WO2018141333A1 - Anordnung zur auflösungssteigerung eines laser-scanning-mikroskops - Google Patents

Anordnung zur auflösungssteigerung eines laser-scanning-mikroskops Download PDF

Info

Publication number
WO2018141333A1
WO2018141333A1 PCT/DE2018/100060 DE2018100060W WO2018141333A1 WO 2018141333 A1 WO2018141333 A1 WO 2018141333A1 DE 2018100060 W DE2018100060 W DE 2018100060W WO 2018141333 A1 WO2018141333 A1 WO 2018141333A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pupil
prism
interferometer
wedge
light
Prior art date
Application number
PCT/DE2018/100060
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kai Wicker
Ralf Netz
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy Gmbh filed Critical Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority to US16/481,795 priority Critical patent/US11525988B2/en
Priority to CN201880009516.9A priority patent/CN110235044B/zh
Publication of WO2018141333A1 publication Critical patent/WO2018141333A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0072—Optical details of the image generation details concerning resolution or correction, including general design of CSOM objectives
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/10—Beam splitting or combining systems
    • G02B27/1066—Beam splitting or combining systems for enhancing image performance, like resolution, pixel numbers, dual magnifications or dynamic range, by tiling, slicing or overlapping fields of view
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/10—Beam splitting or combining systems
    • G02B27/12—Beam splitting or combining systems operating by refraction only
    • G02B27/126—The splitting element being a prism or prismatic array, including systems based on total internal reflection

Definitions

  • the invention relates to an arrangement for increasing the resolution of a laser scanning microscope (LSM), in particular for classical and confocal laser scanning microscopes (CLSM).
  • LSM laser scanning microscope
  • CLSM classical and confocal laser scanning microscopes
  • Image Inversion Interferometry is a known method of increasing resolution and light efficiency in CLSM, as described, for example, in US Pat. for fluorescence LSM in Optics Express Vol. 15, No. 19 (2007), 12206 to 12216.
  • the descanned light is split in the detection path of an LSM at a beam splitter, the wavefront laterally rotated in two separate interferometer arms relative to each other before being combined interferometrically at a further beam splitter.
  • the two interferometer outputs C (constructive) and D (destructive) are optionally imaged on pinholes and then recorded with integrating detectors.
  • the two wavefronts rotated relative to one another are identical to one another for reasons of symmetry and can perfectly interfere with each other, ie a full signal in C and a zero signal in D.
  • the fluorophore is far away from the inversion axis removed, the mutually inverted wavefronts no longer overlap and therefore can not interfere with each other.
  • This interferometric suppression of light that does not come from the inversion axis ie, the current scan position
  • This effect can be combined in a LSM with spot illumination and a pinhole for further resolution enhancement, improved depth resolution (enhanced sectioning), and a higher signal-to-noise ratio (SNR).
  • a wavefront reflection can also be performed on a lateral axis.
  • the resolution increase is then limited to a direction perpendicular to the mirror axis, but the method can then also be used for line scan systems.
  • a dual application of the principle with reflection around two mutually perpendicular axes again reaches the point-symmetrical increase in resolution of the inversion.
  • the optical transfer function has a rectangular shape and thus transmits high spatial frequencies significantly better than the normally limiting wide-field transfer function, which has a nearly triangular shape (compare Fig. 2b in Optics Express 15, No. 19 (2007), 12209).
  • WO 2008/093099 A2 describes a method and an arrangement for increasing the image resolution in confocal laser scanning microscopes (CLSM), which still achieve significant improvements in lateral resolution in the case of pinhole openings of about 1 Airy unit.
  • CSM confocal laser scanning microscopes
  • image inversion occurs by flipping the entire image.
  • the entire image In order to achieve the image inversion, the entire image must be divided into two beam paths and guided, wherein in one of the beam paths, the inversion takes place, while in the other beam path, the image remains unchanged. Thereafter, the beam paths are brought together again and brought the images to interference.
  • the invention has for its object to find a new way of increasing resolution in laser scanning microscopy (LSM) by image inversion interferometry (III), which for a lll-typical resolution increase (up to 40%) allows a simplified adjustment and less susceptibility to spurious effects as well as lower manufacturing costs.
  • LSM laser scanning microscopy
  • III image inversion interferometry
  • the object is achieved with a method for improving the resolution or the signal-to-noise ratio of a laser scanning microscope by means of image inversion interferometry, in which at least one mirroring of a pupil bundle takes place in an interferometer arm, to wavefronts of a pupil image mirrored on at least one axis and unchanged pupil image of another interferometer arm, solved by the steps:
  • the splitting of the pupil bundle into complementary subregions P and Q of the pupil in the common path interferometer is realized by means of a double wedge prism so that one of the two complementary subregions P or Q is guided in separate wedge prisms as interferometer arms with at least one internal reflection, and the interfering of the internally reflected light of the interferometer arms takes place on a contact surface coated with the partially transparent beam splitter layer the wedge prisms, wherein transmitted at the beam splitter layer light of a wedge prism with reflected light of the other wedge prism and reflected light of a wedge prism with transmitted light of the other wedge prism is superimposed and wavefronts of the first portion P with those of the second portion Q structurally and destructively be interfered so that the bundle pitch of the pupil is used for the interference of the mutually mirrored wavefronts from the subregions P and Q.
  • light which emerges from a hypotenuse surface of at least one of the wedge prisms as interfered portions of light reflected by the beam splitter layer of one interferometer arm and transmitted light of the other interferometer arm is preferably evaluated.
  • the emission of the interfered light from the at least one hypotenuse surface (c) it is expedient to detect the intensity by means of a detector in a conjugated pupil.
  • the interfered light from the second portion Q of conjugated pupil to the full screen with the first portion P are unfolded.
  • the interfered light of each one interfered subregion ( U + Tx + R + Sx) or (T-Ux + S-Rx) of the conjugated pupil after the double prism each in two-quarter subregions (U + Tx + Ry + Sxy) and (R + Sx-Uy-Txy) or ( T-Ux + Sy-Rxy) and (S-Rx-Ty + Uxy) divided, in each case one of the other double wedge prisms in the sense of a common-path interferometer and constructively and destructively superimposed, so that four different, each with every quarter sub-areas (R, S, T, U) interfered with another quarter conjugated pupils, which are composable to a full pupil
  • the splitting of the pupil bundle into complementary subregions P and Q of the pupil is realized in the common path interferometer by means of a double wedge prism.
  • the guiding of one of the two complementary subregions P or Q of the pupil takes place as interferometer arms in separate wedge prisms, whereby at least one of the wedge prisms is replaced by a roof prism of the amici type, which is complemented by a complementary prism to the wedge prism but separated by an air gap is, the inversion of the complementary portions P and Q is performed as rotation in the at least one roof prism by means of two internal reflections of the subregions P or Q at roof edges of a roof prism, and takes place the internally reflected twice Light of the at least one of the interferometer arms on a coated with a partially transparent beam splitter layer contact surface of the wedge prisms, wherein twice reflected light of a roof prism is superimposed with transmitted light of the other wedge prism, so that the bundling pitch of the pupil for interference of mutually rotated by 180 ° wavefronts of the subregions P and Q of the pupil leads.
  • both wedge prisms can be replaced by roof prisms with complementary prism and air gap particularly advantageous to produce from the pupil through the interferometer arms with constructive and destructive interference a full screen of the conjugated pupil.
  • the object in an arrangement for improving the resolution or the signal-to-noise ratio of a laser scanning microscope with means for image inversion interferometry, comprising means for mirroring a pupil bundle in an interferometer arm, is accompanied by a pupil image mirrored on at least one lateral axis to bring an unchanged pupil image of another Interferometerarms to interference, solved by the fact that a compact common-path interferometer is present, the at least one double wedge prism of two contains rectangular, mirror-symmetrically arranged wedge prisms, which are each in contact with each other on a large catheter surface and have a partially transparent beam splitter layer, that light from the pupil bundle with a pupil of the laser scanning microscope is directed orthogonally to a respective small catheter surface of the wedge prisms, said either a first partial area P or a second partial area Q of the pupil of the laser scanning microscope complementary to the first partial area P is coupled into the wedge prisms, and the light coupled into the wedge prisms is totally reflected on at least one hypotenuse surface of the wedge pris
  • the wedge prisms advantageously have internal angles such that light incident orthogonally into the small catheter surfaces is aligned parallel to the beam splitter layer and to the base and top surfaces of the wedge prisms, totally reflected upon first encounter with the hypotenuse surface of each wedge prism and orthogonal upon second impingement upon reflection at the beam splitter layer the hypotenuse surface is directed.
  • the wedge prisms are designed with internal angles of 90 °, 60 ° and 30 ° and assembled in the double wedge prism to an equilateral prism.
  • the partially transparent beam splitter layer located between the two wedge prisms is preferably designed as a neutral splitter layer.
  • the partially transparent beam splitter layer is applied to one of the wedge prisms and provided as a cemented surface for the assembly of the wedge prisms.
  • the wedge prisms of the double wedge prism can be parallel to the optical axis of the laser scanning microscope along the beam splitter layer be designed to be displaceable against each other in order to easily adjust the optical path lengths in the two wedge prisms can.
  • An alternative possibility for producing the path difference can be realized by a double wedge in front of or at the short catheter surface of one of the wedge prisms
  • At least one further double wedge prism is arranged downstream of the double wedge prism, and the hypotenuse faces of the double wedge prism and the at least one further wedge prism are aligned parallel to each other to block the interfering light emerging from the beam splitter layer through the hypotenuse face from at least one of the subregions (U + Tx + R + Sx) and (R + Sx-Uy-Txy) of the conjugated pupil to unfold into a full pupil image.
  • At least one further double wedge prism is arranged downstream of the double wedge prism in the constructive or destructive interferometer channel and has small catheter surfaces rotated parallel to the hypotenuse surface of the double wedge prism by the light interfering with the beam splitter layer from one of the hypotenuse surfaces of two of the partial regions (U + Tx + R + Sx) and (R + Sx-Uy-Txy) of the conjugated pupil to at least a quarter portion (U + Tx + Ry + Sxy) or (R + Sx-Uy-Txy) or (T + Ux + Sy + Rxy) or (S + Rx-Ty-Uxy).
  • the pupil or a focal plane image of the laser scanning microscope is provided and imaged into a conjugate pupil or conjugate focal plane image.
  • the invention is based on the basic idea that the lateral increase in resolution in laser scanning microscopes through the use of image inversion interferometry with image inversion on a Michelson or Mach-Zehnder interferometer type always suffers because the exact mirror adjustments are complex and susceptible to interference.
  • the same division (intensity or amplitude division) of the wavefront for a subsequent interferometric combination relative to one in the separate interferometer beam paths relative to each other made image rotation problematic.
  • the constructive and the destructive output of the interferometer must result in symmetry for an emitter fluorophore in the image axis to two identical rotated wavefronts, which perfectly interfere with each other, whereby in the destructive beam path extinction and constructive reinforcement.
  • the wavefronts can no longer overlap and interfere with each other.
  • Constructive and destructive output of the interferometer in this case each show 50% signals that can not overlap interferometrically. The increase in resolution thus results exclusively from the interferometric amplification of near-axis emitting fluorophores with perfectly rotated superimposed identical wavefronts.
  • the resulting demanding stability and adjustment requirements are alleviated by introducing into the detection beam path of the LSM a so-called common-path interferometer and performing a half-pupil image inversion interferometry (HP-III).
  • HP-III half-pupil image inversion interferometry
  • a geometric pupil division (spatial division) is undertaken. It is exploited that the light distribution in the pupil is symmetrical and therefore two pupil halves without prior division at the beam splitter can be combined interferometrically with each other, the half-pupils are mirrored or rotated 180 ° to each other about the optical axis brought to overlap. In a special beam splitter, the half-pupils are then combined interferometrically, so that the contents of the two divided half-pupils combined with each other are brought into interference.
  • the HP-III is performed completely by having both a partial area P (preferably a half-pupil, but may also be designed as a quarter-pupil) with the other (complementary, equal) partial area Q and vice versa the other partial area Q with the one partial area P is interfered. Without limiting the generality, it is assumed below for the explanation of half-pupils.
  • the Ill wedge prism is slightly offset in the direction perpendicular to the partially transmissive layer of the prism and / or installed under a minimum deviating from the optical axis angle.
  • the two outputs are no longer identical, but in one interferometer channel the half-pupils P and Qx constructively interfere (interferometer channel C: P + Qx) and in the other the half-pupils Q and Px destructively (inerferometer channel D: Q - Px).
  • the precondition is that the two wedge prisms are not cemented together or glued along the optical axis only after the adjustment of the horizontal offset.
  • the arrangement according to the invention makes possible a simplified solution for increasing the resolution in laser scanning microscopes (LSM) by image inversion interferometry (III), in which the Ill principle, realized as half-pupil interference (HP-III) in a shortened, stable common-path interferometer, is simplified Adjustment and lower sensitivity to external disturbing effects (eg temperature, vibration, etc.) and causes lower production costs. Furthermore, the invention circumvents the same division of the wave front (intensity division) required in the prior art and replaces this with a pupil surface division (or spatial bundle division), which is much easier to adjust.
  • FIG. 1 is a schematic representation of an LSM detection beam path with inventive half-pupil image inversion interferometry (HP-III) in a common-path interferometer,
  • 2a shows a schematic representation of the conventional image inversion interferometry (III) with consideration of two pupil subareas P and Q with regard to the invention for explaining the redundant information content in the interfering half-pupils after combining the intensity-divided unaltered and the inverted wavefront of the complete pupil
  • 2b shows a schematic representation of the inventive principle (HP-III) with divided pupil in two half-pupils, of which one mirrored or rotated in each case interferes with the other unchanged half-pupil
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a first embodiment of the beam splitting and wavefront combination according to the invention comprising an equilateral HP-III prism with a partially transparent beam splitter layer between the large catheter surfaces of the two rectangular wedge prisms and its adjustment possibilities for setting a symmetry deviation in the interferometric overlay,
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a second embodiment of the invention with at least one further double wedge prism for pupil reconstruction by duplication of the half-pupils;
  • FIG. 5 shows a perspective illustration of a wavefront inversion embodiment modified with respect to FIG. 4 with two further double-wedge prisms, which are rotated by 90 ° with respect to the beam-dividing plane of the HP-III prism.
  • Fig. 1 for a confocal laser scanning microscope (LSM), wherein a pupil of the detection beam path of the LSM in a shortened common path interferometer 2, which is shown in a basic version with a double wedge prism 3 (hereinafter also referred to as HP lll prism), coupled and mapped to at least one optoelectronic receiver 4.
  • LSM confocal laser scanning microscope
  • HP lll prism double wedge prism 3
  • a pinhole 43 or 44 is preferably arranged in front of a first detector 41 and optionally a second detector 42.
  • the pinhole can ideally be a line pinhole (not drawn) adapted to the line illumination, ie a slot instead of a hole.
  • the receiver 4 would then ideally be a linear detector 41 (line detector), which resolves the line spatially resolved in the image space.
  • both subregions P and Q contain the same wavefront components due to the symmetry of the pupil image information and neglecting any asymmetrical aberrations, this results in an information redundancy of the subregions P and Q.
  • a half-pupil 13 can be mirrored onto the other half-pupil 14 (ie after a simple reflection on a laterally oriented x-axis, drawn here as a horizontal axis 11) for interference be superimposed.
  • the result of Fig. 2b, the half-pupil superposition of HP 13 with HP 14, the same as in the right-hand illustration of Fig. 2a (after interfering with the wavefronts partitioned from the entire pupil 1) is the upper area fraction P + Qx.
  • the latter is in turn equal to the lower area fraction Q + Px, which corresponds to the half-pupil superposition of HP 14 with HP 13.
  • a pupil 1 of the detection beam path of an LSM is shown in stylized form on the left, wherein a subdivision into two subregions P and Q along a horizontal axis 1 1 which laterally crosses the optical axis 12 of the LSM is undertaken.
  • the horizontal coordinate is declared as the x-direction and the vertical coordinate as the y-direction. This assignment is assumed below - without limiting the generality for the designation of the pupil portions.
  • the light coming from the microscope is collimated by a collimating optics 5, so that a pupil 1 is formed behind the collimating optics 5.
  • the collimated light is then directed into the shortened common-path interferometer 2.
  • the generated pupil 1 may be in front of, in, or behind the interferometer.
  • the collimating optics 5 also does not have to perfectly collimate the bundle; it suffices if the bundle within the common path interferometer 2 is at least not clipped. This means that slightly divergent and convergent bundles are also accessible to HP-III.
  • parts of the microscope can already act as collimating optics 5. It can be exploited that modern microscopes often have infinitely corrected objects, so that the light is already collimated, and the common-path interferometer 2 can already be positioned in the collimated bundle between the lens and the tube lens of the microscope or directly after the tube lens of the microscope can be arranged as long as the above-mentioned bundle trimming does not occur.
  • the common path interferometer 2 in this embodiment includes a double wedge prism 3, which is composed of two mirror-symmetrically arranged rectangular wedge prisms 31 and 32, the large catheter surfaces a of the two wedge prisms 31 and 32 are in contact and on one of these catheter surfaces a a partially transparent beam splitter layer 34 is applied.
  • the two large catheter surfaces a of the wedge prisms 31 and 32 are preferably glued together as cemented surfaces and thus produce a compact and stable common path interferometer 2.
  • the common-path interferometer 2 is shortened in that it has no conventional input beam splitter III, which makes a division into two interferometer arms.
  • the double wedge prism 3 used in the collimated beam from the pupil 1 two adjacent entry surfaces in the form of small catheter surfaces b of the wedge prisms 31 and 32. These small catheter surfaces b represent the entry surfaces of the separate interferometer and each take one of the half-pupils 13 and 14 (as complementary partial areas of the pupil 1).
  • image reversal occurs by total reflection at the hypotenuse surface c of each wedge prism 31 and 32
  • Reflected light components of the half-pupils 13 and 14 are then directed from opposite sides to the partially transparent beam splitter layer 34, which is preferably a neutral divider layer, and from there brought into the wedge prism 31 totally reflected portions with the transmitted portions of the wedge prism 32 to interference, while the in Wedge prism 32 totally reflected portions with the transmitted portions of the wedge prism 31 interfere.
  • the half-pupil 13 remains practically unchanged by double-glazing and is interfered with the portion of the half-pupil 14 that has passed through the beam splitter layer 34 in the wedge prism 32, so that the resulting half-pupil combination P + Qx is detected by a first detector 41 via focusing optics 61 is recorded.
  • the other half-pupil combination P-Qx is likewise available and can additionally be recorded via a focusing optics 62 with a second detector 42 (shown in dashed lines).
  • each interferometer channel C and D as in the conventional III, the information of the complete pupil 1 is "interferometrically folded." For a desired resolution increase by further calculation of the signals, it is important that in both interferometer channels C and D a sign change the interference P + Qx and P-Qx is present.
  • the significantly improved resolution can be achieved by using both interference channels C and D, in which a phase difference of the wave fronts of the half-pupils 13 and 14 is deliberately set by path length change within the wedge prisms 31 and 32.
  • Fig. 3 shows the preferred implementation possibility, which consists of a single HP-III prism (double wedge prism 3), in which two wedge prisms 31 and 32 are in mirror symmetry in contact with each other, wherein on the large Catheter surface a of the two wedge prisms 31 and 32 is a beam splitter layer 34 in the form of a partially transparent neutral divider layer.
  • the internal angles of the wedge prisms 31 and 32 are chosen so that incident light, ie light parallel to the beam splitter layer 34 and to ground and top surfaces (not labeled, as parallel below and above the plane of the drawing) of the wedge prisms 31 and 32 incident first impinging on the hypotenuse surface c of each wedge prism 31 or 32 is totally reflected and after the second impingement on the beam splitter layer 34 (ie after transmission through the latter) orthogonally to the Hypotenuse composition c of the other wedge prism 32 or 31 strikes to the respective wedge prism 31st or 32 can leave without dispersive effects.
  • the internal angles of the wedge prisms to 30 °, 60 ° and 90 °, wherein the large Katheten vom a - with the beam splitter layer 34 in between - are in contact, without being rigidly connected (glued) by a cement layer 33 together.
  • the small catheter surfaces b which are arranged within a plane orthogonal to the optical axis 12 of the detection beam path of the LSM, the light of the pupil 1, as far as it comes from the focal plane of the LSM, collimated coupled.
  • the pupil bundle coming from the LSM is subdivided into an upper and a lower half pupil 13 and 14 by the geometry of the double prism 3 and its position with the beam splitter layer 34 in a plane which is spanned by the horizontal axis 11 and the optical axis 12. Equivalent would also be a division into a left and a right half-pupil with the optical axis 12 vertical axis 15 (only in Fig. 5 drawn) or any alignment possible, since there are no system-preferred directions except the orientation to the preferred imported coordinate system.
  • the two half-pupils 13 and 14 are reflected by the total reflection at the respective Hypotenuse lake c of the wedge prisms 31 and 32 in the direction of the beam splitter layer 34, after which they interfere with each other.
  • both wedge prisms 31 and 32 along the optical axis 12 are to be understood as selectively movable, it is for a simple adjustment as preferred to assume that a wedge prism 32 is permanently installed, while on the other wedge prism 31 in the direction of the optical axis 12 can slide only horizontally. As a result, the adjustment is limited only to a one-dimensional movement and the common-path interferometer 2 remains set up to a path length change in one of the interferometer arms almost fixed to the LSM. By this measure, the wedge prism displacement to each other, the optical Path lengths within the in both wedge prisms 31, 32 to the beam deflection (by total reflection at the respective large catheter surfaces) slightly different.
  • optical double wedge 321 drawn in front of the wedge prism 32 in FIG. 3, which can also be attached directly to one of the prisms 31, 32.
  • the double wedge prism 3 can be adjusted so that one of the outputs is constructive and the other is destructive.
  • the adjustment of the compact common path interferometer 2 in the form of the double wedge prism 3 is limited to a simple one-dimensional linear movement of the same, wherein the two interferometer arms are mutually fixed and reduced to two mirror surfaces.
  • a rotation of the double wedge prism 3 about a lateral axis 1 1 (eg horizontal x-axis) orthogonal to the optical axis 12 by a small angle can also be a symmetry deviation in the interferometer channels C and 1 of the common-path interferometer 2, which generates in an analogous manner to a phase difference of the wavefront in the half-pupils 13 and 14.
  • the adjustment of the double-wedge prism 3 is limited to the variation an angle, while the interferometer arms remain limited to two mutually fixed mirror surfaces.
  • a pupil half along the dividing line (here along a horizontal axis 1 1) is mirrored to the other and brought to the interference.
  • the resolution-enhancing ill-effect results only in the dimension perpendicular to this line, so it is a one-dimensional increase in resolution.
  • an isotropic increase in resolution can be achieved by taking at least one more image, in which the double prism is rotated about the optical axis, so that the dissolution-enhancing effect acts in another dimension .
  • the pictures taken in this way can be combined in the computer into a single picture, which has an improved resolution in all lateral directions.
  • the further double-wedge prisms 35 and 36 are arranged on both sides of the HP III prism 3 with mutually parallel hypotenuse faces c in the same plane so as to pass backward, thereby splitting and unfolding instead of folding and interferometric combining , which corresponds to the desired Halbpupillendopplung.
  • Fig. 5a shows an arrangement of three HP lll prisms 3, wherein the other double wedge prisms 35 and 36 with respect to the HP-Ill prism 3 are arranged rotated by 90 °.
  • the wavefront is successively mirrored on two mutually orthogonal axes, which has a wavefront inversion result.
  • FIG. 5b shows again schematically the results of the individual interferometer channels C and D and C, D 'and C ", D" (after the further double wedge prisms 35 and 36) according to the arrangement of Fig. 5a.
  • the complete pupil imaging can be conjugated as doubly-interfered by the assembly of the doubly superimposed quarter-pupils Pupille 1 'are generated, if necessary for further processing of the LSM images.
  • the pupil 1 is split at a beam splitter, the individual paths are rotated relative to each other by 180 ° about the pupil center.
  • the respective pupil halves must be rotated 180 ° around the pupil center to the other pupil half instead of being mirrored on a line (e.g., horizontal axis 11).
  • the desired Aufnismrehhen the pupil contents can be realized by one of the two pupil halves 13, 14 undergoes additional reflection about an axis perpendicular to the dividing line of the horizontal axis 1 1 axis ,
  • One of the two wedge prisms 31, 32 namely here the wedge prism 31, is modified for this by replacing the flat hypotenuse surface c described in the previous examples with a roof-shaped double surface (including a right angle) whose "roof edge" is along a center line of the original one Hypotenuse surface c and strikes the optical axis 12.
  • the roof prism 37 thus inserted is an amici-type prism in which instead of the simple reflection on the hypotenuse surface c of the wedge prism 31 (according to FIGS The two roof surfaces of the roof prism 37 shown in FIG. 6, which leads to a further desired reflection in addition to the original reflection, with which a rotation of the half-pupil 13 is generated by 180 ° about the optical axis 12.
  • the angle of the roof edge over the optical axis 1 2 is chosen so that both the required geometric reflections are met as well as total reflection occurs at the prism-air interfaces of the roof surfaces of the roof prism 37.
  • the angle of incidence to the exit surfaces of the roof prism 37 is steep enough that total reflection does not occur Light left the roof prism 37 can.
  • the light reflected at the beam splitter layer 34 (as well as the light transmitted from the wedge prism 32 through the beam splitter layer 34) does not orthogonally strike the roof surfaces of the roof prism 37 Exit a beam deflection experienced by the snelliusschen refraction law.
  • the original prism shape of the wedge prism 31 is restored by filling the roof prism 37 with an additional complementary prism 38 (with the same refractive index as the roof prism 37).
  • an air gap 39 (or a gap which is filled with a material having a lower refractive index) remains, so that the total reflections described remain possible and the snelliussche refraction at the light exit from the roof prism 37 through the re-entry into the complementary prism 38 is reversed immediately.
  • FIG. 7 illustrates this situation in a perspective view with a stylized representation of the imaged half-pupils 13 'and 14' for the constructive and destructive interferometer channels C and D, respectively.
  • the associated overlay scheme is shown in FIG. 8b and with the overlay scheme of the conventional III (FIG. Fig. 8a) compared.
  • FIG. 8b shows the overlay diagram of the interferences in the common-path interferometer 2 as a result image.
  • the overlay pattern of HP-III (FIG. 8b) is identical in the destructive interferometer channel D to that of the corresponding pupil half of III ( Figure 8a).
  • the overlay pattern of the HP-III compared to the III is only once again mirrored around the x-axis 1 1, but this has no influence on the signal detected in the constructive interferometer channel C.
  • the half-pupil image 13 ' must be mirrored about the x-axis 1 1 with the half-pupil image 14' of the destructive interferometer channel D, whereby the constructive interferometer channel C as (T + Rxy, S + Uxy) is consistent with the representation of Fig. 8a recognizable.
  • suitable illumination eg with a Bessel beam
  • SNR signal-to-noise ratio
  • the pure area division of the pupil 1 permits a much more stable and easily adjustable wavefront overlay than intensity splitting (amplitude division) of the wavefronts in the case of conventional III, is thus ideally suited. both to increase the lateral resolution in an LSM system, to improve the SNR as well as the susceptibility to environmental influences significantly to reduce. By additional measures, the increased lateral resolution can also be transferred to the axial resolution in the so-called sectioning.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Instruments For Measurement Of Length By Optical Means (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Auflösungssteigerung eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM). Die Aufgabe, der Auflösungssteigerung bei LSM durch Bildinversionsinterferometrie (III) zu finden, die eine vereinfachte Justage und geringere Störanfälligkeit aufweist, wird erfindungsgemäß gelöst, indem - um Wellenfronten eines an wenigstens einer Achse gespiegelten Pupillenbildes und eines unveränderten Pupillenbildes zu interferieren - das vom Laser-Scanning-Mikroskop kommenden Pupillenbündels in ein verkürztes Common-Path-Interferometer (2) eingekoppelt wird, wobei die Fläche einer Pupille (1) aus dem Pupillenbündel entlang einer zur optischen Achse (12) lateralen Achse (11) in zwei komplementäre Teilbereiche P und Q unter Erzeugung zweier Teilbündel, die entlang des Common-Path-Interferometers (2) als zwei gegenüberliegend entlang der optischen Achse (12) ausgerichtete Interferometerarme spiegelsymmetrisch separat wenigstens einer Bündelumlenkung durch Totalreflexion zugeführt werden, und das Licht der Interferometerarme an einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) interferiert wird aus transmittiertem Licht des einen Interferometerarms und reflektiertem Licht des anderen Interferometerarms und umgekehrt, sodass eine konstruktive Interferenz (C) und eine destruktive Interferenz (D) der Wellenfronten aus den beiden unterschiedlichen Teilbereichen P und Q der Pupille (1) erzeugbar sind.

Description

Anordnung zur Auflösungssteigerung eines Laser-Scanning-Mikroskops
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Auflösungssteigerung eines Laser-Scanning- Mikroskops (LSM), insbesondere für klassische und konfokale Laser-Scanning- Mikroskope (CLSM).
Des Weiteren ist eine Verwendung in einem LSM mit ortsauflösendem Detektor, bevorzugt bei der Verarbeitung von mikroskopischen Bildern in Verbindung mit einem Airy-Scan-System von bevorzugtem Interesse.
In der Medizin und Biologie sind hochauflösende Laser-Scanning-Mikroskope immer wichtiger werdende Hilfsmittel für Diagnostik, Laserchirurgie und Forschung, da elektronenmikroskopische und mehrheitlich UV-Strahlung nutzende Bearbeitungs- und Untersuchungsverfahren nicht für lebende Zellen geeignet sind.
Die Bildinversionsinterferometrie (kurz: III - Image Inversion Interferometry) ist ein bekanntes Verfahren zur Steigerung der Auflösung und der Lichteffizienz in CLSM, wie sie z.B. für Fluoreszenz-LSM in Optics Express Vol. 15, Nr. 19 (2007), 12206 bis 12216, beschrieben ist.
Hierbei wird, um eine Auflösungssteigerung an LSM zu erreichen, das descannte Licht im Detektionspfad eines LSM an einem Strahlteiler aufgeteilt, die Wellenfront in zwei getrennten Interferometerarmen relativ zueinander lateral gedreht, bevor sie an einem weiteren Strahlteiler interferometrisch kombiniert wird. Die beiden Interferometer- ausgänge C (konstruktiv) und D (destruktiv) werden optional auf Pinholes abgebildet und dann mit integrierenden Detektoren aufgezeichnet.
Liegt der emittierende Fluorophor auf der Bildinversionsachse, so sind aus Symmetriegründen die beiden zueinander gedrehten Wellenfronten zueinander identisch und können perfekt miteinander interferieren, d.h. es kommt zu einem vollen Signal in C und einem Null-Signal in D. Liegt der Fluorophor hingegen weit von der Inversionsachse entfernt, so überlappen sich die zueinander invertierten Wellenfronten nicht mehr und können daher auch nicht miteinander interferieren. Es kommt zu einem Signal von je 50% in C und D. Durch diese interferometrische Unterdrückung von Licht, das nicht von der Inversionsachse (d.h. der momentanen Scan-Position) kommt, ergibt sich eine effektive Auflösungssteigerung. Dieser Effekt kann in einem LSM mit punktförmiger Beleuchtung und einem Pinhole kombiniert werden, um eine weitere Auflösungssteigerung, verbesserte Tiefenauflösung (verbessertes Sectioning) und ein größeres Signal- Rausch-Verhältnis (SNR) zu erzielen.
Anstatt einer Wellenfront-Inversion kann auch eine Wellenfrontspiegelung an einer lateralen Achse vorgenommen werden. Hierdurch wird die Auflösungssteigerung dann auf eine (die zur Spiegelachse senkrechte) Richtung beschränkt, das Verfahren kann dann aber auch für Linien-Scan-Systeme verwendet werden. Eine Doppelanwendung des Prinzips mit Spiegelung um zwei zueinander senkrechte Achsen erreicht wieder die punktsymmetrische Auflösungssteigerung der Inversion. Die optische Transferfunktion (OTF) hat hierbei eine rechteckige Form und überträgt hohe Raumfrequenzen somit deutlich besser als die normalerweise limitierende Weitfeldtransferfunktion, die eine nahezu dreieckige Form hat (vgl. Fig. 2b in Optics Express 15, Nr. 19 (2007), 12209).
In der WO 2008/093099 A2 werden ein Verfahren und eine Anordnung zur Steigerung der Bildauflösung bei konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen (CLSM) beschrieben, die bei Pinhole-Öffnungen von ca. 1 Airy-Einheit noch signifikante Verbesserungen der lateralen Auflösung erreichen. Bei dieser Art der III erfolgt die Bild-Inversion durch Spiegeln des kompletten Bildes. Um die Bildinversion zu erreichen, muss das komplette Bild in zwei Strahlengänge aufgeteilt und geführt werden, wobei in einem der Strahlengänge die Inversion erfolgt, während im anderen Strahlengang das Bild unverändert bleibt. Danach werden die Strahlengänge wieder zusammengeführt und die Bilder zur Interferenz gebracht.
Alle vorstehend beschriebenen I Ii-Verfahren sind vor allem in der Justage sehr aufwendig und empfindlich gegenüber Störeffekten, die einen Einsatz in einem Mikroskop sehr schwierig machen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Möglichkeit der Auflösungssteigerung bei Laserscanningmikroskopen (LSM) durch Bildinversions- interferometrie (III) zu finden, die für eine lll-typische Auflösungssteigerung (von bis zu 40%) eine vereinfachte Justage und geringere Empfindlichkeit gegenüber Störeffekten gestattet sowie geringere Herstellungskosten verursacht.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einem Verfahren zur Verbesserung der Auflösung oder des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Laser-Scanning-Mikroskops mittels Bildinversionsinterferometrie, bei der mindestens eine Spiegelung eines Pupillenbündels in einem Interferometerarm erfolgt, um Wellenfronten eines an wenigstens einer Achse gespiegelten Pupillenbildes und eines unveränderten Pupillenbildes eines anderen Interferometerarms zu interferieren, gelöst durch die Schritte:
- Einkoppeln des vom Laser-Scanning-Mikroskop kommenden Pupillenbündels in ein Common-Path-Interferometer (2),
- Teilen der Fläche einer Pupille (1 ) aus dem Pupillenbündel entlang einer definierten, zu einer optischen Achse (12) des kollimierten Bündels lateralen Achse (1 1 ) in zwei komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille (1 ) unter Erzeugung zweier Teilbündel, die entlang des Common-Path-Interferometers (2) als zwei gegenüberliegend entlang der optischen Achse (12) ausgerichtete Interferometerarme parallel geführt und separat wenigstens einer Bündelumlenkung durch Totalreflexion zugeführt werden, und
- Interferieren des Lichts der Interferometerarme an einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) nach der wenigstens einen Bündelumlenkung, wobei mittels der Strahlteilerschicht (34) transmittiertes Licht des einen Interferometerarms mit reflektiertem Licht des anderen Interferometerarms und umgekehrt jeweils eine Kombination von Wellenfronten eines ersten Teilbereichs P mit einem zweiten, zum ersten Teilbereich P komplementären Teilbereich Q der Pupille (1 ) und umgekehrt eingeht, sodass eine konstruktive Interferenz (C) und eine destruktive Interferenz (D) der Wellenfronten aus den beiden unterschiedlichen Teilbereichen P und Q der Pupille (1 ) erzeugbar sind.
Vorteilhaft wird das Teilen des Pupillenbündels in komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille in dem Common-Path-Interferometer mittels eines Doppelkeilprismas realisiert, sodass jeweils einer der zwei komplementären Teilbereiche P oder Q in separaten Keilprismen als Interferometerarme mit mindestens einer internen Reflexion geführt wird, und das Interferieren des intern reflektierten Lichts der Interferometerarme erfolgt an einer mit der teildurchlässigen Strahlteilerschicht beschichteten Kontaktfläche der Keilprismen, wobei an der Strahlteilerschicht transmittiertes Licht des einen Keilprismas mit reflektiertem Licht des anderen Keilprismas sowie reflektiertes Licht des einen Keilprismas mit transmittiertem Licht des anderen Keilprismas überlagert wird und Wellenfronten des ersten Teilbereichs P mit denen des zweiten Teilbereichs Q konstruktiv und destruktiv interferiert werden, sodass die Bündelteilung der Pupille zur Interferenz der zueinander gespiegelten Wellenfronten aus den Teilbereichen P und Q verwendet wird.
Dabei wird vorzugsweise Licht, das aus einer Hypotenusenfläche mindestens eines der Keilprismen als interferierte Anteile von an der Strahlteilerschicht reflektiertem Licht des einen Interferometerarms und transmittiertem Licht des anderen Interferometerarms austritt, ausgewertet.
Nach dem Austreten des interferierten Lichts aus der mindestens einen Hypotenusenfläche (c) erfolgt zweckmäßig eine Detektion der Intensität mittels eines Detektors in einer konjugierten Pupille.
In einer anderen Variante kann nach dem Austreten des interferierten Lichts aus mindestens einer der Hypotenusenflächen der Keilprismen des Doppelkeilprismas mittels mindestens eines weiteren Doppelkeilprismas, das der mindestens einen Hypotenusenfläche entgegengesetzt und mit parallel dazu ausgerichteter Hypotenusenfläche nachgeordnet ist, das interferierte Licht von dem zweiten Teilbereich Q der konjugierten Pupille zum Vollbild mit dem ersten Teilbereich P aufgeklappt werden.
Bei einer weiteren Variante kann nach dem Austreten des interferierten Lichts aus den Hypotenusenflächen der Keilprismen des Doppelkeilprismas mittels jeweils eines weiteren Doppelkeilprismas, das zur jeweiligen Hypotenusenfläche des Keilprismas mit parallelen kleinen Kathetenflächen um 90 ° gedreht angeordnet wird, das interferierte Licht von jeweils einem interferierten Teilbereich (U+Tx+R+Sx) oder (T-Ux+S-Rx) der konjugierten Pupille nach dem Doppelprisma je in zwei viertel Teilbereiche (U+Tx+Ry+Sxy) und (R+Sx-Uy-Txy) oder (T-Ux+Sy-Rxy) und (S-Rx-Ty+Uxy) geteilt, in jeweils einem der weiteren Doppelkeilprismen im Sinne eines Common-Path- Interferometers geführt und konstruktiv und destruktiv überlagert werden, sodass vier unterschiedlich mit je allen viertel Teilbereichen (R, S, T, U) interferierte Viertel weiterer konjugierten Pupillen, die zu einem vollen Pupillenbild zusammensetzbar sind, an den Hypotenusenflächen der weiteren Doppelkeilprismen austreten.
In einer vorteilhaften Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die Pupillenteilbereiche nicht als Spiegelbilder, sondern zueinander um 180 ° gedrehte überlagert werden, wird das Teilen des Pupillenbündels in komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille in dem Common-Path-Interferometer mittels eines Doppelkeilprisma realisiert, erfolgt das Führen jeweils einer der zwei komplementären Teilbereiche P oder Q der Pupille als Interferometerarme in separaten Keilprismen, wobei mindestens anstelle eines der Keilprismen ein Dachkantprisma nach dem Amici- Typ verwendet wird, das mit einem Komplementärprisma zum Keilprisma ergänzt, aber durch einen Luftspalt davon separiert ist, wird das Invertieren der komplementären Teilbereiche P und Q als Drehung in dem mindestens einen Dachkantprisma mittels zweier interner Reflexionen der Teilbereiche P oder Q an Dachkanten des einen Dachkantprismas ausgeführt wird, und erfolgt das Interferieren des intern zweimal reflektierten Lichts des mindestens einen der Interferometerarme an einer mit einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht beschichteten Kontaktfläche der Keilprismen, wobei zweifach reflektiertes Licht des einen Dachkantprismas mit transmittiertem Licht des anderen Keilprismas überlagert wird, sodass die Bündelteilung der Pupille zur Interferenz von zueinander um 180 ° gedrehten Wellenfronten der Teilbereiche P und Q der Pupille führt.
Dabei können besonders vorteilhaft auch beide Keilprismen durch Dachkantprismen mit Komplementärprisma und Luftspalt ersetzt werden, um aus der Pupille durch die Interferometerarme mit konstruktiver und destruktiver Interferenz ein Vollbild der konjugierten Pupille zu erzeugen.
Des Weiteren wird die Aufgabe bei einer Anordnung zur Verbesserung der Auflösung oder des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Laser-Scanning-Mikroskops mit Mitteln zur Bildinversionsinterferometrie, enthaltend Mittel zur Spiegelung eines Pupillenbündels in einem Interferometerarm, um ein an wenigstens einer lateralen Achse gespiegeltes Pupillenbild mit einem unveränderten Pupillenbild eines anderen Interferometerarms zur Interferenz zu bringen, dadurch gelöst, dass ein kompaktes Common-Path- Interferometer vorhanden ist, das mindestens ein Doppelkeilprisma aus zwei rechtwinkligen, spiegelsymmetrisch angeordneten Keilprismen enthält, die jeweils an einer großen Kathetenfläche miteinander in Kontakt stehen und dazwischen eine teildurchlässige Strahlteilerschicht aufweisen, dass Licht aus dem Pupillenbündel mit einer Pupille des Laser-Scanning-Mikroskops orthogonal auf jeweils eine kleine Kathetenfläche der Keilprismen gerichtet ist, wobei in die Keilprismen entweder ein erster Teilbereich P oder ein zweiter, zum ersten Teilbereich P komplementärer Teilbereich Q der Pupille des Laser-Scanning-Mikroskops eingekoppelt ist, und dass das in die Keilprismen eingekoppelte Licht an mindestens einer Hypotenusenfläche des Keilprismas totalreflektiert in Richtung der teildurchlässigen Strahlteilerschicht gelenkt und von dieser teilweise reflektiert und transmittiert ist und mit in gleicher Weise, aber entgegengesetzt auf die Strahlteilerschicht gerichtetem Licht interferiert, sodass an der Strahlteilerschicht transmittiertes und reflektiertes Licht des einen Keilprismas und reflektiertes und transmittiertes Licht des anderen Keilprismas als eine Kombination von Wellenfronten des ersten Teilbereichs P der Pupille des Laser-Scanning-Mikroskops mit dem zweiten, komplementären Teilbereich Q der Pupille zur Interferenz vorhanden sind.
Vorteilhaft weisen die Keilprismen Innenwinkel derart auf, dass orthogonal in die kleinen Kathetenflächen einfallendes Licht parallel zur Strahlteilerschicht sowie zu Grund- und Deckflächen der Keilprismen ausgerichtet ist, beim ersten Auftreffen auf die Hypotenusenfläche jedes Keilprismas totalreflektiert und beim zweiten Auftreffen nach Reflexion an der Strahlteilerschicht orthogonal auf die Hypotenusenfläche gerichtet ist.
Zweckmäßig sind die Keilprismen mit Innenwinkeln von 90°, 60° und 30° ausgeführt und im Doppelkeilprisma zu einem gleichseitigen Prisma zusammengesetzt.
Die zwischen den beiden Keilprismen befindliche teildurchlässige Strahlteilerschicht ist vorzugsweise als Neutralteilerschicht ausgebildet.
Vorteilhaft ist die teildurchlässige Strahlteilerschicht auf eines der Keilprismen aufgetragen ist und als eine Kittfläche für das Zusammenfügen der Keilprismen vorgesehen.
Zur Erzeugung einer Phasendifferenz zwischen den Interferometerarmen des Common- Path-Interferometers können die Keilprismen des Doppelkeilprismas parallel zur optischen Achse des Laser-Scanning-Mikroskops entlang der Strahlteilerschicht gegeneinander verschiebbar ausgebildet sein, um die optischen Weglängen in den beiden Keilprismen einfach einstellen zu können. Eine alternative Möglichkeit zur Erzeugung des Wegunterschieds kann durch einen Doppelkeil vor oder an der kurzen Kathetenfläche eines der Keilprismen realisiert werden
In einer vorteilhaften Ausführung ist mindestens ein weiteres Doppelkeilprisma dem Doppelkeilprisma nachgeordnet und die Hypotenusenflächen des Doppelkeilprismas und des mindestens einen weiteren Doppelkeilprismas sind parallel zueinander ausgerichtet, um das interferierte, von der Strahlteilerschicht durch die Hypotenusenfläche austretende Licht von wenigstens einem der Teilbereiche (U+Tx+R+Sx) und (R+Sx-Uy-Txy) der konjugierten Pupille zu einem vollen Pupillenbild aufklappen zu können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung ist mindestens ein weiteres Doppelkeilprisma dem Doppelkeilprisma im konstruktiven oder destruktiven Interferometerkanal nachgeordnet und weist parallel zur Hypotenusenfläche des Doppelkeilprismas um 90 ° gedrehte kleine Kathetenflächen auf, um das von der Strahlteilerschicht interferierte, durch eine der Hypotenusenflächen austretende Licht von zweien der Teilbereiche (U+Tx+R+Sx) und (R+Sx-Uy-Txy) der konjugierten Pupille auf mindestens einen viertel Teilbereich (U+Tx+Ry+Sxy) oder (R+Sx-Uy-Txy) oder (T+Ux+Sy+Rxy) oder (S+Rx-Ty- Uxy) zu überlagern. zur Bildinversionsinterferometrie die Pupille oder eine Fokalebenenabbildung des Laser-Scanning-Mikroskops vorgesehen und in eine konjugierte Pupille oder konjugierte Fokalebenenabbildung abgebildet ist.
Die Erfindung basiert auf der Grundüberlegung, dass die laterale Auflösungssteigerung bei Laserscanningmikroskopen durch die Anwendung der Bildinversionsinterferometrie mit Bildumkehrung nach einem Michelson- oder Mach-Zehnder-Interferometertyp stets daran leidet, dass die exakten Spiegeljustierungen aufwändig und anfällig gegen Störungen sind.
Außerdem ist bei der Bildteilung die idealerweise gleiche Aufteilung (Intensitäts- bzw. Amplitudenteilung) der Wellenfront für eine anschließende interferometrische Kombination nach einer in den getrennten Interferometerstrahlengängen relativ zueinander erfolgten Bilddrehung problematisch. Denn die Gleichwertigkeit des konstruktiven und des destruktiven Ausgangs der Interferometers muss bei einem emittierenden Fluorophor in der Bildachse aus Symmetriegründen zu zwei identischen zueinander gedrehten Wellenfronten führen, die perfekt miteinander interferieren, wobei im destruktiven Strahlengang eine Auslöschung erfolgt und im konstruktiven eine Verstärkung. Bei einem weit von der Inversionsachse entfernt liegenden Fluorophor, können sich die Wellenfronten allerdings nicht mehr überlappen und auch nicht miteinander interferieren. Konstruktiver und destruktiver Ausgang des Interferometers zeigen in diesem Fall jeweils 50%-Signale, die sich nicht interferometrisch überlagern können. Die Auflösungssteigerung resultiert also ausschließlich aus der interferometrischen Verstärkung von achsnahen emittierenden Fluorophoren bei perfekt gedreht überlagerten identischen Wellenfronten.
Gemäß der Erfindung werden die daraus resultierenden anspruchsvollen Stabilitätsund Justageforderungen dadurch entschärft, dass in den Detektionsstrahlengang des LSM ein sogenanntes Common-Path-Interferometer eingebracht und darin eine Halbpupillen-Bildinversionsinterferometrie (HP-III) durchgeführt wird. Hierbei wird vom descannten Licht (d.h. Licht, das durch punktförmiges Abrastern eines Objekts mit einem Belichtungsspot seriell und in einer Pupille des LSM eintrifft) im Detektionspfad eines LSM nicht - wie bei der herkömmlichen III an einem Strahlteiler durch Intensitätsaufteilung (Amplitudenteilung) - die Wellenfront in zwei Teilstrahlenbündel aufgeteilt.
Bei der erfindungsgemäßen HP-III wird stattdessen eine geometrische Pupillenteilung (räumliche Aufteilung) vorgenommen. Dabei wird ausgenutzt, dass die Lichtverteilung in der Pupille symmetrisch ist und deshalb zwei Pupillenhälften ohne vorherige Aufteilung am Strahlteiler miteinander interferometrisch kombiniert werden können, wobei die Halbpupillen gespiegelt oder zueinander um 180 ° um die optische Achse gedreht zur Überlagerung gebracht werden. In einem speziellen Strahlteiler werden die Halbpupillen dann interferometrisch kombiniert, sodass die Inhalte der zwei aufgeteilten Halbpupillen miteinander kombiniert zur Interferenz gebracht werden. Dabei ist es für den eindimensionalen interferometrischen Effekt gleichgültig, ob die Wellenfront-Spiegelung in der Bildebene oder in der Pupillenebene des optischen Systems stattfindet, da sich eine solche Spiegelung gleichermaßen auf Orts- und Fourierraum auswirkt. Die HP-III wird vollständig durchgeführt, indem sowohl der eine Teilbereich P (vorzugsweise eine Halbpupille, kann aber auch als eine Viertelpupille ausgelegt sein) mit dem anderen (komplementären, gleichgroßen) Teilbereich Q als auch andersherum der andere Teilbereich Q mit dem einen Teilbereich P interferiert wird. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit wird im Folgenden zur Erläuterung von Halbpupillen ausgegangen.
Bei der Interferenz wird eine minimale Symmetrieabweichung eingeführt, indem z.B. das Ill-Doppelkeilprisma leicht in senkrechter Richtung zur teildurchlässigen Schicht des Prismas versetzt und/oder unter einem minimal von der optischen Achse abweichenden Winkel eingebaut wird. Dadurch sind die beiden Ausgänge nicht mehr identisch, sondern in einem Interferometerkanal interferieren die Halbpupillen P und Qx konstruktiv (Interferometerkanal C: P + Qx) und im anderen die Halbpupillen Q und Px destruktiv (Inerferometerkanal D: Q - Px). Dieses Ergebnis entspricht dann dem der Kanäle C und D im klassischen Ill-Ansatz, beide Kanäle zu messen und (im simpelsten Fall) voneinander zu subtrahieren, und führt in gleichem Maße zu einer signifikanten Auflösungs- und Kontraststeigerung im Vergleich zum Signal nur eines der Interferometerkanäle C oder D.
Es gibt insgesamt vier realistische Möglichkeiten zur Einstellung der minimalen Symmetrieabweichung (die in Fig. 3 als hohle Pfeile angedeutet sind):
- optischer Doppelkeil vor oder an einem der beiden Keilprismen des III- Doppelkeilprismas,
- relativer Versatz der beiden Teilprismen des Ill-Doppelkeilprismas zueinander (entlang der optischen Achse),
- ein vertikaler Versatz der teildurchlässigen Schicht des Ill-Doppelkeilprismas gegenüber der optischen Achse,
- ein kleiner Nickwinkel des Ill-Doppelkeilprismas gegenüber der optischen Achse um eine dazu orthogonale Achse (z.B. x-Richtung bei z-Richtung der optischen Achse). Für die zweitgenannte Möglichkeit gilt allerdings die Voraussetzung, dass die beiden Keilprismen nicht miteinander verkittet sind bzw. erst nach der Einstellung des horizontalen Versatzes entlang der optischen Achse verklebt werden.
Mit der vorstehend erläuterten Erfindung ergibt sich eine einfache Realisierung einer Halbpupillen-Bildinversionsinterferenz (HP-III), die sowohl eine leicht ausführbare als auch sehr stabile Justierung mit zudem geringen Herstellungskosten ermöglicht. Die spezielle Prismenanordnung des Ill-Doppelkeilprismas ist bereits oben genannt.
Die erfindungsgemäße Anordnung ermöglicht eine vereinfachte Lösung zur Auflösungssteigerung bei Laserscanningmikroskopen (LSM) durch Bildinversions- interferometrie (III), bei der das Ill-Prinzip, als Halbpupilleninterferenz (HP-III) in einem verkürzten, stabilen Common-Path-Interferometer realisiert, eine vereinfachte Justage und geringere Empfindlichkeit gegenüber äußeren Störeffekten (z.B. Temperatur, Vibration usw.) aufweist sowie geringere Herstellungskosten verursacht. Des Weiteren umgeht die Erfindung die im Stand der Technik erforderliche gleiche Aufteilung der Wellenfront (Intensitätsteilung) und ersetzt diese durch eine Pupillenflächenteilung (bzw. räumliche Bündelteilung), die deutlich einfacher justierbar ist.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Dazu zeigen die Zeichnungen:
Fig. 1 : eine schematische Darstellung eines LSM-Detektionsstrahlengangs mit erfindungsgemäßer Halbpupillen-Bildinversionsinterferometrie (HP-III) in einem Common-Path-Interferometer,
Fig. 2a: eine schematische Darstellung der herkömmlichen Bildinversionsinterferometrie (III) mit Betrachtung zweier Pupillenteilbereiche P und Q im Hinblick auf die Erfindung zur Erläuterung des redundanten Informationsgehalts in den interferierten Halbpupillen nach Kombination der jeweils intensitätsgeteilten unveränderten und der invertierten Wellenfront der kompletten Pupille, Fig. 2b:eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips (HP-III) mit aufgeteilter Pupille in zwei Halbpupillen, von denen jeweils eine gespiegelt oder gedreht mit der anderen unveränderten Halbpupille interferiert ist,
Fig. 3: eine schematische Darstellung einer ersten Ausführung der erfindungsgemäßen Strahlteilung und Wellenfrontkombination enthaltend ein gleichseitiges HP-III- Prisma mit einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht zwischen den großen Kathetenflächen der zwei rechtwinkligen Keilprismen und dessen Justiermöglichkeiten zur Einstellung einer Symmetrieabweichung bei der interfero- metrischen Überlagerung,
Fig. 4: eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführung der Erfindung mit mindestens einem weiteren Doppelkeilprisma zur Pupillenrekonstruktion durch Doppelung der Halbpupillen;
Fig. 5: eine perspektivische Darstellung einer gegenüber Fig. 4 modifizierten Ausführung zur Wellenfrontinversion mit zwei weiteren Doppelkeilprismen, die bezüglich der Strahlteilungsebene des HP-lll-Prismas um 90 ° gedreht sind.
Die Erfindung, die aufgrund der bevorzugten Ausführung als Halbpupillen- Bildinversionsinterferometrie (HP-III - half-pupil image Inversion interferometry) bezeichnet sein soll, ist in Fig. 1 für ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) dargestellt, wobei eine Pupille 1 des Detektionsstrahlengangs des LSM in ein verkürztes Common-Path-Interferometer 2, das in einer Basisversion mit einem Doppelkeilprisma 3 (nachfolgend auch als HP-lll-Prisma bezeichnet) gezeigt ist, eingekoppelt und auf mindestens einen optoelektronischen Empfänger 4 abgebildet wird. Für die typische konfokale Auswertung des LSM ist bevorzugt vor einem ersten Detektor 41 und gegebenenfalls einem zweiten Detektor 42 je ein Pinhole 43 bzw. 44 angeordnet. Im eindimensionalen Fall (Linienscan) kann das Pinhole idealerweise ein an die Linienbeleuchtung angepasstes (nicht gezeichnetes) Linien-Pinhole sein, also ein Schlitz anstelle eines Lochs. Der Empfänger 4 wäre dann idealerweise ein linearer Detektor 41 (Zeilendetektor), der die Linie ortsaufgelöst im Bildraum auflöst.
Für den eindimensionalen interferometrischen Effekt der Wellenfrontkombination, d.h. bei dem lediglich eine Spiegelung in einer lateralen Richtung erfolgt, ist es völlig gleichgültig, ob die Wellenfront-Spiegelung in der Fokalebene oder in der Pupillenebene eines optischen Systems stattfindet, da sich eine solche Spiegelung gleichermaßen auf Orts- und Fourierraum auswirkt. Es wird hier deshalb - ohne Beschränkung der Allgemeinheit - davon ausgegangen, dass die Spiegelung am Doppelkeilprisma 3 in einem kollimierten Strahlenbündel nach einer Austrittspupille des LSM erfolgt.
Das zugrunde liegende Prinzip der Erfindung soll zunächst anhand von Fig. 2 erläutert werden.
Betrachtet man in Fig. 2a eine Spiegelung der Pupille 1 - die bei herkömmlicher III (durch Intensitätsteilung mittels eines Neutralteilers) stets als Wellenfrontspiegelung der vollen Pupille eines ersten Teilstrahlenbündels mit der ungespiegelten Wellenfront der vollen Pupille eines zweiten Teilstrahlenbündels erfolgt - im Hinblick auf die Erfindung, indem die Pupille 1 an einer horizontalen Achse 1 1 , die die optische Achse 12 des LSM orthogonal kreuzt, in zwei Teilbereiche P und Q unterteilt wird, so sieht man, dass bei der herkömmlichen III sowohl der Teilbereich P (= Halbpupille HP 13 der HP-III) mit dem Teilbereich Q (= HP 14 der HP-III) als auch andersherum der Teilbereich Q mit Teilbereich P interferiert wird. Da beide Teilbereiche P und Q - aufgrund der Symmetrie der Pupillenbildinformation und unter Vernachlässigung von eventuellen asymmetrischen Aberrationen - dieselben Wellenfrontanteile enthalten, stellt sich somit eine Informationsredundanz der Teilbereiche P und Q dar. Die unterschiedlichen Kreuzschraffuren dienen hier zur visuellen Symbolisierung der gespiegelten und schließlich interferierten Wellenfrontanteile der beiden komplementären Pupillenbereiche P und Q. Für den vorhandenen Informationsgehalt ist es daher ausreichend, nur die Teilbereiche P und Q als Halbpupillen 13 und 14 zu interferieren und somit gemäß der Erfindung auf eine Intensitätsteilung (= Amplitudenteilung) der Wellenfronten der kompletten Pupille 1 zu verzichten. Deshalb nimmt die Erfindung anstelle der Amplitudenteilung der Wellenfront der Pupille 1 eine räumliche Teilung der Pupille 1 in zwei Halbpupillen 13 und 14 mittels des Doppelkeilprismas 3 (wie in Fig. 1 gezeigt) vor.
In Gegenüberstellung zu Fig. 2a kann also gemäß Fig. 2b eine Halbpupille 13 auf die andere Halbpupille 14 gespiegelt (d.h. nach einfacher Spiegelung an einer lateral ausgerichteten x-Achse, hier als horizontale Achse 1 1 gezeichnet) zur Interferenz überlagert werden. Qualitativ ist das Ergebnis von Fig. 2b, die Halbpupillenüberlagerung aus HP 13 mit HP 14, dasselbe wie in der rechten Darstellung von Fig. 2a (nach dem Interferieren der aus der gesamten Pupille 1 aufgeteilten Wellenfronten) der obere Flächenanteil P+Qx. Letzterer ist wiederum mit dem unteren Flächenanteil Q+Px gleich, welcher der Halbpupillenüberlagerung aus HP 14 mit HP 13 entspricht. Dabei ist es wichtig zu erwähnen, dass gemäß der Erfindung in den zwei Interferometerkanälen C und D zur konstruktiven und destruktiven Überlagerung der Wellenfronten unterschiedliche Phasenvorzeichen, wie z.B. P+Qx in C und P-Qx in D, erzeugt werden müssen, um bei der Überlagerung eine Interferenz mit Verstärkung zu erreichen, wie sie bei der Interferenz der durch Spiegelung überlagerten vollständigen Pupillenbilder von Fig. 2a gemäß herkömmlicher III einfach durch Weglängenunterschiede in den zwei separierten Teilstrahlenbündeln erzeugt werden.
Während die exakte Amplitudenteilung der Wellenfrontteilung gemäß herkömmlicher III (Fig. 2a) erhebliche Aufwände verursacht und sehr störanfällig ist, kann die räumliche Bildteilung der Pupille 1 in Halbpupillen 13 und 14 gemäß der Erfindung viel einfacher realisiert und letztlich die Interferenz der Halbpupillen 13 und 14 in analoger Weise zum gleichem Ergebnis gebracht werden.
Die Realisierung der räumlichen Bildteilung in die zwei Halbpupillen 13 und 14 wird nachfolgend nochmals mit Bezug auf Fig. 1 erläutert.
In Fig. 1 ist links eine Pupille 1 des Detektionsstrahlengangs eines LSM stilisiert dargestellt, wobei eine Unterteilung in zwei Teilbereiche P und Q entlang einer horizontalen Achse 1 1 , die die optische Achse 12 des LSM lateral kreuzt, vorgenommen wird. Bei üblicher Zuordnung eines kartesischen Koordinatensystems in den Strahlengang des LSM mit der optischen Achse 12 in z-Richtung wird die horizontale Koordinate als x-Richtung und die vertikale Koordinate als y-Richtung deklariert. Diese Zuordnung wird im Folgenden - ohne Beschränkung der Allgemeinheit für die Bezeichnung der Pupillenanteile angenommen.
Idealerweise wird das vom Mikroskop kommende Licht durch eine Kollimationsoptik 5 kollimiert, sodass sich hinter der Kollimationsoptik 5 eine Pupille 1 ausbildet. Das kollimierte Licht wird dann in das verkürzte Common-Path-Interferometer 2 gerichtet. Dabei darf sich die erzeugte Pupille 1 vor, in, oder auch hinter dem Interferometer befinden.
Die Kollimationsoptik 5 muss das Bündel allerdings auch nicht perfekt kollimieren; es genügt, wenn das Bündel innerhalb des Common-Path-Interferometers 2 zumindest nicht beschnitten wird. Das bedeutet, dass leicht divergente und konvergente Bündel ebenfalls der HP-III zugänglich sind.
Weiterhin können auch bereits Teile des Mikroskops als Kollimationsoptik 5 fungieren. Dabei kann ausgenutzt werden, dass moderne Mikroskope häufig auf unendlich korrigierte Objekive aufweisen, sodass das Licht bereits kollimiert vorliegt, und das Common-Path-Interferometer 2 bereits im kollimierten Bündel zwischen Objektiv und Tubuslinse des Mikroskops positioniert sein kann oder direkt nach der Tubuslinse des Mikroskops angeordnet werden kann, solange der oben erwähnte Bündelbeschnitt nicht auftritt.
Das Common-Path-Interferometer 2 enthält in dieser Ausführung ein Doppelkeilprisma 3, das aus zwei spiegelsymmetrisch angeordneten rechtwinkligen Keilprismen 31 und 32 zusammengesetzt ist, wobei die großen Kathetenflächen a der beiden Keilprismen 31 und 32 miteinander in Kontakt stehen und auf einer dieser Kathetenflächen a eine teildurchlässige Strahlteilerschicht 34 aufgebracht ist. Die beiden großen Kathetenflächen a der Keilprismen 31 und 32 sind vorzugsweise als Kittflächen miteinander verklebt und erzeugen so ein kompaktes und stabiles Common-Path- Interferometer 2.
Das Common-Path-Interferometer 2 ist insofern verkürzt, da es keinen bei der III üblichen Eingangsstrahlteiler aufweist, der eine Aufteilung in zwei Interferometerarme vornimmt. Bei dem eingesetzten Doppelkeilprisma 3 liegen im kollimierten Strahlenbündel von der Pupille 1 zwei benachbarte Eintrittsflächen in Form der kleinen Kathetenflächen b der Keilprismen 31 und 32. Diese kleinen Kathetenflächen b stellen die Eintrittsflächen der separaten Interferometerarme dar und nehmen jeweils eine der Halbpupillen 13 und 14 (als komplementäre Teilbereiche der Pupille 1 ) auf.
Innerhalb der so definierten Interferometerarme erfolgt eine Bildumkehr durch Totalreflexion an der Hypotenusenfläche c jedes Keilprismas 31 und 32. Die reflektierten Lichtanteile der Halbpupillen 13 und 14 werden dann von entgegengesetzten Seiten auf die teildurchlässige Strahlteilerschicht 34 gelenkt, die vorzugsweise eine Neutralteilerschicht ist, und von dort aus die im Keilprisma 31 totalreflektierten Anteile mit den transmittierten Anteilen aus dem Keilprisma 32 zur Interferenz gebracht, während die im Keilprisma 32 totalreflektierten Anteile mit den transmittierten Anteilen aus dem Keilprisma 31 interferieren.
Im Keilprisma 31 bleibt die Halbpupille 13 durch Zweifachspieglung praktisch unverändert und wird mit dem im Keilprisma 32 einfach reflektierten Anteil der Halbpupille 14, der die Strahlteilerschicht 34 durchquert hat, interferiert, sodass die resultierende Halbpupillenkombination P+Qx über eine Fokussieroptik 61 von einem ersten Detektor 41 aufgenommen wird. Wenn gewünscht, steht die andere Halbpupillenkombination P-Qx aber ebenfalls zur Verfügung und kann über eine Fokussieroptik 62 mit einem zweiten Detektor 42 (gestrichelt dargestellt) zusätzlich aufgenommen werden. In jedem Interferometerkanal C und D steht, wie bei der herkömmlichen III, die Information der kompletten Pupille 1 „interferometrisch gefaltet" zur Verfügung. Für eine gewünschte Auflösungssteigerung durch weitere Verrechnung der Signale ist es dabei wichtig, dass in beiden Interferometerkanälen C und D ein Vorzeichenwechsel der Interferenz P+Qx und P-Qx vorliegt.
Zunächst gestattet die Erkenntnis, dass es für das Extrahieren des Informationsgehaltes der vollen Pupille 1 ausreichend ist, nur einmal den Flächenanteil P mit Q der Halbpupillen 13 und 14 zu interferieren, eine sehr einfache Realisierung der Methode der Halbpupillenkombination mit einer geringen Verbesserung der Auflösung, die sowohl mit geringen Herstellungskosten erreichbar als auch leicht und stabil zu justieren ist.
Wie nachfolgend erläutert wird, kann die entscheidend verbesserte Auflösung aber durch eine Nutzung beider Interferenzkanäle C und D erreicht werden, in denen ein Phasenunterschied der Wellenfronten der Halbpupillen 13 und 14 durch Weglängenänderung innerhalb der Keilprismen 31 und 32 gezielt eingestellt wird.
Fig. 3 zeigt die bevorzugte Realisierungsmöglichkeit, die aus einem einzigen HP-III- Prisma (Doppelkeilprisma 3) besteht, bei dem zwei Keilprismen 31 und 32 spiegelsymmetrisch miteinander in Kontakt sind, wobei sich auf der großen Kathetenfläche a eines der beiden Keilprismen 31 bzw. 32 eine Strahlteilerschicht 34 in Form einer teildurchlässigen Neutralteilerschicht befindet. Die Innenwinkel der Keilprismen 31 und 32 sind so gewählt, dass senkrecht einfallendes Licht, d.h. Licht das parallel zur Strahlteilerschicht 34 sowie zu Grund- und Deckflächen (nicht bezeichnet, da parallel unter- und oberhalb der Zeichnungsebene) der Keilprismen 31 und 32 einfällt, beim ersten Auftreffen auf die Hypotenusenfläche c jedes Keilprismas 31 bzw. 32 totalreflektiert wird und nach dem zweiten Auftreffen auf die Strahlteilerschicht 34 (d.h. nach Transmission durch letztere) orthogonal auf die Hypotenusenfläche c des jeweils anderen Keilprismas 32 bzw. 31 trifft, um das jeweilige Keilprisma 31 bzw. 32 ohne dispersive Effekte verlassen zu können. Somit ergeben sich die Innenwinkel der Keilprismen zu 30 °, 60 ° und 90 °, wobei die großen Kathetenflächen a - mit der Strahlteilerschicht 34 dazwischen - miteinander in Kontakt stehen, ohne durch eine Kittschicht 33 miteinander starr verbunden (verklebt) zu sein. In die kleinen Kathetenflächen b, die innerhalb einer Ebene orthogonal zur optischen Achse 12 des Detektionsstrahlengangs des LSM angeordnet sind, wird das Licht der Pupille 1 , soweit es aus der Fokalebene des LSM stammt, kollimiert eingekoppelt.
Das vom LSM kommende Pupillenbündel wird durch die Geometrie des Doppelprismas 3 und dessen Lage mit der Strahlteilerschicht 34 in einer Ebene, die von horizontaler Achse 1 1 und optischer Achse 12 aufgespannt wird, in eine obere und eine untere Halbpupille 13 und 14 unterteilt. Gleichwertig wäre auch eine Aufteilung in eine linke und eine rechte Halbpupille bei zur optischen Achse 12 senkrechter Achse 15 (nur in Fig. 5 gezeichnet) oder auch jede beliebige Ausrichtung möglich, da es außer der Ausrichtung auf das bevorzugt eingeführte Koordinatensystem keine systembedingten Vorzugsrichtungen gibt.
Die beiden Halbpupillen 13 und 14 werden durch die Totalreflexion an den jeweiligen Hypotenusenflächen c der Keilprismen 31 und 32 in Richtung der Strahlteilerschicht 34 reflektiert, nach der sie miteinander interferieren.
Um die gewünschte Auflösungssteigerung zu erreichen, ist es wichtig, die beiden Interferometerkanäle C und D gemäß ihrer Bedeutung bei der III konstruktiv und destruktiv einzustellen. Um durch Abweichungen der durchlaufenen optischen Weglängen zwischen den beiden Keilprismen 31 , 32 eine geringe Wellenfront- Verschiebung bei der Interferenz zu erzeugen, kann mindestens eine der folgenden Möglichkeiten als einfach realisierbare Justiereinstellungen angewendet werden:
- ein relativer Versatz der beiden Keilprismen 31 , 32 des Doppelkeilprismas 3 zueinander (entlang der optischen Achse 12),
- ein optischer Doppelkeil 321 am Eingang eines der beiden Teilprismen 31 , 32 des Doppelkeilprismas 3, wobei vom Doppelkeil 321 wenigstens ein Keil lateral (parallel zur Richtung der x-Achse) verschiebbar ist, um in diesem Beispiel eine geringe Wellenfrontverzögerung im Keilprisma 32 gegenüber dem unbeeinflussten Keilprisma 31 zu erzeugen,
- ein vertikaler Versatz der teildurchlässigen Schicht 34 des Doppelkeilprismas 3 gegenüber der optischen Achse 12,
- ein kleiner Nickwinkel des Doppelkeilprismas 3 gegenüber der optischen Achse 12 um eine horizontale Achse (x-Richtung).
Jede dieser Möglichkeiten ist in Fig. 3 durch hohle Pfeile angedeutet, obwohl nur wenigstens eine davon zur Anwendung kommen muss.
Bei der ersten Einstellmöglichkeit, im Doppelkeilprisma 3 einen relativen Versatz der beiden Keilprismen 31 und 32 zueinander entlang der optischen Achse 12 zu realisieren, handelt es sich um eine Maßnahme, die voraussetzt, dass die Keilprismen 31 und 32 entlang der Strahlteilerschicht 34 nicht durch eine Kittschicht 33 miteinander starr verbunden sein dürfen. Insoweit sind die Spiegelflächen an den Hypotenusenflächen c der Keilprismen 31 und 32 nicht mehr zueinander starr fixiert, sondern nur noch die zweite Spiegelfläche der Strahlteilerschicht 34 bleibt unveränderlich im Common-Path-Interferometer 2. Obwohl in Fig. 3 beide Keilprismen 31 und 32 entlang der optischen Achse 12 als wahlweise beweglich zu verstehen sind, ist es für eine einfache Justage als bevorzugt anzunehmen, dass ein Keilprisma 32 fest installiert ist, während darauf das andere Keilprisma 31 in Richtung der optischen Achse 12 nur horizontal gleiten kann. Dadurch bleibt die Justage nur auf eine eindimensionale Bewegung beschränkt und das Common-Path-Interferometer 2 bleibt bis auf eine Weglängenänderung in einem der Interferometerarme nahezu fix zum LSM eingerichtet. Durch diese Maßnahme der Keilprismenverschiebung zueinander werden die optischen Weglängen innerhalb der in beiden Keilprismen 31 , 32 bis zur Strahlumlenkung (durch Totalreflexion an den jeweiligen großen Kathetenflächen) geringfügig unterschiedlich.
Denselben Effekt erreicht man durch den in Fig. 3 vor dem Keilprisma 32 eingezeichneten optischen Doppelkeil 321 , der auch direkt an einem der Prismen 31 , 32 angebracht sein kann.
Durch ein Verschieben orthogonal zu der horizontalen Pupillenachse 1 1 und der optischen Achse 12 kann das Doppelkeilprisma 3 so eingestellt werden, dass einer der Ausgänge konstruktiv und der andere destruktiv ist. Damit beschränkt sich die Justage des kompakten Common-Path-Interferometers 2 in Form des Doppelkeilprismas 3 auf eine einfache eindimensionale lineare Bewegung desselben, wobei die beiden Interferometerarme untereinander fix und auf zwei Spiegelflächen reduziert sind.
Mittels einer Rotation des Doppelkeilprismas 3 um eine laterale Achse 1 1 (z.B. horizontale x-Achse) orthogonal zur optischen Achse 12 um einen kleinen Winkel (z.B. „Nickwinkel" gegenüber der Richtung der optischen Achse 12) kann ebenfalls eine Symmetrieabweichung in den Interferometerkanälen C und D des Common-Path- Interferometers 2 (nur in Fig. 1 bezeichnet) erreicht werden, der in analoger Weise zu einer Phasendifferenz der Wellenfront in den Halbpupillen 13 und 14 erzeugt. Auch bei dieser Justagevariante beschränkt sich die Einstellung des Doppelkeilprismas 3 auf die Variation eines Winkels, während die Interferometerarme auf zwei zueinander fix eingestellte Spiegelflächen beschränkt bleiben.
Durch die Doppelprisma-Anordnung wie in Fig. 3 dargestellt, wird eine Pupillenhälfte entlang der Trennungslinie (hier entlang einer horizontalen Achse 1 1 ) auf die andere gespiegelt und zur Interferenz gebracht. Der auflösungssteigernde Ill-Effekt ergibt sich nur in der zu dieser Linie senkrechten Dimension, ist also eine eindimensionale Steigerung der Auflösung.
Ohne Veränderungen an den Keilprismen vornehmen zu müssen, kann eine isotrope Auflösungssteigerung (in alle Richtungen) erreicht werden, indem mindestens ein weiteres Bild aufgenommen wird, bei dem das Doppelprisma um die optische Achse gedreht wird, so dass der auflösungssteigernde Effekt in eine andere Dimension wirkt. Die so aufgenommenen Bilder können im Computer zu einem einzigen Bild kombiniert werden, das eine in alle lateralen Richtungen verbesserte Auflösung hat.
Pupillenverdopplung:
Auch wenn die Hälfte der Pupilleninformation im herkömmlichen III redundant ist, kann es auch bei der HP-III von Vorteil sein, nach Durchlauf des Lichts durch das Common- Path-Interferometer 2 eine volle Pupille 1 ' zur Verfügung zu haben, indem - hier ausgewählt - die Halbpupille 14 durch Aufklappen (Spiegelung von sich selbst) oder durch Einkoppeln der Halbpupille 13 (nicht gezeichnet) auszufüllen. Dies kann sinnvoll sein, wenn die Ausgänge des Common-Path-Interferometers 2 auf ein Pinhole 43 bzw. 44 (nur in Fig. 1 gezeichnet) abgebildet werden sollen, um eine optische Tiefenauflösung (Sectioning) zu erzielen. Fig. 4 zeigt diese Möglichkeit, mit identisch aufgebauten weiteren Doppelkeilprismen 35 und 36 eine solche Pupillenverdopplung zu erzielen. Hier werden die weiteren Doppelkeilprismen 35 und 36 zu beiden Seiten des HP-lll-Prismas 3 mit zueinander parallelen Hypothenusenflächen c in derselben Ebene so angeordnet, dass sie rückwärts durchlaufen werden, wodurch es statt eines Aufeinanderfaltens und interferometrischen Kombinierens zu einer Aufspaltung und einem Aufklappen kommt, was der gewünschten Halbpupillendopplung entspricht.
Wie oben beschrieben, kann eine zweifache Anwendung der Wellenfrontspiegelung zu einer Wellenfrontinversion genutzt werden. Dazu zeigt Fig. 5a eine Anordnung aus drei HP-lll-Prismen 3, wobei die weiteren Doppelkeilprismen 35 und 36 gegenüber dem HP- Ill-Prisma 3 um 90° verdreht angeordnet sind. Hierbei wird die Wellenfront nacheinander an zwei zueinander orthogonalen Achsen gespiegelt, was eine Wellenfrontinversion zur Folge hat. Dabei entstehen infolge der doppelten Reflexion (= Inversion) Viertel der gesamten Pupille 1 , die jedoch die lateral zweidimensionale Auflösungsverbesserung des LSM ermöglichen. Fig. 5b zeigt dazu nochmals schematisch die Ergebnisse der einzelnen Interferometerkanäle C und D sowie C, D' bzw. C", D" (nach den weiteren Doppelkeilprismen 35 bzw. 36) gemäß der Anordnung von Fig. 5a. Dabei kann durch die Zusammenfügung der zweifach überlagerten Viertelpupillen die vollständige Pupillenabbildung als zweifach interferierte konjugierte Pupille 1 ' erzeugt werden, falls dies für eine Weiterverarbeitung der LSM-Bilder erforderlich ist.
Bei der herkömmlichen III wird die Pupille 1 an einem Strahlteiler aufgespalten, die einzelnen Pfade werden relativ zueinander um 180 ° um die Pupillenmitte gedreht. Um einen gleichwertigen Fall für ein Halb-Pupillen-Ill zu realisieren, müssen die jeweiligen Pupillenhälften um 180 ° um die Pupillenmitte auf die andere Pupillenhälfte gedreht werden, anstatt an einer Linie (z.B. horizontalen Achse 1 1 ) gespiegelt zu werden.
Da eine Drehung um 180 ° äquivalent durch zwei Spiegelungen an zueinander senkrechten Achsen möglich ist, kann das gewünschte Aufeinanderdrehen der Pupilleninhalte dadurch realisiert werden, dass eine der beiden Pupillenhälften 13, 14 eine zusätzliche Spiegelung um eine zur Trennungslinie der horizontalen Achse 1 1 senkrechte Achse erfährt.
Diese Variante ist in Fig. 6 und Fig. 7 dargestellt. Eines der beiden Keilprismen 31 , 32, nämlich hier das Keilprisma 31 , wird hierfür modifiziert, indem die in den bisherigen Beispielen beschriebene ebene Hypotenusenfläche c durch eine dachförmige Doppelfläche (mit eingeschlossenem rechten Winkel) ersetzt wird, deren„Dachkante" entlang einer Mittellinie der ursprünglichen Hypotenusenfläche c verläuft und auf die optische Achse 12 trifft. Das somit eingesetzte Dachkantprisma 37 ist ein Prisma vom Amici-Typ, bei dem es statt der einfachen Reflexion an der Hypotenusenfläche c des Keilprismas 31 (gemäß Fig. 1 - 5) zu zwei Reflexionen an den zwei Dachflächen des Dachkantprismas 37 gemäß Fig. 6 kommt, die neben der ursprünglichen Reflexion auch zu einer weiteren gewünschten Reflexion führt, mit der eine Drehung der Halbpupille 13 um 180 ° um die optische Achse 12 erzeugt wird.
Der Winkel der Dachkante über der optischen Achse 1 2 ist so gewählt, dass sowohl die erforderlichen geometrischen Spiegelungen erfüllt werden als auch Totalreflexion an den Prisma-Luft-Grenzflächen der Dachflächen des Dachkantprismas 37 auftritt.
Wie in den bisherigen Beispielen ist auch in der Ausführung gemäß Fig. 6 und Fig. 7 nach der Vereinigung der Halbpupillen 13 und 14 an der Strahlteilerschicht 34 der Einfallswinkel zu den Austrittsflächen des Dachkantprismas 37 steil genug, dass es nicht zu Totalreflexion kommt, sondern das Licht das Dachkantprisma 37 verlassen kann. Da im Gegensatz zum 90 °-Austritt aus der ursprünglichen Hypotenusenfläche c des Keilprismas 31 das an der Strahlteilerschicht 34 reflektierte Licht (ebenso wie das aus dem Keilprisma 32 durch die Strahlteilerschicht 34 transmittierte Licht) die Dachflächen des Dachkantprismas 37 nicht orthogonal trifft, würde es beim Austritt eine Strahlumlenkung nach dem snelliusschen Brechungsgesetz erfahren. Um dies zu verhindern, wird die ursprüngliche Prismenform des Keilprismas 31 durch Auffüllen des Dachkantprismas 37 mit einem zusätzlichen Komplementärprisma 38 (mit gleichem Brechungsindex wie das Dachkantprisma 37) wieder hergestellt. Hierbei ist zu beachten, dass zwischen Dachkantprisma 37 und Komplementärprisma 38 ein Luftspalt 39 (oder ein Spalt, der mit einem Material mit niedrigerem Brechungsindex gefüllt ist) bestehen bleibt, damit die beschriebenen Totalreflexionen möglich bleiben und die snelliussche Brechung beim Lichtaustritt aus dem Dachkantprisma 37 durch den Wiedereintritt in das Komplementärprisma 38 umgehend wieder rückgängig gemacht wird. Wie Fig. 6 in einer Seitenansicht und einer Frontalansicht in Richtung der optischen Achse 12 des Common-Path-Interferometers 2 zu sehen ist, wird die Halbpupille 13 mittels zweier Spiegelungen um zwei zueinander orthogonale, zur optischen Achse 12 laterale Achsen 1 1 und 15 effektiv um 180 ° um die optische Achse 12 gedreht und mit der an der x-Achse (laterale Achse 1 1 ) einmal gespiegelten Abbildung der Halbpupille 14' überlagert. Fig. 7 verdeutlicht diesen Sachverhalt in einer perspektivischen Ansicht mit stilisierter Darstellung der abgebildeten Halbpupillen 13' und 14' für den konstruktiven und den destruktiven Interferometerkanal C bzw. D. Das zugehörige Überlagerungsschema ist in Fig. 8b dargestellt und mit dem Überlagerungsschema der herkömmlichen III (Fig. 8a) gegenübergestellt.
Die Betrachtung des Überlagerungsschemas des III ist unter dem Blickwinkel der Erfindung (HP-III) in zwei Halbpupillen und vier Viertelpupillen R, S, T, U unterteilt, obwohl beim III stets die vollständige Pupille 1 gedreht (bzw. 2-dimensional an orthogonalen Achsen gespiegelt wird.
In Fig.8b ist das Überlagerungsschema der Interferenzen im Common-Path- Interferometer 2 als Ergebnisbild dargestellt. Im Vergleich mit Fig. 8a wird deutlich, dass das herkömmliche III redundante Quadrantenabbildungen überlagert, die völlig gleichwertig sind. Das Überlagerungsschema des HP-III (Fig. 8b) ist dabei im destruktiven Interferometerkanal D identisch zu dem der entsprechenden Pupillenhälfte des III (Fig. 8a). Im konstruktiven Interferometerkanal C ist das Überlagerungsschema des HP-III im Vergleich zum III lediglich noch einmal um die x-Achse 1 1 gespiegelt, was aber keinen Einfluss auf das im konstruktiven Interferometerkanal C detektierte Signal hat. Für eine Überlagerung der beiden Interferometerkanäle C und D muss die Halbpupillenabbildung 13' aber ohnehin um die x-Achse 1 1 gespiegelt mit der Halbpupillenabbildung 14' des destruktiven Interferometerkanals D zur Deckung gebracht werden, wodurch dann der konstruktive Interferometerkanal C als (T+Rxy, S+Uxy) mit der Darstellung von Fig. 8a übereinstimmend erkennbar ist.
Falls das vollständige Bild der Pupille 1 (konjugierte Pupille 1 ') wie im ersten Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 4 oder in der Doppel-HP-lll-Variante gemäß Fig. 5a benötigt wird, kann auch das zweite Keilprisma 32 durch ein Dachkantprisma 37 und ein Komplementärprisma 38 ersetzt werden, um auch im konstruktiven Interferometerkanal C die Überlagerung der an der x-Achse gespiegelten Halbpupille 13 mit der um 180 ° gedrehten Halbpupille 14 zu realisieren. Damit ist die vollständige Überlagerungssituation der Wellenfronten aus allen Pupillenanteilen wie beim herkömmlichen III einstellbar und mit deutlich höherer Stabilität realisierbar
Erweiterte Schärfentiefe:
Obwohl der HP-lll-Effekt (wie der herkömmliche Ill-Effekt) für sich alleine genommen keinerlei axiale Auflösung hat, kann durch geeignete Beleuchtung (z.B. mit einem Besselstrahl) ein Scanning-Modus realisiert werden, der eine axiale Summenprojektion mit hoher lateraler Auflösung und hohem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) durch lediglich einen 2D-Scan erzielt.
Die erfindungsgemäße Halbpupillen-Bildinversionsinterferometrie (HP-III), deren reine Flächenteilung der Pupille 1 (räumliche Aufteilung des Pupillenbündels) eine viel stabilere und einfacher justierbare Wellenfront-Überlagerung gestattet als eine Intensitätsteilung (Amplitudenteilung) der Wellenfronten bei herkömmlicher III, ist somit bestens geeignet, sowohl die laterale Auflösung in einem LSM-System zu erhöhen, das SNR zu verbessern als auch die Störanfälligkeit gegenüber Umwelteinflüssen deutlich zu verringern. Durch Zusatzmaßnahmen kann die erhöhte laterale Auflösung auch auf die axiale Auflösung beim sog. Sectioning übertragen werden.
Bezugszeichenliste
1 Pupille
1 ' konjugierte Pupille (Pupillenbild)
1 1 laterale Achse (x-Achse)
12 optische Achse
13, 14 Halbpupille
13', 14' Halbpupillenabbildung
15 laterale Achse (y-Achse)
2 Common-Path-Interferometer
3 HP-lll-Prisma (Doppelkeilprisma)
31 , 32 Keilprisma
321 optischer Doppelkeil
33 Kittschicht
34 teildurchlässige Strahlteilerschicht (Neutralteilerschicht) 35, 36 weiteres Doppelkeilprisma
37 Dachkantprisma
38 Komplementärprisma
39 Luftspalt
4 Empfänger
41 , 42 erster, zweiter Detektor
43, 44 Pinhole
5 Kollimationsoptik
61 , 62 Fokussieroptik
a, b große, kleine Kathetenfläche
c Hypotenusenfläche
C, D konstruktiver, destruktiver Interferometerkanal
P, Q Teilbereich (Halbpupille)
R, S, T U Teilbereich (Viertelpupille)

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Verbesserung der Auflösung oder des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Laser-Scanning-Mikroskops mittels Bildinversionsinterferometrie, bei der mindestens eine Spiegelung eines Pupillenbündels in einem Interferometerarm erfolgt, um Wellenfronten eines an wenigstens einer Achse gespiegelten Pupillenbildes und eines unveränderten Pupillenbildes eines anderen Interferometerarms zu interferieren, enthaltend die Schritte:
- Einkoppeln des vom Laser-Scanning-Mikroskop kommenden Pupillenbündels in ein Common-Path-Interferometer (2),
- Teilen der Fläche einer Pupille (1 ) aus dem Pupillenbündel entlang einer definierten, zu einer optischen Achse (12) des kollimierten Bündels lateralen Achse (1 1 ) in zwei komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille (1 ) unter Erzeugung zweier Teilbündel, die entlang des Common-Path-Interferometers (2) als zwei gegenüberliegend entlang der optischen Achse (12) ausgerichtete Interferometerarme spiegelsymmetrisch geführt und separat wenigstens einer Bündelumlenkung durch Totalreflexion zugeführt werden,
- Interferieren des Lichts der Interferometerarme an einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) nach der wenigstens einen Bündelumlenkung, wobei mittels der Strahlteilerschicht (34) transmittiertes Licht des einen Interferometerarms mit reflektiertem Licht des anderen Interferometerarms und umgekehrt jeweils eine Kombination von Wellenfronten eines ersten Teilbereichs P mit einem zweiten, zum ersten Teilbereich P komplementären Teilbereich Q der Pupille (1 ) und umgekehrt eingeht, sodass eine konstruktive Interferenz (C) und eine destruktive Interferenz (D) der Wellenfronten aus den beiden unterschiedlichen Teilbereichen P und Q der Pupille (1 ) erzeugbar sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Teilen des Pupillenbündels in komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille (1 ) in dem Common-Path- Interferometer (2) mittels eines Doppelkeilprismas (3) realisiert wird, sodass jeweils einer der zwei komplementären Teilbereiche P oder Q in separaten Keilprismen (31 , 32) als Interferometerarme mit mindestens einer internen Reflexion geführt wird, und das Interferieren des intern reflektierten Lichts der Interferometerarme an einer mit der teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) beschichteten Kontaktfläche der Keilprismen (31 , 32) erfolgt, wobei an der Strahlteilerschicht (34) transmittiertes Licht des einen Keilprismas (31 ) mit reflektiertem Licht des anderen Keilprismas (32) sowie reflektiertes Licht des einen Keilprismas (31 ) mit transmittiertem Licht des anderen Keilprismas (32) überlagert wird und Wellenfronten des ersten Teilbereichs P mit denen des zweiten Teilbereichs Q konstruktiv und destruktiv interferiert werden, sodass die Bündelteilung der Pupille (1 ) zur Interferenz der zueinander gespiegelten Wellenfronten aus den Teilbereichen P und Q verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei Licht, das aus einer Hypotenusenfläche (c) mindestens eines der Keilprismen (31 ; 32) als interferierte Anteile von an der Strahlteilerschicht (34) reflektiertem Licht des einen Interferometerarms und transmittiertem Licht des anderen Interferometerarms austritt, ausgewertet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei nach dem Austreten des interferierten Lichts aus der mindestens einen Hypotenusenfläche (c) eine Detektion der Intensität mittels eines Detektors (4, 41 , 42) in einer konjugierten Pupille (1 ') erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei nach dem Austreten des interferierten Lichts aus mindestens einer der Hypotenusenflächen (c) der Keilprismen (31 , 32) des Doppelkeilprismas (3) mittels mindestens eines weiteren Doppelkeilprismas (35; 36), das der mindestens einen Hypotenusenfläche (c) entgegengesetzt und mit parallel dazu ausgerichteter Hypotenusenfläche (c) nachgeordnet ist, das interferierte Licht von dem zweiten Teilbereich Q der konjugierten Pupille (1 ') zum Vollbild mit dem ersten Teilbereich P aufgeklappt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei nach dem Austreten des interferierten Lichts aus den Hypotenusenflächen (c) der Keilprismen (31 , 32) des Doppelkeilprismas (3) mittels jeweils eines weiteren Doppelkeilprismas (35; 36), das zur jeweiligen Hypotenusenfläche (c) des Keilprismas (31 ; 32) mit parallelen kleinen Katheten flächen (b) um 90 ° gedreht angeordnet wird, das interferierte Licht von jeweils einem interferierten Teilbereich (U+Tx+R+Sx) oder (T-Ux+S-Rx) der konjugierten Pupille (1 ') je in zwei viertel Teilbereiche (U+Tx+Ry+Sxy) und (R+Sx-Uy-Txy) oder (T- Ux+Sy-Rxy) und (S-Rx-Ty+Uxy) geteilt, in einem der weiteren Doppelkeilprismen (35; 36) im Sinne eines Common-Path-Interferometers (2) geführt und konstruktiv und destruktiv überlagert wird, sodass vier unterschiedlich mit je allen viertel Teilbereichen (R, S, T, U) interferierte Viertel weiterer konjugierten Pupillen (1 '), die zu einem vollen Pupillenbild zusammensetzbar sind, an den Hypotenusenflächen (c) der weiteren Doppelkeilprismen (35; 36) austreten.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei
- das Teilen des Pupillenbündels in komplementäre Teilbereiche P und Q der Pupille (1 ) in dem Common-Path-Interferometer (2) mittels eines Doppelkeilprisma (3) realisiert wird,
- das Führen jeweils einer der zwei komplementären Teilbereiche P oder Q der Pupille (1 ) als Interferometerarme in separaten Keilprismen (31 , 32) erfolgt, wobei mindestens anstelle eines der Keilprismen (31 ) ein Dachkantprisma (37) nach dem Amici-Typ verwendet wird, das mit einem Komplementärprisma (38) zum Keilprisma (31 ) ergänzt, aber durch einen Luftspalt (39) davon separiert ist, und
- das Invertieren der komplementären Teilbereiche P und Q als Drehung in dem mindestens einen Dachkantprisma (37) mittels zweier interner Reflexionen der Teilbereiche P oder Q an Dachkanten des einen Dachkantprismas (37) ausgeführt wird, und
- das Interferieren des intern zweimal reflektierten Lichts des mindestens einen der Interferometerarme an einer mit einer teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) beschichteten Kontaktfläche der Keilprismen (31 , 32) erfolgt, wobei zweifach reflektiertes Licht des einen Dachkantprismas (37) mit transmittiertem Licht des anderen Keilprismas (32) überlagert wird, sodass die Bündelteilung der Pupille (1 ) zur Interferenz von zueinander um 180 ° gedrehten Wellenfronten der Teilbereiche P und Q der Pupille (1 ) führt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei beide Keilprismen (31 , 32) durch Dachkantprismen (37) mit Komplementärprisma (38) und Luftspalt (38) ersetzt werden, um aus der Pupille (1 ) durch die Interferometerarme mit konstruktiver und destruktiver Interferenz ein Vollbild der konjugierten Pupille (1 ') zu erzeugen.
9. Anordnung zur Verbesserung der Auflösung oder des Signal-Rausch-Verhältnisses eines Laser-Scanning-Mikroskops mit Mitteln zur Bildinversionsinterferometrie, enthaltend Mittel zur Spiegelung eines Pupillenbündels in einem Interferometerarm, um ein an wenigstens einer lateralen Achse (1 1 , 15) gespiegeltes Pupillenbild (1 ') mit einem unveränderten Pupillenbild (1 ') eines anderen Interferometerarms zur Interferenz zu bringen, dadurch gekennzeichnet, dass
- ein kompaktes Common-Path-Interferometer (2) vorhanden ist, das mindestens ein Doppelkeilprisma (3) aus zwei rechtwinkligen, spiegelsymmetrisch angeordneten Keilprismen (31 , 32) enthält, die jeweils an einer großen Kathetenfläche (a) miteinander in Kontakt stehen und dazwischen eine teildurchlässige Strahlteilerschicht (34) aufweisen,
- Licht aus dem Pupillenbündel mit einer Pupille (1 ) des Laser-Scanning-Mikroskops orthogonal auf jeweils eine kleine Kathetenfläche (b) der Keilprismen (31 , 32) gerichtet ist, wobei in die Keilprismen (31 , 32) entweder ein erster Teilbereich P oder ein zweiter, zum ersten Teilbereich P komplementärer Teilbereich Q der Pupille (1 ) des Laser-Scanning-Mikroskops eingekoppelt ist,
- das in die Keilprismen (31 , 32) eingekoppelte Licht an mindestens einer Hypotenusenfläche (c) des Keilprismas (32) totalreflektiert in Richtung der teildurchlässigen Strahlteilerschicht (34) gelenkt und von dieser teilweise reflektiert und transmittiert ist und mit in gleicher Weise, aber entgegengesetzt auf die Strahlteilerschicht (34) gerichtetem Licht interferiert, sodass an der Strahlteilerschicht (34) transmittiertes und reflektiertes Licht des einen Keilprismas (31 ) und reflektiertes und transmittiertes Licht des anderen Keilprismas (32) als eine Kombination von Wellenfronten des ersten Teilbereichs P der Pupille (1 ) des Laser-Scanning-Mikroskops mit dem zweiten, komplementären Teilbereich Q der Pupille (1 ) zur Interferenz vorhanden sind.
10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
die Keilprismen (31 , 32) Innenwinkel derart aufweisen, dass orthogonal in die kleinen Kathetenflächen (b) einfallendes Licht parallel zur Strahlteilerschicht (34) sowie zu Grund- und Deckflächen der Keilprismen (31 , 32) ausgerichtet ist, beim ersten Auftreffen auf die Hypotenusenfläche (c) jedes Keilprismas (31 , 32) totalreflektiert und beim zweiten Auftreffen nach Reflexion an der Strahlteilerschicht (34) orthogonal auf die Hypotenusenfläche (c) gerichtet ist.
1 1 . Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass
die Keilprismen (31 , 32) mit Innenwinkeln von 90°, 60° und 30° ausgeführt sind und im Doppelkeilprisma (3) zu einem gleichseitigen Prisma zusammengesetzt sind.
12. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
die teildurchlässige Strahlteilerschicht (34) als Neutralteilerschicht ausgebildet ist.
13. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
die teildurchlässige Strahlschicht (34) auf eines der Keilprismen (31 ; 32) aufgetragen ist und als eine Kittfläche (33) für das Zusammenfügen der Keilprismen (31 , 32) vorgesehen ist.
14. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
die Keilprismen (31 ,32) des Doppelkeilprismas (3) parallel zur optischen Achse (12) des Laser-Scanning-Mikroskops entlang der Strahlteilerschicht (34) gegeneinander verschiebbar sind, um eine Differenz zwischen optischen Weglängen in den beiden Keilprismen (31 , 32) einfach einstellen zu können.
15. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
vor oder an einem der Keilprismen (31 ,32) des Doppelkeilprismas (3) orthogonal zur optischen Achse (12) des Laser-Scanning-Mikroskops und zu der Strahlteilerschicht (34) ein optischer Doppelkeil angeordnet ist, um eine Differenz zwischen optischen Weglängen in den beiden Keilprismen (31 , 32) einfach einstellen zu können.
16. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
mindestens ein weiteres Doppelkeilprisma (35; 36) dem Doppelkeilprisma (3) nachgeordnet ist und die Hypotenusenflächen (c) des Doppelkeilprismas (3) und des mindestens einen weiteren Doppelkeilprismas (35; 36) parallel zueinander ausgerichtet sind, um das interferierte, von der Strahlteilerschicht (34) durch die Hypotenusenfläche (c) austretende Licht von wenigstens einem der Teilbereiche (U+Tx+R+Sx) und (R+Sx-Uy-Txy) der konjugierten Pupille (1 ') zu einem vollen Pupillenbild aufklappen zu können.
17. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
mindestens ein weiteres Doppelkeilprisma (35; 36) dem Doppelkeilprisma (3) im konstruktiven oder destruktiven Interferometerkanal (C; D) nachgeordnet ist und parallel zur Hypotenusenfläche (c) des Doppelkeilprismas (3) um 90 ° gedrehte kleine Kathetenflächen (b) aufweist, um das von der Strahlteilerschicht (34) interferierte, durch eine der Hypotenusenflächen (c) austretende Licht von zweien der Teilbereiche (U+Tx+R+Sx) und (R+Sx-Uy-Txy) der konjugierten Pupille (1 ') auf mindestens einen viertel Teilbereich (U+Tx+Ry+Sxy) oder (R+Sx-Uy-Txy) oder (T+Ux+Sy+Rxy) oder (S+Rx-Ty-Uxy) zu überlagern.
18. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass
zur Bildinversionsinterferometrie die Pupille (1 ) des Laser-Scanning-Mikroskops vorgesehen und in eine konjugierte Pupille (1 ') abgebildet ist.
- Hierzu 8 Seiten Zeichnungen -
PCT/DE2018/100060 2017-01-31 2018-01-25 Anordnung zur auflösungssteigerung eines laser-scanning-mikroskops WO2018141333A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/481,795 US11525988B2 (en) 2017-01-31 2018-01-25 Assembly for increasing the resolution of a laser scanning microscope
CN201880009516.9A CN110235044B (zh) 2017-01-31 2018-01-25 用于提高激光扫描显微镜的分辨率的设备

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102017101829.8A DE102017101829A1 (de) 2017-01-31 2017-01-31 Anordnung zur Auflösungssteigerung eines Laser-Scanning-Mikroskops
DE102017101829.8 2017-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018141333A1 true WO2018141333A1 (de) 2018-08-09

Family

ID=61167850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2018/100060 WO2018141333A1 (de) 2017-01-31 2018-01-25 Anordnung zur auflösungssteigerung eines laser-scanning-mikroskops

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11525988B2 (de)
CN (1) CN110235044B (de)
DE (1) DE102017101829A1 (de)
WO (1) WO2018141333A1 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111711750B (zh) * 2020-06-05 2023-11-07 腾讯科技（深圳）有限公司 基于人工智能的图像处理方法、装置、设备及介质
CN111895934B (zh) * 2020-07-31 2021-07-16 北京理工大学 一种光学元件表面局部陡度面形误差干涉测量方法及装置
WO2022182715A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods and apparatus for high-resolution microscopy
US11867507B1 (en) * 2023-05-05 2024-01-09 Mloptic Corp. Extended reality virtual distance measurement system

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4061425A (en) * 1976-07-06 1977-12-06 Martin Marietta Corporation High resolution alignment interferometer
WO2008052405A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-08 Shanghai Micro Electronics Equipment Co., Ltd. Alignment system used in lithography apparatus and diffraction orders-combining system used in alignment system
WO2008093099A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 King's College London Method and apparatus for improving image resolution
CN104034421B (zh) * 2014-05-21 2015-12-09 中国科学院西安光学精密机械研究所 双视场多普勒外差干涉仪

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1051968A (de) *
JPS59164925A (ja) 1983-03-11 1984-09-18 Hitachi Ltd 屈折的走査法を用いた二光束干渉計
US5155551A (en) * 1991-03-01 1992-10-13 Research-Cottrell Technologies, Inc. Laser referencing system for refractively scanning interferometer
DE4311726C2 (de) * 1993-04-08 1996-02-08 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren und Vorrichtun zur Erweiterung des Meßbereichs bei Nomarski-Mikroskopen
DE4424900A1 (de) * 1994-07-15 1996-01-18 Polytec Gmbh Interferometrische Meßverfahren
US6201609B1 (en) * 1999-08-27 2001-03-13 Zygo Corporation Interferometers utilizing polarization preserving optical systems
US6628406B1 (en) * 2000-04-20 2003-09-30 Justin L. Kreuzer Self referencing mark independent alignment sensor
US6441972B1 (en) * 2000-06-13 2002-08-27 Jon R. Lesniak Optical image separator
US7054077B2 (en) * 2003-04-01 2006-05-30 Zetetic Institute Method for constructing a catadioptric lens system
GB2402752B (en) * 2003-06-12 2006-07-26 Agilent Technologies Inc Optical component and compact wavelength locking arrangement including such a component
EP1869399A2 (de) * 2005-04-11 2007-12-26 Zetetic Institute Vorrichtung und verfahren zur in-situ- und ex-situ-messung der räumlichen impulsantwort eines optischen systems mit phasenverschiebungs-punktbeugungs-interferometrie
CN100401009C (zh) * 2006-06-21 2008-07-09 中国科学院力学研究所 长工作距干涉显微镜系统
EP2267403A3 (de) * 2007-02-21 2011-04-20 Agfa HealthCare N.V. System und Verfahren zur optischen Kohärenztomographie
EP2163906B1 (de) * 2008-09-16 2014-02-26 Mitutoyo Corporation Verfahren zur Bewegungserkennung einer Messsonde und Messinstrument
DE102011000835C5 (de) * 2011-02-21 2019-08-22 Leica Microsystems Cms Gmbh Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
CN102645739B (zh) * 2012-03-20 2013-12-25 中国科学院上海光学精密机械研究所 透射型样品相位显微装置和相位显微方法
JP2014098835A (ja) * 2012-11-15 2014-05-29 Canon Inc 顕微鏡用照明光学系およびこれを用いた顕微鏡
CN103063307A (zh) * 2012-12-28 2013-04-24 南京理工大学 像面干涉高光谱显微成像装置和方法
DE102013001238B4 (de) * 2013-01-25 2020-06-10 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Lichtmikroskop und Mikroskopieverfahren
US10585272B2 (en) * 2013-03-15 2020-03-10 University Of Utah Research Foundation Coherent fluorescence super-resolution microscopy
DE102013019348A1 (de) * 2013-08-15 2015-02-19 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
CN107003624B (zh) * 2014-12-15 2018-11-06 Asml控股股份有限公司 用于光瞳对称化的方法和设备
CN105807412B (zh) * 2016-04-07 2018-07-17 浙江大学 一种基于自由曲面整形的全内反射显微方法与装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4061425A (en) * 1976-07-06 1977-12-06 Martin Marietta Corporation High resolution alignment interferometer
WO2008052405A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-08 Shanghai Micro Electronics Equipment Co., Ltd. Alignment system used in lithography apparatus and diffraction orders-combining system used in alignment system
WO2008093099A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 King's College London Method and apparatus for improving image resolution
US20100059696A1 (en) * 2007-02-02 2010-03-11 Rainer Heintzmann Method and Apparatus for Improving Image Resolution
CN104034421B (zh) * 2014-05-21 2015-12-09 中国科学院西安光学精密机械研究所 双视场多普勒外差干涉仪

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. G CURRIE ET AL: "Four stellar-diameter measurements by a new technique: amplitude interferometry.", ASTROPHYSICAL JOURNAL, vol. 187, 31 January 1974 (1974-01-31), United States, pages 131 - 134, XP055466753, ISBN: 978-0-89252-105-0 *
OPTICS EXPRESS, vol. 15, no. 19, 2007, pages 12206 - 12216
OPTICS EXPRESS, vol. 15, no. 19, 2007, pages 12209

Also Published As

Publication number Publication date
CN110235044A (zh) 2019-09-13
CN110235044B (zh) 2022-04-29
US11525988B2 (en) 2022-12-13
US20200026050A1 (en) 2020-01-23
DE102017101829A1 (de) 2018-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1248132B1 (de) Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe
WO2018141333A1 (de) Anordnung zur auflösungssteigerung eines laser-scanning-mikroskops
DE112013002113B4 (de) Strahlformer
DE102005035700A1 (de) Messvorrichtung und Verfahren zur Bestimmung von Relativpositionen eines in mindestens eine Richtung bewegbar angeordneten Positioniertischs
DE2518047A1 (de) Interferometer
EP1359452B1 (de) Konfokales Mikroskop mit zwei Mikrolinsenarrays und einem Lochblendenarray
DE102012020877A1 (de) Optikanordnung und Lichtmikroskop
EP3295138A1 (de) Statisches fourier-transformations-spektrometer
EP2816316B1 (de) Interferometer
EP3513235A1 (de) Lichtmikroskop
EP2980525B1 (de) Triple-pass interferometer
WO2017144364A1 (de) Dreidimensionales interferometer und verfahren zur bestimmung einer phase eines elektrischen feldes
EP1122574A2 (de) Mikroskop-Aufbau
DE102008005355B4 (de) Autofokusvorrichtung und Autofokussierverfahren für eine Abbildungsvorrichtung
DE102018122652A1 (de) Spektralauflösende, hochauflösende 3D-Lokalisierungmikroskopie
EP2745158B1 (de) Messverfahren für höhenprofile von oberflächen
WO2016071033A1 (de) Verfahren zur erzeugung eines bildes einer probe
LU93022B1 (de) Verfahren und Mikroskop zum Untersuchen einer Probe
DE10321885A1 (de) Anordnung und Verfahren zur hochdynamischen, konfokalen Technik
DE102018126544A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Erfassen von Richtungsänderungen eines Lichtstrahls
DE102018130162A1 (de) Verfahren, Interferometer und Signalverarbeitungsvorrichtung, jeweils zur Bestimmung einer Eingangsphase und/oder einer Eingangsamplitude eines Eingangslichtfelds
DE102016108384B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zur lichtblattartigen Beleuchtung einer Probe
DE10321886A1 (de) Robuster interferometrischer Sensor und Verfahren zur Objektabtastung
EP2813802B1 (de) Messeinrichtung
EP3746829A1 (de) Verfahren zum abbilden einer probe mittels eines lichtblattmikroskops

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18703475

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18703475

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1