CN114236799A - 超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置与方法 - Google Patents

Abstract

超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置，包括主光路和辅助定焦光路；主光路由激光器、单模光纤、第一准直透镜、超振荡环带片、显微物镜、分光棱镜、管镜、CCD等组成，辅助定焦光路由白光LED光源、Y型多模光纤、第二准直透镜、分光棱镜、色散物镜、光谱仪等组成；其中色散物镜与显微物镜处于同一位置，替换使用；相应的样品实时精确定焦方法：在辅助定焦光路，利用光谱仪获得与样品下表面、超振荡环带片上表面对应的峰值波长；然后利用激光干涉仪对辅助定焦光路精确标定，得到波长‑位移校准关系曲线；最后利用标定后的辅助定焦光路在原位实时测量超振荡环带片和样品之间Z向距离，并垂直移动样品将其定焦至超振荡环带片的最佳焦平面处。

Description

超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置与方法

技术领域

本发明属于光学技术领域，特别涉及一种超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置与方法。

背景技术

基于超振荡环带片的超分辨光学显微镜是在共焦显微成像装置的基础上将由普通折射透镜或透镜组组成的显微物镜替换为超振荡环带片，使得整个系统微型化、集成化，同时能够实现超分辨扫描成像，该技术的出现来源于两方面原因：

一方面，超振荡环带片的超分辨聚焦基于光学超振荡现象，合理设计超振荡环带片结构可以使超振荡环带片聚焦光场中局部振荡频率高于全局最高傅立叶频率分量，以此实现超分辨聚焦。利用这样的二维衍射光学元件可以不借助倏逝波而实现远场超分辨光学成像，并且在批量化制备和低成本推广上有明显优势，对于光学系统的微型化、集成化十分有利。

另一方面，用于光学显微成像与测量的共焦显微成像装置最早发明于20世纪50年代后期，现已在现代生物及医学成像、工业检测及精密测量、材料科学与纳米技术等领域得到广泛的应用。其结构上的突出特点是采用点照明、点扫描和点探测以及三点的共轭关系(理想共焦成像系统)，引入逐点扫描装置实现宽场光学成像，并且能够有效隔离杂散光得到清晰成像。为了实现光学显微成像系统的微型化、集成化同时提高光学系统的成像分辨率，可以利用超振荡环带片的轻薄性、光场可控性强、设计自由度大、便于集成等优点，将其代替传统共焦显微镜中的传统显微物镜，以实现系统微型化、集成化的技术与方案，达到超分辨聚焦及成像的目的。

2012年，英国研究人员在二元振幅型超振荡环带片的基础上开发出一种基于共焦原理的远场超分辨光学显微成像技术(参见文献：Rogers ET,Lindberg J,Roy T,et al.Asuper-oscillatory lens optical microscope for subwavelength imaging.NatureMaterials,2012,11(5):432-435)，这样的透射式共焦超分辨成像技术可以在二维平面上扫描样品，实现超分辨成像。而为了实现超分辨成像，需要将样品精确定位到显微镜焦点位置，但是这个过程十分缓慢，并且调整精度受到机械的极大限制，降低了整个超分辨光学显微镜的工作效率。

2018年，西安交通大学针对基于超振荡环带片的超分辨共焦扫描光学成像系统中样品的轴向精确定位问题，提出了一种基于结构光照明层析测量原理的定位方法(参见文献：王通.金属膜微纳光学元件衍射聚焦机理与实验研究.陕西：西安交通大学博士学位论文，2018)该方法通过在照明光路引入一维光栅并投影至待测样品表面，同时采用精密位移工作台驱动光栅在横向产生三步步进移相扫描，通过CCD采集不同相位光栅条纹在样品表面的投影图像，对采集到的3幅图像进行数学处理，在探测光场中解调分离出普通像场和层析像场，最后得到轴向层析响应曲线精确定位探测平面位置。这种方法虽然实现了轴向定焦，但是需要分别对样品和超振荡环带片进行扫描定焦，定焦速度慢、精度低，且装置复杂。

2021年，西安交通大学进一步提出了基于反射式共焦原理的适用于超振荡环带片的轴向精密定焦方法(参见文献：李国卿.基于超振荡平面透镜的新型光学超分辨显微系统研究.陕西：西安交通大学硕士学位论文，2021)，采用均匀反射面沿光轴方向进行轴向扫描，当超振荡环带片或者样品位于测量物镜焦平面时，此时反射点、照明点和探测点三点共轭，形成共焦条件，由此可以得到超振荡环带片或者样品的位置，由此实现样品的轴向定位。该方法具有精度高的优点，但需要分别对样品和超振荡环带片分别扫描定焦，速度慢，无法避免样品的机械切换问题，且不能实时测得样品的轴向位置，也不能直接获得超振荡环带片和样品之间的轴向距离(即Z向距离)，只能间接的获得相对位置，在系统方面必须加入Z向精密位移台来实现样品的扫描定焦，导致该方法成本高、效率低。

截止目前，在国内外尚未见一种可有效解决超振荡环带片超分辨共焦扫描光学显微镜的样品实时精确定焦方法，亟需新的方法与技术的出现。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置与方法，针对现有超振荡环带片超分辨共焦扫描光学显微镜样品定焦所遇到的系统结构复杂和低效率的突出问题，通过在基于超振荡环带片的超分辨共焦扫描光学显微镜系统主光路中构建基于光谱色散共焦的超振荡环带片超分辨光学显微镜的辅助光路，无需对物镜或样品进行轴向机械扫描，可在原位实现对样品的进行实时、准确定焦。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置，包括主光路和辅助定焦光路；

所述主光路，由激光器出射激光，经单模光纤进入第一准直透镜后进入超振荡环带片，然后经显微物镜进入分光棱镜，经分光棱镜透射的部分进入管镜并被CCD接收，其中超振荡环带片水平设置，样品置于超振荡环带片和显微物镜之间，位于超振荡环带片和显微物镜的共轭焦点处；

所述辅助定焦光路，由白光LED光源发出白光光束，经Y型多模光纤的端口A进入第二准直透镜，之后进入所述分光棱镜，经分光棱镜反射的部分进入色散物镜形成沿轴的色散聚焦，样品置于色散物镜的测量范围内，其反射或散射光经所述分光棱镜返回Y型多模光纤，并从其端口B进入光谱仪；

所述色散物镜与显微物镜处于同一位置，替换使用。

在一个实施例中，所述激光器出射的激光沿水平方向，在进入超振荡环带片之前通过经反射镜反射为竖直方向；所述白光LED光源发出的白光光束沿水平方向，在进入色散物镜之前经分光棱镜反射为竖直方向。

本发明还提供了利用所述超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦方法，包括以下步骤：

步骤一，利用光谱仪的光谱响应曲线获得与样品的下表面、超振荡环带片的上表面对应的峰值波长；

步骤二，利用激光干涉仪对辅助定焦光路进行精确标定，得到一条波长-位移校准关系曲线，作为标定测量曲线；

步骤三，利用标定后的辅助定焦光路实现在原位对超振荡环带片和样品之间Z向距离的实时测量，并垂直移动样品将其准确定焦至超振荡环带片的最佳焦平面处。

在一个实施例中，所述步骤一，白光光束经Y型多模光纤形成点光源照明，经第二准直透镜后由分光棱镜分束，反射光束通过色散物镜形成沿轴的色散聚焦，样品的上下表面与超振荡环带片上表面均处于轴向色散范围内，白光LED光源聚焦的不同色光的连续聚焦将实时跟踪样品与超振荡环带片上不同高度位置的点，照射在样品上下表面与超振荡环带片上表面的反射或散射光再次进入Y型多模光纤后由光谱仪探测，光谱仪探测的光谱响应曲线的三个峰值波长对应的光束恰聚焦于样品的上下表面与超振荡环带片上表面，此时实现了三点共轭聚焦成像，对应出现三个峰值波长，而其余波长的光因离焦而被光纤滤波抑制，进入光谱仪的强度锐减，此时光谱仪的轴向光强响应具有显著的单峰响应特性，通过光谱信号处理即可提取出与样品的下表面、超振荡环带片的上表面对应的峰值波长。

在一个实施例中，以平面反射镜上表面为标定辅助定焦光路的待测表面，标定时，在保持色散物镜不动的情况下，将平面反射镜上表面移动至色散物镜工作范围的最低处，此时使用激光干涉仪对平面反射镜上表面的位置进行实时监控，以当前位置为位移零点，沿Z方向向上移动平面反射镜上表面，平面反射镜的反射或散射光进入光谱仪，获得相应位移的峰值波长，实现平面反射镜的Z方向位移和光谱仪经过光谱信号处理后得到的峰值波长相对应，由此得到一条波长-位移校准关系曲线。

在一个实施例中，所述步骤三，在辅助定焦光路标定完成后，测量样品和超振荡环带片Z向距离时，使用光谱仪对光谱信号处理，提取出光强峰值对应的实际波长，将其代入标定测量曲线，即可求解得到样品的位移值；当将超振荡环带片和样品共同作为待测物时，光谱响应曲线将出现三个峰值，第一个峰值对应样品的上表面反射的波长峰值，第二个峰值对应样品的下表面反射的波长峰值，第三个峰值对应超振荡环带片的上表面反射的波长峰值，将第二个峰值和第三个峰值对应的波长代入标定测量曲线得到对应空气间隙，即超振荡环带片与样品的Z向距离。

在一个实施例中，所述步骤三，对样品精确定焦的过程为：切换物镜为色散物镜，水平调整超振荡环带片位置，使透过色散物镜的光束光轴垂直通过其中心，将其固定；水平调整样品，使光轴垂直聚焦于样品的透明区域，粗调样品与超振荡环带片的Z向距离使其处于色散物镜的测量范围内；白光LED光源发出的白光光束沿辅助定焦光路被光谱仪接收，根据标定测量曲线，得出超振荡环带片和样品之间的Z方向的实时距离，根据已知的超振荡环带片最佳焦距，垂直移动超振荡环带片将样品准确定位到超振荡环带片的最佳焦平面位置，固定样品位置，切换物镜为显微物镜，并在超振荡环带片和样品位置保持不变的条件下，垂直微调显微物镜位置将样品清晰成像于CCD像面上，此时完成全部调整，关闭白光LED光源。

在一个实施例中，在样品定焦完成后，打开激光器，激光器发出的激光经第一准直透镜准直成平行光后照射至超振荡环带片上，光束经超振荡环带片会聚成超分辨聚焦光斑至样品上，经样品产生的透射光由显微物镜接收，然后经过管镜会聚到CCD的成像靶面上，采用相机面阵虚拟针孔进行共焦点探测，无须进行物理针孔的对准，采用图像针孔模板矩阵对实时光斑图像进行微小区域的截取、积分求和，由XY位移器对样品进行二维扫描，利用共焦探测输出形成二维超分辨扫描光学成像。

与现有超振荡环带片超分辨共焦扫描光学显微镜中样品定焦方法相比，传统方法需要对样品和超振荡环带片分别扫描定焦，因此定焦结果精度低、速度慢，本发明提供的基于光谱色散共焦方法的超振荡环带片扫描光学显微镜的样品实时精确定焦方法，无需进行轴向扫描，可在原位实现对样品进行实时、准确定焦。

附图说明

图1为本发明超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置的光路示意图。

其中：1—激光器、2—单模光纤、3—第一准直透镜、4—反射镜、5—超振荡环带片、6—样品、7—色散物镜、8—显微物镜、9—分光棱镜、10—管镜、11—CCD、12—第二准直透镜、13—Y型多模光纤、14—白光LED光源、15—光谱仪。

图2为实验验证装置图。

图3为光谱响应实验曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

本发明提供了一种样品实时精确定焦装置，基于光谱色散共焦的超振荡环带片共焦扫描光学显微镜实现。

其中，光谱色散共焦意为利用光谱沿轴色散代替样品的轴向机械扫描，从而提高检测效率，其轴向分辨率可达亚微米级，能够兼顾测量精度与测量速度。基于超振荡环带片的超分辨光学显微镜是在共焦显微成像装置的基础上将由普通折射透镜或透镜组组成的显微物镜替换为超振荡环带片，使得整个系统微型化、集成化，同时能够实现超分辨扫描成像。

参考图1，本发明的样品实时精确定焦装置主要包括主光路和辅助定焦光路。

其中，主光路主要采用激光器1、单模光纤2、第一准直透镜3、超振荡环带片5、显微物镜8、分光棱镜9、管镜10和CCD11。由激光器1出射激光，经单模光纤2进入第一准直透镜3后进入超振荡环带片5，然后经显微物镜8进入分光棱镜9，经分光棱镜9透射的部分进入管镜10并被CCD11接收，其中超振荡环带片5水平设置，样品6置于超振荡环带片5和显微物镜8之间，位于超振荡环带片5和显微物镜8的共轭焦点处。示例地，本实施例中，激光器1出射的激光沿水平方向，并在进入超振荡环带片5之前通过经反射镜4反射为竖直方向。

本发明中，样品6可通过电子束直写等工艺，在透明薄片上形成所要扫描成像的结构，在透明薄片的非结构位置留出透明区域。示例地，透明薄片可以为盖玻片。

辅助定焦光路主要采用超振荡环带片5、色散物镜7、分光棱镜9、第二准直透镜12、Y型多模光纤13、白光LED光源14和光谱仪15。由白光LED光源14发出白光光束，经Y型多模光纤13的端口A进入第二准直透镜12，之后进入分光棱镜9，经分光棱镜9反射的部分进入色散物镜7形成沿轴的色散聚焦，样品6置于色散物镜7的测量范围内，其反射或散射光经分光棱镜9返回Y型多模光纤13，并从其端口B进入光谱仪15。示例地，本实施例中，白光LED光源14发出的白光光束沿水平方向，在进入色散物镜7之前经分光棱镜9反射为竖直方向。

在本发明中，色散物镜7与显微物镜8处于同一位置，在使用主光路时，替换使用显微物镜8，在使用辅助定焦光路时，替换使用色散物镜7。实例地，可将二者安装于物镜转盘，通过转动转盘实现切换。

利用上述的样品实时精确定焦装置可进行实时精确定焦，步骤如下：

步骤一，基于辅助定焦光路，利用光谱仪15的光谱响应曲线获得与样品6的下表面、超振荡环带片5的上表面对应的峰值波长。

具体地，白光LED光源14发出白光光束，经Y型多模光纤13形成点光源照明，经第二准直透镜12准直后，由分光棱镜9分束，反射光束通过色散物镜7形成沿轴的色散聚焦，样品6的上下表面与超振荡环带片5上表面均处于轴向色散范围内，由于白光中的不同波长光经过同一介质折射率不同，所以聚焦位置也不同，会聚焦一系列连续的焦点位置在待测物上。因此白光LED光源14聚焦的不同色光的连续聚焦将实时跟踪样品6与超振荡环带片5上不同高度位置的点，照射在样品6上下表面与超振荡环带片5上表面的反射或散射光再次进入Y型多模光纤13后由光谱仪15探测，光谱仪15探测的光谱响应曲线的三个峰值波长对应的光束恰聚焦于样品6的上下表面与超振荡环带片5上表面，此时实现了三点共轭聚焦成像，对应出现三个峰值波长，而其余波长的光因离焦而被光纤滤波抑制，进入光谱仪15的强度锐减，此时光谱仪15的轴向光强响应具有显著的单峰响应特性，由于光束进入光谱仪15之后，可以得到一条波长-光强曲线，此时可以从曲线中得到对应光强峰值的波长，因此通过光谱信号处理即可提取出与样品6的下表面、超振荡环带片5的上表面对应的峰值波长。

步骤二，利用激光干涉仪对辅助定焦光路进行精确标定，得到一条波长-位移校准关系曲线，作为标定测量曲线。

具体地，标定过程为：仍然采用辅助定焦光路，在色散物镜7轴向色散范围内放置一块平面反射镜，以平面反射镜上表面为标定辅助定焦光路的待测表面。标定时，在保持色散物镜7不动的情况下，将平面反射镜上表面移动至色散物镜7工作范围的最低处，此时使用激光干涉仪对平面反射镜上表面的位置进行实时监控，以当前位置为位移零点，沿Z方向向上移动平面反射镜上表面，平面反射镜的反射或散射光进入光谱仪15，获得相应位移的峰值波长，实现平面反射镜的Z方向位移和光谱仪15经过光谱信号处理后得到的峰值波长相对应，由此得到一条波长-位移校准关系曲线。

步骤三，利用标定后的辅助定焦光路实现在原位对超振荡环带片5和样品6之间Z向距离的实时测量，并垂直移动样品6将其准确定焦至超振荡环带片5的最佳焦平面处，此时样品6的下表面与超振荡环带片5之间Z向距离使得超振荡环带片5聚焦光斑尺度最小，即，超振荡环带片5的实际焦距处。

具体地，在辅助定焦光路标定完成后，测量样品6和超振荡环带片5的Z向距离时，使用光谱仪15对光谱信号处理，提取出光强峰值对应的实际波长，将其代入标定测量曲线，即可求解得到样品6的相对位移或高度值。而当将超振荡环带片5和样品6共同作为待测物时，光谱响应曲线将出现三个峰值，第一个峰值对应样品6的上表面反射的波长峰值，第二个峰值对应样品6的下表面反射的波长峰值，第三个峰值对应超振荡环带片5的上表面反射的波长峰值，将第二个峰值和第三个峰值对应的波长代入标定测量曲线可以得到对应空气间隙，即超振荡环带片5与样品6的Z向距离。

对样品6精确定焦的具体过程为：转动物镜转盘，切换物镜为色散物镜7，水平调整超振荡环带片5位置，使透过色散物镜7的光束光轴垂直通过其中心，将超振荡环带片5固定。然后水平调整样品6，使光轴垂直聚焦于样品6的透明区域，粗调样品6与超振荡环带片5的Z向距离使其处于色散物镜7的测量范围内；白光LED光源14发出的白光光束，经Y型多模光纤13端口A滤波出射，被第二准直透镜12准直为平行光，随后由分光棱镜9分束，再通过色散物镜7照射到样品6和超振荡环带片5上，反射回的光线由色散物镜7接收，再返回到Y型多模光纤13端口B，再经端口C传输给光谱仪15。光束被光谱仪15接收后，根据标定测量曲线，得出超振荡环带片5和样品6之间的Z方向的实时距离，根据已知的超振荡环带片5最佳焦距，垂直移动超振荡环带片5将样品6准确定位到超振荡环带片5的最佳焦平面位置，固定样品6位置，转动物镜转盘，切换物镜为显微物镜8，并在超振荡环带片5和样品6位置保持不变的条件下，垂直微调显微物镜8位置将样品6清晰成像于CCD11像面上，此时完成全部调整，关闭白光LED光源14。示例地，显微物镜8为消色差显微物镜。

具体地，在样品6定焦完成后，利用主光路进行超分辨共焦扫描成像的步骤为：打开激光器1，激光器1发出的激光经第一准直透镜3准直成平行光后照射至超振荡环带片5上，光束经超振荡环带片5会聚成超分辨聚焦光斑至样品6上，经样品6产生的透射光由显微物镜8接收，然后经过管镜10会聚到CCD11的成像靶面上，采用相机面阵虚拟针孔进行共焦点探测，无须进行物理针孔的对准，采用图像针孔模板矩阵对实时光斑图像进行微小区域的截取、积分求和，由XY位移器对样品6进行二维扫描，利用共焦探测输出形成二维超分辨扫描光学成像。

为了验证所提出方法的可行性，本发明搭建了相应的实验验证装置，如图2所示。用超振荡环带片5作为底层，用两片约170μm厚的盖玻片搭建出一层近似为340μm厚的空气间隙(中空)作为实际定焦过程中的超振荡环带片焦距，然后再用一片约170μm厚度的盖玻片作为实际定焦过程中的样品6，真实的样品在盖玻片的下表面会有具体的待测结构。

由白色LED光源发出白色光束，光束经Y型多模光纤端口处针孔滤波出射，再通过色散物镜照射到样品和超振荡环带片上，反射回的光线由色散物镜接收，再传输给光谱仪。光谱仪经过光谱信号处理后得到波长-位移校准关系测量曲线，由测出的三个峰值的后两个峰值对应的波长，从预先测定的波长-位移校准关系测量曲线得出超振荡环带片和样品之间的Z方向的距离。对相同的340μm厚度的空气间隙，在色散物镜距离待测样品不同高度(即使用标定的波长-位移校准关系测量曲线的不同区间)下进行了5次实验，测得的样品和超振荡环带片的Z向距离如表1所示。测得的光谱响应实验曲线如图3所示。

表1样品和超振荡环带片的Z向距离实测值

图2中出现了三个光谱响应的峰值，对应为所测样品上表面、下表面和超振荡环带片上表面所对应的波长反射回去的峰值，而由第二个峰值和第三个峰值对应的波长带入预先测定的波长-位移校准关系测量曲线可以得到对应的位移，由它们之间的差值则可以得到超振荡环带片和样品Z向距离。

表1中样品厚度即为盖玻片厚度，出厂值约为170μm，可以看出，测量的结果准确，平均值的相对误差在0.1％；Z向间距即为超振荡环带片和样品的Z向距离，实际设计出的超振荡环带片焦距数量级为几百微米，所以用两片厚度约170μm的盖玻片搭建出一层厚度约340μm的空气间隙模拟为实际定焦过程中的超振荡环带片的焦距是具有现实意义。从结果可以看出，与理想的空气间隙相比，距离的变化是由于样品的制备是利用盖玻片支撑的，存在平整度不一和倾斜等因素造成的，另外盖玻片在叠加的过程中会产生一定的空气间隙，实际测量这些问题均可避免。

对于与现有超振荡环带片超分辨共焦光学显微镜样品定焦时十分缓慢不同，本方法不需要进行轴向扫描就可以实时测得超振荡环带片和样品的Z向距离，而且对于不同折射率表面的测量，也只需要测定一次波长-位移校准关系测量曲线即可。实验结果证明本发明所提出的基于光谱色散共焦的超振荡环带片扫描光学显微镜的样品实时精确定焦方法是具有实际可行性的。本发明提供的这种基于光谱色散共焦方法的超振荡环带片共焦扫描光学显微镜的样品实时精确定焦方法，无需进行轴向扫描，可在原位实现对样品进行实时、准确定焦。大大提高了超振荡环带片超分辨共焦光学显微镜的工作效率和可靠性。进一步推进了超振荡环带片超分辨光学显微镜在实现纯光学无标记远场超分辨显微成像的重要应用。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置，其特征在于，包括主光路和辅助定焦光路；

所述主光路，由激光器(1)出射激光，经单模光纤(2)进入第一准直透镜(3)后进入超振荡环带片(5)，然后经显微物镜(8)进入分光棱镜(9)，经分光棱镜(9)透射的部分进入管镜(10)并被CCD(11)接收，其中超振荡环带片(5)水平设置，样品(6)置于超振荡环带片(5)和显微物镜(8)之间，位于超振荡环带片(5)和显微物镜(8)的共轭焦点处；

所述辅助定焦光路，由白光LED光源(14)发出白光光束，经Y型多模光纤(13)的端口A进入第二准直透镜(12)，之后进入所述分光棱镜(9)，经分光棱镜(9)反射的部分进入色散物镜(7)形成沿轴的色散聚焦，样品(6)置于色散物镜(7)的测量范围内，其反射或散射光经所述分光棱镜(9)返回Y型多模光纤(13)，并从其端口B进入光谱仪(15)；

所述色散物镜(7)与显微物镜(8)处于同一位置，替换使用。

2.根据权利要求1所述超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦装置，其特征在于，所述激光器(1)出射的激光沿水平方向，在进入超振荡环带片(5)之前通过经反射镜(4)反射为竖直方向；所述白光LED光源(14)发出的白光光束沿水平方向，在进入色散物镜(7)之前经分光棱镜(9)反射为竖直方向。

3.利用权利要求1或2所述超振荡环带片共焦成像系统的样品实时定焦方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，利用光谱仪(15)的光谱响应曲线获得与样品(6)的下表面、超振荡环带片(5)的上表面对应的峰值波长；

步骤二，利用激光干涉仪对辅助定焦光路进行精确标定，得到一条波长-位移校准关系曲线，作为标定测量曲线；

步骤三，利用标定后的辅助定焦光路实现在原位对超振荡环带片(5)和样品(6)之间Z向距离的实时测量，并垂直移动样品(6)将其准确定焦至超振荡环带片(5)的最佳焦平面处。

4.根据权利要求3所述样品实时定焦方法，其特征在于，所述步骤一，白光光束经Y型多模光纤(13)形成点光源照明，经第二准直透镜(12)后由分光棱镜(9)分束，反射光束通过色散物镜(7)形成沿轴的色散聚焦，样品(6)的上下表面与超振荡环带片(5)上表面均处于轴向色散范围内，白光LED光源(14)聚焦的不同色光的连续聚焦将实时跟踪样品(6)与超振荡环带片(5)上不同高度位置的点，照射在样品(6)上下表面与超振荡环带片(5)上表面的反射或散射光再次进入Y型多模光纤(13)后由光谱仪(15)探测，光谱仪(15)探测的光谱响应曲线的三个峰值波长对应的光束恰聚焦于样品(6)的上下表面与超振荡环带片(5)上表面，此时实现了三点共轭聚焦成像，对应出现三个峰值波长，通过光谱信号处理，提取出与样品(6)的下表面、超振荡环带片(5)的上表面对应的峰值波长。

5.根据权利要求3所述样品实时定焦方法，其特征在于，以平面反射镜上表面为标定辅助定焦光路的待测表面，标定时，在保持色散物镜(7)不动的情况下，将平面反射镜上表面移动至色散物镜(7)工作范围的最低处，此时使用激光干涉仪对平面反射镜上表面的位置进行实时监控，以当前位置为位移零点，沿Z方向向上移动平面反射镜上表面，平面反射镜的反射或散射光进入光谱仪(15)，获得相应位移的峰值波长，实现平面反射镜的Z方向位移和光谱仪(15)经过光谱信号处理后得到的峰值波长相对应，由此得到一条波长-位移校准关系曲线。

6.根据权利要求3所述样品实时定焦方法，其特征在于，所述步骤三，在辅助定焦光路标定完成后，测量样品(6)和超振荡环带片(5)的Z向距离时，使用光谱仪(15)对光谱信号处理，提取出光强峰值对应的实际波长，将其代入标定测量曲线，即可求解得到样品(6)的位移值；当将超振荡环带片(5)和样品(6)共同作为待测物时，光谱响应曲线将出现三个峰值，第一个峰值对应样品(6)的上表面反射的波长峰值，第二个峰值对应样品(6)的下表面反射的波长峰值，第三个峰值对应超振荡环带片(5)的上表面反射的波长峰值，将第二个峰值和第三个峰值对应的波长代入标定测量曲线得到对应空气间隙，即超振荡环带片(5)与样品(6)的Z向距离。

7.根据权利要求6所述样品实时定焦方法，其特征在于，所述步骤三，对样品(6)精确定焦的过程为：切换物镜为色散物镜(7)，水平调整超振荡环带片(5)位置，使透过色散物镜(7)的光束光轴垂直通过其中心，将其固定；水平调整样品(6)，使光轴垂直聚焦于样品(6)的透明区域，粗调样品(6)与超振荡环带片(5)的Z向距离使其处于色散物镜(7)的测量范围内；白光LED光源(14)发出的白光光束沿辅助定焦光路被光谱仪(15)接收，根据标定测量曲线，得出超振荡环带片(5)和样品(6)之间的Z方向的实时距离，根据已知的超振荡环带片(5)最佳焦距，垂直移动超振荡环带片(5)将样品(6)准确定位到超振荡环带片(5)的最佳焦平面位置，固定样品(6)位置，切换物镜为显微物镜(8)，并在超振荡环带片(5)和样品(6)位置保持不变的条件下，垂直微调显微物镜(8)位置将样品(6)清晰成像于CCD(11)像面上，此时完成全部调整，关闭白光LED光源(14)。

8.根据权利要求3或7所述样品实时定焦方法，其特征在于，在样品(6)定焦完成后，打开激光器(1)，激光器(1)发出的激光经第一准直透镜(3)准直成平行光后照射至超振荡环带片(5)上，光束经超振荡环带片(5)会聚成超分辨聚焦光斑至样品(6)上，经样品(6)产生的透射光由显微物镜(8)接收，然后经过管镜(10)会聚到CCD(11)的成像靶面上，采用相机面阵虚拟针孔进行共焦点探测，无须进行物理针孔的对准，采用图像针孔模板矩阵对实时光斑图像进行微小区域的截取、积分求和，由XY位移器对样品(6)进行二维扫描，利用共焦探测输出形成二维超分辨扫描光学成像。

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