CN202548054U - 一种高精度荧光各向异性显微成像装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种高精度荧光各向异性显微成像装置。在反射式荧光显微镜上，光源发出的光通过起偏器、激发滤波片和分光镜后，被显微物镜聚焦于样品上；样品反射的荧光通过物镜、分光镜和发射滤波片后，又通过一个可调角度检偏器，在CCD相机的像平面上成像；计算机控制可调角度检偏器绕成像光路的光轴步进回转，每旋转一个角度，CCD拍摄一帧偏振荧光图像，共计拍摄M幅图像；最后利用傅里叶变换，从M幅图像中计算出荧光各向异性的图像。本实用新型的特点是建立一种单通道荧光检偏光路，使荧光各向异性的测量分辨率大幅度提高，并且该显微成像系统具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。

Description

一种高精度荧光各向异性显微成像装置

技术领域

本实用新型涉及到荧光显微成像的方法和仪器，特别是借助反射式宽场荧光显微镜，对生物样品进行高精度荧光各向异性显微成像的装置。

背景技术

光学显微成像技术可以在样品正常状态下，进行活体细胞的观察，最大程度地保持样品真实环境。但是，由于Abbe原则的限制，因此无法使用常规的宽场显微成像技术对纳米尺度下分子之间相互作用进行研究。荧光各向异性显微成像技术，是基于荧光偏振的光学现象，可以对纳米尺度的荧光分子间的相互作用进行功能成像，信号选择性强，与其他功能显微成像方法比，系统造价低。

荧光各向异性的测量原理如图1所示，通过测得的荧光水平发射光强度和垂直发射光强，计算出荧光分子的偏振度进而推导出荧光各向异性图像                                                

。而在"Imaging lifetime and anisotropy spectra in the frequency domain," in Journal of Microscopy-Oxford. vol. 234, 2009, pp. 80-88所述，采用传统荧光偏振显微成像方法对不同样品进行观测可知：罗丹明6G和59%甘油溶液的光强光谱分布均匀，但是在荧光偏振的荧光各向异性图上，可以明显看出噪声。而对于观察罗丹明6G和50%甘油溶液和670nm的荧光球的一维空间分布光强光谱，从光强光谱上可以明显分辨出各自对应的谱线位置，但是在各向异性光谱上，噪声极其明显，对荧光球位置的辨识有一定的困难。在"Wide-field time-resolved fluorescence anisotropy imaging (TR-FAIM): Imaging the rotational mobility of a fluorophore," in Review of Scientific Instruments. vol. 74, 2003, pp. 182-192中所述，对于CHO 细胞表达erbB1–eGFP荧光图像和各向异性图像谱，在光强度图像上可以分辨细胞的内部细节，而在荧光偏振的各向异性图像上，基本分辨不出细胞的内部细节，预示着现有的荧光各向异性显微成像方法的分辨率还不足于支持对细胞内进行更精细的观测。

发明内容

针对困扰荧光各向异性显微成像分析的“低分辨率难题”，本实用新型提出一种新型高精度荧光各向异性显微成像装置，可以大幅度提高荧光各向异性的偏振参数——各向异性值 r的测量分辨率，并且装置具有更高的稳定性和更好的抗干扰能力。

为解决上述问题，本实用新型提供了以下技术方案：

一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源、透镜组、反射式荧光显微镜、相机、计算机，所述反射式荧光显微镜包括激发滤波片、物镜、分光镜、发射滤波片；所述透镜组和激发滤波片之间包括一个起偏器，发射滤波片和相机之间包括一个可调角度检偏器，相机与计算机连接。

所述起偏器与可调角度检偏器均为线偏振片。

所述激发光源、透镜组以及起偏器组成荧光激发光路，可调角度检偏器、相机组成荧光成像光路。在荧光激发光路中不包含任何光学波片；在荧光成像光路中不包含任何光学波片，在发射滤波片和相机像平面之间的光路中，不包含任何光束分数装置。

所述可调角度检偏器与计算机连接。

所述透镜组由两个透镜组成，相机为CCD相机。

本项实用新型的可调角度检偏器的回转中心与反射荧光光路的光轴中心重合；通过计算机控制线偏振光旋转控制器，每回转一个角度，相机拍下一帧样品反射的荧光显微图像，并将荧光显微图像转换成为显微图像数据，经过图像采集卡送入计算机处理。

一种高精度荧光各向异性显微成像装置的成像方法，包括以下步骤：

1）激发光源发出的照明光通过透镜组转化为高斯光强分布，经线起偏器、激发滤波片、分光镜后，由物镜聚焦于样品上；

2）样品反射的荧光经过物镜、分光镜、发射滤波片及可调角度检偏器后，在相机上成像；

3）可调角度检偏器回转一个角度，相机拍下一帧荧光显微图像，并保存在计算机中；

4）计算可调角度检偏器P2角度变化的光强分布为：

，

；

式中：m 表示第m次采样，

表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，

表示可调角度检偏器的初始相位角，

表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，

表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，

M是相机拍下的图像总帧数；

5）对步骤4）的光强分布进行离散傅里叶变换：

，

，

其中：

为信号频率，m表示第m次采样，

表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，

表示可调角度检偏器的初始相位角，

表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，

表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数；

6）当可调角度检偏器共回转

°时，根据计算机采集到的显微图像数据，计算荧光偏振度显微图像为： 

式中，当频率k取

时，

在频率k>0上取到最大值；；

7）根据荧光偏振度，计算荧光各向异性显微图像为

。

其中荧光激发源发出的照明光为Lambertian分布。

所述步骤3）的可调角度检偏器回转角度由计算机控制的，计算机控制可调角度检偏器的回转角度大小。

所述步骤4）中所述可调角度检偏器每回转一个角度相机拍下一帧图像，相机拍下一帧图像。

CCD相机拍下的样品荧光显微图像通过单通道、可调角度的线偏振检偏通道和傅里叶变换，由计算机计算出荧光各向异性的显微图像，使测量分辨率从 ±0.01提高到 ±0.001。

本发明提出这种新型荧光各向异性显微成像装置和方法，特点是结构简单，荧光各向异性的测量分辨率高。

附图说明

图1为荧光各向异性的测量原理；

图2 为本发明的高精度荧光各向异性显微成像装置的结构简图；

图3 为发明部分偏振光的旋转检偏原理； 

图4 (a) 为可调角度检偏器的旋转角度

与输出光强I(

)之间的关系；

图4(b) 为可调角度检偏器的旋转角度

与输出光强实测误差△I()之间的关系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：

本发明提出的高精度荧光各向异性显微成像装置的结构如图2所示，本装置依次包括激发光源1、透镜组2、反射式荧光显微镜3、相机4、计算机5，在实施例中相机4采用的是CCD相机，透镜组2由两个透镜组成。核心部分是反射式荧光显微镜。光源可以是高亮度LED、汞灯或氙灯。激发光源1发出的Lambertian分布的照明光强通过透镜组2转换为高斯光强分布，并接入反射式荧光显微镜3。高斯光强分布的光源经起偏器34、激发滤波片31及分光镜36，被显微物镜32聚焦于样品上；荧光经过物镜32、分光镜36及发射滤波片33以及可调角度检偏器35，在CCD相机的相平面上成像，并将荧光反射在CCD相机上得图像转换成为显微图像数据，经过图像采集卡送入计算机处理。

如图3所示，可调角度检偏器35上安装有步进电机，并且可调角度检偏器35的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合，计算机5控制步进电机转动，控制可调角度检偏器35绕荧光成像光路的光轴中心步进回转，从而带动可调角度检偏器35的以等角间距或不等角间距旋转。本发明的成像系统中，可调角度检偏器35每旋转一个角度，CCD相机拍摄一幅图像，图像序列存储在计算机5内。

此时，测得的光强分布的最大值和最小值分别为

和

，则偏振度为：

，                                                         (1)

在上式中，(x,y)代表显微图像的空间坐标。

那么，荧光各向异性的图像为：

，                                                                         (2)

在本发明中：由Stockes矢量和Poincare球对部分偏振光的描述可知，部分偏振光可以等效为完全偏振光I _p 和自然光I _n 的叠加。偏振光检测原理如图3所示，以偏振光B的传播方向为z轴，垂直z轴的平面为xoy面，建立直角坐标系。由于线偏振光符合马吕斯定律，而在任何角度，自然光都只有一半能量透过检偏器，则通过可调角度检偏器35的光强分布与

的关系为：

，                                        (3)

其中，

表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，

是可调角度检偏器的初始相位角，

为可调角度检偏器的偏振主轴与x轴夹角，

表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强。

在实际情况下，是通过步进电机带动可调角度检偏器35回转产生的等间距或不等间距离散值，因此式(3)变为：

，

，    (4)

其中，m 表示第m次采样，

表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，

表示可调角度检偏器的初始相位角，

表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数。

在本实施例中，可调角度检偏器35等间距回转共计

°。

式(4)的离散傅里叶变换为：

,

                                                                 (5)

其中，

为信号频率，m表示第m次采样，

表示空间坐标为(x,y)的完全偏振光的光强，

表示可调角度检偏器的初始相位角，

表示在采样点m时，可调角度检偏器回转的一个角度，

表示空间坐标为(x,y)的自然光的光强，M是相机拍下的图像总帧数。

则当可调角度检偏器回旋共计

°时，根据计算机采集到的显微图像数据，计算荧光偏振度为：

,                                                              (6)

式中，当频率k取k _max时，

在频率k>0上取到最大值。

将式(6)代入式(2)得出样品荧光各向异性的显微图像为：

                                                         (7)

由于光电探测器的噪声分布是泊松噪声，且与信号强度成正比，式(6)和式(1)计算偏振度的两种方法相比，前者的噪声比后者低，是后者的

倍。如图

所示，如果I _p = 0.2018，I _n = 0.8072，

每隔等间距回转，共回转

步即

°，测得的光强值为图

上的黑方点点序列，根据式(7)，此时的荧光各向异性为r = 0.18181；图是噪声光强和理想值之间的偏差。如果根据式

和式

计算，一般测量方法测得的荧光各向异性为r=0.19691，测量误差为

r=0.0151；如果根据式

计算，测量荧光各向异性r=0.18177，误差仅为 r=0.00004；由此可见，本发明提出的可调角度检偏和傅里叶变换方法可以大幅度提高荧光各向异性显微成像的分辨率。

Claims (5)

1.一种高精度荧光各向异性显微成像装置，依次包括激发光源（1）、透镜组（2）、反射式荧光显微镜（3）、相机（4）、计算机（5），所述反射式荧光显微镜（3）包括激发滤波片（31）、物镜（32）、分光镜（36）、发射滤波片（33）；其特征在于所述透镜组（2）和激发滤波片（31）之间包括一个起偏器（34），发射滤波片（33）和相机（4）之间包括一个可调角度检偏器（35），相机（4）与计算机（5）连接。

2.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征是在于所述起偏器（34）与可调角度检偏器（35）均为线偏振片。

3.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述激发光源（1）、透镜组（2）以及起偏器（34）组成荧光激发光路，可调角度检偏器（35）、相机（4）组成荧光成像光路。

4.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述可调角度检偏器（35）与计算机（5）连接。

5.根据权利要求1所述荧光各向异性显微成像装置，其特征在于所述透镜组（2）由两个透镜组成，相机（4）为CCD相机。

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