CN109375358A - 一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法，首先推导出差分相衬定量相位成像中各向同性相位传递函数所对应的最优照明图案，确定其为照明数值孔径NA_ill与系统用物镜数值孔径NA_obj相等的半环形照明图案；其照明强度分布以方向轴为起点，随照明角度余弦变化；在极坐标下强度分布可以表示为S(θ)＝cos(θ)；本发明有效弥补相位传递的频率损失，不仅最高频率的传递表现得到增强，同时低频相位信息的传递性也得到明显提升，保证了相位结果的正确性和高分辨率；同时该最优照明方案将照明轴数量减到最少的2个，大大减少了差分相衬定量相位成像所需采集图像的数量，提高了成像速度，使其获得实时动态、高正确率、高分辨率的相位成像结果。

Description

一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像 方法

技术领域

本发明属于光学显微成像、测量技术，特别是一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法。

背景技术

由于生物细胞的透明特性，对生物细胞进行无标记研究一直是显微成像方法的热点。定量相位显成像技术作为目前种类最多、应用最广的无标记成像方法逐渐成为细胞研究的主要手段。在定量相位成像技术中，按成像原理可以主要分为两类，即基于相干成像和基于非相干成像的定量相位成像方法。得益于不同的成像原理，这两种方法往往在成像分辨率、成像通量、成像速度等方面具有不同的成像表现。在这些成像方法中，以差分相衬(Differential Phase Contrast)定量相位成像为代表的非相干定量相位成像方法仅需几幅原始图像即可完成相位的定量恢复，同时可带来两倍于物镜衍射极限的横向分辨率，使得成像结果具有很高的正确性和稳定性。这些优势使得差分相衬定量相位成像在细胞成像方面有着极为重要的应用价值。

传统差分相衬定量相位成像通过在成像系统中引入相移量，将不可见的样品相位转换为可以测量的强度信息。近年来，可编程LED阵列、LCD显示屏等新型光源被引入显微成像系统，使得照明方式的灵活可调，新的采用不对称照明的差分相衬成像方式被提出，例如，田磊等在2015年提出了差分相衬成像定量相位成像技术，成功利用差分相衬成像技术实现了样品定量相位的求解(Tian L,Waller L.Quantitative differential phasecontrast imaging in an LED array microscope.Optics express,2015,23(9):11394-11403.)。在基于LED的差分相衬成像方法中，通常采用两轴的不对称半圆型照明图案采集4幅图像，由此计算得到两个轴方向上的差分相衬图像进行相位的求解。由于LED控制的便利性，这样的成像方式使得差分相衬成像在活细胞成像上的优势凸显。但是，半圆型的成像模型得到的相位传递函数存在一定限制，它在最高频率2NA_obj/λ处表现出很弱的传递特性，这导致差分相衬成像的理想最高分辨率难以实现，同时在低频部分，相位传递函数的传递性非常差，往往只能得到对比度非常低的相位结果。为改善差分相衬成像低频相位的传递特性，新的半环型照明下的成像模型被提出(专利申请号：201710660630.5)，但这类照明强度分布均匀的半环型照明对应的系统相位传递函数分布不均匀，在两轴照明的情况下由于部分频率的缺失给相位结果引入了许多的伪影和误差。

为了改善差分相衬成像的相位传递函数，新的照明方式不断被研究以提升差分相衬成像系统相位传递函数的表现特性。一种基于多轴照明实现理想对称的相位传递函数差分相衬方法(Tian L,Waller L.Quantitative differential phase contrast imagingin an LED array microscope.Optics express,2015,23(9):11394-11403.)通过12个不同轴的照明下获得了各向同性的相位传递函数，弥补了频率的缺失。虽然这种多轴的方法可以获得各向同性的相位传递函数，但是低频部分的传递仍然受到限制，无法获得较高的对比度。不仅如此，12轴照明大大增加了采集图像的数量，这将对差分相衬成像速度产生阻碍。为了在更少照明轴的情况下获得各向同性的相位传递函数，一种新的径向照明的差分相衬成像方法(Yu-Zi Lin；Kuang-Yuh Huang andYuan Luo.Quantitative differentialphase contrast imaging at high resolution with radially asymmetricillumination.Optics Letters,2018,43(12):2973-2976.)通过采用径向分布的随角度线性变化的照明图案，在3轴照明的情况下获得了各向同性的相位传递函数。这大大缩减了目前各项同性相位传递函数需要的采集图像数量，不过该方法仅仅给出了优化的照明方式，轻微的提升了相位恢复的结果。并且该径向照明方法所得相位传递函数虽然是各项同性的，但是其低频部分成像表现仍然非常差，低频相位无法恢复的问题仍然存在于差分相衬成像中。为了在两轴的情况下实现各向同性的相位传递函数，有人提出一种新的嵌入振幅梯度掩码对照明进行编码，近似的得到了各向同性的相位传递函数(Chen Hsi-Hsun；LinYu-Zi；Luo Yuan.Isotropic differential phase contrast microscopy forquantitative phase bio-imaging.Journal ofbiophotonics,2018,e201700364)。不过该方法的推导过程中将光源和光瞳函数模型表达为与实际情况不同的高斯模型，各向同性的结论并不严格。同时，相位低频信息缺失的问题仍然没有得到解决。总之，严格各向同性相位传递函数对应的最优照明图案在目前现有技术中仍然没有能够获得。

发明内容

本发明的目的在于提供一种最优照明模式下的实时动态、高正确率、高分辨率差分相衬定量相位显微成像方法，以解决差分相衬定量相位成像中相位成像结果部分频率信息缺失严重、成像速度缓慢、系统对噪声敏感等问题。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法，过程如下：

步骤一，最优照明图案设计：首先推导得出差分相衬定量相位成像中各向同性相位传递函数所对应的照明图案，即为最优照明图案，具体是推导得到的最优照明图案形状为照明数值孔径NA_ill与系统用物镜数值孔径NA_obj相等的半环形图案，设物镜的数值孔径为NA_obj，该照明环上的单颗LED与中心点的间距为d，由单颗LED发出的光线与光轴的夹角为α_i，则由该环形图案上的LED照明时得到的照明NA_ill满足下式：

推导得到的最优照明图案照明强度分布以方向轴为起点随照明角度余弦变化，极坐标下表达式为：

S(θ)＝cos(θ)

其中，夹角θ按顺时针方向增大；

步骤二，最优照明下原始图像采集：采用电脑控制液晶显示屏LCD或高密度可编程LED阵列显示两轴照明情况下的四幅最优照明图案，并产生同步触发信号至相机，在每幅图案下采集一幅样品图像，共采集四幅原图像，分别记为I_l、I_r和I_u、I_d，其中I_l、I_r代表左右轴方向上的两幅图像，I_u、I_d代表上下轴方向上的两幅图像；

步骤三，相差图像计算：根据差分相衬成像计算公式，计算得到最优照明下样品在左右轴方向上的强度相差图像以及上下轴方向上的强度相差图像

步骤四，最优照明模式对应的相位传递函数计算：基于弱相位近似条件，推导最优照明图案差分相衬成像系统中两个轴方向的相位传递函数PTF_lr(u)、PTF_ud(u)；

步骤五，对样品定量相位的求解：利用求得的两轴相位传递函数和对应的样品相差图像，在Tikhonov准则下进行反卷积计算，得到最终要求的定量相位结果，完成整套最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像。

与现有技术相比，本发明所述方法具有以下突出优势：(1)从相位成像结果的正确性及信息完整性来看，本发明所设计并采用的最优照明图案对应的相位传递函数呈各向同性。在极坐标系中，令r_a为相位传递函数中任一点a到中心点的距离，r_NA为部分相干成像的在频域中的极限频率到中心点的距离，那么得到左右方向的相位传递函数为：

上下方向的相位传递函数为：

得到它们的强度分布为：

可以看到相位传递函数的强度分布中各频率成分的传递表现与角度无关，仅与频率对应的半径相关，这使得差分相衬定量相位成像的相位传递特性得到了均匀的增强。与传统的半圆型照明方案比较，不仅最高频率相位的传递表现得到增强，同时相位的低频成分也可被有效恢复，保证了相位恢复结果的正确性、信息完整性和高分辨率。(2)从成像速度来看，通过最优照明模式的设计，我们将得到各向同性相位传递函数需要的照明光轴数量减少到了最小的两轴照明，大大减少了差分相衬定量相位成像所需采集图像的数量，保证了成像的速度，使其获得实时动态的高分辨率的定量相位成像效果。(3)从对噪声的敏感性来看，通过最优照明图案的设计，相位传递函数的低频及高频值都得到了极大增强，基本不存在零值。这使得成像结果对噪声不敏感，可基本不考虑正则化因素，与传统方法需要一个合适的正则化参数β不同，最优照明在有噪声的情况下基本不需要考虑正则化就可以得到对噪声不敏感的结果，正则化参数β可取极小值或零值。(4)从实现过程来看，最优照明图案的设计不仅保证了差分相衬定量相位成像的信息完整性，对于成像过程中获取到的非定量差分相衬图像，不同于均匀光强照明下的计算结果，其在各个方向上的衬度也将整体得到加强。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1基于最优照明模式设计下差分相衬定量相位显微成像方法的流程图。

图2为不同孔径照明下相位传递函数的仿真结果，2(a1)、2(a2)、2(a3)所示为不同角度下的单个照明模式，2(b1)、2(b2)、2(b3)是对应的相位传递函数；2(c1)、2(c2)、2(c3)、2(c4)、2(c5)、2(c6)所示为不同的DPC照明模式，2(d1)、2(d2)、2(d3)、2(d4)、2(d5)、2(d6)是对应的相位传递函数。

图3为最优照明下照明光源的强度分布在极坐标下的模型。

图4为四种照明模式下对差分相衬定量相位成像相位传递函数的仿真结果。4(a1)、4(a2)、4(a3)、4(a4)分别表示传统半圆形照明、径向照明、振幅梯度掩码照明以及最优照明四种照明模式；4(b1)、4(b2)、4(b3)、4(b4)为各照明模式对应的上下方向上的相位传递函数；4(c1)、4(c2)、4(c3)、4(c3)为左右方向上的相位传递函数；4(d1)、4(d2)、4(d3)、4(d4)为上下、左右两轴方向上相位传递函数的强度分布；4(e1)、4(e2)、4(e3)、4(e4)为各照明模式对应的相位传递函数中半径在NA、和五个频率位置处的强度分布曲线图。

图5为四种照明模式下选择不同的正则化参数β抑制系统噪声，对差分相衬定量相位成像结果的仿真。5(a1)、5(a2)、5(a3)、5(a4)分别表示β取0时传统半圆形照明、径向照明、振幅梯度掩码照明以及最优照明四种照明模式下对噪声图像计算获得的定量相位结果；5(b1)、5(b2)、5(b3)、5(b4)表示β取0.1时获得的定量相位结果；5(c1)、5(c2)、5(c3)、5(c4)表示β取0.2时获得的定量相位结果；5(d)表示各照明模式获得的定量相位结果在不同频率位置处的分布曲线图。

图6为在10倍物镜下，对未染色Hela细胞在最优照明模式设计下进行差分相衬定量相位成像的最终相位成像结果。

具体实施方式

本发明基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法所依赖的实际硬件平台是基于高密度可编程LED阵列或液晶显示屏LCD照明的显微成像系统。整个系统包括图像采集用的工业相机、显微物镜、样片、载物台、可编程LED阵列或LCD显示屏作为显微镜照明光源，其被安置在样品载物台下方，与载物台的上表面间距H通常在20-100mm之间，中心处于显微系统的光轴上。LED阵列或LCD显示屏中包括若干个点光源，它们规则排布形成一个二维矩阵。每个点光源均可进行红、绿、蓝三通道照明，典型波长为红光635nm、绿光525nm和蓝光475nm。每个点光源之间中心间距d典型值1-10mm，LED阵列或LCD显示屏通过固定基板实现位置的固定。

若使用LED阵列进行系统照明，则驱动LED阵列以点亮其中每个点光源的实现电路可采用单片机、ARM、或者可编程逻辑器件等现有技术，具体实现方法可参考相关文献(郭宝增,邓淳苗：基于FPGA的LED显示屏控制系统设计[J].液晶与显示,2010,25(3):424-428)。

若使用LCD显示屏进行系统照明，则需要显微镜自带的卤素灯等光源在显示屏底部提供辅助照明以保证照明亮度，使用LCD替换原显微镜中聚光镜下的孔径光阑，通过在显示屏上显示不同亮度、色彩、形状的图像作为系统的空间光滤波器，驱动电路所采用的技术同LED阵列基本无异，具体实现方法可参考相关文献201510631692.4。

结合图1，本发明基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法的步骤如下：

步骤一，最优照明图案设计

对于差分相衬定量相位成像最优照明模式的设计，就是要推导各向同性相位传递函数所对应的照明图案。由于采用该照明图案进行照明时，各频率成分的相位信息均可被完整传递，因此称其为最优照明图案。对于最优照明图案的设计可分为以下两大步骤，分别为最优照明形状的确定以及照明强度分布的确定。

(1)差分相衬定量相位成像最优照明图案的形状由以下推导过程确定：

首先确定最优照明图案的外径即最大照明角度。为探究照明图案与相位传递函数间的关系，对不同孔径照明下对应的系统相位传递函数进行仿真。如图2(a1)-(a3)所示为不同角度下的单颗LED照明模式，图2(b1)-(b3)是对应的相位传递函数。可以看到，随着照明角度的增大，其对应的相移量不断增大，相位传递函数中的重合抵消区域越来越小。当最大照明角度确定的照明数值孔径与物镜数值孔径相等时，传递函数中的两个孔径相切。此时，传递函数的低频部分将具有最优的传递特性。

在此基础上进一步确定最优照明图案的内径。采用多种不同的差分相衬照明模式，如图2(c1)-(c6)所示，并求解相位传递函数，得到的相位传递函数显示在图2(d1)-(d6)。可以看到，随着半圆型照明半径的增加[图2(c1)-(c3)]，相位传递函数的数值覆盖面积越来越大，这说明相位传递特性越来越优。在半圆型照明传递函数中，大部分低频成分的数值为0，这使得其在低频部分的对比度很差。如图2(c4)-(c6)所示，环形照明下相位传递函数具有更好的低频成像表现。且当照明图案为与物镜NA相切的环形时，相位传递函数具有更大的进步，尤其是在低频部分。在这种照明模式下，任一照明角度产生的相位传递函数均没有重合抵消，最终得到的相位传递函数在低频部分表现出好的传递特性，其相位结果的低频对比度将得到大大的增强。不仅如此，高频部分的数值也得到了增强，相位分辨率将得到提升。

根据上述内容可以确定，在差分相衬成像中，照明图案的最优形状应为半环形照明，它的照明数值孔径NA_ill应等于系统用物镜数值孔径NA_obj。任何照明强度分布在采用这样的半环形照明时，其传递特性都会得到增强。由此确定，若差分相衬定量相位成像所采用的物镜数值孔径为NA_obj，最优照明图案采用的半环形图案LED距离中心点的间距为d，LED与样品的距离为h，单个LED发出的光线与光轴的夹角为α_i。推导得到的各向同性相位传递函数对应的最优照明图案应为照明数值孔径NA_ill与系统用物镜数值孔径NA_obj相等的半环形照明图案，即半环形照明的LED满足：

(2)最优照明图案的强度分布确定过程如下：

在极坐标中，定义单个轴方向上的相位传递函数为PTF(r,θ)，其中，r表示相位传递函数中某一点到中心点的距离，θ表示该点与轴方向的夹角。在两轴照明的情况下要求相位传递函数的强度分布满足各向同性的要求，则要求满足下面公式：

|PTF_lr(r,θ)|²+|PTF_ud(r,θ)|²＝C_r

这里的PTF_lr(u)和PTF_ud(u)分别表示左右轴方向和上下轴方向上的相位传递函数。C_r是只与r相关的常数。上述公式可以看作同心圆的表达公式，要求相位传递函数在某一固定半径上的任何角度具有相同的值。

在极坐标下，相位传递函数为周期函数，所以对PTF(r,θ)傅里叶级数展开，得到下面的表达式：

上式中的a_n和b_n是系数项，与r、θ无关，n为任意的正整数。要满足|PTF_lr(r,θ)|²+|PTF_ud(r,θ)|²＝C_r，则|PTF_lr(r,θ)|²和|PTF_ud(r,θ)|²不能产生任何交叉项，得到PTF_lr(r,θ)的表达式如下所示：

PTF_lr(r,θ)＝a_ncos(nθ)

或PTF_lr(r,θ)＝b_nsin(nθ)

差分相衬成像中两个照明方向互相垂直，所以两个轴对应的相位传递函数相差所以当PTF_lr(r,θ)＝a_ncos(nθ)，可以得到PTF_ud(r,θ)＝b_nsin(nθ)。当PTF_lr(r,θ)＝b_nsin(nθ)，可以得到PTF_ud(r,θ)＝a_ncos(nθ)。

为了方便推导，建立了一个新的模型对相位传递函数的计算过程进行表示，如图3所示。采用与物镜NA相等照明角度的光源进行照明，光源的强度分布表示为S(θ)。那么在极坐标系中，要求S(θ)必须满足三个约束条件：(a)S(θ)是关于方向轴的偶函数；(b)S(θ)是关于夹角θ的周期函数；(c)S(θ)关于点 点对称。

相位传递函数中任一点a的值可以由图中红色弧线对应的照明强度对圆心角进行积分得到：

这里α表示红色弧线对应的圆心角的一半。r_a为a点与中心点的距离，r_NA为物镜光瞳对应的距离。

可以求得：

S(θ)＝k_ncos(nθ)

其中，k_n为任意的常数。由此可见，最优照明图案是照明光强随着照明角度余弦变化的环形照明光。在相位恢复的过程中，一般采用Tikhonov准则来实现反卷积求解，考虑到过零点的问题，最优的照明图案的强度分布应该确定为：

S(θ)＝cos(θ)

其中，夹角θ按顺时针方向增大。

步骤二，最优照明下原始图像采集

采用电脑控制液晶显示屏LCD或高密度可编程LED阵列显示两轴照明情况下的四幅最优照明图案，并产生同步触发信号，在每幅图案下采集一幅样品图像，共采集四幅原图像，分别记为I_l、I_r和I_u、I_d，其中I_l、I_r分别代表左右轴方向上采集到的两幅强度图像，I_u、I_d分别代表上下轴方向上采集到的两幅强度图像。

可利用液晶显示屏LCD或者高密度LED阵列产生最优照明图案，在基于LCD显示屏的系统中，照明系统由系统光源和LCD显示屏两部分构成，此时LCD实现对照明图案的调制作用；在基于LED系统中，照明光源直接为LED阵列，电脑控制使LED显示最优照明图案即可。

步骤三：强度相差图像计算

根据差分相衬成像计算公式，计算得到最优照明下样品在左右轴方向上的强度相差图像以及上下轴方向上的强度相差图像

步骤四，最优照明模式对应的相位传递函数计算

基于弱相位近似条件，推导最优照明图案差分相衬成像系统中两个轴方向的相位传递函数PTF_lr(u)，PTF_ud(u)。

差分相衬成像这样的复杂部分相干照明下，采集的图像强度分布可以看作不同角度下照明强度的线性叠加，所以可以将复杂照明分解成不同角度下的照明来进行分析。对复传播函数为t(r)＝e^-A(r)+iφ(r)的薄的纯相位样品进行成像，单个角度的倾斜照明光表示为S(u_j)，其中r＝(x,y)表示样品平面的坐标，φ(r)代表样品的相位，u_j代表单个角度照明光源在频域对应的相移量。为了将样品相位和强度可以独立的进行分析，对样品的复振幅分布采用弱相位近似，得到t(r)≈1+a(r)+iφ(r)。那么，相机平面上的复振幅分布的傅里叶变换表示为：

这里的u表示频域的频率分量，A(u)表示样品振幅在频域内的分布，Φ(u)表示样品相位在频域的分布。P(u)表示物镜在傅里叶平面上的光瞳函数，相当于低通滤波的作用，仅使物镜数值孔径以内的频率成分被收集到。那么，单个角度倾斜照明下相机采集的强度图像的频谱分布可以由W_j(u)和它的共轭项W_j*(u)进行卷积得到：

计算复杂照明下频率域的强度分布，忽略计算过程的高阶卷积项，强度谱分布可以被分为三项，表示为：

I(u)＝Bδ(u)+A(u)ATF(u)+iΦ(u)PTF(u)

B代表背景项，表示为B＝∫∫S(u_j)|P(u_j)|²d²u_j，A(u)为样品的振幅谱分布，Φ(u)为样品的相位谱分布，ATF(u)表示振幅传递函数，PTF(u)表示相位传递函数。

那么可以得到复杂照明下相位的频率响应由相位传递函数来表征：

PTF(u)＝∫∫S(u_j)[P^*(u_j)P(u+u_j)-P(u_j)P^*(u-u_j)]d²u_j

这是复杂照明下振幅传递函数和相位传递函数的通用表达式，适应于所有的照明模式和光瞳函数。

差分相衬成像一般采用上下和左右两个轴方向上的不对称照明图案成像，这样的倾斜照明引入了相位因子，将不可见的样品相位转换为可测量的强度。一个简单的差分计算过程被用来突出样品的相位差异，在这样的计算模型下，差分相衬成像的相位传递函数表示为：

这里的PTF_lr(u)表示左右轴方向上的相位传递函数，S_l(u_j)表示左方向上的照明光源强度。上下方向上的相位传递函数PTF_ud(u)推导过程同上，只需将式中的照明强度项替换为上或下方向上的照明光强。

在最优照明模式下，差分相衬成像的相位传递函数各向同性。即在极坐标系中，令r_a为相位传递函数中任一点a到中心点的距离，r_NA为部分相干成像的在频域中的极限频率到中心点的距离，那么左右方向的相位传递函数可表示为：

上下方向的相位传递函数为：

得到它们的强度分布为：

可以看到相位传递函数的强度分布中各频率成分的传递表现与角度无关，仅与频率对应的半径相关，数值呈现为一系列的同心圆分布，相位传递呈各向同性。

步骤五，对样品定量相位的求解

利用步骤四中求得的两轴相位传递函数PTF_lr(u)、PTF_ud(u)，和步骤三中求得的样品强度相差图像I_lr、I_ud，采用Tikhonov准则进行反卷积计算，得到最优照明下样品的定量相位成像结果：

这里的φ(r)即为本方法最终要求得到的样品定量相位结果，至此已完成整套最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像。

上式中正则化参数β是用来抑制相位传递函数中近似0的数值可能被过度放大带来的误差。在最优化照明模式下，由于相位传递函数在部分相干成像范围(2NA_obj)内数值都得到了极大增强，特别是低频部分仅有极少的零值，因此采用Tikhonov准则计算时，不需要考虑正则化参数就可以得到抗噪声的定量相位结果，正则化参数通常取极小值或零值。

为了验证最优照明模式下差分相衬定量相位成像的效果，我们对四种不同照明方案下的成像过程进行了仿真。如图4所示，图4(a1)-(a4)分别表示传统半圆形照明、径向照明、振幅梯度掩码照明以及最优照明四种照明模式，图4(d1)-(d4)为各照明模式对应的上下、左右两轴方向上相位传递函数的强度分布。可以明显地看出，最佳照明下的相位传递函数具有最大的频率覆盖区域，且其在频率为2NA_obj区域的相位传递性得到了显著的增强。观察前三种照明模式下获得的相位传递函数，4(d1)-(d3)在低频区域存在大量的零值，这会导致成像结果的低频分量对比度较差，而4(d4)所示最优照明下相位传递函数的低频分量得到了明显的增强，这将显著提升低频相位的传递特性。此外，半圆形照明和径向照明下相位传递函数的频率分布不满足各向同性，振幅梯度掩码照明和最优照明下则可获得对称的、各向同性的相位传递函数。为定量地分析各模式所对应相位传递特性，我们在相位传递函数中选择半径在NA、和五个频率位置处的强度值，以此来绘制图4(e1)-(e4)中的强度曲线图。从中可以看到，对于几乎所有频率分量，最优照度对应的相位传递函数强度值最大，这意味着其对几乎所有频率的相位具有最佳的传递特性。这一仿真结果说明本文提出的最优照明方案有效地避免了差分相衬定量相位成像频率成分的缺失，可以最完整地恢复出样品在各频率下的定量相位。

为了进一步模拟最优照明模式在真实系统中的成像表现，我们在差分相衬定量相位成像的仿真过程中，对四种照明模式下的原始图像加入了相同水平的高斯噪声，以模拟相机在实际情况中拍摄到的图像。上文中提到，在Tikhonov准则下进行反卷积计算定量相位的过程中，正则化参数β用于抑制系统噪声。图5(a1)-(a4)表示β取0时不同照明模式下对噪声图像获得的定量相位计算结果。由于相位传递函数中低频区域存在大量的零值，因此半圆形照明，径向照明和振幅梯度掩码照明下的图像噪声在反卷积过程中被进一步放大，造成相位结果严重的失真。然而，在最优照明模式下，图5(a4)所示的相位结果对噪声不敏感，基本不存在失真。接着我们在反卷积过程中选择不同的正则化参数β来抑制成像过程中的噪声影响，如图5(b1)-(b3)和图5(c1)-(c3)所示，前三种照射模式下成像结果的噪声虽然得到了一定的抑制，但低频相位依然很难被正确恢复。为获得更真实的相位结果，必须选择更合适的正则化参数。然而，正则化参数的确定通常没有可靠的理论基础，只能通过经验来判断，不断试验最佳的正则化参数将耗费许多的时间及人力。而在最佳照明下该问题得到了解决，从图5(a4)、5(b4)、5(c4)可以看出，采用最优照明可在各个不同的正则化参数下获得同样理想的成像结果。综上所述我们可以得出结论，最优照明模式下的差分相衬定量相位成像不仅可以获得更好的图像对比度和更高的成像分辨率，而且还具有更理想的抗噪声特性。且与传统方法不同，在采用Tikhonov准则计算时，不需要考虑正则化参数即可得到良好的、抗噪声的定量相位结果。

最后我们通过一组实验验证最优照明模式下差分相衬定量相位成像的成像性能，选取的观测对象为未染色Hela细胞，HeLa细胞作为第一个成功实现室体外增殖的人类细胞系，被世界各地的研究人员广泛使用并积累了大量的实验数据，这使得我们对其观测结果更容易找到参照。我们在十倍物镜下完成对其相位的计算恢复。如图6所示，在最终求得的定量相位图像中，各个方向上的相位分辨率分布均匀且维持在较高水平，表明最优照明模式下差分相衬定量相位成像的相位传递性呈现各向同行。通过局部放大观察可以进一步发现，图中单个Hela细胞的细胞核以及囊泡部分均清晰可见，表明高频相位信息可被精准恢复；在正则化参数β取零的条件下图像背景仍十分均匀，几乎不会收到雾状的低频噪声影响，表明相位的低频成分也可以被正确恢复，并保持良好的图像信噪比。

Claims (6)

1.一种基于最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像方法，其特征在于过程如下：

步骤一，最优照明图案设计：首先推导得出差分相衬定量相位成像中各向同性相位传递函数所对应的照明图案，即为最优照明图案。具体是得到的最优照明图案形状为照明数值孔径NA_ill与系统用物镜数值孔径NA_obj相等的半环形图案，设物镜的数值孔径为NA_obj，该照明环上的单颗LED与中心点的间距为d，由单颗LED发出的光线与光轴的夹角为α_i，则由该环形图案上的LED照明时得到的照明NA_ill满足下式：

得到的最优照明图案照明强度分布以方向轴为起点随照明角度余弦变化，极坐标下表达式为：

S(θ)＝cos(θ)

其中，夹角θ按顺时针方向增大；

步骤二，最优照明下原始图像采集：采用电脑控制液晶显示屏LCD或高密度可编程LED阵列显示两轴照明情况下的四幅最优照明图案，并产生同步触发信号至相机，在每幅图案下采集一幅样品图像，共采集四幅原图像，分别记为I_l、I_r和I_u、I_d，其中I_l、I_r代表左右轴方向上的两幅图像，I_u、I_d代表上下轴方向上的两幅图像；

步骤三，相差图像计算：根据差分相衬成像计算公式，计算得到最优照明下样品在左右轴方向上的强度相差图像以及上下轴方向上的强度相差图像

步骤四，最优照明模式对应的相位传递函数确定：最优照明模式对应的相位传递函数PTF_lr(u)、PTF_ud(u)呈各向同性，即在极坐标系中，令r_a为相位传递函数中任一点a到中心点的距离，r_NA为部分相干成像的在频域中的极限频率到中心点的距离，那么得到左右方向的相位传递函数为：

上下方向的相位传递函数为：

得到它们的强度分布为：

步骤五，对样品定量相位的求解：利用求得的两轴相位传递函数和对应的样品相差图像，在Tikhonov准则下进行反卷积计算，得到最终要求的定量相位结果，完成整套最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤一中最优照明图案的强度分布确定过程如下：

在极坐标中，定义单个轴方向上的相位传递函数为PTF(r,θ)，其中，r表示相位传递函数中某一点到中心点的距离，θ表示该点与轴方向的夹角，在两轴照明的情况下要求相位传递函数的强度分布满足各向同性的要求，则要求满足下面公式：

|PTF_lr(r,θ)|²+|PTF_ud(r,θ)|²＝C_r

这里的PTF_lr(u)和PTF_ud(u)分别表示左右轴方向和上下轴方向上的相位传递函数；C_r是只与r相关的常数；

在极坐标下，相位传递函数为周期函数，所以对PTF(r,θ)傅里叶级数展开，得到下面的表达式：

上式中的a_n和b_n是系数项，与r、θ无关，n为任意的正整数，要满足|PTF_lr(r,θ)|²+|PTF_ud(r,θ)|²＝C_r，则|PTF_lr(r,θ)|²和|PTF_ud(r,θ)|²不能产生任何交叉项，得到PTF_lr(r,θ)的表达式如下所示：

PTF_lr(r,θ)＝a_ncos(nθ)

或PTF_lr(r,θ)＝b_nsin(nθ)

差分相衬成像中两个照明方向互相垂直，所以两个轴对应的相位传递函数相差所以当PTF_lr(r,θ)＝a_ncos(nθ)，得到PTF_ud(r,θ)＝b_nsin(nθ)，当PTF_lr(r,θ)＝b_nsin(nθ)，得到PTF_ud(r,θ)＝a_ncos(nθ)；

采用与物镜NA相等照明角度的光源进行照明，光源的强度分布表示为S(θ)，那么在极坐标系中，S(θ)满足三个约束条件：(a)S(θ)是关于方向轴的偶函数；(b)S(θ)是关于夹角θ的周期函数；(c)S(θ)关于点点对称；

相位传递函数中任一点a的值由图中红色弧线对应的照明强度对圆心角进行积分得到：

α表示红色弧线对应的圆心角的一半，r_a为a点与中心点的距离，r_NA为物镜光瞳对应的距离，求得：

S(θ)＝k_ncos(nθ)

其中，k_n为任意的常数，最优照明图案是照明光强随着照明角度余弦变化的环形照明光；

在相位恢复的过程中，考虑到过零点的问题，最优的照明图案的强度分布应该确定为：

S(θ)＝cos(θ)

其中，夹角θ按顺时针方向增大。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤二中，可利用液晶显示屏LCD或者高密度LED阵列产生最优照明图案，在基于LCD显示屏的系统中，照明系统由系统光源和LCD显示屏两部分构成，此时LCD实现对照明图案的调制作用；在基于LED系统中，照明光源直接为LED阵列，电脑控制使LED显示最优照明图案即可。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤四中，对复传播函数为t(r)＝e^-A(r)+iφ(r)的薄的纯相位样品进行成像，单个角度的倾斜照明光表示为S(u_j)，其中r＝(x,y)表示样品平面的坐标，φ(r)代表样品的相位，u_j代表单个角度照明光源在频域对应的相移量；为了将样品相位和强度独立的进行分析，对样品的复振幅分布采用弱相位近似，得到t(r)≈1+a(r)+iφ(r)；那么，相机平面上的复振幅分布的傅里叶变换表示为：

u表示频域的频率分量，A(u)表示样品振幅在频域内的分布，Φ(u)表示样品相位在频域的分布，P(u)表示物镜在傅里叶平面上的光瞳函数；单个角度倾斜照明下相机采集的强度图像的频谱分布由W_j(u)和它的共轭项W_j ^*(u)进行卷积得到：

计算复杂照明下频率域的强度分布，忽略计算过程的高阶卷积项，强度谱分布被分为三项，表示为：

I(u)＝Bδ(u)+A(u)ATF(u)+iΦ(u)PTF(u)

B代表背景项，表示为B＝∫∫S(u_j)|P(u_j)|²d²u_j，A(u)为样品的振幅谱分布，Φ(u)为样品的相位谱分布，ATF(u)表示振幅传递函数，PTF(u)表示相位传递函数；

得到复杂照明下相位的频率响应由相位传递函数来表征：

PTF(u)＝∫∫S(u_j)[P^*(u_j)P(u+u_j)-P(u_j)P^*(u-u_j)]d²u_j

这是复杂照明下振幅传递函数和相位传递函数的通用表达式，适应于所有的照明模式和光瞳函数；

差分相衬成像采用上下和左右两个轴方向上的不对称照明图案成像，这样的倾斜照明引入了相位因子，将不可见的样品相位转换为可测量的强度，一个简单的差分计算过程被用来突出样品的相位差异，在计算模型下，差分相衬成像的相位传递函数表示为：

PTF_lr(u)表示左右轴方向上的相位传递函数，S_l(u_j)表示左方向上的照明光源强度，上下方向上的相位传递函数PTF_ud(u)推导过程同上，将式中的照明强度项替换为上或下方向上的照明光强；

在最优照明模式下，差分相衬成像的相位传递函数各向同性，即在极坐标系中，令r_a为相位传递函数中任一点a到中心点的距离，r_NA为部分相干成像的在频域中的极限频率到中心点的距离，左右方向的相位传递函数可表示为：

上下方向的相位传递函数为：

得到它们的强度分布为：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤五中，利用步骤四中求得的两轴相位传递函数PTF_lr(u)、PTF_ud(u)，和步骤三中求得的样品强度相差图像I_lr、I_ud，采用Tikhonov准则进行反卷积计算，得到最优照明下样品的定量相位成像结果：

φ(r)即为最终要求得到的样品定量相位结果，至此已完成最优照明模式设计下的差分相衬定量相位显微成像。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在Tikhonov准则下求解样品定量相位时，正则化参数β通常取极小值或零值。