CN105814402A

CN105814402A - 连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法与系统

Info

Publication number: CN105814402A
Application number: CN201380081848.5A
Authority: CN
Inventors: 叶燕; 陈林森; 楼益民; 刘艳花; 周云; 申溯; 魏国军
Original assignee: Svg Optronics Co ltd; Suzhou University
Current assignee: Suzhou University; SVG Tech Group Co Ltd
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: WO2015077926A1; KR102074279B1; CN105814402B; KR20160091380A

Abstract

一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法与系统，包括计算机（34）、光源（12）、可变标度的傅立叶变换光路、位相分光器件（9）、双远心投影光学系统（19）、大数值孔径物镜（30）、样品平台（32）和面阵相机，特征为：傅立叶变换光路包括第一傅立叶变换透镜或透镜组（8）与第二傅立叶变换透镜或透镜组（10），位相分光器件（9）置于两者之间，与第二傅立叶变换透镜或透镜组（10）之间的距离连续可调，具有绕傅立叶变换光路的光轴旋转的运动自由度。该连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法与系统可灵活实现连续可变空频的干涉条纹，用于共焦显微光学系统的结构光场照明，实现空间超分辨率成像；在纳秒频闪分幅照明模式下，不仅可实现超分辨率显微成像，提升纳米检测可靠性和检测速度，还可进行样品的动态检测分析，实现瞬态纳米结构的检测。

Description

连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法与系统技术领域

本发明涉及一种超分辨显微成像方法与系统，具体涉及一种实时 /动态三维形貌和纳米级成像方法与系统，应用于激光共焦显微成像、生物荧光检测、微纳米形貌检测和微纳结构写入标记。

背景技术

所谓超分辨率显微成像（Super resolution microscopy, SIM ) 是实现超过衍射光学极限的检测方法。一般地，受衍射光学极限的限制，小于光学系统成像分辨率的结构不能被分辨。如显微光学成像系统的分辨率为 R=k! A /NA , 式中，为比例系数， λ为波长， ΝΑ为数值孔径，通过缩短波长、增大物镜的数值孔径 ΝΑ等途径可提升的光学系统成像分辨率非常有限，其光学分辨率不会超过 λ /2。而随着纳米技术的应用，对具有微纳结构样品的快速检测是分析过程中不可或缺的技术手段，在功能新材料、纳米集成器件、 MEMS/NEMS 研宄中，微纳界面的表征与检测必须是无损方式；在生物工程研宄中，需更高分辨率（纳米级）显微成像仪，对更细的结构特性检测与分析；在大尺寸纳米器件样品制备中，快速检测很关键。因此，纳米尺度的检测分析问题，本质上就是如何实现超分辨率显微成像的问题。

目前，在纳米尺度的检测仪器如电子显微（SEM )、原子力显微镜（AFM )、荧光共焦扫描显微成像（C SIM ) 等，不能完全满足大样品的快速检测分析要求，不能实现样品动态演变的检测。 1、电子显微镜（SEM ) : 可达 lOnrn分辨率，需增加导电层才能进行结构检测，不适合无损检测的样品，不能用于活性生物样品的分析。同时， SEM串行工作方式，检测效率低，很难用于大尺寸样品的全场检测。 2、原子力扫描探针 (AFM probe) : 近几年来快速发展起来检测方法，运用微探针扫描，获得纳米级结构分布，但是， AFM的检测效率极低，检测时间长，对被检测样品的结构有诸多限制。不能实现快速检测和样品的动态分析。 3、共焦扫描显微镜（CSIM) : 通过聚焦激光点在表面扫描共焦检测，获得样品三维形貌。成像分辨率取决于系统衍射光学极限 λ /2。如 405_{n m} 蓝光，共焦扫描显微极限分辨率为 200nm，不能满足更小尺寸的检测要求。同时，采用扫描方式，由于时序的延迟问题，也不能用于样品的动态演变的检测分析。

因此， SEM、 AOF、 CSIM均是串行读写（扫描）方式的检测仪器，其共性问题是，被检测的结构越小、检测效率越低，不能用于纳米结构与动态演变样品的快速检测分析。

2000 年，美国加州大学的 M.G.L.Gustafsson 教授研发的结构光照明显微技术（ Structure Illumination Microscopy , SIM ) , 为超分辨的光学显微成像开辟了一条新的路径。这个技术采用横向调制光照明样品，利用调制照明光将高空间频率信号编码到低频图像中。当知道照明光场分布和最终的低频叠加条紋后，原来无法观测的、精细的图像就可以通过后期计算的方式获取。美国专利 US6376818 中描述结构光显微成像作为一种具有获得光学断层成像数据的成像技术，基于面扫探测方式使其具有对样本进行快速成像的潜力，该检测方法需要获得至少三种不同空间位相照明下的图像。

目前，有两种方法提供不同位相的结构照明光，一种是采用数字微镜阵列 DMD作为空间光调制器（例如中国专利，申请号 200810071628.5， 201110448980.8 , 201210402820.4) , 探测器进行曝光期间，数字微镜驱动版通过产生一系列的脉宽调制信号控制每个微镜开关状态的占空比，产生 256 级不同亮度灰度图案，具有方便、输入输出简便等特点。但是，由于以 DMD ( 1024X768， 10.68um为例）是一种像素化的空间光调制器件，结构光的改变是数字化的，也存在诸多不足， 1、数字微反射镜 DMD 的调制是靠单元微镜的转动对光线的反射实现的，从而导致结构光的条紋空频是按微镜单元的倍率（数字化）改变的，不能产生连续改变的结构光场。例如，产生（0， pi/2 , pi ) 位相改变， 500 lp/mm的空频 DMD 最好调制水平。对于非 0或 90度的结构光场（60度， 45度等）， DMD 对图像的旋转产生较大数字误差，使得结构光照明的位相调制精度显著下降。对检测样品的种类受到很大限制，横向分辨率和检测精度有待提高。 2、连续光源照明用于检测，受环境的影响较大。例如，假设环境振动因素使样品（系统）振动速率达 2um/s-5um/s， CCD检测时间 40ms，那么，在检测期间，样品不稳定的范围达到 80_nm-200nm，最终检测结果上将叠加一个随机模糊量。考虑到荧光材料需要一定的激发能量， CCD 需要一个积分接受时间，检测的时间约需要数十毫秒。因此，任何的系统不稳定，将会导致检测数据不确定性。这要求检测系统具有严格的隔振措施。 3、相似地，采用大 NA物镜光学系统可获提高结构光场的空频，但是，焦深（kl A /NA2 ) 也随之迅速减小，例如 NA1.49 , 450nm波长，焦深仅为 200nm。这对光学聚焦系统的稳定性提出极其严格要求。任何外界的微小变化将导致聚焦位置的改变，使得检测可靠性变差。必须系统要有严格的自适应控自聚焦措施。同时，由于 DMD尺寸和物镜像差的限制，单次检测的视场小于 20um。 4、通过 DMD的开断和调焦方式，对样品进行分幅采样，进行 3D结构的合成，在系统稳定性不足的情况下，其 3D结构的检测精度不会很高。

另一种是采用格栅作为光源的调制器，将具有单一空间频率的条紋格栅投射到样本，显微镜可以对条紋格栅投影到所在的焦面进行很好的成像，获得标记有锐利的条紋的样本层析图像，采用横向移动或旋转格栅的方式（美国专利 US8081378B2 , US8160379B2 , US6819415B2 ) 改变其相对空间位置，实现对结构照明光的相移，这种方式需要对格栅的位置移动进行严格的控制并与摄像机同步操作，成像速度慢且只能用于观察静态的样本。因此，中国专利 201210553557.9利用三个中心波长相近但光谱互不重叠的窄带光或激光组成照明光，三路光通过各自独立的投影路径，把格栅投影到样品上获得照明结构光，再利用分光模块把不同波长的样品反射光投影到成像模块的不同感光区域并同时进行成像，该系统只能形成三种相移的照明结构光，且系统结构复杂；中国专利 201210580743.1 一种用于实现结构光照明的圆盘，将圆盘均分为九个扇形区域，在每个扇形区域上设有一个格栅，九个格栅依次分为分别包括三个格栅的第一格栅组、第二格栅组以及第三格栅组，第一格栅组中的每一个格栅倾斜角为负 120 度，第二格栅组中的每一个格栅倾斜角为 0 度，第三格栅组中的每一个格栅倾斜角为正 120 度，每组格栅分为三个平行的格栅，且同组内格栅成像时，每个格栅的条紋横向偏移三分之一周期，只需旋转圆盘即可得到不同的格栅满足结构光照明模式需要，该系统可获得三组三种相移的照明结构光，相移量及格栅空频改变量有限、分立。

由于结构光照明是通过检测样品表面结构光场的位相分布，对位相分布 "解包裹"，实现小于光学衍射极限的结构检测，即超分辨率成像。这里，从样品表面反射回来的结构光场携带了由样品结构引起的位相改变，结构光场起到 "载频"作用，理论上， "载频"越高，位相改变的能力越大；结构条紋的相移越小，构建的图像精度越高。

因此，针对目前结构光照明显微成像存在的问题，获得连续空频改变的、高空频的结构光场，成为提高检测横向分辨率、快速显微成像动态目标的重要途径之一。

发明内容

本发明的目的是提出一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法与系统，以获得空间超分辨率成像，提升纳米检测可靠性和检测速度，同时实现样品的动态检测分析。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，包括计算机、光源、可变标度的傅立叶变换光路、位相分光器件、双远心投影光学系统、大数值孔径物镜、样品平台和面阵相机，所述的傅立叶变换光路包括第一傅立叶变换透镜或透镜组与第二傅立叶变换透镜或透镜组，所述位相分光器件置于第一傅立叶变换透镜或透镜组与第二傅立叶变换透镜或透镜组之间；所述位相分光器件与第二傅立叶变换透镜或透镜组之间的距离连续可调；所述位相分光器件具有绕傅立叶变换光路的光轴旋转的运动自由度。

上述技术方案中，所述光源可以是连续激光光源或脉冲激光光源，所述脉冲光源包括并不局限于纳秒脉冲激光光源、皮秒脉冲激光光源、飞秒脉冲激光光源等。脉冲激光器可提供频闪光源，调制频率可达 l kHz，脉冲宽度： 5ns-20ns。

所述光源可以是激光二极管光源。

在高功率激光光源下，系统可写入纳米结构；在纳秒激光光源下，纳秒时序的频闪分幅照明，不仅可实现超分辨率显微成像，提升纳米检测可靠性和检测速度，还可进行样品的动态检测分析，实现瞬态纳米结构的检测；本系统可进行样品的荧光显微检测；在采用不同波长的二极管光源照明时，在第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面产生的干涉条紋空频不同。

所述面阵相机可以是电荷耦合元件 CCD 相机、互补金属氧化物半导体 CMOS 相机或其它相机。

计算机控制光源、位相分光器件、双远心投影光学系统和样品平台的运动。

上述技术方案中，所述位相分光器件为一维光栅结构。或者，所述位相分光器件为二元光学结构。

上述技术方案中，位相分光器件在第二傅立叶变换透镜或透镜组的后焦面上形成纳米干涉条紋。

上述技术方案中，通过设置位相分光器件，其正负 1 级衍射光点分立傅立叶变换光轴两侧，并消零级光，当位相分光器件位于焦平面时，两衍射光点合二为一。

通过沿光轴连续改变位相分光器件的位置，可在第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面产生连续可变空频的干涉条紋。

通过绕光轴旋转位相分光器件，可在第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面产生不同取向的干涉条紋。

通过同时平移、旋转位相分光器件，可在第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面产生不同空频、不同取向的干涉条紋。

进一步的技术方案，所述系统中包括空间光调制器，所述空间光调制器位于光源与傅立叶变换光路之间。

上述技术方案中，第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面上的纳米干涉条紋、平台上样品以及 CCD三者共焦。

上述技术方案中，根据需要，可以在光路中设置视场光阑、可变光阑。一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法，采用上述系统实现，激光束在扩束后，照射在第一傅立叶变换透镜或透镜组上后，由位相分光器件产生正负一级衍射光点，经过第二傅立叶变换透镜或透镜组，在后焦面形成干涉光场，再经过双远心投影光学系统和大数值孔径物镜的合束，在样品平台上形成纳米级细分光场；对物镜进行 Z 向调节，实现纳米精度聚焦，对样品形成具有纳米尺度的结构光照明，实现样品结构检测。与此同时，红光像散光路与反射的绿色荧光分别进行自动聚焦光学检测（纵向）和对准照明（横向）与检测， CCD与样品处于共轭共焦位置，可直接检测到反射的结构光场的位相分布，偏振分束和双色分束镜保证各波长互不干扰。

进一步的技术方案，所述激光束在扩束后，经过空间光调制器（数字微反射镜， digital micro-mirror , DMD ) 再照射到第一傅立叶变换透镜或透镜组上。

上述技术方案中，位相光学元件可以采用位相光栅。位相光栅是一种消除零级光的光栅，其正负一级衍射光点处于第一傅立叶变换透镜（组）焦平面上，分立光轴两侧，两光点的距离与位相光栅到焦平面的距离成正比，位相光栅距焦平面的距离越大，光点分开的距离越大，当位相光栅位于焦平面时，两衍射光点合二为一。因此，移动位相光栅，光点距离实现了连续变化。这样，在第二傅立叶变换透镜（组）的后焦面上形的干涉条紋（光场）空频将连续改变。

上述技术方案中，含有干涉条紋的光场，经过后继的投影微缩光学系统，空频被进一步提高。设投影光学系统缩微倍数为 M， f为傅里叶变换透镜焦距， F为位相光栅 grating空频，则在样品上的结构光场的干涉条紋的空频为 Fn=M/PN=2(f-dz)FM/f，位相光栅 grating平移带来的样品上的结构光场的位相变化率为 AFn=|2AzFM/f|。这里， Δζ为位相光栅 grating到焦平面距离的改变量。

上述技术方案中，设在系统中的 tube lens焦距 f=200mm，物镜（NA0.95 ) 的焦距 l mm， F=120 lp/mm , 取 dz=0则样品上的结构光场的干涉条紋空频可达 5000 lp/mm ( 200nm周期）。设光栅位移精度为 Δζ=5μιη，则本系统可支持 0.05pi位相改变，能够实现 200nm X 0.05 = l Onm位相结构变化与相应的位相分辨的检测，从而获得超过衍射极限的分辨率（~10nm ) 的显微成像。

上述技术方案中，结构光照明不仅可用一维的干涉条紋（光栅结构），也可用二元位相元件替代位相光栅，产生的二维结构光场，用于结构光照明，获得二维空频可调的结构光场。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1，纳米级的结构光照明，可获更高分辨率。

基于位相光学元件的结构光照明，其干涉条紋具有 200nm*0.05 = l Onm 位相结构变化能力，比已报道的其他方法至少提高一个量级，不但无数字误差，且可连续地改变结构光场中条紋空频和取向，从而，能够获更精细的位相结构变化，实现超分辨率 3D显微成像，适应更高精度、更复杂形貌的快速检测。

2，纳秒激光频闪照明，保证更高的检测可靠性。

在连续变空频干涉条紋结构照明的基础上，本方案采用脉冲激光光源，用纳秒时序照明，每帧照明时间 5纳秒 -20纳秒。假设，样品振幅达 5mm/s，在 20纳秒照明内，检测结果受振动影响的模糊量小于 0.4nm。从而，纳秒时序照明方法，克服了环境振动的影响，消除了连续光源调制带来的检测不可靠性，保证了更精细的位相变化信息的检测精度。

以纳秒脉冲宽度 20ιιιη，用位置触发方式，可确保定位精度 ±1脉冲，理论上，在激光干涉定位下，具有 ±l nm 重复定位精度， RMS 精度可达亚纳米水平。

3，分频照明，可获更高精度 3D数据检测。

重复频率的频闪照明，如每幅照明时间 20ns , 光场尺寸 80um，在检测期内，可进行数百帧以上的检测图像。这样，不仅可通过空频变化来检测和校验 3D样品的检测，还可进行对样品的动态演变的检测，获得结构更精细的 3D形貌。

4，更强的环境适应性，可实现更高的检测效率。

作为对比， NA0.95显微物镜，焦深一般在 200nm-300nm，检测受环境振动影响很大，可靠性很难保障。利用连续空频照明的干涉光路，位相光栅的尺寸可以做到 20mmx200m_m，因此，结构光场的尺寸（视场）可达 80um 以上，这样，结构照明的条紋箱深度（景深）达 l Oum , 通过对连续样品的采样与合成，实现大视场 3D形貌检测。

5，在低功率照明下，本方法可进行样品的荧光显微检测。在高功率照明下，系统可写入纳米结构。

附图说明

图 1 连续可变空频结构光照明的光路系统；

图 2 连续可调结构光照明超分辨显微成像系统；

图 3 位相元件靠近第一傅立叶变换透镜时的傅立叶变换系统；

图 4 位相元件远离第一傅立叶变换透镜时的傅立叶变换系统；

图 5 位相元件绕光轴旋转时的傅立叶变换系统；

图 6 空间调制的连续可调结构光照明超分辨显微成像系统；

图 7 连续分频结构光照明进行动态检测的步骤；

图 8 空间调制的大幅面连续可调结构光照明超分辨显微成像系统；图 9 不同波长下变频光路系统；

图 10 位相元件为二维正交光栅时的傅立叶变换系统。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：可连续可调结构光照明光路系统

本实施例中可连续可调结构光照明光路系统两条光线的传播示意图如附图 1所示，其中主光线经过位相光栅 grating后产生的一级衍射光与光轴夹角为 α ，然后，经过透镜准直后，与光轴的夹角为 β，其中位相光栅 grating周期为 Ρ，消除零级光后，正负一级衍射光在输出平面的光场内，相互干涉后得到的条紋（光栅）周期为 PN。 4f 光学系统的焦距为 f，位相光栅 grating与前透镜距离为 dz，主光线与焦平面的夹角为 0，由 O 点发出的平行光与光轴的距离为 h，由 O 点发出的平行光经过后透镜后的光线与主光线经过后透镜后的光线平行。在可变标度的傅立叶变换系统上，位相光栅 grating在透镜后的会聚光上的连续平移，将使得正负一级衍射光焦点间距连续改变，在输出光场内干涉条紋实现了结构光空频的连续改变，这样，就有下列关系： Χπηβ - ―， tana" - ~ - ~， P x sin - Λ tan

f f - dz

所以， ^tanai

〃f _ d

= arcsm一尸 β - arctan

由于最后用正负一级光干涉，所以 a « tana" ¾ sin , =

如果用近轴近似： 2 x if 。

含有干涉条紋的光场，经过后继的投影微缩光学系统，空频被进一步提高。设投影光学系统缩微倍数为 M， f为傅里叶变换透镜焦距， F为位相光栅 grating 空频，则在样品上的结构光场的干涉条紋的空频为 Fn=M /PN=2(f-dz)FM/f,通过改变 dz取得的干涉条紋的空频为 [0， 2FM】lp/mm。位相光栅 grating 平移带来的样品上的结构光场的位相变化率为， △Fn=|2AzFM/f|。

这里， Δζ为位相光栅 grating到焦平面距离的改变量。

本实施例中，位相光栅 F=120 lp/mm, 在系统中的 tube lens 焦距 f=200mm，物镜（NA0.95) 的焦距 lmm，样品上的结构光场的干涉条紋空频 [0， 5000]lp/mm, 其中最大值 5000 lp/mm ( 200nm 周期）在 dz=0 时取得。图 2中的光栅位移精度为 Δζ=5μιη，本方法可支持 0.05pi位相改变。因此，能够实现 200nm*0.05 = lOnm位相结构变化与相应的位相分辨的检测。理论上，可获超过衍射极限的分辨率（~10nm) 的显微成像。本实施例中所述结构照明不仅可用一维的干涉条紋（光栅结构），也可用二元位相元件替代位相光栅，产生的二维结构光场，用于结构光照明，获得二维空频可调的结构光场。

本实施例中所述傅立叶变换系统包括任意形式或组合的傅立叶变换光学系统。

实施例二：大幅面连续可调结构光照明超分辨显微成像系统。

如附图 2 所示，本实施例中的连续可调结构光照明超分辨显微成像系统包含纳秒脉冲激光 12，空间滤波器 13，第一傅立叶变换透镜 8，衍射光栅 9，第二傅立叶变换透镜 10，视场光阑 16，实时检测光路 17，半透半反镜 18， tubelensl9 , 微缩物镜 30，自动聚焦光路 31，二维精密平移台 32，运动控制器 33，控制计算机 34，检测样品 35。

实施例中纳秒脉冲激光 12发出的激光经空间滤波器 13扩束准直后形成平行光进入由第一傅立叶变换透镜 8，衍射光栅 9，第二傅立叶变换透镜 10构成的光栅空频和角度连续调制光路，在第二傅立叶变换透镜 10后的区域形成指定空频和取向的光栅条紋信息，在第二傅立叶变换透镜后焦面上设置有视场光阑 16用于限制干涉条紋的成像区域，透过视场光阑的光栅条紋经过半透半反镜 18， tubelensl9和微缩物镜 30在检测样品 35 表面上形成具有高频结构的细分条紋。自动聚焦光路 31监控并实时调整聚焦物镜与检测样品 35表面的距离，保证高频光栅条紋在感光材料表面精确成像，实现纳米精度聚焦，对样品形成了具有纳米尺度的结构光照明，用于样品结构检测。实时检测光路 17对样品 35表面条紋的位相变化实时成像，这里 CCD与样品处于共轭共焦位置，可直接检测到反射的结构光场的位相分布，偏振分束和双色分束镜保证各波长互不干扰。通过对这种位相变化解包裹，实现对样品表面形貌的横向检测，结合自动聚焦光路实现对样品表面形貌的纵向检测，实现样品 35的三维形貌检测。运动控制器 33在控制计算机 34设定的程序下控制衍射光栅 9 的移动或转动或同时移动和转动，实现光栅条紋的空频或取向或空频和取向的连续变化，获得一种以上的反射结构光场的位相分布，实现样品 35的超分辨率三维形貌检测。

若检测样品 35 的幅面大于检测系统的照明光场尺寸，运动控制器 33在控制计算机 34设定的程序控制下协调纳秒脉冲激光 12 的脉冲时序、衍射光栅 9的移动和转动以及二维精密平移台 32的二维移动，通过样品表面不同区域的三维形貌检测，实现大幅面样品的三维形貌检测。

实施例三：分幅结构光场照明检测方式

本实施例中采用附图 2 所示的系统，可采用不同空频的分幅结构光场照明检测方式。在同一个傅立叶变换光路系统中，位相元件 9 在计算机的控制下，沿光路系统的光轴平移，从而使得位相元件离傅立叶变换透镜 8 的位置不同，产生的结构光照明的空频也不同，如附图 3、附图 4所示。在本实施例中，位相光栅 F= 120 lp/mm , 在系统中的 tube lens 焦距 f=200mm，物镜（NA0.95 ) 的焦距 l mm，当位相光栅 9与透镜 8距离 dz 为 20mm时，如附图 3所示，其产生的结构光照明空频为 45001p/mm；当位相光栅 9与透镜 8距离 dz为 80mm时，如附图 4所示，其产生的结构光照明空频为 30001p/mm。这样系统投射在样品表面的结构光的空频不同。

本实施例中采用附图 2 所示的系统，还可采用不同取向的分幅照明检测方式。在同一个傅立叶变换光路系统中，位相元件 9 的在计算机的控制下绕光轴旋转，自 P 1方向旋转 Θ角后至 P2方向，如附图 5所示，当位相元件 9在 P 1位置时，照明光栅在 xy平面内，其光栅条紋与 P 1方向垂直，当位相元件在 P2位置时，照明光栅在 xy平面内，其光栅条紋与 P2 方向垂直，两种光栅条紋之间的夹角为 θ，即当位相元件绕光轴旋转时，其在傅立叶变换透镜后焦面形成的光栅取向不同，从而通过旋转位相元件可实现不同取向的结构光照明。

在本实施例中，位相元件 9在 x ly l平面内，当位相元件在 P 1位置（即 y l方向）时，其在后焦面形成的光栅在 xy平面内，光栅条紋垂直于 P 1 方向（即与 y l平行的 y方向）；当位相元件在 P2位置（即与 y l方向夹 20度角）时，其在后焦面形成的光栅在 xy平面内，光栅条紋垂直于 P2 方向（即与 y方向夹 60度角）。

本实施例中采用附图 2 所示的系统，还可采用特定空频和特定取向的分幅照明检测方式。在同一个傅立叶变换光路系统中，位相元件 9 的在计算机的控制下沿光轴平移或绕光轴旋转，在傅立叶变换透镜后焦面形成的光栅不同的空频和取向，从而通过平移、旋转位相元件可实现不同取向的结构光照明。

本实施例中，按照附图 3、附图 4与附图 5所示的原理，当位相光栅 F=120 lp/mm，在系统中的 tube len 焦距 f=200mm，物镜（ NA0.95 )的焦距 l mm , 当需要产生结构光照明的空频为 25001p/mm 时，根据公式 Fn =2(f-dz)FM/f，解得 dz=f( l -Fn/(2FM))，则位相光栅 9与透镜 8距离 dz 为 100mm ; 当需要产生结构光照明的空频为 15001p/mm 时，根据公式 dz=f(l-Fn/(2FM))，位相光栅 9与透镜 8距离 dz为 140mm；当需要产生结构光照明的空频为 5001p/mm时，根据公式 dz=f(l-Fn/(2FM))，位相光栅 9与透镜 8距离 dz为 180mm。当希望取得结构光照明的条紋取向与 P1方向顺时针方向夹 60度角时，则将位相光栅 9顺时针沿绕光轴方向旋转 60度角；当希望取得结构光照明的条紋取向与 P1方向顺时针方向夹 90度角时，则将位相光栅 9顺时针沿绕光轴方向旋转 90度角；当希望取得结构光照明的条紋取向与 P1方向逆时针方向夹 30度角时，则将位相光栅 9逆时针沿绕光轴方向旋转 30度角。

如本实施例所示，本系统可采用不同空频的结构光分幅照明方式；采用相同空频、不同取向的结构光分幅照明方式和采用特定变空频和取向的结构光分幅照明方式。

实施例四：采用 DMD与连续变空频的相互调制的结构光照明

本实施例中采用 DMD与连续变空频的相互调制的结构光照明系统，如附图 6所示，包含纳秒脉冲激光 12，空间滤波器 13，反射镜 14， DMD空间光调制器 15，第一傅立叶变换透镜 8，衍射光栅 9，第二傅立叶变换透镜 10，视场光阑 16，实时检测光路 17，半透半反镜 18， tubelensl9 , 微缩物镜 30，自动聚焦光路 31，二维精密平移台 32，运动控制器 33，控制计算机 34，检测样品 35。

本实施例中纳秒脉冲激光 12发出的激光经空间滤波器 13扩束准直后形成平行光入射到 DMD空间光调制器 15上， DMD空间光调制器作为可变光阑用于控制平行光束的光斑尺寸和形状，经过 DMD空间光调制器反射的光线进入由第一傅立叶变换透镜 8，衍射光栅 9，第二傅立叶变换透镜 10构成的光栅空频和角度连续调制光路，在第二傅立叶变换透镜 10的后焦面上形成指定空频和取向的光栅条紋，后焦面上设置有视场光阑 16，透过视场光阑的光栅条紋经过半透半反镜 18， tubelensl9和微缩物镜 30 在样品 35上形成高频光栅条紋。通过对这种位相变化解包裹，实现对样品表面形貌的横向检测，结合自动聚焦光路实现对样品表面形貌的纵向检测，实现样品 35的三维形貌检测。运动控制器 33在控制计算机 34设定的程序下控制衍射光栅 9 的移动或转动或同时移动和转动，实现光栅条紋的空频或取向或空频和取向的连续变化，获得一种以上的反射结构光场的位相分布，实现样品 35的超分辨率三维形貌检测。

实施例五：采用连续分频的结构光照明，用于动态样品检测的时序。本实施例中，无论是如附图 2还是附图 6所示的检测系统，其连续分频结构光照明进行动态检测的步骤如附图 7所示，首先，样品平台预扫描，通过位置传感器标定纵向位置，建立标准数据库；其次，将需检测物品置于检测平台；第三，预扫描检测样品，通过与标准库快速比对获得采集点的纵向自动聚焦位置；第四，电机驱动平台 x，y方向平移，位置传感器 z方向自动聚焦；第五，分幅照明，获得多帧不同空频或取向结构光照明下的检测图像；第六，判断是否扫描完毕，如未完毕，则移动到下一位置继续检测，如完毕则进行相应算法处理，构建检测物品的 3D形貌。本实施例中，数值孔径为 NA0.95的显微物镜，焦深一般在 200nm-300nm，检测受环境振动影响很大，可靠性很难保障。利用连续空频照明的干涉光路，位相光栅的尺寸可以做到 20mmx200mm，因此，结构光场的尺寸

(视场）可达 80um以上，结构照明的条紋箱深度（景深）达 10um。本实施例中分幅照明即重复频率的频闪照明，如每幅照明时间 20ns , 光场尺寸 80um，在检测期内，可进行数百帧以上的检测图像。这样，不仅可通过空频变化来检测和校验 3D样品的检测，还可进行对样品的动态演变的检测，获得结构更精细的 3D形貌；此外，通过对连续样品的采样与合成，实现大视场 3D形貌检测。

实施例六：大幅面分幅结构光场照明检测方式

本实施例中，基于实施例五中采用连续分频的结构光照明，用于动态样品检测，若实现高精度大幅面分幅结构光场照明检测方式，其检测系统也可以如附图 8所示。其中，自动光路 31采用两种不同波长的照明光源 311和 312，其中 311与 18、 30和 313单元构成自动聚焦检测光路，实现垂直于运动平台的自动对焦功能； 312与 18、 30和 313单元构成自动定位光路，实现平行于运动平台方向的检测光场的无缝拼接。结合分幅结构光场照明方式，实现高精度的大幅面动态检测。本实施例中的自动光路 31可应用于如附图 2或附图 6所示的检测系统中。

实施例七：采用按照傅里叶级数展开的结构光场照明的 3D结构检测本实施例中，任何表面形貌样品展开的傅立叶级数中，低频部分反映表面形貌的低梯度部分特点，即形貌轮廓或形状；高频部分反映表面形貌的高梯度特点，即细节或突变；频率越高则反映的细节程度越高。因此连续变频的结构光照明，可实现物体的高分辨率 3D结构检测。

本实施例中根据上述检测系统原理，样品上的结构光场的干涉条紋的空频为 Fn=M /PN=2(f-dz)FM/f, 通过改变 dz取得的干涉条紋的空频为 [0，

2FM] lp/mm ; 当位相元件 9 平移带来的样品上的结构光场的位相变化率为 AFn=|2AzFM/f|，贝 !j Az=AFnf/(2FM)，其中 Δζ为位相元件 9到焦平面距离的改变量，正负符号表示位相元件 9沿光轴平移的方向。

本实施例中，当位相光栅 F=120 lp/mm , 在系统中的 tube lens 焦距 f=200mm，物镜（NA0.95 ) 的焦距 l mm，产生结构光照明的空频为 [0，

5000] lp/mm , 当运动控制系统改变位相元件 9 的位移量为 0.5um时，引起的条紋空频改变为 0.01251p/mm _; 如需以 llp/mm的步长改变系统产生的结构光照明的空频，则位相元件 9的位移量为 0.04mm。

因此，本系统可实现按照傅里叶级数展开的结构光场照明的 3D结构检测。实施例八：采用不同波长

本实施例中，附图 2、附图 6和附图 8所示的系统中，可采用连续激光光源、脉冲激光光源和激光二极管光源等各种类型的光源，也可采用各种波长或不同波长的光源。

本实施例中分别采用三种波长（λ^λ^λ^作为光源，由于透镜对不同波长入射光的折射能力不同，在相同的光路系统中，如附图 9 所示，不同波长的入射光经过第一傅立叶变换透镜后，照射在位相元件上位置及入射角度不同（Θ Θ Θ3)，根据光栅方程，其正负一级衍射角为 arcsin((d*sine4)/d) ( d=l/F，光栅周期），因此 ; 而与光轴重合的入射光相应的正负一级衍射光随着入射波长的减小而减小

(θχ ">θ₂ ">θ₃ ") , 从而在同一光路系统中，不同的入射光正负一级衍射光在焦平面的距离不同，波长越短，其在焦平面的距离越小，最终在第二傅立叶变换透镜后焦面形成的干涉条紋空频也越小。

本实施例中也可采用不同的波长，结合位相元件的平移和旋转，根据检测需要，实现不同空频变化范围的结构光照明检测。

实施例九：采用二维位相调制元件，形成二维结构光照明

本实施例中，一种光栅空频和取向连续可变的二维结构光照明方法，包括焦距为 fl的第一傅立叶变换透镜 8与焦距为 f2的第二傅立叶变换透镜 10透镜构成的 4F光学系统和衍射光栅 9。所述衍射光栅 9位于第一傅立叶变换透镜与第一傅立叶变换透镜的焦距之间，所述衍射光栅为各种形状的二维光栅结构。衍射光栅可以沿着光轴 11移动，也可以绕着光轴 11 转动。通过移动衍射光栅 9 改变衍射光栅与第一傅立叶变换透镜之间的距离 dz，实现所述光栅空频 Λ参数的连续调制。通过旋转衍射光栅 9，实现所述光栅取向角 Θ参数的连续调制。如附图 1所示。

本实施例中，所述衍射光栅 9 可以是各种形式的二维光栅结构，当位相光栅 9为矩形正交二维光栅时，如附图 10所示，其在傅立叶变换透镜的后焦面形成正交二维点阵。

本实施例中，所述衍射光栅 9为正交光栅，位于在 xlyl平面内， xl方向 F l=2001p/mm， yl 方向 F2=2501p/mm，当 tube len 焦距 f=200mm， dz=100mm时，在 xy平面内实现二维点阵结构光照明，若微缩倍数 M=25，产生结构光照明的二维点阵在对应方向上的空频分别为 Fn l=50001p/mm , Fn2=62501p/mm , 当衍射光栅 9沿光轴平移时，其在两个方向上的空频变化范围为 [0， 10000] lp/mm 和 [0， 12500】lp/mm ; 衍射光栅 9可绕光轴转动，改变结构光照明的光栅取向。

本发明的连续变空频脉冲频闪结构光照明与已有方法的性能对比表: 结构光照明 DMD调制 +连续光源连续位相调制 +脉冲光源 +分频

空间频率（载频） 500 lp/mm 5000 lp/mm

位相调制 0, 0.5pi, lpi (台阶式） 0 - pi, 0.05pi (连续改变)

结构光场旋转有数字误差结构光场的旋转无数字误差

3D检测视场 20um 80画

样品特性静态样品静态、动态样品演变

横向分辨率（达到或预期） ~90nm lOnm -50nm 照明（检测）时间 ~20ms-50ms 20ns 刷新频率 lO fps 1kHz fps

环境要求 <0.1mm/s 基本不受环境限制

总体上，在连续空频调制的干涉条紋（光栅）形成方法，位相变化更精细，更高，纳秒时序照明与位相采样、可检测动态演变过程和 3D结构。

Claims

权利要求书

1 . 一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，包括计算机、光源、可变标度的傅立叶变换光路、位相分光器件、双远心投影光学系统、大数值孔径物镜、样品平台和面阵相机，其特征在于：所述的傅立叶变换光路包括第一傅立叶变换透镜或透镜组与第二傅立叶变换透镜或透镜组，所述位相分光器件置于第一傅立叶变换透镜或透镜组与第二傅立叶变换透镜或透镜组之间；所述位相分光器件与第二傅立叶变换透镜或透镜组之间的距离连续可调；所述位相分光器件具有绕傅立叶变换光路的光轴旋转的运动自由度。
2. 根据权利要求 1所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，其特征在于：所述位相分光器件为一维光栅结构。
3. 根据权利要求 1所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，其特征在于：所述位相分光器件为二元光学结构。
4. 根据权利要求 2或 3所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，其特征在于：位相分光器件在第二傅立叶变换透镜或透镜组的后焦面上形成纳米干涉条紋。
5. 根据权利要求 1所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，其特征在于：所述系统中包括空间光调制器，所述空间光调制器位于光源与傅立叶变换光路之间。
6. 根据权利要求 1所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像系统，其特征在于：第二傅立叶变换透镜或透镜组后焦面上的纳米干涉条紋、平台上样品以及 CCD三者共焦。
7. 一种连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法，其特征在于：采用权利要求 1 所述系统实现，激光束在扩束后，照射在第一傅立叶变换透镜或透镜组上后，由位相分光器件产生正负一级衍射光点，经过第二傅立叶变换透镜或透镜组，在后焦面形成干涉光场，再经过双远心投影光学系统和大数值孔径物镜的合束，在样品平台上形成纳米级细分光场；对物镜进行 Z 向调节，实现纳米精度聚焦，对样品形成具有纳米尺度的结构光照明，实现样品结构检测。
8. 根据权利要求 7所述的连续可调结构光照明的超分辨显微成像方法，其特征在于：所述激光束在扩束后，经过空间光调制器再照射到第一傅立叶变换透镜或透镜组上。