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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop und
ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren.
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In
der Laser-Scanning-Mikroskopie gibt es Anwendungen, bei denen ein
schnelles Detektieren in verschiedenen Objekttiefen der Probe erwünscht ist.
Ein Beispiel hierfür
ist die Untersuchung von Anregungszuständen der Nervenenden in der
Hirnforschung.
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Bekannten
Systemen, bei der zur Beeinflussung der Fokuslage Linsen oder Linsengruppen
bewegt werden, sind aufgrund der Massenträgheit im Bereich der hier gewünschten
schnellen Änderungen nur
bedingt einsetzbar. Ähnliche
Schwierigkeiten existieren bei elektrisch angesteuerten Piezoschwingern
des Mikroskopsystems.
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Ausgehend
hiervon ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Laser-Scanning-Mikroskop sowie
ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren zur Verfügung zu
stellen, bei denen eine schnelle Detektierung in verschiedenen Tiefen
der Probe möglich ist.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul,
das eine Lasereinheit, die ein Laserstrahlenbündel erzeugt, und eine Scanneinheit
enthält,
die das Laserstrahlenbündel
in einem vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe fokussiert
und über
diesen Bereich ablenkt, wobei dabei aufgrund einer Wechselwirkung
zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe Probenstrahlung erzeugt
wird, und einem Detektionsmodul, das die erzeugte Probenstrahlung
detektiert, wobei das Beleuchtungs- und/oder das Detektionsmodul
zumindest eine Linse enthält,
deren Brennweite verstellbar ist.
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Durch
das Vorsehen einer Linse, deren Brennweite verstellbar ist, ist
es nicht mehr notwendig, Linsen oder Linsengruppen mechanisch zu
bewegen. Daher kann die Änderung
der Fokuslage und somit eine Detektion in unterschiedlichen Probentiefen
schnell durchgeführt
werden.
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Insbesondere
ist die Linse als elektro-optische Linse ausgebildet, deren Brennweite
durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein- und verstellbar ist.
Solche Linsen können
sehr schnell ihre Brennweite ändern,
so daß die
gewünschte
schnelle Detektion der unterschiedlichen Tiefen der Probe erfolgen
kann.
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Die
Linse kann entweder als Flüssigkristgllinse
ausgebildet sein, wobei nematische oder ferroelektrische Flüssigkristalle
eingesetzt werden können. Es
ist jedoch auch möglich,
elektrooptische Linsen einzusetzen, wie sie von der Firma Varioptic
SA aus Lyon in Frankreich vertrieben werden.
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Die
Linse kann, in Ausbreitungsrichtung des Laserstrahlenbündels gesehen,
so vor der Scanneinheit angeordnet sein, daß das Laserstrahlenbündel zuerst
durch die Linse läuft
und danach auf die Scanneinheit trifft und daß die Probenstrahlung zuerst
auf die Scanneinheit und dann auf die Linse trifft. Die Linse sitzt
somit im sogenannten descannten Strahlengang, was den Aufbau des
Laser-Scanning-Mikroskops zwischen Scanneinheit und Probe vereinfacht.
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Das
Detektionsmodul kann ein Objektivmodul umfassen, wobei die Linse
in einer konjugierten Ebene zur Austrittspupille des Objektivmoduls
in Detektionsrichtung angeordnet ist. Damit ist es sehr gut möglich, die
gewünschte
Fokusverstellung durchzuführen.
Als Austrittspupille wird hier sowohl die unmittelbare Austrittspupille
als auch die durch zumindest eine Zwischenabbildung übertragene
Austrittspupille des Objektivmoduls verstanden. Das Objektivmodul kann
z.B. als einzelnes Objektiv oder als Kombination eines Objektivs
mit einer Tubuslinse ausgebildet sein.
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Die
elektro-optische Linse weist bevorzugt positive Brechkraft auf.
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Ferner
kann das Mikroskop einen Strahlteiler umfassen, der das Laserstrahlenbündel von
der Lasereinheit zur Scanneinheit lenkt und die Probenstrahlung
zum Detektionsmodul lenkt. Die Linse kann zwischen dem Strahlteiler
und der Lasereinheit, zwischen dem Strahlteiler und der Scanneinheit und/oder
zwischen dem Strahlteiler und dem Detektionsmodul angeordnet sein.
Somit kann die Lage der Linse im Mikroskop so gewählt werden,
daß optimale Ergebnisse
für die
gewünschte
Anwendung erreicht werden.
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Das
Beleuchtungsmodul kann zwei hintereinander angeordnete Linsen, deren
Brennweiten jeweils verstellbar sind, sowie ein Ansteuermodul aufweisen,
das die Linsen so ansteuert, daß die
Brennweiten stets so eingestellt sind, daß die zwischen den beiden Linsen
liegenden Brennpunkte zusammenfallen. Damit ist es leicht möglich, eine Änderung
des Strahlquerschnitts des Laserstrahlenbündels in gewünschter
Art und Weise durchzuführen.
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Ferner
kann in einer Weiterbildung das Beleuchtungs- und/oder Detektionsmodul
neben der zumindest einen Linse eine dieser nachgeordnete zweite
Linse mit verstellbarer Brennweite und ein Steuermodul aufweisen,
wobei die Brennweiten beider Linsen mittels des Steuermoduls so
verstellbar sind, daß die
zwischen beiden Linsen liegenden Brennpunkte stets zusammenfallen.
Die beiden Linsen können
somit als Strahlquerschnittswandler eingesetzt werden, wobei zur Änderung
des Strahlquerschnitts keine mechanische Bewegung einer der beiden
Linsen notwendig ist. Auch können
die beiden Linsen beispielsweise in einem Objektiv des Mikroskops
eingesetzt werden, so daß die
Vergrößerung des
Mikroskops elektrisch einstellbar ist, ohne daß dazu eine mechanische Bewegung
oder Veränderung
der Lage der beiden Linsen notwendig wird. Die beiden Linsen können elektro-optische
Linsen mit verstellbarer Brennweite sein, deren Brennweite jeweils
insbesondere durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein- bzw.
verstellbar ist.
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Insbesondere
können
die beiden Linsen in einem Bereich des Mikroskops angeordnet sein,
in dem die Laserstrahlung zur Beleuchtung und/oder die Probenstrahlung
kollimiert ist/sind (also in einem Bereich, in dem die Strahlung
als paralleles Strahlenbündel
vorliegt).
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Das
Laser-Scanning-Mikroskop kann ferner eine Steuereinheit aufweisen,
die die Steuerung des Mikroskops (beispielsweise der Scanneinheit)
durchführt,
so daß die
gewünschten
Bilder (z.B. optische Schnitte in unterschiedlichen Probentiefen)
erzeugt werden können.
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Die
Probenstrahlung kann beispielsweise reflektierte, transmittierte
Strahlung und/oder Fluoreszenzstrahlung sein.
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Die
Aufgabe wird ferner gelöst
durch ein Laser-Scanner-Mikroskopierverfahren, bei dem ein Laserstrahlenbündel erzeugt,
in einem vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe fokussiert und
innerhalb des Bereiches so abgelenkt wird, daß aufgrund einer Wechselwirkung
zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe Probenstrahlung
erzeugt wird, die konfokal detektiert wird, wobei bei der Beleuchtung
und/oder Detektion zumindest eine Linse verwendet wird, deren Brennweite
verstellbar ist.
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Damit
ist es möglich,
leicht und schnell die Fokustiefe bzw. -lage einzustellen.
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Die
Linse kann insbesondere eine elektro-optische Linse sein, deren
Brennweite durch Anlegen einer elektrischen Spannung verstellbar
ist.
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Die
Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der Figuren noch
näher erläutert. Es
zeigen:
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1 eine
schematische Ansicht, einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops;
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2 eine
Weiterbildung der Linsen 3, 5 von 1 als
Querschnittswandler;
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3 den
Querschnittswandler von 2 in einer anderen Betriebsstellung,
und
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4 und 5 der
Querschnittswandler von 2 zur Variation des Durchmessers
des vom Querschnittswandler abgegebenen Strahlenbündels.
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Bei
der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das Laser-Scanning-Mikroskop
LSM eine Lasereinheit 1, die ein Laserstrahlenbündel 2 abgibt, das
mittels einer ersten Optik 3 in eine Fokusebene 4 fokussiert
wird.
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Das
aus der Fokusebene 4 divergent austretende Laserstrahlenbündel wird über eine
zweite Optik 5, einen Strahlteiler 6, eine elektro-optische
Linse 7, einen Scanner 8 mit zwei Ablenkspiegeln 9 und 10, über ein
Scannobjektiv 11 und ein Objektivmodul 13 auf
bzw. in eine Probe 14 auf einem Probentisch 15 fokussiert.
Die Elemente 1 bis 11 und 13 bilden ein Beleuchtungsmodul
BM. Ab der Fokusebene 4 sind zur Vereinfachung der Darstellung
nur noch die Ausbreitungsrichtung des Laserstrahlenbündels sowie der
nachfolgend beschriebenen Probenstrahlung eingezeichnet.
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Der
Scanner 8 dient dazu, das fokussierte Laserstrahlenbündel in
dem zu untersuchenden Bereich der Probe 14 so abzulenken,
daß der
gesamte Bereich mit dem fokussierten Laserstrahlenbündel überstrichen
wird.
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Aufgrund
der Wechselwirkung des fokussierten Laserstrahlenbündels mit
der Probe wird Probenstrahlung erzeugt (beispielsweise Fluoreszenzstrahlung).
Die Probenstrahlung wird konfokal detektiert, indem die Probenstrahlung über das
Objektivmodul 13 und das Scannobjektiv 11, den
Scanner 8, die elektro-optische Linse 7 und den
Strahlenteiler 6 bis zu einer dritten Optik 16 geführt wird,
die die Probenstrahlung auf eine Lochblende 17 zur konfokalen
Unterdrückung
von unerwünschter
Strahlung fokussiert. Die durch die Lochblende 17 hindurchtretende
Probenstrahlung wird über
eine vierte Optik 18 auf einen Detektor 19 gerichtet.
Die Elemente 13, 11 bis 6 sowie 16 bis 19 bilden
in dieser Reihenfolge ein Detektionsmodul DM.
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Da
es schwierig ist, ein Objektiv mit gewünschter Vergrößerung zu
konstruieren, dessen Austrittspupille im Scanner 8 liegt
und das gleichzeitig die notwendigen Abbildungseigenschaften aufweist,
dient hier das Objektivmodul 13 dazu, eine Zwischenabbildung
von der Probe 14 in eine zwischen Objektivmodul 13 und
Scannobjektiv 11 liegende Ebene 12 vorzunehmen.
Das Scannmodul 11 dient dazu, die Austrittspupille des
Objektivmoduls 13 in den Scanner 8 zu übertragen.
Das Objektivmodul 13 kann z.B. als einzelnes Objektiv oder
als Kombination eines Objektivs mit einer Tubuslinse ausgebildet
sein.
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Um
nun einen optischen Schnitt in einer vorbestimmten Tiefe in der
Probe 14 zu untersuchen, wird das Laserstrahlenbündel 2 in
die Tiefe fokussiert und wird mittels des Scanners 8 der
gesamte Bereich rasterförmig
beleuchtet. Die dabei erzeugte Probenstrahlung wird durch den Scanner 8 descannt
und konfokal detektiert.
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Zur
schnellen Durchführung
optischer Schnitte in unterschiedlichen Tiefen ist die elektrooptische
Linse 7 vorgesehen, deren Brennweite mittels einer Steuereinheit 20 verstellbar
ist. Die Verstellung wird durch Anlegen einer vorbestimmten Spannung an
die elektro-optische Linse 7 durchgeführt. Damit ist es möglich, die
Fokussierung bzw. die Fokustiefe oder Fokuslage des Laserstrahlenbündels 2 entlang der
optischen Achse des Objektivs 11 schnell zu ändern und
somit schnell optische Schnitte in unterschiedlichen Tiefen durchzuführen.
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Die
elektro-optische Linse 7 ist hier in einer zur Austrittspupille
des Objektivmoduls 13 (bei der Detektion) konjugierten
Ebene angeordnet. Ferner ist die Ebene, in der die elektro-optische
Linse 7 angeordnet ist, auch konjugiert zur ebene des Scanners 8. Falls
notwendig, kann noch eine entsprechende Zwischenabbildung (nicht
gezeigt) vorgesehen sein. Die Linse kann natürlich auch an anderen Stellen
zwischen Scanner 8 und Strahlteiler 6 angeordnet
sein. Damit ist es möglich,
sehr schnell und exakt die Fokussierung bzw. Fokustiefe mittels
einer Änderung der
Brennweite der elektro-optischen Linse 7 einzustellen bzw.
zu verstellen.
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Auch
die zweite Optik 5 und/oder die dritte Optik 16 kann
eine elektro-optische Linse enthalten.
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In 2 ist
eine Weiterbildung der Anordnung der Linsen 3 und 5 von 1 schematisch
dargestellt. Die Linsen 3 und 5 können als
Strahlquerschnittswandler ausgebildet sein, der ver- bzw. einstellbar
ist. Dazu sind die Linsen 3, 5 als elektro-optische
Linsen 3, 5 ausgebildet. Die Linsen 3 und 5 werden
mittels eines Steuermoduls 21 so angesteuert, daß ihre Brennpunkte,
die zwischen den beiden Linsen 3 und 5 liegen,
stets zusammenfallen und daß das
von der Linse 5 ausgehende Strahlenbündel den gewünschten
Querschnitt des Laserstrahlenbündels 2 aufweist.
Dies ist in 2 für ein erstes zugeführtes Strahlenbündel 22 gezeigt
(der eingezeichnete Pfeil zeigt die Ausbreitungsrichtung). In 3 wird
ein zweites Strahlenbündel 23 mit
größerem Durchmesser
als das erste Strahlenbündel 22 zugeführt. Jedoch
sind die Brennweiten der Linsen 3 und 5 so eingestellt,
daß das
von der Linse 5 kommende Laserstrahlenbündel 2 wiederum den
gewünschten
Strahlenquerschnitt aufweist.
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Zwischen
der Lasereinheit 1 und der Fokusebene 4 kann auch
eine Lichtleitfaser (nicht gezeigt) angeordnet sein, in deren der
Lasereinheit 1 zugeordnetes Ende die Laserstrahlung eingekoppelt
wird und deren entgegengesetztes Ende in der Fokusebene 4 liegt.
In diesem Fall kann die Linse 3 weggelassen werden.
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Es
ist natürlich
auch möglich,
die Linse 3 mit einem Strahlenbündel mit konstantem Durchmesser zu
beaufschlagen, so daß bei
Veränderung
der Lage der Brennpunkte, wie in 4 und 5 gezeigt
ist, der Durchmesser des von der Linse 5 ausgehenden Strahlenbündels variierbar
ist. Die Brennweiten der Linsen 3 und 5 können in
einem weiten Bereich variiert werden. Beispielsweise können die
Linsen 3 und 5 in einem Abstand von 15 cm zueinander
aufgebaut werden. Wenn man dann beispielsweise bei der Linse 3 eine
Brennweite von 5 cm und bei der Linse 5 eine Brennweite
von 10 cm mittels des Steuermoduls 21 einstellt, wird der
Durchmesser des einfallenden Strahlenbündels 24 im ausfallenden
Strahlenbündel 25 verdoppelt.
Zur Halbierung des Durchmessers des einfallenden Strahlenbündels 24 kann
man bei der Linse 3 eine Brennweite von 10 cm und bei der Linse 5 eine
Brennweite von 5 cm mittels des Steuermoduls 21 einstellen
(5). Natürlich
sind mittels des Steuermoduls auch sämtliche andere Variationen
der Brennweiten einstellbar, bei denen die Summe der Brennweiten
stets dem Abstand der Linsen 3 und 5 entspricht
bzw. bei dem die beiden Brennpunkte der Linsen 3 und 5 stets
zusammenfallen.
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Der
in Verbindung mit 2 bis 5 beschriebene
Strahlquerschnittswandler kann in einer Weiterbildung zusätzlich oder
anstatt der Linse 7 im Laser-Scanning-Mikroskop LSM vorgesehen
sein. Insbesondere wird der Strahlquerschnittswandler in Bereichen
des Laser-Scanning-Mikroskops
LSM angeordnet, in dem die Laserstrahlung zur Beleuchtung und/oder
die Probenstrahlung kollimiert ist/sind. Ferner kann der Strahlquerschnittswandler
im Objektivmodul 13 vorgesehen sein, so daß die Vergrößerung des
Laser-Scanning-Mikroskops LSM elektrisch einstellbar ist (ohne daß eine mechanische
Verschiebung oder Bewegung von Linsen notwendig ist).