CN108896471B - 基于led阵列微流通道活细胞相衬成像方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像方法及系统，顺着光路传递方向依次包括：可编程LED灯板、可控流速微流通道、显微镜、高速相机图像采集模块，还包括图像细胞重影消除模块、图像细胞特征提取和位置匹配模块、相衬成像模块；相衬成像是透明样品成像的最有效方法，它可以获得普通强度成像无法看到的样本的轮廓细节，本发明能消除微流通道中在一个曝光时间内细胞快速运动造成的模糊，更好将两幅连续采集的图像中细胞进行快速准确匹配，并利用相衬成像原理，对整个微流通道中细胞流动过程起到一个三维的观测。
Description
技术领域
本发明属于显微相衬成像技术领域，具体涉及一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像方法及系统。
背景技术
微流体技术在科学技术分析中得到广泛应用，如低成本、短时间进行分离和高分辨率、高灵敏度检测。特别是在分子分析、生物防御分子、生物和微电子学等方面的研究。许多显微技术，如明场和荧光显微镜、相差显微镜、微分干涉对比(DIC)显微镜和激光扫描共聚焦显微镜已经发展和应用于微流体。在通道观测中建立了用于超快细胞的非对称检测时间拉伸光学显微镜(ATOM)，光流显微镜(OFM)提供了一种新的无透镜改进微流体方案，用于获得SPE的图像。全息光流显微镜(HOM)是基于LED数字同轴全息平台与微流体。此外，多视数字全息显微术(ML-DH)证明了RBC存在的益处，它提供了在数值分辨率和噪声抑制方面的增强，从而获得在没有闭塞物体的液体中的图像质量高于在该情况下可实现的图像。
相位成像是透明样品成像的最有效方法，它可以获得普通强度成像无法看到的样本的轮廓细节。相位成像的恢复存在多种方法，如Zernike相位相衬成像、差分干涉对比度(DIC)成像和其它定量相位成像方法。此外，还通过具有LED阵列的非对称照明模式来实现差分相位对比度(DPC)成像。
采用LED阵列代替传统照明光源，可以轻松地实现非对称照明模式。每个LED可以单独从其独特的角度控制，因此照明的角度可以由一组LED打开来设置。LED阵列显微镜具有照明光源形状可编程、视野大、响应快等优点，它的照明计算灵活地应用在暗场、相位对比、傅立叶瞳孔成像、数字像差消除、光场再聚焦和3D相位成像中实现。本文采用上、下、左、右半角和暗场对样品进行连续照明，获得相位衬度成像。
当细胞在微通道中以一个速度流动时，运动模糊在一个相机曝光时间内的视场中出现，靶标位置将在成对半圆照明图像之间移动。此外，从运动模糊自适应识别技术、边缘检测技术、松弛平均技术、点扩展函数的新算法和LED阵列的编码照明可以提供去模糊校正的解决方法。为了消除相衬成像的目标位置移动误差，需要识别、目标的配准和移动位置误差校正。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像方法及系统。
为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像的系统，顺着光路传递方向依次包括：可编程LED灯板、可控流速微流通道、显微镜、高速相机图像采集模块，还包括图像细胞重影消除模块、图像细胞特征提取和位置匹配模块、相衬成像模块；可编程LED灯板平行设置于可控流速微流通道的上方，可控流速微流通道置于显微镜的载物平台上，高速相机图像采集模块置于显微镜的前端出口，其中LED灯板用于产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道，可控流速微流通道用于控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜用于放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块与可编程LED灯板之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块连续采集在非对称照明下可控流速微流通道中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块和图像细胞特征提取和位置匹配模块对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频。
作为优选方式，本系统在用相衬成像模块处理流动细胞轮廓图像时，可编程LED灯板的照明花样变化的速度和高速相机图像采集模块的曝光时间必须保证可控流速微流通道的视野中至少有一个样本细胞，并且保证连续采集样本图像之间细胞无旋转。
作为优选方式，图像细胞重影消除模块使用最小二乘法对采集的细胞样本图像进行重影消除。
为实现上述发明目的，本发明还提供一种基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，所述方法为：LED灯板产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道，可控流速微流通道控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块与可编程LED灯板之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块连续采集在非对称照明下可控流速微流通道中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块和图像细胞特征提取和位置匹配模块对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频。
作为优选方式，本方法在用相衬成像模块处理流动细胞轮廓图像时，可编程LED灯板的照明花样变化的速度和高速相机图像采集模块的曝光时间必须保证可控流速微流通道的视野中至少有一个样本细胞，并且保证连续采集样本图像之间细胞无旋转。
作为优选方式，图像细胞重影消除模块使用最小二乘法对采集的细胞样本图像进行重影消除。
作为优选方式，本方法包括如下步骤：
(1)设置可编程LED灯板照明花样为上下、左右和暗场五种；
(2)控制相机采集和LED灯板花样变化同步；
(3)向可控流速微流通道中注入带有细胞的缓冲液；
(4)连续采集在可控流速微流通道中流通的细胞图像；
(5)针对采集图像采用最小二乘法进行重影消除和去噪声；
(6)消除重影之后，在相邻两幅细胞图像之上进行的位置切割匹配；
(7)位置重置之后进行图像相衬成像；
(8)将所有相衬图像合成为一个视频。
本发明介绍了一种利用LED阵列照明的微流道中的细胞暗场、相衬成像的显微方法，包括运动去模糊、图像配准、非对称照明成像。可编码LED阵列与摄像机同步，以100Hz帧速率捕获流细胞图像，并分别在20Hz处恢复和提取暗场和相衬图像。此方法也可以获取通道中的细胞的3D和断层成像信息。随着LED照明模式切换的速度和相机的响应和灵敏度的增加，在不对称相位成像中可以识别微流通道中更快的流动细胞。
本发明的有益效果为：相衬成像是透明样品成像的最有效方法，它可以获得普通强度成像无法看到的样本的轮廓细节。能消除微流通道中在一个曝光时间内细胞快速运动造成的模糊。更好将两幅连续采集的图像中细胞进行快速准确匹配。并利用相衬成像原理，对整个微流通道中细胞流动过程起到一个三维的观测。
附图说明
图1是本发明中基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像的系统示意图；
图2是本发明系统和方法的样本图像重影消除算法验证处理前后效果图。
图3是本发明系统和方法的连续采集两幅图像中细胞特征信息提取示意图。
图4是展示实际应用中五幅连续采集图像相衬成像原理和效果示意图。
图5是展示本发明中的流程图。
1为可编程LED灯板、2为可控流速微流通道、3为显微镜、4为高速相机图像采集模块、5为图像细胞重影消除模块、6为图像细胞特征提取和位置匹配模块、7为相衬成像模块。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
图2是使用本发明系统和方法的样本图像重影消除算法验证处理前后效果图，a中展示使用beats在9ms曝光时间LED阵列下固定采集的图像，可以看到图中beats加入20像素点水平移动之后有明显的模糊，b中使用算法去重影之后的图像，可以看到重影消除；
图3是本发明系统和方法的连续采集两幅图像中细胞特征信息提取示意图。对连续采集图像进行对比，(a)中提取出相同的特征，(b)对微流通道中细胞两幅连续采集图像边缘提取之后叠加图像，两幅图像相同特征匹配测出距离，位移总量约为27个像素点，并按照此距离进行图像匹配；
图4是展示实际应用中五幅连续采集图像相衬成像原理和效果示意图。此图为20倍物镜NA为0.4采集图像，曝光时间为9ms，分别采用上下半圆、暗场和左右半圆LED照明模式依次采集微流通道中细胞运动图像,左边图例为连续采集图像，细胞有明显向左流动，右边上图为上下半圆采集图像进行相衬成像，右边下图为上下半圆叠加之后的亮场图样。
一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像的系统，顺着光路传递方向依次包括：可编程LED灯板1、可控流速微流通道2、显微镜3、高速相机图像采集模块4，还包括图像细胞重影消除模块5、图像细胞特征提取和位置匹配模块6、相衬成像模块7；可编程LED灯板1平行设置于可控流速微流通道2的上方，可控流速微流通道2置于显微镜3的载物平台上。
高速相机图像采集模块4置于显微镜3的前端出口，其中LED灯板用于产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道2，可控流速微流通道2用于控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜3用于放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块4与可编程LED1灯板之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块4连续采集在非对称照明下可控流速微流通道2中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块5和图像细胞特征提取和位置匹配模块6对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块7对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频。
本系统在用相衬成像模块7处理流动细胞轮廓图像时，可编程LED灯板1的照明花样变化的速度和高速相机图像采集模块4的曝光时间必须保证可控流速微流通道2的视野中至少有一个样本细胞，并且保证连续采集样本图像之间细胞无旋转。
图像细胞重影消除模块5使用最小二乘法对采集的细胞样本图像进行重影消除。
本发明还提供一种基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，所述方法为：LED灯板产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道2，可控流速微流通道2控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜3放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块4与可编程LED灯板1之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块4连续采集在非对称照明下可控流速微流通道2中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块5和图像细胞特征提取和位置匹配模块6对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块(7)对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频。
本方法包括如下步骤：
(1)设置可编程LED灯板照明花样为上下、左右和暗场五种；
(2)控制相机采集和LED灯板花样变化同步；
(3)向可控流速微流通道中注入带有细胞的缓冲液；
(4)连续采集在可控流速微流通道中流通的细胞图像；
(5)针对采集图像采用最小二乘法进行重影消除和去噪声；
(6)消除重影之后，在相邻两幅细胞图像之上进行的位置切割匹配；
(7)位置重置之后进行图像相衬成像；
(8)将所有相衬图像合成为一个视频。
在采集到的图像组基础上，对单个半圆成像的结果图像的运动造成的模糊进行消除，运用的基本原理算法如下：
1.重影消除，由于微流体中细胞在一定曝光时间内有一定的定向平移和旋转，所以在这段时间拍摄到的图像是有重影的。因此，在细胞相位对比成像中，重影消除变得尤其的必要。假设细胞在微流体的平移速度为v，设置点扩散函数(PSF)为p(x),那么由于运动产生重影图像G(x)，实际为原图像F(x)与点扩散函数(PSF)的卷积：
G(x)＝F(x)*p(x)+N(x)
其中，F(x)为原图像，N(x)是噪声，由此进行傅立叶变换之后在傅立叶域的方程形式如下：
其中
分别表示傅立叶中的原图像、PSF和噪声。根据上式进行变化可以得到重影消除之后的原始图像
如下：
为了图像处理方便，我们将图像矩阵化，令其中原始图像为A，产生重影之后的图像为B，p代表PSF，式如下：
B＝Ap+N
其中p循环矩阵，其中每个列向量是用零填充的模糊PSF。我们根据最小二乘法，建立图像重影消除算法。
同时为了消除连续两次半圆照明采集图像的运动位置差异，我们根据LED半圆切换时间差，以及对图像中细胞信息进行提取和定位，针对连续两幅图得细胞信息定位之后进行位置重置，匹配连续采集得两幅图像，具体算法:
2.位置匹配，本发明中，使用了五种LED照明模式，分别是暗场、上半圆、下半圆、左半圆和右半圆，单幅图像的曝光时间为t，基本步骤为：a对图像进行特征提取；b计算相同特征之间的像素点距离；c对连续两幅图像按照距离进行图像的匹配。
在基于重影消除和位置匹配之后，利用五次不同的LED照明花样，依次使用的是暗场、上下半圆和左右半圆LED照明模式，如图3。其中暗场由显微镜的NA决定，NA决定圆之外的为暗场。暗场由于在视场之外，能够以更大角度的照明，获得更多的高频信息。在五种不同LED照明模式中，上下半圆照明下，分别得到的图像将其振幅叠加IBF＝IUF+IDF就能得到明场的采集图像，相关系数σ＝1的时候。为了获得dpc图像我们利用上下半圆LED照明的图像来计算，根据相衬成像原理，
其中IUF是上半圆照明得到的图像的振幅，IDF是下半圆照明得到的图像的振幅，由此得到相衬图像，在垂直分界线有明显的阴影效果。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种基于LED阵列微流通道活细胞相衬成像的系统，其特征在于：顺着光路传递方向依次包括：可编程LED灯板(1)、可控流速微流通道(2)、显微镜(3)、高速相机图像采集模块(4)，还包括图像细胞重影消除模块(5)、图像细胞特征提取和位置匹配模块(6)、相衬成像模块(7)；可编程LED灯板(1)平行设置于可控流速微流通道(2)的上方，可控流速微流通道(2)置于显微镜(3)的载物平台上，高速相机图像采集模块(4)置于显微镜(3)的前端出口，其中LED灯板用于产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道(2)，可控流速微流通道(2)用于控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜(3)用于放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块(4)与可编程LED(1)灯板之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块(4)连续采集在非对称照明下可控流速微流通道(2)中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块(5)和图像细胞特征提取和位置匹配模块(6)对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块(7)对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频；
本系统在用相衬成像模块(7)处理流动细胞轮廓图像时，可编程LED灯板(1)的照明花样变化的速度和高速相机图像采集模块(4)的曝光时间必须保证可控流速微流通道(2)的视野中至少有一个样本细胞，并且保证连续采集样本图像之间细胞无旋转；
图像细胞重影消除模块(5)使用最小二乘法对采集的细胞样本图像进行重影消除。
2.一种基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，其特征在于：
LED灯板产生相衬成像的非对称光，该非对称光照射在通有流通细胞样本的可控流速微流通道(2)，可控流速微流通道(2)控制悬浮细胞液的定向运动，显微镜(3)放大微流通道中样本信息，高速相机图像采集模块(4)与可编程LED(1)灯板之间电压信息相互反馈控制，高速相机图像采集模块(4)连续采集在非对称照明下可控流速微流通道(2)中快速运动细胞图像信息，然后在计算机中利用图像细胞重影消除模块(5)和图像细胞特征提取和位置匹配模块(6)对采集的细胞样本图像进行重影消除、细胞特征提取、相同特征之间像素距离计算和对连续相邻两幅图像依照像素距离进行切割匹配，并且利用相机相源大小估算细胞流速，利用相衬成像模块对细胞图像进行上下、左右相衬对比成像并合成视频观察细胞流动过程中形态变化情况，最终利用相衬成像模块(7)对细胞图像进行连续的相衬成像并合成流通细胞视频。
3.根据权利要求2的基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，其特征在于：本方法在用相衬成像模块(7)处理流动细胞轮廓图像时，可编程LED灯板(1)的照明花样变化的速度和高速相机图像采集模块(4)的曝光时间必须保证可控流速微流通道(2)的视野中至少有一个样本细胞，并且保证连续采集样本图像之间细胞无旋转。
4.根据权利要求2的基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，其特征在于：图像细胞重影消除模块(5)使用最小二乘法对采集的细胞样本图像进行重影消除。
5.根据权利要求2的基于LED阵列的微流通道活细胞相衬成像的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设置可编程LED灯板照明花样为上下、左右和暗场五种；
(2)控制相机采集和LED灯板花样变化同步；
(3)向可控流速微流通道中注入带有细胞的缓冲液；
(4)连续采集在可控流速微流通道中流通的细胞图像；
(5)针对采集图像采用最小二乘法进行重影消除和去噪声；
(6)消除重影之后，在相邻两幅细胞图像之上进行的位置切割匹配；
(7)位置重置之后进行图像相衬成像；
(8)将所有相衬图像合成为一个视频。
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