CN103353675A - 基于微结构的移频超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微结构的移频超分辨显微成像方法，将入射照明光垂直照射在微结构上产生表面波，使用表面波对样品表面进行照明，并通过显微镜从远场接收强度图像；对所述的强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，使用移频算法对所得到的频谱进行还原，并得到相应的频谱还原图像；改变表面波导入样品的方向，直至覆盖0～360°，每次均上述步骤，得到不同方向下的频谱还原图像；对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；对所述的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。本发明还公开了一种基于微结构的移频超分辨显微成像装置。

Description

基于微结构的移频超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于微观观测测量领域，具体涉及一种基于微结构的移频超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括1～100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨显微术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。

自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在：物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大小；分子生物学的发展要求人们能观测到活体细胞这种高散射物质内小到纳米尺度的单分子；微电子技术的发展要求人们能检测到超大规模集成电路中窄到数十纳米的线宽尺寸；纳米新材料的出现要求人们能观测到纳米尺度大小的纳米颗粒等，这些现代科学的新进展，更加促使人们不断地去探索高分辨显微成像的新方法和新技术。

由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和1000nm。二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息（如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息），因而无法完全取代光学显微成像的地位。

随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术（Super-resolution Optical Microscopy,SROM）应运而生。根据原理不同，现有技术可以分为两大类：一类是以固体浸没透镜（Solid Immersion Lens，SIL）技术为代表的近场显微技术；另一类则是以激发抵制损耗显微镜（Stimulated Emission Depletion，STED）为代表的荧光显微技术。然后，两种现有技术都存在着一定的缺陷：前者虽然使用宽场照明，但很难将其分辨率压缩在100nm以下；后者则是基于荧光显微技术，无法使用于非荧光样品上，因此使用范围受到限制。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明基于微结构对于光场波矢的调制作用，提供了一种实现远场超分辨的方法，通过移频算法实现了超分辨显微图像获取。

一种基于微结构的移频超分辨显微成像方法，包括以下几个步骤：

1）将入射照明光垂直照射在微结构上产生表面波；

2）使用表面波对样品表面进行照明，并通过显微镜从远场接收强度图像；

3）对所述的强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，使用移频算法对所得到的频谱进行还原，并得到相应的频谱还原图像；

4）改变表面波导入样品的方向，直至覆盖0～360°，每次均重复步骤2）和步骤3），得到不同方向下的频谱还原图像；

5）对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；

6）对所述的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

所述的入射照明光为具有相同偏振方向、且波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振光。

所述的微结构是指具有亚波长空间周期的微结构阵列，如光栅，或点阵等具有多方向频率覆盖的二维图形微结构等，优选为光栅。周期性分布的结构的微结构可以使表面波的特定传导模式可以被选择性增强，从而使得产生的表面波具有限定的传输方向和光波矢大小。

在步骤4）中，表面波导入样品的方向改变次数由下式决定：

NUM=π/arcsin(k_m/k_s)

式中：k_m为显微镜最大截止频率，k_s为表面波横向光波矢。

本发明的工作原理是：

当准直后的单色光垂直照射在微结构上时，通过光栅衍射、散射等机制可以在微结构表面及其周围区域形成表面波。当微结构具有周期性分布的结构时，可以使表面波的特定传导模式可以被选择性增强，从而使得产生的表面波具有限定的传输方向和光波矢大小。表面波的横向光波矢可以由如下公式表示：

k_s=2Nπ/Λ

其中Λ为微结构的空间周期，N为正整数，考虑到衍射效率，一般取N=1。

由于表面波沿样品表面的横向光波矢大于入射照明光在自由空间内的光波矢，样品受到表面波照明时，其产生图像的空间频谱可以由如下公式表示：

$k_o=k_i\⊗k_s$

其中，k_i为样品的空间频谱分布。当表面波的传输方向和横向光波矢大小确定时，上述公式可以进一步简化为：

k_o=k_i-k_s

即发生移频现象。频谱移动方向与表面波的传输方向相同。当0<k_o≤k_m时（k_m为显微镜最大截止频率），原本不能分辨的样品表面亚波长细节信息，可以被移频至可传导频域内从而可以被显微镜从远场接收。通过对接收的强度图像进行傅里叶变换即可以直接得到k_o，再通过上述公式中的反运算k_i=k_o+k_s即可以将频谱还原。

如果表面波仅从单一方向对样品进行照明，其可移频的范围是有限的。对整个频谱面进行二维傅里叶展开，可知可移频通带范围是一个与显微镜通带等大的圆形区域。其相对于频谱原点的张角，可由如下公式确定：

$\mathrm{\&Theta;}=2\arcsin (k_m/k_s)$

其中，

为显微镜最大截止频率，NA为显微镜系统数值孔径，λ₀为照明光波长。如果样品表面只具有一维方向的亚波长细节，其对应的频谱图像也将呈一维分布，此时，理论上说只需要单方向倏逝场照明即可将整幅图像的频谱还原。但是，对于不能预知一维亚波长细节分布，或是需要观察具有二维方向亚波长细节的样品时，则需要进行全方向的移频计算。为了覆盖360°的方向角，需要改变入射光方向，进行重复多次的移频计算。所需要的最小移频次数为

$\mathrm{NUM}=2\mathrm{\&pi;}/\mathrm{\&Theta;}$

次数越多，则频谱信息的还原程度越高，但与此同时，所需要的计算时间则呈线性增加。因此，需要综合考虑系统的图像还原精度与算法消耗时间。

随后，对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，即可得到完整高频频谱图像。对得到的完整高频频谱图像进行反傅里叶变换，即可得到观察样品的超分辨显微图像。

本发明还提供了一种基于微结构的移频超分辨显微成像装置，包括沿光路依次布置的：

激光器，用于产生入射照明光；

微结构，利用入射照明光的垂直照射产生照射样品的表面波；

显微镜，用于收集样品表面的强度图像。

所有光学元件，包括激光器、微结构、显微镜和样品，均位于同轴光路上。其中，所述的激光器为发射具有相同偏振方向、且波长为380～780nm的可见单色线偏振光的激光器。

所述的微结构为具有亚波长空间周期的微结构阵列，如光栅、点阵等。优选为光栅，周期性分布的结构的微结构可以使表面波的特定传导模式可以被选择性增强，从而使得产生的表面波具有限定的传输方向和光波矢大小，便于对样品的照明。

所述的显微镜为100X放大非浸没光学显微镜，其数值孔径优选为0.8～0.95。

设有与所述微结构连接的平板介质波导，所述的样品放置在平板介质波导上。样品可以直接放置在微结构上，也可以放置在与微结构相连接的平板介质波导上。在后一种情况下，平板介质波导的传输模式应该与所产生的表面波的传输方向和横向光波矢大小相匹配。

本发明具有以下有益的技术效果：

（1）分辨率精细度高，当工作波长为600nm时，理论分辨率极限可达75nm；

（2）结构简单，成本低廉；

（3）采用宽场成像方式，图像获取速度远高于扫描成像方式，可以获取观察样品的即时动态图像，系统图像刷新率高；

（4）适用性强，对样品本身材质无要求。

附图说明

图1为本发明的基于微结构的移频超分辨显微成像装置的结构原理图；

图2为本明中微结构的示意图；

图3为本发明采用微结构连接平板介质波导后的结构原理图；

图4为本发明中单方向照明情况下移频通带的示意图；

图5为本发明中经过合成后的完整高频频谱图像的示意图。

图中，激光器1，微结构2，显微镜3，样品4，平板介质波导5。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

图1为本发明的基于微结构的移频超分辨显微成像装置的结构原理图。

如图1所示，基于微结构的移频超分辨显微成像装置，包括：激光器1，微结构2，显微镜3，样品4。

激光器1、微结构2、显微镜3和样品4位于同轴光路上。由激光器1中发出的入射照明光，垂直照射在微结构2上。其中，所述的入射照明光，是指具有相同偏振方向、波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振准直光。所述的微结构2，是指具有亚波长空间周期的微结构阵列，如光栅、点阵等等，优选为光栅，如图2所示。

此时，由于微结构2的特征尺寸小于入射照明光波长，通过光栅衍射、散射等机制可以在微结构表面及其周围区域形成表面波。当微结构2具有周期性分布的结构时，可以使表面波的特定传导模式可以被选择性增强，从而使得产生的表面波具有限定的传输方向和光波矢大小。表面波的横向光波矢可以由如下公式表示：

k_s=2Nπ/Λ

其中Λ为微结构的空间周期，N为正整数，考虑到衍射效率，一般取N=1。

为了使产生的表面波照明样品4，可以将样品4直接放置在微结构2上，也可以将样品放置在一个与微结构2与微结构相连接的平板介质波导5上，如图3所示。在后一种情况下，平板介质波导5的传输模式应该与所产生的表面波的传输方向和横向光波矢大小相匹配。经过样品4散射所产生的光强分布由显微镜3在远场接收成为强度图像。该强度图像的空间频谱可以由如下公式表示：

$k_o=k_i\&CircleTimes;k_s$

其中，k_i为样品4原有的空间频谱分布。当表面波的传输方向和横向光波矢大小确定时，上述公式可以进一步简化为：

k_o=k_i-k_s

即发生移频现象。频谱移动方向与表面波的传输方向相同。当0<k_o≤k_m时（

为显微镜最大截止频率），原本不能分辨的样品4表面亚波长细节信息，可以被移频至可传导频域内从而可以被显微镜从远场接收。通过对接收的强度图像进行傅里叶变换即可以直接得到k_o，再通过上述公式中的反运算k_i=k_o+k_s即可以将频谱还原。将还原后的频谱进行傅里叶变换，即可以得到相应的频谱还原图像。

如果表面波仅从单一方向对样品4进行照明，其可移频的范围是有限的。对整个频谱面进行二维傅里叶展开，可知可移频通带范围是一个与显微镜3通带等大的圆形区域，如图4所示。图中的实线区域为显微镜3通带区域范围，虚线区域则为可移频通带范围。因此，本发明系统的截止频率可以写为k_max=k_s+k_m。为获得尽可能高的系统分辨能力，在系统参数固定的前提下，应使k_s和k_m尽可能大。根据k_s的计算公式，应使微结构保持较小的空间周期。同时，为获得较大的km，应当使所述的显微镜3为100X放大非浸没光学显微镜，其数值孔径优选为0.8～0.95。

移频通带范围相对于频谱原点的张角，可由公式

确定。如果样品表面只具有一维方向的亚波长细节，其对应的频谱图像也将呈一维分布，此时，理论上说只需要单方向倏逝场照明即可将整幅图像的频谱还原。但是，对于不能预知一维亚波长细节分布，或是需要观察具有二维方向亚波长细节的样品时，则需要进行全方向的移频计算。为了覆盖360°的方向角，需要改变表面波的导入方向，进行重复多次的移频计算。由于表面波的传输方向与微结构2的周期方向相同，为实现多角度的入射光，需要旋转微结构2对表面波的导入方向加以改变，直至覆盖0～360°。每次旋转改变角度与移频通带范围相对于频谱原点的张角相同，由所需要的最少旋转次数由最少移频次数决定，可以表示为

$\mathrm{NUM}=2\mathrm{\&pi;}/\mathrm{\&Theta;}$

相对而言，次数越多，则频谱信息的还原程度越高，但与此同时，所需要的计算时间则呈线性增加。因此，需要综合考虑系统的图像还原精度与算法消耗时间。最终得到的频谱是各次结果的叠加，即可以得到完整的高频频谱图像，如图5所示。最终，对得到的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

本系统的理论极限分辨能力可以由系统的截止频率进行计算，其计算公式为

$r=\frac{\mathrm{\&pi;}}{k_{\max }}$

将k_max的表达式代入，即可得到系统的理论极限分辨能力。例如：当使用入射照明光中心波长为600nm、所用微结构2光栅周期为200nm时，经过计算可得理论极限分辨率为75nm。

Claims (10)

1.一种基于微结构的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）将入射照明光垂直照射在微结构上产生表面波；

2）使用表面波对样品表面进行照明，并通过显微镜从远场接收强度图像；

3）对所述的强度图像进行傅里叶变换得到相应频谱，使用移频算法对所得到的频谱进行还原，并得到相应的频谱还原图像；

4）改变表面波导入样品的方向，直至覆盖0～360°，每次均重复步骤2）和步骤3），得到不同方向下的频谱还原图像；

5）对不同方向下的频谱还原图像进行叠加，得到完整的高频频谱图像；

6）对所述的完整高频频谱图像进行傅里叶反变换，得到观察样品的超分辨显微图像。

2.如权利要求1所述的基于微结构的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，所述的入射照明光为具有相同偏振方向、且波长在380～780nm范围内的可见单色线偏振光。

3.如权利要求1所述的基于微结构的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，所述的微结构为光栅或点阵。

4.如权利要求3所述的基于微结构的移频超分辨显微成像方法，其特征在于，在步骤4）中，表面波导入样品的方向改变次数由下式决定：

NUM=π/arcsin(k_m/k_s)

式中：k_m为显微镜最大截止频率，k_s为表面波横向光波矢。

5.一种基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，包括沿光路依次布置的：

激光器，用于产生入射照明光；

微结构，利用入射照明光的垂直照射产生照射样品的表面波；

显微镜，用于收集样品表面的强度图像。

6.如权利要求5所述的基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的激光器为发射具有相同偏振方向、且波长为380～780nm的可见单色线偏振光的激光器。

7.如权利要求6所述的基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的微结构为具有亚波长空间周期的微结构阵列或具有多方向频率覆盖的二维图像微结构。

8.如权利要求7所述的基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的微结构为光栅或点阵。

9.如权利要求5所述的基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的显微镜为100X放大非浸没光学显微镜，其数值孔径为0.8～0.95。

10.如权利要求9所述的基于微结构的移频超分辨显微成像装置，其特征在于，设有与所述微结构连接的平板介质波导，所述的样品放置在平板介质波导上。

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