-
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe, umfassend eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Beleuchtungsbündels und ein Fokussiersystem zum Fokussieren des Beleuchtungslichtbündels zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe.
-
In der sogenannten Lichtblatt- oder Lichtscheibenmikroskopie wird eine Probe über ein Beleuchtungsobjektiv, dessen optische Achse senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik liegt, mit einem Lichtblatt beleuchtet. Indem die Fokusebene, in der die Probe mit dem Lichtblatt beleuchtet wird, sukzessive längs der optischen Achse der Detektionsoptik verschoben wird, ist eine dreidimensionale Bildgebung möglich. Ein Vorteil dieser in der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie eingesetzten Methode ist insbesondere auch eine besonders geringe Lichtbelastung der Probe.
-
Problematisch ist jedoch, dass das Beleuchtungslicht senkrecht zur optischen Achse der Detektionsoptik propagiert. So kann es durch Streuzentren oder Absorber innerhalb der Probe zu einer Streuung bzw. einer Absorption des Beleuchtungslichtes kommen, was sich im resultierenden Bild in Form von Streifenartefakten in Propagationsrichtung des Beleuchtungslichts bemerkbar macht.
-
Zur Verringerung solcher Artefakte sind im Stand der Technik verschiedene Methoden bekannt. So wird in der
US 8 792 162 B2 vorgeschlagen, zwei separate Beleuchtungsstrahlengänge vorzusehen, über welche die Probe von beiden Seiten beleuchtet wird. Die vorgeschlagene beidseitige Beleuchtung der Probe hat den offensichtlichen Nachteil, dass zwei separate Beleuchtungsvorrichtungen vorzusehen sind, die zudem präzise zueinander zu justieren sind. Dies ist technisch und wirtschaftlich aufwendig. Außerdem ist diese Lösung in manchen SPIM-Techniken wie der sogenannten Schiefebenenmikroskopie, kurz OPM (oblique plane microscopy), nicht anwendbar. Ein Beispiel für ein Schiefebenenmikroskop findet sich in der
US 8 582 203 B2 .
-
In der Druckschrift
US 7 787 179 B2 wird die Verwendung eines verstellbaren Ablenkelementes zur sequentiellen Erzeugung verschiedener Einfallsrichtungen des Beleuchtungslichtblatts vorgeschlagen. Das Ablenkelement muß zur Erzielung einer hinreichenden Geschwindigkeit beispielsweise als Galvanometer ausgebildet sein und ist dementsprechend teuer. Desweiteren muß die Bewegung des Ablenkelementes zur Bildrate der Detektion synchronisiert sein, um zusätzliche Helligkeitsartefakte zu vermeiden. Ferner ist die Geschwindigkeit des Ablenkelementes beschränkt auf die maximale Bildrate des Gesamtsystems.
-
Die Druckschrift
US 7 787 179 B2 sieht ferner die Benutzung von Zylinderlinsenarrays sowie einer Lichtquelle mit geringer räumlicher Kohärenz zur Erzeugung mehrerer seitlich versetzter Lichtblätter vor. Die hier vorgeschlagene Verwendung einer Lichtquelle mit geringer räumlicher Kohärenz, um Interferenzartefakte zwischen den einzelnen Teilbündeln entlang der langen lateralen Achse des Lichtblatts zu vermeiden, vermindert die Qualität des Lichtblatts entlang der kurzen lateralen Achse, da auch hier die Kohärenz reduziert ist und so keine beugungsbegrenzte Fokussierung mehr möglich ist.
-
Ferner sind in der
DE 10 2004 034 957 A1 und der
DE 10 2012 214 568 A1 Beleuchtungssysteme zur SPIM-Beleuchtung offenbart, die jeweils über eine doppelbrechende Lichtaufspaltung verfügen können, wobei die so erzeugten Teilbündel in entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen propagieren. Die entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen machen es erforderlich, dass das Probenvolumen von drei Richtungen erreichbar ist. Zwei dieser Richtungen sind einander entgegengesetzt, während die dritte Richtung orthogonal dazu liegt.
-
Die ältere Anmeldung
DE 10 2014 116 174 A1 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Probe, bei dem ein Probenbereich über einen Beleuchtungsstrahlengang in einer Lichtblattebene mit zu einem Lichtblatt geformten Licht beleuchtet wird. Von dem Probenbereich abgestrahltes Licht wird entlang einer axialen Detektionsrichtung, die mit der Lichtblattebene einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, über ein Detektionsobjektiv auf einen flächenförmigen Detektor geleitet. Im Detektor wird pixelweise die Intensität registriert und in Sätze von Eingabebilddaten von Bildern umgewandelt. Dabei wird ein erster Satz von Eingabebilddaten und mindestens ein zweiter Satz von Eingabebilddaten erzeugt. Aus den Sätzen von Eingabebilddaten wird durch Verrechnung ein Ausgabesatz von Ausgabebilddaten eines Ausgabebildes erzeugt, in welchem ein Hintergrundsignal gegenüber einzelnen Bildern aus den Eingabebilddaten reduziert ist. Der erste Satz von Eingabebilddaten wird dabei für ein erstes Lichtblatt in der Fokusebene des Detektionsobjektivs, der zweite und der dritte Satz für ein zweites und drittes Lichtblatt oberhalb bzw. unterhalb der Fokusebene erzeugt.
-
Das Dokument
US 2015/0029325 A1 offenbart ein Lichtblattoptiksystem mit Mitteln zur Erzeugung eines Lichtblattes unter Verwendung eines nicht-diffraktiven oder quasi-nicht-diffraktiven und/oder propagationsinvarianten Strahls, der ein asymmetrisches Intensitätsstrahlprofil quer zur Ausbreitungsrichtung hat, wie beispielsweise ein Airy-Strahl.
-
Das Dokument
DE 10 2013 208 926 A1 offenbart ein Verfahren zur 3D-hochauflösenden Lokalisierungsmikroskopie, bei dem in einem Anregungsschritt eine Probe mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird, um in der Probe Fluoreszenzmarker zum Leuchten anzuregen, in einem Abbildungsschritt die Probe mittels einer Abbildungsoptik längs einer Abbildungsrichtung in ein Einzelbild abgebildet wird, wobei das Einzelbild Abbilder der leuchtenden Fluoreszenzmarker enthält und die Abbildungsoptik eine Fokusebene und eine optische Auflösung aufweist, der Anregungs- und der Abbildungsschritt mehrmals wiederholt werden und so mehrere Einzelbilder erzeugt werden, wobei die Anregungsschritte so ausgeführt werden, dass zumindest für einen Teil der leuchtenden Fluoreszenzmarker deren Abbilder in jedem der Einzelbilder isoliert sind, in den erzeugten, mehreren Einzelbildern aus den isolierten Abbildern der leuchtenden Fluoreszenzmarker jeweils eine Ortsangabe des entsprechenden Fluoreszenzmarkers ermittelt wird, die eine Genauigkeit hat, welche über die optische Auflösung hinausgeht, und aus den so ermittelten Ortsangaben ein hochaufgelöstes Gesamtbild erzeugt wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungsstrahlung in die Probe als ein erstes Lichtblatt eingestrahlt wird, das längs der Abbildungsrichtung eine Intensitätsverteilung hat, die zur Fokusebene asymmetrisch ist, und in den Einzelbildern die isolierten Abbilder der leuchtenden Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer Umrissform analysiert werden und aus der Umrissform eine Angabe über den Abstand des entsprechenden Fluoreszenzmarkers von der Fokalebene abgeleitet wird.
-
Das Dokument
DE 39 09 621 A1 offenbart ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur berührungslosen Messung von Geschwindigkeiten, Geschwindigkeitsverläufen und Zerfallsfrequenzen in Flüssigkeitsstrahlen und Flammen.
-
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe anzugeben, mit denen unter Vermeidung der vorstehend erläuterten Nachteile herkömmlicher Systeme das Auftreten von Streifenartefakten, die durch Abschattungen des Beleuchtungslichts innerhalb der Probe bei selektiver Beleuchtung der Fokusebene mittels eines Lichtblatts verursacht werden, weitgehend verhindert werden kann.
-
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Vorrichtung nach Anspruch 1 und das Verfahren nach Anspruch 13. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung sieht eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Beleuchtungslichtbündels und ein Fokussiersystem zum Fokussieren des Beleuchtungslichtbündels zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung vor, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist. Erfindungsgemäß ist ferner eine Abbildungsoptik vorgesehen, welche die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene der Probe abbildet. Zwischen dem Fokussiersystem und der Abbildungsoptik ist ein Polarisationselement angeordnet, welches das Beleuchtungslichtbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel aufspaltet, die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik propagieren, wodurch die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene einander überlagert sind, abbildbar ist.
-
Da in dem einzigen Beleuchtungsstrahlengang der erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung die beiden durch das Polarisationselement erzeugten Teilbündel unter verschiedenen Winkeln zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs in die Abbildungsoptik propagieren, werden in der Probe zwei Lichtblätter generiert, welche die betrachtete Fokusebene aus unterschiedlichen Richtungen beleuchten. Tritt nun in einer der beiden Beleuchtungsrichtungen infolge eines Streuzentrums oder eines Absorbers eine Abschattung des Beleuchtungslichtes auf, so ist durch die andere, durch das Streuzentrum oder den Absorber unbeeinträchtigte Beleuchtungsrichtung immer noch eine ausreichende Beleuchtung der Fokusebene gewährleistet. Dadurch können Streifenartefakte zuverlässig vermieden werden.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt insbesondere die Einkopplung von Beleuchtungslicht in ein SPIM-System, das ein einziges Beleuchtungsobjektiv aufweist. Damit ist die erfindungsgemäße Realisierung technisch weniger aufwendig als herkömmliche Systeme, in denen verschieden polarisierte Teilbündel in entgegengesetzten Beleuchtungsrichtungen in die Probe propagieren und die deshalb zwei separate Beleuchtungsobjektive benötigen.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist besonders bevorzugt anwendbar in einer herkömmlichen SPIM-Anordnung, bei der neben einem Beleuchtungsobjektiv ein separates Detektionsobjektiv vorgesehen ist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt. So ist sie beispielsweise auch in der Schiefebenen-Mikroskopie anwendbar, bei der ein einziges Objektiv zur Beleuchtung und zur Detektion eingesetzt wird.
-
Das Polarisationselement ist in einer zu der Fokusebene konjugierten Position angeordnet. Diese konjugierte Position liegt beispielsweise an der Stelle des durch das Fokussiersystem primär erzeugten Lichtblatts.
-
In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das Polarisationselement ausgebildet, die beiden Teilbündel unter entgegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung wegzulenken. Bezeichnet man den vorstehend genannten Winkel mit α und die durch die Abbildungsoptik bewirkte Vergrößerung mit β, so werden in dieser Ausführungsform in der Probe zwei Lichtblätter generiert, die unter einem Winkel ±α/β zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung innerhalb der Probe propagieren. Der Winkel 2α > 0, den die beiden Propagationsrichtungen zueinander aufweisen, reduziert die durch Streuung und Absorption verursachte Streifenbildung.
-
Vorzugsweise ist das Polarisationselement so ausgebildet, dass die beiden Teilbündel linear polarisiert sind, wobei ihre Polarisationsrichtungen senkrecht zueinander liegen. Die senkrecht zueinander liegenden Polarisationsrichtungen haben den Vorteil, dass eine Interferenz zwischen den beiden Lichtblättern ausgeschlossen ist. Außerdem werden durch eine Beleuchtung mit diesen beiden Polarisationsrichtungen Photoselektionseffekte in der Anregung von Fluorophoren reduziert.
-
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polarisationselement ein Wollaston-Prisma. Ein solches Prisma besteht beispielsweise aus zwei rechtwinkligen Calcit-Prismen, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die optischen Achsen der beiden Prismen liegen senkrecht zueinander.
-
Vorzugsweise umfasst das Fokussiersystem ein anamorphotisches optisches Element, z. B. eine Zylinderlinse. Mit einer solchen Zylinderlinse, die das Beleuchtungslichtbündel nur in einer Richtung fokussiert, kann die für die gewünschte selektive Beleuchtung der Fokusebene benötigte lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung auf besonders einfache Weise erzeugt werden. Dazu kann das anamorphotische Element entweder in eine dem Objekt konjugierte Ebene oder auch in eine der Pupille konjugierte Ebene fokussieren. In der ersten Form ist das Polarisationselement zweckmäßigerweise in einer der vorderen Brennebene der anamorphotisch optischen Elements konjugierten Ebene angeordnet, in der letzteren Form in einer der hinteren Brennebene des anamorphotisch optischen Elements konjugierten Ebene. Auch diese Ausführungsformen sind nur beispielhaft zu verstehen. So sind auch andere Realisierungen denkbar, z. B. in Form einer Powell-Linse oder dergleichen.
-
In einer weiteren alternativen Ausführungsform umfasst das Fokussiersystem eine Abtastvorrichtung und eine zylindersymmetrische Optik. Die Abtastvorrichtung ist beispielsweise ein um eine Achse verkippbarer Abtastspiegel, etwa ein Galvanometerspiegel oder ein auf einem mikro-elektromechanischen System basierender Spiegel, kurz MEMS-Spiegel, der das Beleuchtungsbündel infolge seiner Verkippung innerhalb einer Ebene derart ablenkt, dass das Beleuchtungsbündel in dieser Ebene gleichsam ein Lichtblatt aufbaut. Die zylindersymmetrische Optik ist z. B. eine f-Theta-Linse oder eine f-tan Theta-Linse.
-
Eine konkrete Realisierung eines solchen Fokussiersystems ist beispielsweise in der
US 8 970 950 B2 beschrieben.
-
Vorzugsweise liegt die Ebene, in der das Polarisationselement das Beleuchtungslichtbündel in die beiden Teilbündel aufspaltet, senkrecht zur Fokussierrichtung des anamorphotischen optischen Systems bzw. senkrecht zur Abtastrichtung der Abtastvorrichtung, wobei die Fokussierung bzw. die Abtastrichtung zweckmäßigerweise senkrecht zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung liegt.
-
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist das Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert. Die Erfindung ist jedoch auf eine solche Ausführung nicht beschränkt. So kann das Beleuchtungslichtbündel auch unpolarisiert sein. Auch die Verwendung von zirkular oder elliptisch polarisiertem Beleuchtungslicht ist möglich.
-
Ist das Beleuchtungslichtbündel linear polarisiert, so weist dessen Polarisationsrichtung vorzugsweise gegenüber der Aufspaltungsrichtung des Polarisationselementes einen Winkel von 45° auf. Dies ermöglicht eine besonders einfache Realisierung der erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung.
-
In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst die Abbildungsoptik ein Objektiv, welches das einzige Beleuchtungsobjektiv darstellt. Damit ist die Erfindung besonders gewinnbringend in einem üblichen SPIM-Mikroskop anwendbar, das ein einziges Beleuchtungsobjektiv sowie ein separates Detektionsobjektiv aufweist.
-
In einer speziellen Ausgestaltung umfasst die Abbildungsoptik ein Unendlich-Objektiv und eine Tubuslinse. Dieser im Wesentlichen zweiteilige Aufbau der Abbildungsoptik hat den Vorteil, dass in dem an das Objektiv anschließenden Unendlich-Strahlengang auf besonders einfache Weise weitere optische Komponenten eingekoppelt werden können, falls dies erforderlich oder hilfreich ist. Dieser Aufbau ermöglicht auch eine besondere Modularität des Systems durch die Nutzbarkeit der großen kommerziell verfügbaren Portfolios an Unendlich-Objektiven.
-
In einer alternativen Ausführungsform umfasst die Abbildungsoptik ein Endlich-Objektiv. Damit ist eine besonders kompakte und einfach realisierbare einteilige Ausführung des Vergrößerungssystems möglich.
-
Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe nach Anspruch 13 vor, bei dem ein Beleuchtungsbündel erzeugt wird und das Beleuchtungsbündel zu einer lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung fokussiert wird, mit der eine Fokusebene der Probe beleuchtbar ist, wobei die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene der Probe abgebildet wird und das Beleuchtungsbündel in zwei verschieden polarisierte Teilbündel, die in unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen in die Abbildungsoptik propagieren, aufgespaltet wird und die lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung durch die Abbildungsoptik in Form von zwei verschieden polarisierten Lichtblättern, die in der Fokusebene einander überlagert sind, abgebildet wird.
-
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem SPIM-Mikroskop oder einem Schiefebenen-Mikroskop angewandt.
-
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
-
1 eine schematische Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung als erstes Ausführungsbeispiel;
-
2 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel;
-
3 eine schematische Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung als zweites Ausführungsbeispiel; und
-
4 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel.
-
5 eine weitere Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsvorrichtung als drittes Ausführungsbeispiel; und
-
6 eine weitere Schnittansicht der Beleuchtungsvorrichtung gemäß dem dritten Ausführungsbeispiel.
-
Die 1 und 2 zeigen Schnittansichten einer Beleuchtungsvorrichtung 10, die beispielsweise Teil eines SPIM-Mikroskops ist. Das SPIM-Mikroskop enthält eine in den 1 und 2 nur schematisch dargestellte Detektionseinheit 11 mit einer Detektionsoptik 13 und einem Detektor 15. Die optische Achse O' der Detektionsoptik 13 ist senkrecht zur optischen Achse O der Beleuchtungsvorrichtung 10 angeordnet. In den 1 und 2 wird jeweils auf ein rechtwinkliges Koordinatensystem x-y-z Bezug genommen, dessen z-Achse mit der optischen Achse O zusammenfällt. Demnach ist die Beleuchtungsvorrichtung 10 in 1 in einem x-z-Schnitt und in 2 in einem y-z-Schnitt dargestellt. Die Darstellungen in den 1 und 2 sind vereinfacht und rein schematisch. So sind lediglich diejenigen Komponenten dargestellt, die für das Verständnis der Erfindung erforderlich sind.
-
Die Beleuchtungsvorrichtung 10 umfasst eine Lichtquelle 12, ein anamorphotisches Fokussiersystem 14 in Form einer Zylinderlinse, ein Wollaston-Prisma 16 und eine Abbildungsoptik 18, die aus einer Tubuslinse 20 und einem Unendlich-Objektiv 22 gebildet ist. Zwischen dem Unendlich-Objektiv 22 und der Tubuslinse 20 befindet sich die mit 24 bezeichnete Eintrittspupille des Unendlich-Objektivs 22.
-
Die Lichtquelle 12 sendet ein kollimiertes Beleuchtungslichtbündel 26 auf die Zylinderlinse 14 aus. Die Zylinderlinse 14 hat die Eigenschaft, dass sie das Beleuchtungslichtbündel 26 lediglich in einer zur x-Achse parallelen Richtung fokussiert, während sie in einer zur y-Achse parallelen Richtung keine optische Wirkung auf das Beleuchtungslichtbündel 26 hat. Somit erzeugt die Zylinderlinse 14 im Bereich ihrer Brennebene eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung, die in Richtung der x-Achse fokussiert und in Richtung der y-Achse flächig ausgedehnt ist. Diese Beleuchtungslichtverteilung wird durch die Abbildungsoptik 18 in eine in den Figuren mit E bezeichnete Fokusebene abgebildet.
-
Das Wollaston-Prisma 16 befindet sich auf der optischen Achse O an der Stelle, an der die Zylinderlinse 14 das Beleuchtungslichtbündel 26 zu der lichtblattartigen Beleuchtungslichtverteilung fokussiert. Wie in der Schnittansicht nach 2 gezeigt, besteht das Wollaston-Prisma 16 aus zwei rechtwinkligen Prismen, z. B. Calcit-Prismen 28, 30, die an ihren Basisflächen miteinander verkittet sind. Die in 2 nicht gezeigten optischen Achsen der beiden Prismen 28, 30 liegen senkrecht zueinander.
-
Das Wollaston-Prisma 16 ist in dem Strahlengang der Beleuchtungsvorrichtung 10 so angeordnet, dass seine Eintrittsfläche 32 senkrecht zur optischen Achse O ausgerichtet ist. Das auf die Eintrittsfläche 32 fallende Beleuchtungslichtbündel 26 wird durch das Wollaston-Prisma 16 in zwei Teilbündel 34, 36 aufgespalten, die jeweils eine unterschiedliche Polarisation aufweisen. Dabei liegt die Ebene, in der das Wollaston-Prisma 16 das Beleuchtungsbündel in die beiden Teilbündel 34, 36 aufspaltet, parallel zur y-Achse, d. h. in dem Schnitt nach 2 in der Zeichenebene und in dem Schnitt nach 1 senkrecht zur Zeichenebene. Die Aufspaltungsebene des Wollaston-Prismas verläuft somit senkrecht zur Fokussierrichtung der Zylinderlinse 14. In der Darstellung nach 2 soll das mit durchgezogenen Linien dargestellte Teilbündel 34 rein beispielhaft p-polarisiert und das mit gestrichelten Linien dargestellte Teilbündel 36 s-polarisiert sein. Des Weiteren wird in dem in den 1 und 2 dargestellten Ausführungsbeispiel angenommen, dass das in das Wollaston-Prisma 16 eintretende Beleuchtungslichtbündel 26 seinerseits linear polarisiert ist, wobei die Polarisationsrichtung des Beleuchtungslichtbündels 26 senkrecht zur optischen Achse O liegt und gegenüber der Aufspaltungsrichtung des Wollaston-Prismas 16 einen Winkel von 45° aufweist. Diese lineare Polarisation des Beleuchtungslichtbündels 26 ist wiederum rein beispielhaft zu verstehen. So ist es ebenso möglich, dass das Beleuchtungslicht unpolarisiert, zirkular polarisiert oder elliptisch polarisiert ist.
-
Das Wollaston-Prisma 16 zerlegt das Beleuchtungslichtbündel 26 derart, dass die beiden Teilbündel 34 und 36 in der Schnittdarstellung nach 2 unter entgegengesetzt gleichen Winkeln von der optischen Achse O abgelenkt werden. Der jeweilige Winkel ist in 2 mit α bezeichnet. Der Winkel α ist so gewählt, dass er innerhalb des Akzeptanzbereichs der Abbildungsoptik 18 liegt.
-
Damit ist sichergestellt, dass die beiden Teilbündel 34, 36 in jedem Fall in die Abbildungsoptik gelangen. Auf diese Weise erzeugt die Abbildungsoptik 18, welche die von der Zylinderlinse 14 am Ort des Wollaston-Prismas 16 erzeugte lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung in die Fokusebene E abbildet, in der Fokusebene E zwei separate Lichtblätter, von denen das dem Teilbündel 34 zugeordnete Lichtblatt p-polarisiert und das dem Teilbündel 36 zugeordnete Lichtblatt s-polarisiert ist. Wie in 2 gezeigt, sind die beiden Lichtblätter im Bereich der Fokusebene E einander überlagert.
-
Nimmt man an, dass die Abbildungsoptik 18 eine Vergrößerung β aufweist, so propagieren die beiden, senkrecht zueinander polarisierten Lichtblätter in der Probe unter einem Winkel ±α/β zur optischen Achse O. Durch diese beiden unterschiedlichen Propagationsrichtungen können Streifenartefakte infolge von Streuzentren oder Absorbern, die in der Probe vorhanden sind, weitgehend vermieden werden. Tritt nämlich beispielsweise in der Propagationsrichtung des Teilbündels 34 Streuung und/oder Absorption auf, so steht mit dem anderen Teilbündel 36 immer noch eine weitere, ungestörte Propagationsrichtung für die Beleuchtung der Fokusebene E zur Verfügung, durch welche die Streifenbildung reduziert wird.
-
Die 3 und 4 sind den 1 bzw. 2 entsprechende Schnittdarstellungen und zeigen ein zweites Ausführungsbeispiel, das eine gegenüber der in den 1 und 2 dargestellten Ausführungsform abgewandelte Abbildungsoptik 18' aufweist. Während die Abbildungsoptik 18 des ersten Ausführungsbeispiels mit der Tubuslinse 20 und dem nachgeordneten Unendlich-Objektiv 22 im Wesentlichen zweiteilig ausgebildet ist, stellt die Abbildungsoptik 18' des zweiten Ausführungsbeispiels eine einteilige Ausführung dar. So ist die Abbildungsoptik 18' nur aus einem Endlich-Objektiv 22' gebildet. Sie kommt also ohne Tubuslinse aus.
-
Im Übrigen entspricht der Aufbau des zweiten Ausführungsbeispiels dem des ersten Ausführungsbeispiels. Hierzu wird auf die Beschreibung zu den 1 und 2 verwiesen.
-
Die 5 und 6 sind den 1 bzw. 2 entsprechende Schnittdarstellungen und zeigen ein drittes Ausführungsbeispiel, in dem anstelle der Zylinderlinse 14 ein Fokussiersystem vorgesehen ist, das aus einem Abtastspiegel 38 und einer zylindersymmetrischen Optik 40 gebildet ist. Der Abtastspiegel 38 ist lediglich in 6 gezeigt. Im Übrigen ist in den Darstellungen nach 5 und 6 die Lichtquelle 12 zur Vereinfachung nicht gezeigt.
-
Wie in 6 gezeigt, ist der Abtastspiegel 38, der beispielsweise als Galvanometerspiegel oder MEMS-Spiegel ausgeführt ist, um eine zur x-Achse parallelen Achse verkippbar. Infolge dieser Verkippung führt das an dem Abtastspiegel 38 reflektierte Beleuchtungsbündel 26 eine Abtastbewegung in der y-z-Ebene aus. Im Zusammenwirken mit der zylindersymmetrischen Optik 40, die z. B. eine f-Theta-Linse oder eine f-tan Theta-Linse sein kann, wird dadurch in der y-z-Ebene eine lichtblattartige Beleuchtungslichtverteilung erzeugt, die im Übrigen in gleicher Weise wie in den beiden ersten Ausführungsbeispielen dazu genutzt wird, zwei gegeneinander verkippte Lichtblätter unterschiedlicher Polarisation zu erzeugen, die in der Fokusebene E einander überlagert sind.
-
Bezugszeichenliste
-
- 10
- Beleuchtungsvorrichtung
- 11
- Detektionseinheit
- 12
- Lichtquelle
- 13
- Detektionsoptik
- 14
- Zylinderlinse
- 15
- Detektor
- 16
- Wollaston-Prisma
- 18
- Abbildungsoptik
- 20
- Tubuslinse
- 22
- Unendlich-Objektiv
- 22'
- Endlich-Objektiv
- 24
- Pupille des Unendlich-Objektivs 22
- 26
- Beleuchtungslichtbündel
- 28, 30
- rechtwinklige Prismen
- 32
- Eintrittsfläche
- 34, 36
- Teilbündel
- 38
- Abtastvorrichtung
- 40
- zylindersymmetrische Optik
- O
- optische Achse
- O'
- optische Achse
- E
- Fokusebene
- α
- Winkel
- x, y, z
- Achsen
