CN114296228B - 一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，该方法别对待测物体拍摄环形照明和非相干科勒照明下的两张强度图，将两张图像通过空域分割，频域加权两个步骤进行融合。相比传统非相干照明，具有更高的成像分辨率和更好的成像效果；相比将聚光镜照明数值孔径开到最大时的科勒照明，具有更大的成像景深。

Description

一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术，具体涉及一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法。

背景技术

在照明光一定的情况下，显微镜的光学分辨率由物镜的数值孔径决定，所以要想对物体看的越精细，就需要越大数值孔径的物镜。然而瑞利判据下的光学分辨率截止频率只是人眼直接观察的分辨率极限，并不是光学成像系统的理论分辨率极限。光学系统的理论分辨率极限（Katsumasa Fujita, Follow-up review: recent progress in thedevelopment of super-resolution optical microscopy[J],Microscopy, Volume 65,Issue 4, August 2016, 275–281）为：

其中，为照明光源的数值孔径，当物镜数值孔径/>较小时，/>通常与相等，此时光学系统的理论分辨率极限/>为：

但是光学成像系统往往并不能达到其理论分辨率极限，原因是光学成像系统对信息的传递能力随着频率的升高而衰减，到截止频率附近衰减到0，会导致一定范围内的高频信息被淹没在噪声中。所以光学成像系统的分辨率难以达到理论分辨率极限的问题亟待解决。

另一方面，使用高数值孔径NA的物镜尽管能提升成像系统的光学分辨率，但是会带来另一个问题：成像系统的景深被缩小了，这对于观察具有一定厚度的待测样品是相当不利的。这是因为大角度的照明光会将离焦面的相位信息也传递到成像面，造成离焦的效果（Chao Zuo, Transport of intensity equation: a tutorial[J],Optics and Lasersin Engineering, Volume 135,2020, 106-187）。这时往往需要通过减小聚光镜的照明数值孔径NA来提高成像景深，但这样又会导致成像分辨率的降低。所以对于具有厚度的样品而言，成像分辨率和成像景深是不可兼得的。

发明内容

本发明公开了一种基于混合照明模式的高分辨率显微成方法，用于解决传统科勒照明下，成像景深与分辨率无法兼顾的问题。

本发明的技术方案如下：一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，步骤如下：

步骤一. 采集原始图像，分别对待测样品使用环形照明和科勒照明，拍摄两种照明模式下的光强图，以及不放置待测样品时的两张背景光强图/>；

步骤二. 对原始图像进行预处理，根据背景光强图对/>进行光强归一化处理得到/>；

步骤三. 对进行空域分割，得到/>；

步骤四. 对两张光强图进行频域加权相加融合，得到融合后的光强图/>；

步骤五. 对融合后的光强图进行反卷积得到/>。

优选的，步骤一中，环形照明所使用的照明环外径为R，内径为r，照明环外径照明数值孔径为，内径照明数值孔径为/>，显微物镜的数值孔径为，照明光源距离待测样品的高度为h，且必须满足/>，内径照明数值孔径/>的典型范围为/>。

优选的，步骤二中，对光强图的亮度进行归一化的公式为：

其中，是处理后的光强图，/>是对括号内图像求取平均值，/>为图像亮度控制系数，典型范围为(0.7,0.9)。

优选的，步骤三具体为：

首先，求取灰度值分布差异的特性图/>，/>；

然后，求取分割掩膜，公式为：

其中为图像分割的阈值参数，建议取值范围为(0.05,0.1)；

最后，进行空域分割得到/>，/>。

优选的，步骤四具体为：

首先，求取混合照明模式下，两种照明模式对应的传递函数，公式为：

其中，是物镜的相干传递函数，公式为：

是极坐标系表示下频域的极径分量，/>是照明光波长，/>是物镜数值孔径，circ为圆函数，

和/>是环形照明和科勒照明两种照明模式下的照明函数，/>的计算公式为：

为环形照明使用的照明环内外径所对应的照明光空间频率大小，计算公式为：

的计算公式为：

然后，求取融合截止频率，/>满足

，/>，/>；

再，求取融合加权函数，/>的计算公式为：

其中为常数，典型取值范围为(15,25)，/>的计算公式为：/>；

最后，根据求取的加权函数，对/>两张光强图进行频域加权融合，公式为：

其中，是傅里叶变换，/>是傅里叶逆变换。

优选的，步骤五中，反卷积公式为：

其中，是/>做傅里叶变换后的频谱，/>是正则化参数，典型取值范围为(0.01,0.03)。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：（1）相比传统非相干照明，具有更高的成像分辨率和更好的成像效果。（2）相比将聚光镜照明数值孔径开到最大时的科勒照明，具有更大的成像景深。

附图说明

图1是本发明实施例基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法流程图。

图2是本发明实施例中科勒照明成像结果。

图3是本发明实施例中环形照明成像结果。

图4是本发明实施例中等效传递函数与科勒照明传递函数对比图。

图5是传统非相干照明下的成像结果。

图6是本发明实施例的成像结果。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本实施例是一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，步骤如下：

步骤一：原始图像采集，分别对待测样品使用环形照明和科勒照明，拍摄两种照明模式下的光强图，以及不放置待测样品时的两张背景光强图/>。环形照明所使用的照明环外径为R，内径为r，照明环外径照明数值孔径为/>,内径照明数值孔径为/>显微物镜的数值孔径为/>，照明光源距离待测样品的高度为h，且必须满足/>，内径照明数值孔径/>的典型范围为/>。

步骤二：对原始图像进行预处理，根据背景光强图对/>进行光强归一化处理得到/>。

对光强图的亮度进行归一化的公式为：

其中，是处理后的光强图，/>是对括号内图像求取平均值，/>为图像亮度控制系数，典型范围为(0.7,0.9)。

步骤三：对进行空域分割，得到/>。

首先，求取灰度值分布差异的特性图/>，公式为：

然后，求取分割掩膜，公式为：

其中为图像分割的阈值参数，建议取值范围为(0.05,0.1)。

最后，进行空域分割得到/>为：

步骤四：对两张光强图进行频域加权相加融合，得到融合后的光强图/>。

首先，求取混合照明模式下，两种照明模式对应的传递函数，

其中，是物镜的相干传递函数，公式为：

是极坐标系表示下频域的极径分量，/>是照明光波长，/>是物镜数值孔径，circ为圆函数。

和/>是环形照明和科勒照明两种照明模式下的照明函数，/>的计算公式为：

为环形照明使用的照明环内外径所对应的照明光空间频率大小，计算公式为：

的计算公式为：

求取融合截止频率。/>满足

，/>，/>；

接着，求取融合加权函数。/>的计算公式为：

其中为常数，典型取值范围为(15,25)，

的计算公式为：/>。

最后，最后，根据求取的加权函数，对/>两张光强图进行频域加权融合，

步骤五：对融合后的光强图进行反卷积得到/>。反卷积公式为：

其中，是/>做傅里叶变换后的频谱，/>是正则化参数，典型取值范围为(0.01,0.03)。

图2是科勒照明成像结果，图3是环形照明成像结果。可以看到环形照明下图像高频细节的清晰程度明显提升，但是细胞厚度较大的地方离焦现象严重，不能直接作为成像结果。

图4本实施例等效传递函数与科勒照明传递函数对比图，可以看到该方法传递函数在中高频明显高于传统科勒照明。

图5、图6是该方法与传统方法的效果对比图。图5是传统非相干照明下的成像结果，图,6是本实施例的成像结果。可以看到本实施例成像的分辨率与效果要好于传统方法。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种基于混合照明模式的高分辨率显微成像方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一. 采集原始图像，分别对待测样品使用环形照明和科勒照明，拍摄两种照明模式下的光强图 ，以及不放置待测样品时的两张背景光强图/>；

环形照明所使用的照明环外径为R，内径为r，照明环外径照明数值孔径为，内径照明数值孔径为/>，显微物镜的数值孔径为/>，照明光源距离待测样品的高度为h，且必须满足/>，内径照明数值孔径/>的典型范围为/>；

步骤二. 对原始图像进行预处理，根据背景光强图对/>进行光强归一化处理得到/>；

对光强图的亮度进行归一化的公式为：

其中，是处理后的光强图，/>是对括号内图像求取平均值，/>为图像亮度控制系数，典型范围为(0.7,0.9)；

步骤三. 对进行空域分割，得到/>；

步骤三具体为：

首先，求取灰度值分布差异的特性图/>，/>；

然后，求取分割掩膜，公式为：

其中为图像分割的阈值参数，建议取值范围为(0.05,0.1)；

最后，进行空域分割得到/>，/>；

步骤四. 对两张光强图进行频域加权相加融合，得到融合后的光强图；

步骤四具体为：

首先，求取混合照明模式下，两种照明模式对应的传递函数，公式为：

其中，是物镜的相干传递函数，公式为：

是极坐标系表示下频域的极径分量，/>是照明光波长，/>是物镜数值孔径，circ为圆函数，

和/>是环形照明和科勒照明两种照明模式下的照明函数，/>的计算公式为：

为环形照明使用的照明环内外径所对应的照明光空间频率大小，计算公式为：

的计算公式为：

然后，求取融合截止频率，/>满足

，/>，/>；

再，求取融合加权函数，/>的计算公式为：

其中为常数，典型取值范围为(15,25)，/>的计算公式为：/>；

最后，根据求取的加权函数，对/>两张光强图进行频域加权融合，公式为：

其中，是傅里叶变换，/>是傅里叶逆变换；

步骤五. 对融合后的光强图进行反卷积得到/>；

反卷积公式为：

其中，是/>做傅里叶变换后的频谱，/>是正则化参数，典型取值范围为(0.01,0.03)。