相反的照明方向传播到样本中，因此需要两个单独的照明物镜。

本发明的装置可特别优选地应用在传统的SPIM-设备中，这种设备除了设置照明物镜外，还设置了一个单独的探测物镜。但本发明不局限于这种应用。因而本发明例如也可应用在斜面-显微镜中，这种显微镜使用一个唯一的物镜进行照明和探测。

优选地，偏光部件布置在与聚焦平面共轭的位置。该共轭的位置例如位于最初通过聚焦系统产生的光片的部位。

在一种有利的改进中，偏光部件被构造用于使得两个部分光束以相反的相同大小的角度转向离开照明装置的光学轴线。如果上述角度用α表示，由成像光学机构引起的放大率用β表示，则在该实施方式中在样本内产生两个光片，这些光片相对于照明装置的光学轴线以角度±α/β在样本内部传播。两个传播方向相互间具有的角度2α>0，这减少了因散射和吸收引起形成条纹。

优选地，偏光部件经过构造，从而两个部分光束直线地偏光，其中，它们的偏光方向相互垂直。相互垂直的偏光方向具有如下优点：避免了两个光片之间的干涉。此外，通过采用这两个偏光方向进行照明，减少了在荧光团激发时的光子选择效应。

在一种特别优选的实施方式中，偏光部件是Wollaston-棱镜。这种棱镜例如由两个直角的方解石-棱镜构成，这些方解石-棱镜在它们的底面上相互粘合。两个棱镜的光学轴线相互垂直。

优选地，聚焦系统包括变形的光学部件，例如柱面透镜。柱面透镜使得照明光束只在一个方向上聚焦，利用这种柱面透镜可以采用特别简单的方式产生对于按所希望地选择性地照明聚焦平面来说所需要的光片式的照明光分支。为此，变形的部件可以要么聚焦到与样本共轭的平面中，要么也可以聚焦到与瞳孔共轭的平面中。在第一种形式中，偏光部件有益地布置在与变形的光学部件的前面的焦平面共轭的平面中，而在后者形式中，布置在与变形的光学部件的后面的焦平面共轭的平面中。这些实施方式也要仅仅示范性地理解。因而也可以考虑其它实现方案，比如以Powell-透镜等形式来实现。

在另一种替代的实施方式中，聚焦系统包括扫描装置和柱面对称的光学机构。扫描装置例如是可围绕轴线翻摆的扫描反射镜，比如检流计反射镜或基于微机电系统的反射镜—简写为MEMS-反射镜，该扫描反射镜由于其翻摆而使得照明光束在平面内转向，从而照明光束在该平面中仿佛构造了光片。柱面对称的光学机构例如是f-θ-透镜或f-tanθ-透镜。

这种聚焦系统的具体实现方案例如在US 8 970 950B2中有所记载。

在一个平面中，偏光部件(16)使得照明光束分开成两个部分光束，该平面优选垂直于变形的光学系统的聚焦方向，或者垂直于扫描装置的扫描方向，其中，聚焦或扫描方向有益地垂直于照明装置的光学轴线。

在另一优选的设计中，照明光束直线地偏光。但本发明并不局限于这种设计。因此，照明光束也可以不偏光。也可以使用圆形地或椭圆形地偏光的照明光。

如果照明光束直线地偏光，则其偏光方向优选相对于偏光部件的分开方向具有45°的角度。这能特别简单地实现本发明的照明装置。

在一种特别优选的设计中，成像光学机构包括物镜，该物镜是唯一的照明物镜。本发明由此可特别有益地应用在通常的SPIM-显微镜中，其具有唯一的照明物镜以及单独的探测物镜。

在一种特殊的设计中，成像光学机构包括无限远-物镜和管透镜。成像光学机构的这种基本上两组件式的结构具有如下优点：可以在与物镜邻接的无限远-光路中以特别简单的方式输入其它光学分量，如果这是必需的或者有帮助。这种结构也能实现系统的特殊的模块化，因市面上有大量的无限远-物镜组合配置可供采用。

在一种替代的实施方式中，成像光学机构包括有限远-物镜。由此可以特别紧凑地且简单地实现放大系统的一体化设计。

本发明还规定了一种根据权利要求14的用于光片式地照明样本的方法，在该方法中，产生照明光束，把该照明光束聚焦成光片式的照明光分支，利用该照明光分支可对样本的聚焦平面照明，其中，将光片式的照明光分支成像到样本的聚焦平面中，将照明光束分开成两个不同地偏光的部分光束，这些部分光束在不同的传播方向上传播到成像光学机构中，光片式的照明光分支通过成像光学机构以两个不同地偏光的光片形式成像，这些光片在聚焦平面中彼此叠置。

本发明的方法优选地应用在SPIM-显微镜或斜面-显微镜中。

下面借助附图详述本发明。其中：

图1作为第一实施例示出了本发明的照明装置的示意性的剖视图；

图2为根据第一实施例的照明装置的另一剖视图；

图3作为第二实施例示出了本发明的照明装置的示意性的剖视图；

图4为根据第二实施例的照明装置的另一剖视图；

图5作为第三实施例示出了本发明的照明装置的另一剖视图；

图6为根据第三实施例的照明装置的另一剖视图。

图1和2所示为照明装置10的剖视图，其例如是SPIM-显微镜的一部分。该SPIM-显微镜含有在图1和2中仅示意性地示出的探测单元11，该探测单元带有探测光学机构13和探测器15。探测光学机构13的光学轴线O'垂直于照明装置10的光学轴线O布置。在图1和2中分别参照了直角坐标系x-y-z，该坐标系的z-轴与光学轴线O重叠。因此，在图1中以x-z剖视图并且在图2中以y-z剖视图示出了照明装置10。图1和2中的视图是简化的并且纯示意性的。因而仅仅示出了对于理解本发明所必需的组件。

照明装置10包括光源12、柱面透镜形式的变形的聚焦系统14、Wollaston-棱镜16和成像光学机构18，该成像光学机构由管透镜20和无限远-物镜22构成。无限远-物镜22的标有24的入射瞳孔位于无限远-物镜22与管透镜20之间。

光源12将准直的照明光束26发出到柱面透镜14上。柱面透镜14具有如下特性：它使得照明光束26仅在平行于x-轴的方向上聚焦，而它在平行于y-轴的方向上对照明光束26没有光学作用。因此，柱面透镜14在其焦平面的区域中产生光片式的照明光分支，该照明光分支在x-轴的方向上聚焦并且在y-轴的方向上平面地展开。该照明光分支通过成像光学机构18被成像到在这些附图中标有E的聚焦平面中。

Wollaston-棱镜16在光学轴线O上位于如下位置：在该位置，柱面透镜14将照明光束26聚焦成光片式的照明光分支。如根据图2的剖视图中所示，Wollaston-棱镜16由两个直角棱镜即方解石-棱镜28、30构成，这些方解石-棱镜在它们的底面上相互粘合。两个棱镜28、30的在图2中未示出的光学轴线相互垂直。

Wollaston-棱镜16设置在照明装置10的光路中，从而它的入射面32垂直于光学轴线O朝向。射到入射面32上的照明光束26被Wollaston-棱镜16分开成两个部分光束34、36，这些部分光束分别具有不同的偏光性。在一个平面中，Wollaston-棱镜16将照明光束分开成两个部分光束34、36，该平面在此平行于y-轴，也就是说，在根据图2的剖视图中位于图面内，而在根据图1的剖视图中垂直于图面。Wollaston-棱镜的分开平面因而垂直于柱面透镜14的聚焦方向伸展。在根据图2的视图中，用实线示出的部分光束34应纯示范性地被p-偏光，用虚线示出的部分光束36被s-偏光。此外，在图1和2所示的实施例中假定，射入到Wollaston-棱镜16中的照明光束26本身直线地偏光，其中，照明光束26的偏光方向垂直于光学轴线O，并且相对于Wollaston-棱镜16的分开方向具有45°的角度。照明光束26的这种直线的偏光也要纯示范性地予以理解。因而同样可行的是，照明光未偏光、圆形地偏光或椭圆形地偏光。

Wollaston-棱镜16按如下方式把照明光束26拆分开：两个部分光束34和36在根据图2的剖视图中偏转，并与光学轴线O形成相反的相同大小的角度。相应的角度在图2中用α表示。角度α经过选择，从而它处于成像光学机构18的受光范围内。

由此保证两个部分光束34和36在任何情况下都进入到成像光学机构中。通过这种方式，成像光学机构18在聚焦平面E中产生两个单独的光片，在这些光片中，指配于部分光束34的光片被p-偏光，指配于部分光束36的光片被s-偏光，该成像光学机构使得由柱面透镜14在Wollaston-棱镜16的位置产生的光片式的照明光分支成像到聚焦平面E中。如图2中所示，两个光片在聚焦平面E的区域中相互叠置。

假定成像光学机构18具有放大率β，则相互垂直地偏光的两个光片相对于光学轴线O以角度±α/β在样本中传播。通过两个不同的传播方向，可以在很大程度上避免由于样本中存在的散射中心或吸收物所致的条纹伪影。也就是说，如果例如在部分光束34的传播方向上出现了散射和/或吸收，则利用另一部分光束36始终仍为聚焦平面E的照明提供不受干扰的另一传播方向，通过该传播方向减少条纹形成。

图3和4是相应于图1或2的剖视图，并且示出了第二实施例，该第二实施例具有相比于图1和2中所示的实施方式变型的成像光学机构18'。第一实施例的带有管透镜20和后置的无限远-物镜22的成像光学机构18基本上为两组件式构造，而第二实施例的成像光学机构18'是一体式设计。于是，成像光学机构18'只由有限远-物镜22'构成。该成像光学机构没有管透镜也能应付。

在其余之处，第二实施例的结构与第一实施例的结构相应。对此参见针对图1和2所做的说明。

图5和6是相应于图1或2的剖视图，并且示出了第三实施例，在该第三实施例中设置了聚焦系统，来代替柱面透镜14，该聚焦系统由扫描反射镜38和柱面对称的光学机构40构成。扫描反射镜38只在图6中示出。另外，为了简化起见，在根据图5和6的视图中未示出光源12。

如图6中所示，扫描反射镜38可围绕平行于x-轴的轴线翻摆，该扫描反射镜例如被设计成检流计反射镜或MEMS-反射镜。由于这种翻摆，在扫描反射镜38上反射的照明光束26在y-z平面上进行扫描运动。由此在与柱面对称的光学机构40—其可以例如是f-θ-透镜或f-tanθ-透镜—的配合作用下，在y-z平面上产生光片式的照明光分支，此外，所述照明光分支按照与头两个实施例中相同的方式被用于产生两个相对翻摆的不同偏光的光片，这些光片在聚焦平面E中相互叠置。

附图标记清单

10 照明装置

11 探测单元

12 光源

13 探测光学机构

14 柱面透镜

15 探测器

16 Wollaston-棱镜

18 成像光学机构

20 管透镜

22 无限远-物镜

22' 有限远-物镜

24 无限远-物镜22的瞳孔

26 照明光束

28、30 直角棱镜

32 入射面

34、36 部分光束

38 扫描装置

40 柱面对称的光学机构

O 光学轴线

O' 光学轴线

E 聚焦平面

α 角度

x、y、z 轴

Claims (13)

1.一种用于光片式地照明样本的装置（10），包括：

用于产生照明光束（26）的光源（12）；

用于将所述照明光束（26）聚焦成光片式的照明光分支的聚焦系统（14），利用该照明光分支可对所述样本的聚焦平面（E）照明；和

用于将光片式的所述照明光分支成像到所述样本的聚焦平面（E）中的成像光学机构（18）；

其特征在于：在与所述聚焦平面（E）共轭的位置设置在所述聚焦系统（14）和所述成像光学机构（18）之间的偏光部件（16），该偏光部件用于把所述照明光束（26）分开成两个不同地偏光的部分光束（34、36），所述部分光束沿不同的传播方向传播到所述成像光学机构（18）中，光片式的所述照明光分支由此可通过所述成像光学机构（18）以两个不同地偏光的光片形式成像，所述光片从同一侧朝向所述聚焦平面（E）并在所述聚焦平面（E）中彼此叠置，所述成像光学机构（18）包括物镜（22），该物镜是唯一的照明物镜，所述偏光部件（16）被构造用于使得两个部分光束（34、36）以相反的相同大小的角度（α）转向离开所述装置（10）的光学轴线（O）。

2.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，两个部分光束（34、36）直线地偏光，并且，它们的偏光方向相互垂直。

3.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，所述偏光部件（16）是Wollaston-棱镜。

4.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，所述聚焦系统包括变形的光学部件。

5.如权利要求4所述的装置（10），其特征在于，所述变形的光学部件是柱面透镜。

6.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，所述聚焦系统包括扫描装置（38）和柱面对称的光学机构（40）。

7.如权利要求5所述的装置（10），其特征在于，在一个平面中，所述偏光部件（16）使得所述照明光束（26）分开成两个部分光束（34、36），该平面垂直于变形的光学部件（14）的聚焦方向，或者垂直于扫描系统（38）的扫描方向。

8.如权利要求7所述的装置（10），其特征在于，所述照明光束（26）直线地偏光。

9.如权利要求8所述的装置（10），其特征在于，直线地偏光的所述照明光束（26）的偏光方向相对于所述偏光部件（16）的分开方向具有45°的角度。

10.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，所述成像光学机构（18）包括无限远-物镜（22）和管透镜（20）。

11.如权利要求1所述的装置（10），其特征在于，所述成像光学机构包括有限远-物镜。

12.一种用于光片式地照明样本的方法，在该方法中：

产生照明光束（26）；

把所述照明光束（26）聚焦成光片式的照明光分支，利用该照明光分支可对所述样本的聚焦平面（E）照明；

利用成像光学机构（18）将光片式的所述照明光分支成像到所述样本的聚焦平面（E）中；

其特征在于，利用设置在与所述聚焦平面共轭的位置的偏光部件（16）将所述照明光束（26）分开成两个不同地偏光的部分光束（34、36），所述部分光束在不同的传播方向上传播到成像光学机构（18）中，光片式的所述照明光分支通过所述成像光学机构（18）以两个不同地偏光的光片形式成像，所述光片从同一侧朝向所述聚焦平面（E）并在所述聚焦平面（E）中彼此叠置，所述成像光学机构（18）包括物镜（22），该物镜是唯一的照明物镜，所述偏光部件（16）被构造用于使得两个部分光束（34、36）以相反的相同大小的角度（α）转向离开用于光片式地照明样本的装置（10）的光学轴线（O）。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该方法应用在SPIM-显微镜或斜面-显微镜中。

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