KR102566501B1 - 간섭-산란 현미경 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간섭-산란 현미경에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 샘플(1)이 배치되는 샘플 홀더(10), 샘플(1)에 입사되는 입사광(IL)을 조사하는 광원(20), 광원(20)에서 조사된 입사광(IL)을 샘플(1)에 입사시키고, 샘플 홀더(10)와 샘플(1)의 경계면에서 반사된 반사광 및 샘플(1)에서 산란된 산란광을 포함하는 출력광(OL)을 수집하는 제1 대물렌즈(30), 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)을 집속하는 제1 텔레센트릭 렌즈(40), 제1 텔레센트릭 렌즈(40)에서 집속된 출력광(OL)을 초점 공간 내로 투과시키는 제2 대물렌즈(50), 제2 대물렌즈(50)의 초점 공간 내에 배치되어, 투과된 출력광(OL)을 제2 대물렌즈(50)를 향해 반사시키고, 출력광(OL)의 광축 방향을 따라 이동 가능한 이동거울(60), 이동거울(60)에서 반사된 후 제2 대물렌즈(50)에 의해 수집된 출력광(OL)을 집속시키는 제1 튜브렌즈(70), 및 제1 튜브렌즈(70)에서 집속된 출력광(OL)을 검출하는 제1 검출기(80)를 포함한다.

Description

간섭-산란 현미경{INTERFEROMETRIC SCATTERING MICROSCOPY}
본 발명은 간섭-산란 현미경에 관한 것이다.
간섭-산란 현미경(Interferometric-scattering microscopy, iSCAT)은 빛의 간섭을 이용하여 가시광 파장보다 작은 사물을 감지하고 영상화하는 현미경 기술이다. 빛의 간섭이란 서로 다른 위상을 가진 두 개 이상의 파동들이 중첩되어 나타나는 현상으로, 위상차에 따라 보강 또는 상쇄 간섭이 발생한다. 간섭-산란 현미경은 사물에서 산란된 빛과 사물이 놓여있는 샘플의 표면(경계면)에서 반사된 빛의 간섭으로부터 수~수십 나노미터 크기의 사물을 검출해낼 수 있다. 특히 단백질을 단일 분자 수준에서 검출 및 영상화할 수 있고, 관측된 간섭-산란장의 광학적 강도로부터 대상 단백질 분자의 질량을 측정할 수도 있다.
전통적인 명시야(Bright-field) 현미경으로 관측 가능한 사물의 크기는 빛의 회절 한계 이내로 제한된다. 형광 기술의 발달로 광학적 분해능의 한계를 넘어 영상을 얻는 것이 가능하게 되었는데, 이를 초고해상도 형광 현미경 기술(Super-resolution fluorescence microscopy)이라고 한다. 하지만, 제한된 관측시간, 과도한 표지에 의한 광신호 포화 및 광독성에 의한 생물학적 시료의 손상은 형광 기술이 해결해야 하는 문제점으로 남아있다. 이러한 측면에서 간섭-산란 현미경은 높은 감도로 비표지(Label-free) 관찰이 가능하기에 형광 현미경 기술의 한계를 극복하는 기술이 될 수 있고, 레일리 산란 영역에 해당하는 작은 사물에 대한 직관적인 관측을 가능하게 할 뿐만 아니라, 고속 영상 촬영이 가능하기에 큰 잠재력을 가진 기술이라고 할 수 있다.
하기 선행기술문헌의 특허문헌에 개시된 바와 같이, 간섭-산란 현미경으로 취득되는 피관찰 대상체(사물)의 영상을 구성하는 빛은 기준장(Reference field), 산란장(Scattering field), 및 간섭장(Interference field)으로 구분된다. 여기서, 기준장은 피관찰 대상체가 내부에 분산된 샘플과 그 샘플이 배치되는 유리 기판 등의 경계면에서 반사된 빛이고, 산란장은 대상체에서 산란된 빛이며, 이 두 빛 간의 간섭현상으로 간섭장이 발생한다. 간섭장의 세기는 피관찰 대상체의 산란 단면적(Scattering cross-section)에 비례하여 변화할 뿐만 아니라, 두 빛 간의 위상 차이에 의한 상쇄와 보강 간섭에 큰 영향을 받는다. 위상 차이는 샘플의 바닥에서 반사된 기준장과 대상체에서 비롯된 산란장 간의 거리에 영향을 받으며, 위상 차이에 따라 간섭-산란장의 변조가 발생된다. 뿐만 아니라 대상체가 대물렌즈의 초점면에서 벗어나게 되면, 수집되는 빛의 양이 줄어들기 때문에 대상체의 초점상을 더 이상 볼 수 없게 된다.
일반적인 광학 현미경에서는 대물렌즈 또는 샘플 스테이지를 수직 방향으로 이동시켜서 대상체의 초점상을 얻는다. 하지만, 간섭-산란 현미경에서 초점면의 변경은 기준장의 변화를 유발시키므로, 항시 일관된 기준장에 대한 간섭-산란 신호를 측정할 수 없다. 결과적으로는 대상체에 해당하는 간섭-산란 신호가 영상화되는 수직 공간의 깊이는 현미경의 대물렌즈의 초점 심도 내로 한정된다. 따라서 3차원 공간 내에 흩어져 있는 사물에 대한 간섭-산란 신호에 대한 취득이 대물렌즈의 단일 초점면 부근으로 제한된다.
물론 대물렌즈 또는 샘플 스테이지의 수직 이동에 의한 초점면의 변경으로 대상체의 상을 취득할 수 있다. 일반적인 고배율 및 고개구수 대물렌즈의 초점 심도는 마이크로 미터 이내의 범위이며, 명확한 초점상을 구현하기 위해서는 나노미터 수준의 정밀도로 초점면이 변경되어야만 한다. 초점면을 정밀하게 변경하기 위해서 사용되는 이동장치는 통상적으로 압전소자를 구동체로 채택하여 제작함으로써, 나노미터 수준의 높은 정밀도로 이송시킬 수 있다. 다만, 그 속도가 매우 느릴 뿐만 아니라 고개구수의 대물렌즈들은 더욱 많은 빛을 수집하기 위해서 샘플의 표면과 대물렌즈 간의 굴절율 매칭(부합)을 위한 오일을 중간 매개체로 사용하기 때문에, 이동에 의한 대상체의 교반으로 관측된 영상의 질이 저하될 수 있고, 기준장의 변화가 유발될 수 있다.
이에 종래 간섭-산란 현미경의 상기 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있다.
KR 10-2019-0028448 A
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일 측면은 고개수의 대물렌즈가 수집한 빛을 또 다른 대물렌즈로 재구현하는 원격 재초점 시스템이 적용되어, 대물렌즈 또는 샘플의 수직 위치 이동 없이 샘플 내 사물에 대한 영상을 취득할 수 있는 간섭-산란 현미경을 제공하는 데 있다.
본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 샘플이 배치되는 샘플 홀더; 상기 샘플에 입사되는 입사광을 조사하는 광원; 상기 광원에서 조사된 상기 입사광을 상기 샘플에 입사시키고, 상기 샘플 홀더와 상기 샘플의 경계면에서 반사된 반사광 및 상기 샘플에서 산란된 산란광을 포함하는 출력광을 수집하는 제1 대물렌즈; 상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광을 집속하는 제1 텔레센트릭 렌즈; 상기 제1 텔레센트릭 렌즈에서 집속된 상기 출력광을 초점 공간 내로 투과시키는 제2 대물렌즈; 상기 제2 대물렌즈의 상기 초점 공간 내에 배치되어, 투과된 상기 출력광을 상기 제2 대물렌즈를 향해 반사시키고, 상기 투과된 상기 출력광의 광축 방향을 따라 이동 가능한 이동거울; 상기 이동거울에서 반사된 후 상기 제2 대물렌즈(50)에 의해 수집된 상기 출력광을 집속시키는 제1 튜브렌즈; 및 상기 제1 튜브렌즈에서 집속된 상기 출력광을 검출하는 제1 검출기;를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 광원으로부터 조사된 상기 입사광을 편향시키는 음향광학편향기; 상기 음향광학편향기에서 편향된 상기 입사광을 상기 제1 대물렌즈의 후초점면에 집속시키는 제2 텔레센트릭 렌즈; 입사된 평면에 대해 평행한 수평 편광은 투과시키되, 상기 입사된 평면에 대해 수직한 수직 편광은 반사시키도록 형성되어, 상기 제2 텔레센트릭 렌즈를 투과하고 편광된 상기 입사광을 투과시키고, 상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광을 반사시키는 제1 편광분리기; 및 상기 입사광 및 상기 출력광이 진행하는 상기 제1 편광분리기와 상기 제1 대물렌즈 사이의 제1 광경로 상에 배치되는 제1 4분할 파장판;을 더 포함하고, 상기 제1 4분할 파장판을 통과하여 상기 제1 대물렌즈의 후초점 면에 집속된 상기 입사광은, 상기 제1 대물렌즈를 통해, 편향된 각도에 따라 상기 샘플의 2차원 평면 상을 스캔하며, 상기 제1 4분할 파장판을 통과하고 상기 제1 편광분리기에서 반사된 상기 출력광은, 상기 제1 텔레센트릭 렌즈를 투과하여 상기 제2 대물렌즈의 후초점 면에 집속될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 광축 방향을 따르는 상기 제1 텔레센트릭 렌즈와 상기 제2 대물렌즈 사이의 제2 광경로 상에 배치되는 반파장판; 상기 제2 광경로 상에서 상기 반파장판과 상기 제2 대물렌즈 사이에 배치되고, 상기 수평 편광은 투과시키되, 상기 수직 편광은 반사시키도록 형성되는 제2 편광분리기; 및 상기 제2 광경로 상에서 상기 제2 편광분리기와 상기 제2 대물렌즈 사이에 배치되는 제2 4분할 파장판;을 더 포함하고, 상기 이동거울에서 반사된 출력광은 상기 제2 광경로 상을 따라 진행하다가 상기 제2 편광분리기에서 반사되어 상기 제1 튜브렌즈로 입사될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 제1 텔레센트릭 렌즈는, 제1 집광렌즈; 및 상기 제1 집광렌즈와 마주보도록 배치되는 제2 집광렌즈;를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 광원은, 레이저일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 제1 검출기는, 상기 출력광을 검출하여 전기적인 영상 신호로 변환하는 이미지 센서;를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광 중, 상기 입사광과 동일한 파장을 가지는 제1 출력광은 상기 제1 4분할 파장판을 향해 반사시키고, 상기 입사광과 다른 파장을 가지는 제2 출력광은 투과시키는 이색광필터;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 이색광필터를 투과한 상기 제2 출력광을 검출하는 제2 검출기;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경에 있어서, 상기 제2 검출기는, 전자증폭카메라일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 따르면, 일관된 기준장이 유지된 환경하에서 간섭-산란 현미경 검사법을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 샘플 내에서 이동하는 사물에 대한 초점상을 기존보다 더욱 빠르게 획득할 수 있게 할 수 있다.
어떤 입자가 세포와 같이 복잡한 구조물보다 높은 곳에 위치하여 명확한 초점상을 획득할 수 없을 경우에도, 원격 재초점 시스템이 적용되어 입자의 초점상을 빠르고 쉽게 획득할 수 있다. 특히, 대물렌즈 또는 샘플 스테이지의 이동이 없기 때문에 샘플에 어떠한 물리적 교란을 주지 않으므로, 외부 진동에 의한 예민한 측정이 요구되는 경우에 매우 유용할 수 있다.
도 1 내지 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경의 구성도이다.
도 3은 도 1에 도시된 원격 재초점 시스템의 원리를 설명하는 도면이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 간섭-산란 현미경의 구성도이다.
도 5는 실험예에서 제작된 간섭-산란 현미경의 구성도이다.
도 6의 (a)는 상기 도 5의 간섭-산란 현미경에서 샘플 스테이지를 이동해가면서 획득한 영상에서 입자의 중심부 영상을 샘플 스테이지의 위치 순서에 따라 누적한 이미지, 도 6의 (b)는 상기 간섭-산란 현미경에서 거울을 이동해가면서 획득한 영상에서 입자의 중심부 영상을 거울의 위치 순서에 따라 누적한 이미지, 도 6의 (c)는 도 6의 (a)에서 누적한 이미지의 중심선 (빨강)상의 세기 변화, 도 6의 (d)는 도 6의 (b)에서 누적한 이미지의 중심선 (빨강)상의 세기 변화, 도 6의 (e)는 입자의 상을 가장 선명하게 하는 샘플 스테이지 및 거울의 위치값의 관계 그래프를 각각 나타낸다.
본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.
도 1 내지 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경의 구성도이고, 도 3은 도 1에 도시된 원격 재초점 시스템의 원리를 설명하는 도면이다.
도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 샘플(1)이 배치되는 샘플 홀더(10), 샘플(1)에 입사되는 입사광(IL)을 조사하는 광원(20), 광원(20)에서 조사된 입사광(IL)을 샘플(1)에 입사시키고, 샘플 홀더(10)와 샘플(1)의 경계면에서 반사된 반사광 및 샘플(1)에서 산란된 산란광을 포함하는 출력광(OL)을 수집하는 제1 대물렌즈(30), 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)을 집속하는 제1 텔레센트릭 렌즈(40), 제1 텔레센트릭 렌즈(40)에서 집속된 출력광(OL)을 초점 공간 내로 투과시키는 제2 대물렌즈(50), 제2 대물렌즈(50)의 초점 공간 내에 배치되어, 투과된 출력광(OL)을 제2 대물렌즈(50)를 향해 반사시키고, 상기 투과된 출력광(OL)의 광축 방향을 따라 이동 가능한 이동거울(60), 이동거울(60)에서 반사된 후 제2 대물렌즈(50)에 의해 수집된 출력광(OL)을 집속시키는 제1 튜브렌즈(70), 및 제1 튜브렌즈(70)에서 집속된 출력광(OL)을 검출하는 제1 검출기(80)를 포함한다.
본 발명은 간섭-산란 현미경에 관한 것이다. 간섭-산란 현미경은 샘플(1) 내에 분산된 피관찰 대상체(사물)에서 산란된 산란광과 샘플(1)이 배치된 샘플 홀더(10)와 샘플(1) 사이의 경계면에서 반사된 반사광 간의 간섭으로 발생한 간섭광을 이용해 피관찰 대상체를 감지하고 영상화한다. 종래 간섭-산란 현미경은 대물렌즈 또는 샘플 홀더를 거치하는 샘플 스테이지를 수직 방향으로 이동시켜 피관찰 대상체의 초점상을 얻을 수 있는데, 명확한 초점상을 구현하기 위해서는 대물렌즈 또는 샘플 스테이지의 수직 이동에 의한 초점면의 변경이 매우 정밀해야 한다. 이러한 정밀한 초점면 변경을 위해 통상적으로 압전소자를 구동수단으로 사용하고 있으나, 그 속도가 매우 느린 문제가 있다. 또한, 고개구수의 대물렌즈들이 더욱 많은 반사광과 산란광을 수집할 수 있도록, 샘플의 표면과 대물렌즈 간의 굴절률 매칭(부합)을 위한 오일을 중간 매개체로 사용하고 있기 때문에 대물렌즈 또는 샘플 스테이지의 수직 이동에 의한 피관찰 대상체의 교반 및 반사광의 변화가 유발되어 빠르고 명확하게 초점상을 획득할 수 없다. 이러한 종래 간섭-산란 현미경의 문제점을 해결하기 위한 방안으로서, 본 발명이 안출되었다.
본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은, 샘플 홀더(10), 광원(20), 제1 대물렌즈(30), 제1 텔레센트릭 렌즈(40), 제2 대물렌즈(50), 이동거울(60), 제1 튜브렌즈(70), 및 제1 검출기(80)를 포함한다.
샘플 홀더(10)는 샘플(1)이 배치되는 장소를 제공하고, 배치된 샘플(1)은 샘플 홀더(10)의 표면에 접촉된다. 따라서, 샘플(1)과 샘플 홀더(10) 사이에 경계면이 형성된다. 샘플(1)의 내부에는 영상화되는 피관찰 대상체(사물)가 존재한다. 이러한 샘플(1)은 액상이거나 고상일 수 있고, 샘플 홀더(10)는 샘플 챔버 또는 유리 기판일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고 샘플(1)이 배치할 수 있는 형태이기만 하면 특별한 제한이 없다. 일례로, 샘플 홀더(10)는 유리 기판이고, 샘플(1)은 액상 샘플(1)로서 그 유리 기판상에 분주될 수 있다. 한편, 샘플 홀더(10)는 샘플 스테이지 상에 거치될 수 있다.
광원(20)은 광을 출력하는 장치로서, 샘플(1)에 입사되는 입사광(IL)을 조사한다. 이러한 광원(20)은 레이저일 수 있다.
제1 대물렌즈(30)는 광원(20)에서부터 조사된 상기 입사광(IL)을 샘플(1)에 입사시키고, 출력광(OL)을 수집한다. 출력광(OL)은 반사광과 산란광을 포함하는데, 반사광은 샘플(1)로 입사되는 입사광(IL) 중 일부가 샘플 홀더(10)와 샘플(1)의 경계면에서 반사된 광이고, 산란광은 입사광(IL) 중 다른 일부가 샘플(1), 즉 피관찰 대상체에 의해 산란된 광이다. 이러한 반사광과 산란광은 간섭하여 간섭광을 발생시킨다. 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)은 원격 재초점 시스템을 통해 피관찰 대상체를 이미지화한다.
원격 재초점 시스템은 제1 텔레센트릭 렌즈(Telecentric lens)(40), 제2 대물렌즈(50), 이동거울(60), 제1 튜브렌즈(Tube lens)(70), 및 제1 검출기(80)를 포함한다.
원격 재초점 시스템은 대물렌즈 또는 샘플(피관찰 대상체)의 수직 위치 이동에 의한 초점면 변경 없이 피관찰 대상체에 대한 영상을 취득할 수 있도록 구현된 기술로서, 도 3을 참고로 그 원리를 설명한다.
원격 재초점 시스템은 고개수의 대물렌즈(O1)가 수집한 모든 광을 또 다른 대물렌즈(O2)로 재구현한다. 사물 공간(Object space)에 있는 입자에서 비롯된 광을 대물렌즈 (O1)에 의해 수집된 후 튜브렌즈(TL1)의 초점면에 상을 형성하는데, 튜브렌즈(TL1)는 대물렌즈(O1)에 비해 보통 낮은 개구수를 가지기 때문에 초점면을 벗어난 입자에 대해서는 광학적 수차가 발생된 상이 형성된다. 이러한 현상은 튜브렌즈(TL1)의 상의 재현력이 대물렌즈(O1)보다 현저히 부족하기 때문이다. 하지만 튜브렌즈(TL1)를 통과한 모든 광을 고개구수의 대물렌즈(O2)를 통해 초점상을 구현하게 되면, 튜브렌즈(TL1)에서 발생된 수차를 보상할 수 있기에, 대물렌즈(O2)의 영상공간(Image space)에는 수차가 없는 상이 형성될 수 있다.
여기서, 제1 텔레센트릭 렌즈(40)는 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)을 집속한다. 일례로, 제1 텔레센트릭 렌즈(40)는 서로 마주보게 배치되는 제1 집광렌즈(41), 및 제2 집광렌즈(43)를 포함할 수 있다.
제2 대물렌즈(50)는 제1 텔레센트릭 렌즈(40)에서 집속된 출력광(OL)을 초점 공간 내로 투과시킨다. 여기서, 출력광(OL)은 제2 대물렌즈(50)에 의해 다시 상을 형성하는데, 이때 초점 공간 내에서 수차 없는 상이 재현된다.
이동거울(60)은 제2 대물렌즈(50)의 초점 공간 내에 배치되어 초점 공간으로 투과된 출력광(OL)을 다시 제2 대물렌즈(50)로 반사시킨다. 여기서, 이동거울(60)은 상기 투과된 출력광(OL)의 광축 방향을 따라 이동될 수 있다.
제1 튜브렌즈(70)는 이동거울(60)에서 반사되어 제2 대물렌즈(50)를 투과한 출력광(OL)을 집속시킨다.
제1 튜브렌즈(70)에 의해 집속된 출력광(OL)은 제1 검출기(80)로 투영되고, 제1 검출기(80)는 출력광(OL)을 검출하여, 샘플(1) 내 피관찰 대상체를 영상화한다. 이러한 제1 검출기(80)는 출력광(OL)을 검출하여 전기적인 영상 신호로 변환하는 이미지 센서를 포함할 수 있다. 이미지 센서의 일례로, CMOS 이미지 센서를 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
여기서, 이동거울(60)이 이동하게 되면, 제2 대물렌즈(50)의 초점 공간에 재현된 피관찰 대상체에 대한 수차 없는 상을 획득할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 음향광학편향기(90), 제2 텔레센트릭 렌즈(100), 제1 편광분리기(110), 제1 4분할 파장판(120)을 더 포함할 수 있다.
음향광학편향기(Acousto-Optic Deflector, AOD)(90)는 광원(20)으로부터 조사된 입사광(IL)을 편향시킨다.
제2 텔레센트릭 렌즈(Telecentric lens)(100)는 음향광학편향기(90)에서 편향된 입사광(IL)을 제1 대물렌즈(30)의 후초점 면에 집속시킨다. 제2 텔레센트릭 렌즈(100)는 서로 마주보는 제1 집광렌즈(101), 및 제2 집광렌즈(103)를 포함할 수 있다.
제1 편광분리기(Polarized Beam Splitter, PBS)(110)는 입사된 평면에 평행한 수평 편광은 투과시키되, 이에 수직한 수직 편광은 반사시키는 광학장치이다. 제1 편광분리기(110)는 입사광(IL) 및 출력광(OL)이 진행하는 제1 광경로 상에 배치된다. 따라서, 음향광학편향기(90)에서 편향되고, 제2 텔레센트릭 렌즈(100)를 거친 입사광(IL)은 제1 편광분리기(110)를 투과하여 제1 광경로를 따라 제1 대물렌즈(30)로 진행한다. 또한, 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)은 제1 광경로를 따라 제1 편광분리기(110)로 입사되어 반사된다.
제1 4분할 파장판(QuarterWave Plate, QWP)(120)은 제1 편광분리기(110)와 제1 대물렌즈(30) 사이의 제1 광경로 상에 배치된다. 따라서, 제1 편광분리기(110)를 투과하여 제1 대물렌즈(30)로 진행하는 입사광(IL)의 수평 편광은 제1 4분할 파장판(120)을 지나면서 원편광으로 변경된다. 한편, 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL)은 제1 4분할 파장판(120)을 통과하면서 수직 편광으로 변경되므로, 제1 편광분리기(110)에서 반사될 수 있다.
이렇게 제1 4분할 파장판(120)을 통과하여 제1 대물렌즈(30)의 후초점 면에 집속된 입사광(IL)은 제1 대물렌즈(30)를 통해, 편향된 각도에 따라 샘플(1)의 2차원 평면 상을 스캔한다. 한편, 제1 4분할 파장판(120)을 통과하고 제1 편광분리기(110)에서 반사된 출력광(OL)은 제1 텔레센트릭 렌즈(40)를 투과하여 제2 대물렌즈(50)의 후조첨 면에 집속되고, 원력 재초점 시스템을 통해 피관찰 대상체에 대한 수차 없는 상으로 구현되어 영상화된다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 간섭-산란 현미경의 원격 재초점 시스템은 반파장판(130), 제2 편광분리기(140), 및 제2 4분할 파장판(150)을 더 포함할 수 있다.
반파장판(Half-Wave plate, HWP)(130)은 상기 출력광(OL)의 광축 방향을 따르는 제1 텔레센트릭 렌즈(40)와 제2 대물렌즈(50) 사이의 제2 광경로 상에 배치될 수 있다. 따라서, 제1 4분할 파장판(120)을 통과하면서 수직 편광으로 변경되고, 제1 편광분리기(110)에서 반사된 후, 제1 텔레센트릭 렌즈(40)를 투과한 출력광(OL)은 반파장판(130)을 통과하면서 수평 편광으로 변경된다.
제2 편광분리기(Polarized Beam Splitter, PBS)(140)는 입사된 평면에 평행한 수평 편광은 투과시키되, 이에 수직한 수직 편광은 반사시키는 장치로서, 제2 광경로 상에서 반파장판(130)과 제2 대물렌즈(50) 사이에 배치된다. 따라서, 제1 텔레센트릭 렌즈(40)를 거쳐 반파장판(130)에서 수평 편광으로 변경된 출력광(OL)은, 제2 편광분리기(140)를 투과한다.
제2 4분할 파장판(QuarterWave Plate, QWP)(150)은 제2 광경로 상에서 제2 편광분리기(140)와 제2 대물렌즈(50) 사이에 배치된다. 따라서, 제2 편광분리기(140)를 투과한 출력광(OL)의 수평 편광은 원편광으로 변경되어, 제2 대물렌즈(50)의 후초점 면에 집속된다. 또한, 제2 대물렌즈(50)를 투과하고 이동거울(60)에서 반사된 출력광(OL)은 제2 대물렌즈(50)를 통해 제2 4분할 파장판(150)을 통과하면서 수직 편광으로 변경된다. 따라서, 수직 편광으로 변경되고 제2 광경로를 따라 진행하는 출력광(OL)은 제2 편광분리기(140)에서 반사되어, 제1 튜브렌즈(70)로 입사된 후에 제1 검출기(80)로 투영된다. 여기서, 제2 편광분리기(140) 및 제2 4분할 파장판(150)을 통해, 이동거울(60)에서 반사된 출력광(OL)만을 제1 검출기(80)에 투영시킬 수 있다.
종합적으로, 본 발명에 따르면 원격 재초점 시스템을 적용함으로써, 대물렌즈 또는 샘플 스테이지(피관찰 대상체)의 이동 없이, 이동거울의 광축 방향 이동을 통해서 제2 대물렌즈의 초점 공간에 재현된 피관찰 대상체에 대한 수차 없는 상을 획득하고 영상화할 수 있다. 또한, 일관된 기준장이 유지되는 환경하에서 간섭-산란 현미경 검사법을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 샘플 내에서 이동하는 사물에 대한 초점상을 기존보다 더욱 빠르게 획득할 수 있게 할 수 있다. 나아가, 어떤 입자가 세포와 같이 복잡한 구조물보다 높은 곳에 위치하여 명확한 초점상을 획득할 수 없을 경우에도, 원격 재초점 시스템이 적용되어 입자의 초점상을 빠르고 쉽게 획득할 수 있다. 특히, 대물렌즈 또는 샘플 스테이지의 이동이 없기 때문에 샘플에 어떠한 물리적 교란을 주지 않으므로, 외부 진동에 의한 예민한 측정이 요구되는 경우에 매우 유용할 수 있다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 간섭-산란 현미경의 구성도이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 도 1 내지 도 2를 참고로 설명한 간섭-산란 현미경의 구성 외에도, 이색광필터(160)를 더 포함할 수 있다.
이색광필터(Dichroic mirror, DM)(160)는 소정의 파장범위의 광은 반사하고, 다른 파장범위의 광은 투과시키는 필터로서, 제1 대물렌즈(30)에서 수집된 출력광(OL) 중 일부인 제1 출력광(OL1)은 반사시키고, 다른 제2 출력광(OL2)은 투과시킨다. 여기서, 제1 출력광(OL1)은 샘플(1)로 입사되는 입사광(IL)과 동일한 파장을 가지는 출력광(OL)이고, 제2 출력광(OL2)은 상기 입사광(IL)과 다른 파장을 가지는 출력광(OL)일 수 있다. 이때, 제2 출력광(OL2)은 입사광(IL)보다 더 큰 파장을 가질 수 있다. 이색광필터(160)에서 반사된 제1 출력광(OL1)은 제1 4분할 파장판(120)을 향해 진행한다. 여기서, 제1 4분할 파장판(120)을 통과한 입사광(IL)은 거울(M)에 의해 반사된 후, 이색광필터(160)에서 다시 반사되어 제1 대물렌즈(30)의 후초점 면에 집속되고, 제1 출력광(OL1)은 다시 거울(M)에 의해 반사되어 제1 4분할 파장판(120)을 통과할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 간섭-산란 현미경은 제2 검출기(170)를 더 포함할 수 있다.
제2 검출기(170)는 이색광필터(160)를 투과한 제2 출력광(OL2)을 검출한다. 일례로, 제2 검출기(170)는 전자증폭카메라(Electron Multiplication CCD, EMCCD)로서, 제2 출력광(OL2)이 전자증폭카메라에 초점상을 형성할 수 있다. 전자증폭카메라는 제2 출력광(OL2)에 의해 형광이 발생하고 이를 측정하는 경우에 이용될 수 있다. 한편, 이색광필터(160)를 통과한 제2 출력광(OL2)의 경로를 변경하는 경우에는 거울(M)을 사용할 수 있지만, 반드시 거울(M)을 이용해 경로를 변경해야 하는 것은 아니다.
이하에서는 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
1. 간섭-산란 현미경 제작
도 5는 실험예에서 제작된 간섭-산란 현미경의 구성도이다. 도 5에 도시된 바와 같이 간섭-산란 현미경을 제작하였다.
여기서, 레이저(Laser)에서 나오는 광은 음향광학편향기(AOD: Acousto-Optic Deflector)에서 진행 각도가 변경되며, 편향된 광은 텔레센트릭 렌즈 구성(L1, L2)에 의해서 대물렌즈(O1)의 후초점면으로 모인다. 이때 대물렌즈(O1)를 향해 진행하는 광의 편광은 편광분리기(PBS1) 및 4분할 파장판 (QWP1: QuarterWave Plate)를 지나면서 수평 편광(↕)된 광은 원편광으로 변경된다. 대물렌즈(O1)의 후초점면에 모인 광은 광축에 대한 편향각에 따라 샘플의 2차원 평면상을 훑어주게 된다. 이때 발생된 반사 및 산란된 광들은 대물렌즈(O1)으로 다시 수집되며, 입사되는 광의 파장보다 높은 파장의 광은 이색광필터(DM: Dichroic mirror)를 지나 전자증폭카메라(EMCCD: Electron Multiplication CCD)에 초점상을 형성한다. 입사되는 광과 동일한 파장으로 반사 및 산란된 광은 파장판(QWP1)을 지나면서 수직 편광(o)으로 변경되어, 편광분리기(PBS1)에서 반사된다. 반사된 모든 광은 광분리기(BS: Beam splitter)를 지나면서 반반(50:50)으로 나뉜다. 나뉜 광의 절반은 튜브렌즈(TL4)을 지나 iSCAT 채널의 sCMOS(Scientific CMOS) 카메라에 투영되며, 나머지 절반의 광은 원격 재초점 시스템(Remote Forcus System)으로 진행한다. 원격 재초점 시스템으로 진행한 광은 텔레센트릭 렌즈 구성(TL1, TL2)에 의해서 대물렌즈(O2)의 후초점면에 모이게 된다. 이 광들은 대물렌즈(O2)에 의해서 다시 상을 형성하는데, 이대 초점 공간 내에서 수차 없는 상으로 재현된다. 여기서, 대물렌즈(O2)의 초점 공간의 광을 거울(M)로 반사시킨 후 튜브렌즈(TL5)로 RF-iSCAT채널의 sCMOS로 투영한다. 거울(M)의 위치를 광축 방향으로 이동시키면, 대물렌즈(O2)의 초점 공간에 재현된 입자에 대한 수차 없는 상을 획득할 수 있다. 추가적으로 원격 재초점에서 사용한 반파장판(HWP: Half-Wave plate)은 수직 편광(o)되어 있는 기준장과 반사장을 수평 편광(↕)으로 변경하기 위해 사용되었으며, 편광분리기(PBS2)와 4분할 파장판(QWP2)은 거울(M)에서 반사된 광만을 sCMOS에 투영하기 위해서 사용되었다.
2. 간섭-산란 현미경의 특성 분석
원격 재초점 시스템이 적용된 간섭-산란 현미경의 특징을 규명하기 위해서 샘플 스테이지 및 거울(M)을 광축 방향으로 이동시켜 획득한 입자의 세기의 변화를 iSCAT 및 RF-iSCAT 채널에서 각각 측정하여 비교하고 그 결과를 도 6에 도시하였다. 실험에 사용한 샘플은 직경이 0.2㎛ 인 폴리스티렌 입자이며, 두께가 대략 5㎛로 경화된 PDMS 레이어 내부에 무작위로 분포하고 있다.
도 6의 (a)는 상기 도 5의 간섭-산란 현미경에서 샘플 스테이지를 이동해가면서 획득한 영상에서 입자의 중심부 영상을 샘플 스테이지의 위치 순서에 따라 누적한 이미지, 도 6의 (b)는 상기 간섭-산란 현미경에서 거울을 이동해가면서 획득한 영상에서 입자의 중심부 영상을 거울의 위치 순서에 따라 누적한 이미지, 도 6의 (c)는 도 6의 (a)에서 누적한 이미지의 중심선 (빨강, 주황)상의 세기 변화, 도 6의 (d)는 도 6의 (b)에서 누적한 이미지의 중심선 (빨강, 주황)상의 세기 변화, 도 6의 (e)는 입자의 상을 가장 선명하게 하는 샘플 스테이지 및 거울의 위치값의 관계 그래프를 각각 나타낸다.
도 6의 (a)는 샘플 스테이지를 수직 방향으로 이동시켜 가면서 획득한 입자 단면의 초점상 변화이며, 대물렌즈(O1)로 수집된 상의 변화가 iSCAT 및 RF-iSCAT채널로 동시에 투영되었다. 반면에, 샘플 스테이지는 고정된 채로 원격 초점 공간의 거울(M)을 이동시켜 획득한 도 6의 (b)의 경우에는 RF-iSCAT 채널의 상만이 변화하고 있음을 확인할 수 있으며, 이 변화는 도 6의 (a)의 RF-iSCAT 채널의 경우와 동일한 변화가 확인되었다.
샘플 스테이지 및 거울의 위치 변화에 따른 세기 변화 간의 관계를 규명하기 위해서 도 6의 (a)의 iSCAT 채널과 도 6의 (b)의 RF-iSCAT 채널에서 획득한 입자 중심에서의 세기가, 스테이지 및 거울의 축 방향 위치가 바뀜에 따라 어떻게 변하는지 확인하였다. 도 6의 (c)와 (d)는 샘플 스테이지 또는 거울의 축 방향 위치가 바뀜에 따라, 서로 다른 높이에 있는 3개의 입자에 대한 iSCAT 및 RF-iSCAT 채널에서 획득한 상에 발생하는 세기 변화이다. 모든 세기의 변화는 0 ~ 1의 범위로 정규화하였으며, 정규화 값이 0이 되는 지점은 입자의 초점상이 만들어지는 샘플 스테이지 및 거울의 위치이다. 이때, 각각의 위치를 명확하게 기술하기 위해서 정규화 세기가 0이 되는 부근을 중심으로 4차 다항 함수로 근사하였으며, 다항 함수의 기울기가 0이 되는 지점을 입자의 초점상이 형성되는 위치로 정하였다. 관측된 모든 입자에 대한 샘플 스테이지 및 거울의 위치 값을 도 6의 (e)의 그래프로 표시하였으며, 이들을 1차 선형 함수로 근사하였다. 여기서 밝혀낸 관계식에, RF-iSCAT 채널에서 획득한 입자의 초점상의 위치값을 입력하면, iSCAT 채널로 예상되는 입자의 초첨상의 샘플 스테이지의 위치 값을 알아낼 수 있다. 즉, 샘플 스테이지의 축 방향 이동에 따른 입자의 초점상의 변화는 물리적 이동에 의한 결과이다. 그러므로 샘플 스테이지의 수직 위치 값으로 샘플 내에서의 입자의 수직 위치를 측정할 수 있으며, 도 6의 (e)의 그래프는 거울의 이동만으로도 샘플 스테이지 이동에 의한 결과를 예측할 수 있게 한다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
1: 샘플 10: 샘플 홀더
20: 광원 30: 제1 대물렌즈
40: 제1 텔레센트릭 렌즈 41: 제1 집광렌즈
43: 제2 집광렌즈 50: 제2 대물렌즈
60: 이동거울 70: 제1 튜브렌즈
80: 제1 검출기 90: 음향광학편향기
100: 제2 텔레센트릭 렌즈 110: 제1 편광분리기
120: 제1 4분할 파장판 130: 반파장판
140: 제2 편광분리기 150: 제2 4분할 파장판
160: 이색광필터 170: 제2 검출기
IL: 입사광 OL: 출력광
OL1: 제1 출력광 OL2: 제2 출력광

Claims (9)

  1. 샘플이 배치되는 샘플 홀더;
    상기 샘플에 입사되는 입사광을 조사하는 광원;
    상기 광원에서 조사된 상기 입사광을 상기 샘플에 입사시키고, 상기 샘플 홀더와 상기 샘플의 경계면에서 반사된 반사광 및 상기 샘플에서 산란된 산란광을 포함하는 출력광을 수집하는 제1 대물렌즈;
    상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광을 집속하는 제1 텔레센트릭 렌즈;
    상기 제1 텔레센트릭 렌즈에서 집속된 상기 출력광을 초점 공간 내로 투과시키는 제2 대물렌즈;
    상기 제2 대물렌즈의 상기 초점 공간 내에 배치되어, 투과된 상기 출력광을 상기 제2 대물렌즈를 향해 반사시키고, 상기 투과된 상기 출력광의 광축 방향을 따라 이동 가능한 이동거울;
    상기 이동거울에서 반사된 후 상기 제2 대물렌즈에 의해 수집된 상기 출력광을 집속시키는 제1 튜브렌즈; 및
    상기 제1 튜브렌즈에서 집속된 상기 출력광을 검출하는 제1 검출기;를 포함하는 간섭-산란 현미경.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 광원으로부터 조사된 상기 입사광을 편향시키는 음향광학편향기;
    상기 음향광학편향기에서 편향된 상기 입사광을 상기 제1 대물렌즈의 후초점면에 집속시키는 제2 텔레센트릭 렌즈;
    입사된 평면에 대해 평행한 수평 편광은 투과시키되, 상기 입사된 평면에 대해 수직한 수직 편광은 반사시키도록 형성되어, 상기 제2 텔레센트릭 렌즈를 투과하고 편광된 상기 입사광을 투과시키고, 상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광을 반사시키는 제1 편광분리기; 및
    상기 입사광 및 상기 출력광이 진행하는 상기 제1 편광분리기와 상기 제1 대물렌즈 사이의 제1 광경로 상에 배치되는 제1 4분할 파장판;을 더 포함하고,
    상기 제1 4분할 파장판을 통과하여 상기 제1 대물렌즈의 후초점 면에 집속된 상기 입사광은, 상기 제1 대물렌즈를 통해, 편향된 각도에 따라 상기 샘플의 2차원 평면 상을 스캔하며,
    상기 제1 4분할 파장판을 통과하고 상기 제1 편광분리기에서 반사된 상기 출력광은, 상기 제1 텔레센트릭 렌즈를 투과하여 상기 제2 대물렌즈의 후초점 면에 집속되는 간섭-산란 현미경.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 광축 방향을 따르는 상기 제1 텔레센트릭 렌즈와 상기 제2 대물렌즈 사이의 제2 광경로 상에 배치되는 반파장판;
    상기 제2 광경로 상에서 상기 반파장판과 상기 제2 대물렌즈 사이에 배치되고, 상기 수평 편광은 투과시키되, 상기 수직 편광은 반사시키도록 형성되는 제2 편광분리기; 및
    상기 제2 광경로 상에서 상기 제2 편광분리기와 상기 제2 대물렌즈 사이에 배치되는 제2 4분할 파장판;을 더 포함하고,
    상기 이동거울에서 반사된 출력광은 상기 제2 광경로 상을 따라 진행하다가 상기 제2 편광분리기에서 반사되어 상기 제1 튜브렌즈로 입사되는 간섭-산란 현미경.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 텔레센트릭 렌즈는,
    제1 집광렌즈; 및
    상기 제1 집광렌즈와 마주보도록 배치되는 제2 집광렌즈;를 포함하는 간섭-산란 현미경.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 광원은, 레이저인 간섭-산란 현미경.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 검출기는,
    상기 출력광을 검출하여 전기적인 영상 신호로 변환하는 이미지 센서;를 포함하는 간섭-산란 현미경.
  7. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 대물렌즈에서 수집된 상기 출력광 중, 상기 입사광과 동일한 파장을 가지는 제1 출력광은 상기 제1 4분할 파장판을 향해 반사시키고, 상기 입사광과 다른 파장을 가지는 제2 출력광은 투과시키는 이색광필터;를 더 포함하는 간섭-산란 현미경.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 이색광필터를 투과한 상기 제2 출력광을 검출하는 제2 검출기;를 더 포함하는 간섭-산란 현미경.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 제2 검출기는, 전자증폭카메라인 간섭-산란 현미경.
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