CN110579871A - 基于傅里叶叠层显微成像的led照明优化方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法及装置。装置包括计算机以及疏密排列的菱形LED阵列、被测样品、显微物镜、成像透镜、相机。同时提出了一种用于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，包括步骤一：基于LED，孔径和样本之间的关系，在傅里叶域中确定频谱范围；步骤二：使用图像质量评估算法来提取任意子LED和全LED之间的差异表达式；步骤三：分析差异表达式，确定照明角度优化方案。本发明能有效解决现有的傅里叶叠层显微成像技术下样品图像采集效率低、重建图像分辨率低的技术问题。

Description

基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法及装置
技术领域
本发明属于光学显微成像技术领域，涉及傅里叶叠层显微成像技术，具体涉及一种基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法及装置。
背景技术
傅里叶成像是一种平衡显微成像中高分辨率和宽视场的方法，傅里叶显微成像是最近发展起来的一种成像技术。在傅里叶显微成像中，利用不同的斜入射角对样品进行照明，并获取相应的低分辨率图像。利用傅里叶成像复原方法，研究人员可以迭代合成原始图像，生成高分辨率图像。通常，傅里叶成像在空间域和傅里叶域之间切换。采集到的图像是强度信号，在空间域为强度约束。支撑约束来自物镜的受限瞳孔功能。随着光照角的变化，该瞳孔函数约束在傅里叶频率空间上进行了平移。在这个过程中，因采集太多低分辨图像耗费过多时间。最初，使用周期性的LED阵列进行照明，这种均匀的照明采样方案会导致大量的原始图像被采集，使得采集和迭代复原花费了大量时间，并且采集到的大量暗场成像下的低分辨图像使得重建图像分辨率一般。
发明内容
为了解决现有技术中存在的傅里叶叠层显微成像技术采集样品图像效率低以及重建图像质量分辨率低的技术问题，本发明提供了一种基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法及装置。
本发明提供了一种基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：
步骤一、基于LED，孔径和样本之间的关系，在傅里叶域中确定频谱范围。
步骤二、使用图像质量评估算法来提取任意子LED和全LED之间的差异表达式。
步骤三、分析差异表达式，确定照明角度优化方案。
基于LED，孔径和样本之间的关系，在傅里叶域中确定频谱范围
令LED相邻单元的间隔为Dmm，LED平面与样品之间的距离为h mm，M×(放大倍率)、NA(数值孔径)，工作波长为λ，视场角θ0与数值孔径满足以下公式：
NA＝sinθ0；
其中中心LED单元垂直入射通过样品到物镜，傅里叶平面上的截止频率为：
令任一子LED入射角度为φ(入射光与X轴之间的角度α，入射光与Y轴之间的角度β)，则LED，孔径和样本之间的关系满足以下公式：
a和b分别是当前LED单元与沿x和y方向距中心LED单元之间的数量差，r是对应距离。边缘LED和中心LED之间的间隔满足L＝[rmax/D]。[A]表示小于或等于A的最大整数，则有效LED阵列分布为(2L+1)×(2L+1)。
傅里叶域中频谱范围由边缘LED的入射角φ0(光与LED阵列X轴之间的角度max(α)，光与LED阵列Y轴之间的角度max(β))确定。对于合成孔径，沿X轴与Y轴的截止频率值满足以下公式：
其中max(α)＝max(β)作为本发明选择LED阵列的一个指标。
使用图像质量评估算法来提取任意子LED和全LED之间的差异表达式
相邻LED的光谱重叠。由于入射角的差异会使傅里叶空间域变化发生，当LED的位置发生变化时，重叠区域也会发生变化。要选择LED以实现最小数量以加快低分辨图像采集效率，需要找出每个LED的差异。因此，本发明分析重叠光谱的冗余度，并提取任意LED与全光谱之间的微分表达式。首先令有效的LED单元光谱为F0，坐标(i，j)处的LED的光谱为Fi,j，再令差异函数为即PSNR(峰值信噪比)和SSIM(结构相似性)两种全参考图像质量评估算法。强度图f0对应于光谱F0，fres对应于残差光谱(F0-Fij)，PSNR和SSIM评估算法满足以下公式：
SSIM＝[l(x,y)][c(x,y)][s(x,y)]
其中μx、σx和μy、σy分别是x和y的均值和方差。σx,y是x和y的协方差，C1＝C2＝C3＝0.01。
多组实验数据得知PSNR和SSIM的结果越大，x和y就越接近。因此当fres和f0代替x和y时，我们可以得到完全重建图像和没有fij信息图像之间的差异。让ij在整个图像上逐像素移动，最终可以得到PSNR的差分矩阵和SSIM的差分矩阵，即该差分矩阵为任意子LED和全LED之间的差异表达式，通过这两个差分矩阵可以确定所有单一位置的LED对图像重建质量的重要性贡献等级。
分析差异表达式，确定照明角度优化方案
根据步骤二所实现的单一位置的LED对图像重建效果的重要性贡献等级，当我们选择最重要的LED范围时，可以按照菱形的形状提取主要照明区域，其中主要照明区域又可以分为明场成像区域和暗场成像区域。明场成像要求照明孔径在显微镜数值孔径之内，又由于傅里叶叠层成像在频谱扫描过程中需要一定的孔径交叠率(大于60％)，通过下列式子确定明场成像范围下LED的分布：
本发明提出将明场成像范围内相邻LED的间距(1/2Dmm)缩小至暗场成像范围内相邻LED的间距(Dmm)一半，来提高对明场成像下低分辨率图像采集数量。与此同时菱形LED阵列照明方式是：LED阵列先点亮最中心的LED单元，n＝0(n为计算机发出的第一次控制命令)，接着当n＝1时，LED阵列按规律逐个点亮上述LED单元外一圈。以此类推，当n>1时，LED阵列的照明范围为沿水平方向的对角线的LED灯数为2n+3，沿垂直方向的对角线的LED灯数为2n+1，最终其整体照明范围为菱形。
本发明还提供了一种基于LED阵列照明优化的傅里叶叠层显微装置：包括包括沿光路从上到下依次是相机，成像透镜，显微物镜，样品，载物台，稀疏排布的菱形LED阵列以及计算机。LED阵列依次点亮用于为被测样品提供不同角度的照明光；被测样品置于LED阵列和显微物镜之间，被测样品处于显微物镜的焦平面上；显微物镜和成像透镜共同组成一个4f系统，照明光束从LED阵列发出，经被测样品散射后通过该4f系统在成像透镜的后焦面上成像，并由相机记录；显微物镜、成像透镜均安装在显微镜上，显微镜的载物台用来固定样品。每个子LED的照明顺序及所示相机的图像拍摄均由外部计算机编程控制。
本发明对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)有效的减少了对低分辨率图像的采集，提高了图像重建效率。
(2)有效的增加了对明场成像的图像的采集，提高了图像分辨率。
附图说明
图1是本发明装置示意图；
图2是稀疏排布的菱形LED阵列；
图3实施案例中重建的高分辨图像(共使用57个LED照明)；
图4传统LED阵列照明下重建的高分辨图像(共使用225个LED照明)；
图中附图标记含义：1-相机，2-成像透镜，3-显微物镜，4-样品，5-载物台，6-菱形LED阵列，7-计算机，8-明场成像范围，9-暗场成像范围。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合附图实施例对本发明的实施作进一步说明。
如图1所示，本发明的基于LED阵列照明优化的傅里叶叠层显微装置，包括沿光路从上到下依次设置的相机1，成像透镜2，显微物镜3，样品4，载物台5，稀疏排布的菱形LED阵列6以及计算机7。稀疏排布的菱形LED阵列6依次点亮发光单元用于为被测样品4提供不同角度的照明光；被测样品4被置于载物台5上，位于稀疏排布的菱形LED阵列6和显微物镜3之间，处于显微物镜3的焦平面上；显微物镜3和成像透镜2共同组成一个4f系统。照明光束从菱形LED阵列6发出，经被测样品4散射后通过该4f系统在成像透镜2的后焦面上成像，并由相机1记录；其中本实施案例中采用的稀疏排布的菱形LED阵列6到样本4的距离为90mm，照明光波长为630nm，物镜数值孔径为0.1，成像的像元尺寸为2.25um。
如图2所示，本实施案例采用的照明光源为稀疏排布的菱形LED阵列6，其中明场成像范围内8的LED阵列间隔设定为2mm，暗场成像范围内9的LED阵列间隔设定为4mm。
图像采集：计算机7控制LED阵列进行照明，同时控制相机捕获低分辨率图像。首先计算机控制LED阵列先点亮最中心的LED单元，n＝0(n为计算机发出的第一次控制命令)，再根据相邻子LED必有重叠的约束条件，当n＝1时，LED阵列按规律逐个点亮上述LED单元外一圈。以此类推，当n>1时，LED阵列的照明范围为沿水平方向对角线的LED灯个数为2n+3，沿垂直方向对角线的LED灯个数为2n+1，最终其整体照明范围为菱形如图2所示。本实施案例一共采集57幅低分辨图像。
图像重建：计算机对上述采集的低分辨率图像进行重建，选用经典的GS相位恢复算法重建得到一幅高分辨率、宽视场显微图像，如图3所示；作为对比，图4为传统LED阵列(225幅)照明下重建的高分辨图像。保持其它成像系统参数不变情况下，通过对两张高分辨图像对比，发现本实施案例中重建的高分辨图像的质量要优于传统传统LED阵列照明下重建的高分辨图像的质量，并且本发明只采用57幅图而远远小于传统的225幅图，说明利用稀疏排布的菱形LED阵列进行照明的傅里叶显微系统能有效增大频谱中低频区域的交叠率和数据冗余度，可以进一步提高图像重建效率和图像重建质量。

Claims (5)

1.一种基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、基于LED，孔径和样本之间的关系，在傅里叶域中确定频谱范围；
步骤二、使用图像质量评估算法来提取任意子LED和全LED之间的差异表达式；
步骤三、分析差异表达式，确定照明角度优化方案。
2.如权利要求1所述的基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，其特征在于：步骤一具体如下：
令LED相邻单元的间隔为D mm，LED平面与样品之间的距离为h mm，物镜参数为M×(放大倍率)、NA(数值孔径)，工作波长为λ，视场角θ0与数值孔径满足以下公式：
NA＝sinθ0
其中，中心LED单元垂直入射通过样品到物镜，傅里叶平面上的截止频率为：
令任一子LED入射角度为φ，则LED，孔径和样本之间的关系满足以下公式：
a和b分别是当前LED单元与沿x和y方向距中心LED单元之间的数量差，r为对应距离；
边缘LED和中心LED之间的间隔满足L＝[rmax/D]，[A]表示小于或等于A的最大整数，则有效LED阵列分布为(2L+1)×(2L+1)。
3.如权利要求2所述的基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，其特征在于：步骤二具体如下：
相邻LED的光谱重叠，令有效的LED单元光谱为F0，坐标(i，j)处的LED的光谱为Fi,j，再令差异函数为采用峰值信噪比PSNR和结构相似性SSIM两种全参考图像质量评估算法，强度图f0对应于光谱F0，fres对应于残差光谱(F0-Fij)；
SSIM＝[l(x,y)][c(x,y)][s(x,y)]
其中μx、σx和μy、σy分别是x和y的均值和方差,σx,y是x和y的协方差，C1＝C2＝C3＝0.01；
坐标(i，j)在整个图像上逐像素移动，最终得到PSNR的差分矩阵和SSIM的差分矩阵，即该差分矩阵为任意子LED和全LED之间的差异表达式，通过这两个差分矩阵确定所有单一位置的LED对图像重建质量的重要性贡献等级。
4.如权利要求3所述的基于傅里叶叠层显微成像的LED照明优化方法，其特征在于：步骤三具体如下：
根据步骤二得到的单一位置的LED对图像重建效果的重要性贡献等级，当选择最重要的LED范围时，按照菱形的形状提取主要照明区域，其中主要照明区域又可以分为明场成像区域和暗场成像区域；明场成像要求照明孔径在显微镜数值孔径之内，由于傅里叶叠层成像在频谱扫描过程中需要一定的孔径交叠率，则可通过下列式子确定明场成像范围下LED的分布：
将明场成像范围内相邻LED的间距缩小至暗场成像范围内相邻LED的间距一半，提高对明场成像下低分辨率图像采集数量；
菱形LED阵列照明方式是：LED阵列先点亮最中心的LED单元，n＝0，n为计算机发出的第一次控制命令，接着当n＝1时，LED阵列按规律逐个点亮上述LED单元外一圈；以此类推，当n>1时，LED阵列的照明范围为沿水平方向的对角线的LED灯盏数为2n+3，沿垂直方向的对角线的LED灯盏数为2n+1，最终其整体照明范围为菱形。
5.一种基于LED阵列照明优化的傅里叶叠层显微装置，包括沿光路从上到下依次设置的相机(1)，成像透镜(2)，显微物镜(3)，样品4，载物台5，稀疏排布的菱形LED阵列(6)以及计算机(7)，其特征在于：所述稀疏排布的菱形LED阵列(6)依次点亮发光单元用于为被测样品4提供不同角度的照明光；被测样品(4)被置于载物台(5)上，位于稀疏排布的菱形LED阵列(6)和显微物镜(3)之间，处于显微物镜(3)的焦平面上；显微物镜(3)和成像透镜(2)共同组成一个4f系统；照明光束从菱形LED阵列(6)发出，经被测样品(4)散射后通过该4f系统在成像透镜(2)的后焦面上成像，并由相机(1)记录；每个子LED的照明顺序及所示相机的图像拍摄均由外部计算机编程控制。
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