CN105403988A - 基于lcd液晶面板的可编程孔径显微镜系统及其多模式成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统及其多模式成像方法，由显微成像系统和LCD液晶面板的4f系统实现明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式，在成像之前，先对LCD液晶面板中每个像素点的位置进行标记。本发明利用LCD液晶面板实现空间光调制器的功能，可以实现孔径图案、孔径光阑尺寸等的灵活可调，显著提升了显微镜的灵活性与多功能性。

Description

基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统及其多模式成像方法

技术领域

本发明属于光学显微成像技术，特别是一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统及其多模式成像方法。

背景技术

明场成像和暗场成像是最常用的两种显微成像方法，两者的区别在于：照明方式不同。如果只允许透射光束通过物镜光阑成像，称其为明场像；如果只允许衍射光束通过物镜光阑成像，则称为暗场像。所以明场是让照明孔径在物镜数值孔径以内，视场是明亮的；而暗场是则是让照明孔径在物镜数值孔径以外，而不让照明光束通过物镜光阑成像，但是标本中的结构能够衍射光线，这些衍射光有一部分通过物镜光阑成像，所以在黑暗的背景上能够看到表现标本中细微结构的亮点和亮线(于捷年.暗场显微镜成像原理初探[J].中国刑警学院学报,1999,(1):38-40.)。

还有一种常见的成像方式是相差显微成像。1935年荷兰科学家Zernike利用相差显微成像技术发明了相差显微镜，并将其用于观察未染色标本(盛富根.微分干涉相衬显微镜的原理分析(矢量法)[J].光学仪器,1986,(5).)。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，这种相位差人眼无法观察。而相差显微镜利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测。该显微镜主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜3个特殊之处：1.环形光阑(annulardiaphragm)位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上；2.相位板(phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ；3.合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

类似于相差显微成像的成像效果，差分相衬成像也是一种常见的显微成像方法，使用该方法可使样品的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，类似大理石上的浮雕，这样便人为地造成了样品的三维立体感。

通常来说，现代显微镜系统往往伴随有多种显微成像模式，如明场成像、暗场成像和相衬成像等等，这些成像方式需要显微镜的光源提供更加灵活多变的控制。从而，现有的高端显微镜的聚光镜都做成了塔式结构，里面需增设很多的可调附件，如：暗场环遮光板、相衬环遮光板等等。特别是暗场环遮光板与相衬环遮光板，这些元件都需要与每个物镜单独匹配，如果系统中有4个不同倍率的物镜，则需要分别配备四种不同尺寸的遮光板与之相配。显然，这使得显微镜的结构变得日益复杂，元件数目越来越多，成本也随之越来越高。这种复杂的聚光镜结构一般需要熟练的显微镜工作者进行操作，并需要针对标本的差异和物镜的不同进行实践、校正(刘金,解玉兰.柯拉照明在显微镜调节中的应用[J].实验室科学,2006,(2):117-118.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统及其多模式成像方法，利用LCD液晶面板实现空间光调制器的功能，从而实现显微镜系统孔径平面光强分布的灵活可控，并实现明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统，包括显微成像系统和LCD液晶面板的4f系统，该LCD液晶面板的4f系统包括第一透镜L₁、第二透镜L₂、LCD液晶面板以及单色CCD相机，第一透镜L₁、第二透镜L₂的焦距f＝f₁＝f₂，第一透镜L₁和第二透镜L₂构成一个标准的4f成像系统，即第一透镜L₁到显微镜图像平面的端口的距离为f1，第二透镜L₂到CCD相机成像平面的端口的距离为f2，两透镜之间的距离是f1+f2；LCD液晶面板放置于4f系统的傅里叶平面，即第一透镜L₁和第二透镜L₂之间，距离第一透镜L₁的距离为f1，距离第二透镜L₂的距离为f2。

一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，由显微成像系统和LCD液晶面板的4f系统实现明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式，在成像之前，先对LCD液晶面板中每个像素点的位置进行标记。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)利用LCD液晶面板实现空间光调制器的功能，可以实现孔径图案、孔径光阑尺寸等的灵活可调。(2)可以作为附件无缝驳接到传统明场显微镜的相机接口，无需改变显微镜的原始结构，无需任何物理上机械移动的部件，从而显著提升了显微镜的灵活性与多功能性。通过在LCD液晶面板显示不同的图案，结合相应的图像处理方法，方便快捷地实现明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式显微成像，在植物学、动物学、细胞生物学、半导体、材料科学、纳米技术、生命科学、医学诊断等众多领域具有广阔应用前景。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是本发明基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统原理图。

图2是LCD液晶面板中每个像素点的坐标系示意图。

图3是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的明场成像方法中LCD液晶面板所需显示的指定图案，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

图4是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统暗场成像方法中LCD液晶面板所需显示的指定图案，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。。

图5(a)是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统差分相衬成像方法(左右)中LCD液晶面板所需显示的指定图案1，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

图5(b)是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统差分相衬成像方法(左右)中LCD液晶面板所需显示的指定图案2，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

图6(a)是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统差分相衬成像方法(上下)中LCD液晶面板所需显示的指定图案1，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

图6(b)是基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统差分相衬成像方法(上下)中LCD液晶面板所需显示的指定图案2，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

图7是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的明场图像。

图8是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的暗场图像。

图9是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的差分相衬成像图像(左右)。

图10是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的差分相衬成像图像(上下)。

具体实施方式

结合图1，本发明基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统，由两部分构成，一部分为显微成像系统1，另一部分是一个包含LCD液晶面板的4f系统2，这两部分在图1中分别由虚线框标出。所述的显微成像系统1可直接采用现有的显微镜系统，也可以自行构建，其主要包括集光镜3、聚光镜孔径光阑4、聚光镜5、样品载物台6、显微物镜7、反射镜8、与镜筒透镜9。其中集光镜3将照明光汇聚到聚光镜孔径光阑4，聚光镜孔径光阑大小可调，控制照明的通光孔径，通光聚光镜孔径光阑4发散后又被聚光镜5收集后照射样品，透射过样品载物台6上的样品的光被显微物镜7收集，并经过反射镜8反射后由镜筒透镜9放大后成像在显微镜相机端口的图像平面10。

所述的包含LCD液晶面板的4f系统2是系统的核心部分，包括第一透镜L₁11、第二透镜L₂13、LCD液晶面板12以及单色CCD相机14(采用TheImagingSourceDMK41AU02,1280×960,4.65μmpixelsize,15fps)。第一透镜L₁11、第二透镜L₂13的焦距f＝f₁＝f₂。第一透镜L₁11和第二透镜L₂13构成一个标准的4f成像系统，即第一透镜L₁11到显微镜图像平面10的端口的距离为f1，第二透镜L₂11到CCD相机14成像平面的端口的距离为f2，两透镜之间的距离是f1+f2。LCD液晶面板12放置于4f系统的傅里叶平面，即第一透镜L₁11和第二透镜L₂13之间，距离第一透镜L₁11的距离为f1，距离第二透镜L₂13的距离为f2。

以具体实施例子给予说明，即第一透镜L₁11、第二透镜L₂13的焦距f＝f₁＝f₂＝150mm。则第一透镜L₁11和第二透镜L₂13构成一个标准的4f成像系统，即：第一透镜L₁11到显微镜图像平面10的端口的距离为f1＝150mm，第二透镜L₂11到CCD相机14成像平面的端口的距离为f2＝150mm，两透镜之间的距离是f1+f2＝300mm。LCD液晶面板12放置于4f系统的傅里叶平面，即第一透镜L₁11和第二透镜L₂13之间，距离第一透镜L₁11的距离为f1＝150mm，距离第二透镜L₂13的距离为f2＝150mm。L₁和L₂的焦距可以是相同的，但是实际上它们可以选用不同的焦距，这里为了方便起见以f＝f₁＝f₂＝150mm说明。

LCD液晶面板12是作为一种透射型空间光调制器来使用的，其可以是基于TN型的灰度液晶面板。面板尺寸、像素分辨率与像素尺寸可以根据市售产品进行选择，但面板尺寸要能尽可能覆盖第二透镜L₂13前焦面的所有有效区域，像素分辨率与像素尺寸越小越好。目前典型值为面板尺寸2-4.3寸，像素分辨率10×10至480×272，像素尺寸从20微米至10毫米不等。

为了实现LCD液晶面板12中每个像素点明暗控制，需采用相配套的硬件电路。由于LCD液晶面板本身响应很快，硬件电路还可实现不同空间分布的图案的快速切换，实现在时间上快速变化的灰度图案。硬件电路的具体实现方案已经有许多成熟技术，其主控制器可以采用(但不限于)单片机、ARM、或者可编程逻辑器件等，具体实现方法可参考文献：苏维嘉,张澎.基于FPGA的TFT-LCD控制器的设计和实现[J].液晶与显示,2010,25(1):75-78。

本发明基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法实施前，首先对LCD液晶面板中每个像素点的位置进行标记。结合图2，建立坐标系。其中矩形区域代表LCD液晶面板12的有效区域，坐标原点位于其中央。对于任意一个像素点P，其位置坐标为(P_x,P_y)，我们定义该点所对应的成像数值孔径为 ${\mathrm{NA}}_i={\mathrm{Msin\θ}}_i=M\sin arctan\frac{\sqrt{P_x^2+P_y^2}}{f}\≈M\frac{\sqrt{P_x^2+P_y^2}}{f},$ f代表第一透镜L₁11的焦距,M为显微物镜7的放大率。每个像素点P的数值孔径决定了成像光线的角度由此公式可见，约靠近LCD液晶面板或LED阵列边缘的像素，对应成像光线的角度θ_i越大。

本发明基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，主要包括明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式，其中明场成像方法的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统1的显微镜的显微物镜7切换到合适倍率的普通明场物镜，这里(包括下述的)“合适倍率”是指根据实际观察的样品尺寸，使用者观察所需的放大倍数，与观察所需的实际区域而选定。聚光镜孔径光阑4调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％。

步骤二：使LCD液晶面板12中所有像素均透光即可。结合图3，整个白色方块代表LCD液晶面板12中所有像素均透光，而其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。

步骤三：在此配置下，在样品载物台(6)上放入待测样品，在就可显微镜相机端口的图像平面10即可拍摄得到明场显微成像结果。

所述暗场成像方法的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统1的显微镜的显微物镜7切换到合适倍率的普通明场物镜。聚光镜孔径光阑4调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％。

步骤二：使LCD液晶面板12中的中心圆形区域不透光，而其余部分透光即可。不透光区域刚好覆盖聚光镜孔径光阑区域。结合图4，整个方块区域代表LCD液晶面板12中所有像素，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。内圈点线以内的区域为黑色，代表不透光区域刚好覆盖聚光镜孔径光阑区域。

步骤三：在此配置下，在样品载物台(6)上放入待测样品，在就可显微镜相机端口的图像平面10即可拍摄得到明场显微成像结果。

所述差分相衬成像方法的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统1的显微镜的显微物镜7切换到合适倍率的普通明场物镜，聚光镜孔径光阑4调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％，在样品载物台(6)上放入待测样品。

步骤二：仅使LCD液晶面板12中的中心左半圆形区域透光，而其余部分不透光。半圆形区域的半径正好与显微物镜的数值孔径区域NA_obj半径相等。结合图5(a)，整个方块区域代表LCD液晶面板12中所有像素，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。内圈点线以内的区域为黑色，代表不透光区域。通过相机拍摄第一帧图像I₁。

步骤三：仅使LCD液晶面板12中的中心右半圆形区域透光，而其余部分不透光。半圆形区域的半径正好与显微物镜的数值孔径区域NA_obj半径相等。结合图5(b)，整个方块区域代表LCD液晶面板12中所有像素，其中虚线部分代表的是显微物镜的数值孔径区域NA_obj，而内圈点线部分代表的是聚光镜孔径光阑区域NA_ill。内圈点线以内的区域为黑色，代表不透光区域。通过相机拍摄第二帧图像I₂。在此配置下，在样品载物台(6)上放入待测样品，在就可显微镜相机端口的图像平面10即可拍摄得到明场显微成像结果。

步骤四：通过计算实现差分相衬成像(其中I_DPC表示差分相衬成像后的图像)。

注意，上述差分相衬成像又称为左右差分相衬成像，其实上述左/右半圆形区域也可分别改变为上/下半圆形区域从而实现上下差分相衬成像，如图6(a)与图6(b)所示。

为了表明本发明的实际使用效果，我们采用一实例来说明。在实例中，我们采用基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统对未染色的口腔上皮细胞样品进行观察，图7是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的明场图像。注意该样品本身是无色透明的，所以在明场成像下的对比度是很低的，图8是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的暗场图像，可以看到暗场图像中细胞表现为暗背景上的亮图像，细节丰富。图9是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的差分相衬成像(左右)图像。图10是采用本发明所拍摄到的口腔上皮细胞样品的差分相衬成像(上下)图像。可以看出差分相衬成像图像具有很强的浮雕式的立体感，图像对比度获得了很强的提升。

Claims (7)

1.一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统，其特征在于包括显微成像系统(1)和LCD液晶面板的4f系统(2)，该LCD液晶面板的4f系统(2)包括第一透镜L₁(11)、第二透镜L₂(13)、LCD液晶面板(12)以及单色CCD相机(14)，第一透镜L₁(11)、第二透镜L₂(13)的焦距f＝f₁＝f₂，第一透镜L₁(11)和第二透镜L₂(13)构成一个标准的4f成像系统，即第一透镜L₁(11)到显微镜图像平面(10)的端口的距离为f1，第二透镜L₂(11)到CCD相机(14)成像平面的端口的距离为f2，两透镜之间的距离是f1+f2；LCD液晶面板(12)放置于4f系统的傅里叶平面，即第一透镜L₁(11)和第二透镜L₂(13)之间，距离第一透镜L₁(11)的距离为f1，距离第二透镜L₂(13)的距离为f2。

2.根据权利要求1中所述的基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统，其特征在于显微成像系统(1)包括集光镜(3)、聚光镜孔径光阑(4)、聚光镜(5)、样品载物台(6)、显微物镜(7)、反射镜(8)与镜筒透镜(9)，其中集光镜(3)将照明光汇聚到聚光镜孔径光阑(4)，通光聚光镜孔径光阑(4)发散后又被聚光镜(5)收集后照射样品载物台(6)上的样品，透射过样品的光被显微物镜(7)收集，并经过反射镜(8)后由镜筒透镜(9)放大后成像在显微镜相机端口的图像平面(10)。

3.一种基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，其特征在于由显微成像系统(1)和LCD液晶面板的4f系统(2)实现明场、暗场、差分相衬成像三种成像模式，在成像之前，先对LCD液晶面板(12)中每个像素点的位置进行标记，首先建立坐标系，坐标原点位于LCD液晶面板的(12)的中央，对于其中任意一个像素点P，其位置坐标为(P_x,P_y)，定义该点所对应的成像数值孔径为f代表第一透镜L₁(11)的焦距，M为显微物镜(7)的放大率；每个像素点P的数值孔径决定了成像光线的角度

4.根据权利要求3所述的基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，其特征在于明场成像的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统(1)的显微物镜(7)切换到与实际观察的样品尺寸相应倍率的普通明场物镜，聚光镜孔径光阑(4)调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％；

步骤二：使LCD液晶面板(12)中所有像素均透光即可；

步骤三：在样品载物台(6)上放入待测样品，在就可显微镜相机端口的图像平面(10)即可拍摄得到明场显微成像结果。

5.根据权利要求3所述的基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多

模式成像方法，其特征在于暗场成像的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统(1)的显微物镜(7)切换到与实际观察的样品尺寸相应倍率的普通明场物镜，聚光镜孔径光阑(4)调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％；

步骤二：使LCD液晶面板(12)中的中心圆形区域不透光，而其余部分透光即可，不透光区域刚好覆盖聚光镜孔径光阑区域。

步骤三：在样品载物台(6)上放入待测样品，在就可显微镜相机端口的图

像平面(10)即可拍摄得到明场显微成像结果。

6.根据权利要求3所述的基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，其特征在于差分相衬成像的实现步骤如下：

步骤一：将显微成像系统(1)的显微物镜(7)切换到与实际观察的样品尺寸相应的放大倍率的普通明场物镜，聚光镜孔径光阑(4)调节到小于物镜数值孔径的位置上，推荐值为物镜数值孔径的30-80％，在样品载物台(6)上放入待测样品；

步骤二：仅使LCD液晶面板(12)中的中心左半圆形区域透光，而其余部分不透光，半圆形区域的半径正好与显微物镜的数值孔径区域NA_obj半径相等；

步骤三：仅使LCD液晶面板(12)中的中心右半圆形区域透光，而其余部分不透光，半圆形区域的半径正好与显微物镜的数值孔径区域NA_obj半径相等；

步骤四：通过计算实现差分相衬成像，其中I_DPC表示差分相衬成像后的图像。

7.根据权利要求6所述的基于LCD液晶面板的可编程孔径显微镜系统的多模式成像方法，其特征在于差分相衬成像中的左/右半圆形区域也可分别改变为上/下半圆形区域从而实现上下差分相衬成像。