CN106526823B - 一种dna纳米球非荧光非直观显微成像装置及方法 - Google Patents

一种dna纳米球非荧光非直观显微成像装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置。该装置包括计算机、电机驱动器、黑白CCD相机、微型电机、波片、起偏器、检偏器。方法为：将DNA微阵列样品放置与金相显微镜的载物台，打开金相显微镜的光源对载物台上的样品进行照明，同时由计算机驱动电机驱动器和黑白CCD相机，控制微型电机转动和黑白CCD采图，其中微型电机控制起偏器进行周期性的转动，每转动固定角度黑白CCD相机通过波片和检偏器进行一次采图，多次采样得到多幅带有不同偏振信息的图，CCD相机所采集的带有不同偏振信息的图输入计算机进行处理，从而获得待测DNA微阵列中DNA纳米球的非直观图。本发明具有无损试样、成本低、效率高和分辨率高的优点。

Description

一种DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置及方法
技术领域
本发明属于基因检测光学成像技术领域，特别是一种DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置及方法。
背景技术
基因测组作为目前生物学领域最炙手可热的专业门类之一，近几年在国内外均得到了快速的发展，它不仅能够追踪传染病途径，还能预测个体化疾病风险，有效预测癌症、糖尿病、唐氏综合征等多种疾病，从而为后期的防御和治疗提供有效的帮助。
在当前所有的测序技术中，第三代测序技术处于领先地位，其中技术较为完善的是采用荧光成像光学检测方法的测序方法。然而由于红光的衍射极限，基因测序芯片上DNA纳米球间距只能控制在600纳米，而进一步提高这个方法的测量效率受到分辨力和测量速度的限制。因此DNA测序需要采用能够突破衍射极限的光学超显微成像技术来进一步提高测量效率。在现有显微成像领域，传统光学显微受衍射极限影响，分辨率被限制在100nm左右。分辨率最高的是以电子和离子等非光学信息为载体的显微技术，如扫描电子显微镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)等，能实现0.1nm级分辨，而扫描隧道显微镜(STM)则能实现0.01nm级分辨。但是，这些高分辨显微技术都有测量效率低、环境适应性差、易对试样造成损伤、制造和使用价格高等问题，满足不了基因测序的实际工程需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无损试样、成本低、效率高、分辨率高的DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置及方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，包括计算机、电机驱动器、金相显微镜模块，其中金相显微镜模块包括黑白CCD相机、微型电机、波片、起偏器和检偏器，起偏器设置于金相显微镜的灯室前面，该起偏器通过微型电机带动进行旋转，金相显微镜的物镜与黑白CCD相机之间设置一个波片，波片与黑白CCD相机之间设置检偏器；计算机通过电机驱动器接入微型电机，黑白CCD相机与计算机连接；
将待测DNA微阵列放置于金相显微镜的载物台，打开金相显微镜的光源对载物台上的样品进行照明，同时由计算机驱动电机驱动器和黑白CCD相机，控制微型电机转动和黑白CCD相机采图，其中微型电机控制起偏器进行周期性的转动，每转动固定角度黑白CCD相机通过检偏器和波片进行一次采图，多次采样得到多幅带有不同偏振信息的图，CCD相机所采集的带有不同偏振信息的图输入计算机进行处理，从而获得待测DNA微阵列芯片上的DNA纳米球的非直观图像。
优选地，所述微型电机采用伺服电机，伺服电机控制速度可在0-20°/s范围内变动，位置精度可达到0.02°。
优选地，所述起偏器与检偏器均可透过可见光波段的光。
优选地，所述波片为1/4波片。
一种基于所述DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置的DNA纳米球非荧光非直观显微成像方法，步骤如下：
步骤1、将未经染色处理的DNA微阵列作为试样置于金相显微镜的载物台上；
步骤2、打开金相显微镜的灯室对载物台上的DNA微阵列芯片进行照明，利用黑白CCD相机获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机；
步骤3、通过电机驱动器驱动微型电机控制起偏器进行周期性的转动，并且通过黑白CCD相机采集图像，获得多幅光强图并输入计算机；
步骤4、计算机根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；
步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得DNA微阵列中DNA纳米球的相位差非直观图像、方位角非直观图像；
步骤6、根据相位差、方位角，通过Mueller矩阵确定Stokes参量并进行Stokes参数非直观成像。
进一步地，步骤6所述根据相位差、方位角，通过Mueller矩阵确定Stokes参量并进行Stokes参数非直观成像，所采用的公式为：
式中，Idp是像素点所在每幅图的平均光强信息，δ是相位差，是方位角，S0、S1、S2、S3是Stokes的四个参数。
本发明与现有的技术相比，其显著优点为：(1)无损试样：本发明采用的是光学成像方法，对基因试样直接成像，不需对试样进行表面处理，不会对试样造成损坏或污染。(2)成本低：本发明的成本较低，主要是由光学元件构成，一台金相显微镜，多个偏振器件，一台计算机，一个电机组成，视场较大，不需要扫描，不需对基因进行染色等。(3)分辨率高：由于该方法采用了非直观成像方法，利用偏振参数成像，通过计算多幅图像，对点扩散函数进行瘦身，从而绕开了衍射极限，获得高分辨率的假彩色图像。(4)效率高：本发明采用的是光学成像方法，成像速度快，获得各种偏振态下的图像过程可控制在5分钟以内。
附图说明
图1是本发明DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置的结构示意图。
图2是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球普通显微镜直接成像效果图。
图3是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像相位差效果图。
图4是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像方位角效果图。
图5是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像去偏效果图。
图6是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像S0效果图。
图7是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像S1效果图。
图8是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像S2效果图。
图9是本发明实施实例中DNA微阵列的DNA纳米球非荧光非直观显微成像S3效果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明利用非荧光非直观光波参数图进行DNA纳米球形貌结构分析，其中非荧光非直观光波参数图是指利用成像光的相位差、位相角、Stokes参数进行成像。DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置的优势在于不需要对DNA微阵列试样进行染色处理，不会对试样造成损伤，通过测量拟合来强化光学显微系统的分辨。该装置主要是依据一台普通的金相显微镜进行改造，所以大大降低了装置的设计难度。
本发明的DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，包括依次连接的计算机1、电机驱动器2和金相显微镜模块，所述金相显微镜模块包括黑白CCD相机3、检偏器4、波片5、微型电机6和起偏器7，其中起偏器7设置于金相显微镜的灯室8前，该起偏器7在微型电机6的控制下进行旋转，微型电机6在电机驱动器2的驱动下工作，所述电机驱动器2在计算机1的控制下工作，起偏器7的前方设置分束镜10，金相显微镜的物镜9与黑白CCD相机3之间设置一个波片5，波片5与黑白CCD相机3之间设置检偏器4，所述分束镜10同时位于波片5与金相显微镜的物镜9之间，黑白CCD相机3与计算机1连接，将检测到的信息传输给计算机1；
金相显微镜的灯室8发出的光线通过起偏器7调制后由分束镜10反射后通过金相显微镜的物镜9照射到试样11上，经试样反射后的光线依次通过金相显微镜的物镜9、分束镜10、波片5、检偏器4后由黑白CCD相机3采集。
将未经染色处理的DNA微阵列作为试样11放置于金相显微镜的载物台，打开金相显微镜的灯室8对载物台上的样品进行照明，同时由计算机1驱动电机驱动器2和黑白CCD相机3，控制微型电机6转动和黑白CCD相机3采图，其中微型电机6控制起偏器7进行周期性的转动，每转动固定角度黑白CCD相机3通过检偏器4和波片5进行一次采图，多次采样得到多幅带有不同偏振信息的图，黑白CCD相机3所采集的带有不同偏振信息的图输入计算机1进行处理，从而获得待测DNA微阵列芯片上DNA纳米球的非直观图像。
所述微型电机6采用伺服电机，伺服电机控制速度可在0-20°/s范围内变动，位置精度可达到0.02°。
所述起偏器7与检偏器4均可透过可见光波段的光。
所述波片5为1/4波片。
非直观算法的基本原理是：利用光的偏振信息进行成像，对于各向异性的样品进行成像，通过利用线性双折射的物理模型，获得多幅不同偏振态下的光强信息，通过光强表达式，通过利用计算傅里叶级数系数的方法，获得所需要的参数，从而获得所需要的参数图。
本发明基于权所述DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置的DNA纳米球非荧光非直观显微成像方法，步骤如下：
步骤1，将未经染色处理的DNA微阵列作为试样11置于金相显微镜的载物台上；
步骤2，打开金相显微镜的灯室8对载物台上的DNA微阵列芯片进行照明，利用金相显微镜和黑白CCD相机3获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机1；
步骤3，通过电机驱动器2驱动微型电机6控制起偏器7进行周期性的转动，并且通过黑白CCD相机3采集图像，获得多幅光强图并输入计算机1；
所述的微型电机6控制起偏器7进行周期性旋转，可以获得不同相位延迟下的图像，为非直观光波参数成像提供足够的光强信息。
步骤4，计算机1根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角，具体如下：
根据Jones矩阵得到光强函数I(ω)，
其中I0是扣除系统和样品吸收后的光强，是系统透射率的最大值，通过多组光强函数的值拟合得到方位角和相位差δ，ω是起偏器旋转的角度。
步骤5，利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得待测DNA微阵列样品的相位差非直观图像、方位角非直观图像。
步骤6，根据相位差、方位角，通过Mueller矩阵确定Stokes参量并进行Stokes参数非直观成像，所采用的公式为：
式中，Idp是像素点所在每幅图的平均光强信息，δ是相位差，是方位角，S0、S1、S2、S3是Stokes的四个参数。
本发明是利用偏振参数进行DNA纳米球非荧光成像。先利用偏振调制，得到多幅单偏振状态下的图像，从中进行参数提取，得到利用各参数值进行成像的图像。与直接利用远场的光强进行成像相比，偏振参数对于物体结构各项异性的变化更加的灵敏，更为重要的是通过利用均方根拟合，筛选出拟合度高于95％的像素点，使得PSF宽度变窄，这样就可以突破光学成像的衍射极限，大大提高了成像的分辨率。因此，本发明提供了一种新的基因检测光学显微成像的方法，该方法基于非直观参数成像技术，突破了衍射极限，获得了高分辨率图像。
综合探测方法和所采用的微型电机，伺服电机能够快速而精确的控制起偏器的旋转与定位，从而实现不同偏振状态的精确调制，且提高了成像的分辨率，该方法的优势是不需要进行扫描，不需对样品进行染色，无损样品，大大提高了成像效率并降低了成本。
综上，本发明主要有四大优势：(1)无需染色处理、无损样品，(2)成像速度快，(3)成本低，(4)成像的分辨率高。
下面结合实施例进行更详细的描述。
实施例1
下面结合附图详细介绍该发明装置和实现对样品进行光波参数成像的步骤。
(1)结合附图详细介绍该发明装置：
结合图1，本发明利用非荧光非直观光波参数图进行DNA纳米球结构分析的装置，包括依次连接的计算机1、电机驱动器2和金相显微镜模块，所述金相显微镜模块包括黑白CCD相机3、检偏器4、波片5、微型电机6和起偏器7，其中起偏器7设置于金相显微镜的灯室8前，该起偏器7在微型电机6的控制下进行旋转，微型电机6在电机驱动器2的驱动下工作，所述电机驱动器2在计算机1的控制下工作，起偏器7的前方设置分束镜10，金相显微镜的物镜9与黑白CCD相机3之间设置一个波片5，波片5与黑白CCD相机3之间设置检偏器4，所述分束镜10同时位于波片5与金相显微镜的物镜9之间，黑白CCD相机3与计算机1连接，将检测到的信息传输给计算机1；
金相显微镜的灯室8发出的光线通过起偏器7调制后由分束镜10反射后通过金相显微镜的物镜9照射到试样11上，经试样反射后的光线依次通过金相显微镜的物镜9、分束镜10、波片5、检偏器4后由黑白CCD相机3采集。
将未经染色处理的DNA微阵列作为试样11放置于金相显微镜的载物台，打开金相显微镜的灯室8对载物台上的样品进行照明，同时由计算机1驱动电机驱动器2和黑白CCD相机3，通过已集成好的算法软件，控制微型电机6转动和黑白CCD相机3采图，其中微型电机6控制起偏器7进行周期性的转动，利用金相显微镜模块成像进行采图，获得多幅带有不同偏振信息的图，进行计算获得理想的非荧光非直观光波参数图像。伺服电机控制速度可在0-20°/s范围内变动，位置精度可达到0.02°。起偏器7与检偏器4均可透过可见光波段的光。波片5为1/4波片，能够将慢轴的相位延迟π/2。微型电机6控制起偏器7进行周期性旋转，可以获得不同偏振状态下的图像，为非直观光波参数成像提供足够的光强信息。计算机1中的算法集成软件，可以将所获得多幅光强图进行非直观算法的计算，最终获得各种参数图像，也就是非直观光波参数图像。
(2)实现对该装置的光波参数成像方法的具体步骤如下：
步骤1，将未经染色处理的DNA微阵列作为试样(11)置于金相显微镜的载物台上；
步骤2，打开金相显微镜的灯室8对载物台上的DNA微阵列芯片进行照明，利用金相光学显微镜和黑白CCD相机3获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机1；如图2所示。
步骤3，通过电机驱动器2驱动微型电机6控制起偏器7进行周期性的转动，并且通过黑白CCD相机3采集图像，获得多幅光强图并输入计算机1；
步骤4，由步骤3所得到的图像，由计算机1通过集成好的软件进行非直观显微成像的算法运算，从而获得光强图的相位差，方位角等参数信息。
步骤5，利用每一种参数的值形成一幅灰度图像，其中每点的灰度值代表参数值的大小，也可以对不同颜色进行赋值，形成假彩色图像，通过算法也可以调整成像的对比度，获得较高对比度的相位差非直观图像、方位角等非直观图像，如图3、图4和图5所示；
步骤6，根据相位差、方位角，通过Mueller矩阵确定Stokes参量并进行Stokes参数非直观成像，如图6、图7、图8和图9所示。
对获得的图像进行处理，可以获得分辨率较高的图像。主要是采用了参数的非直观算法，通过点扩散函数的瘦身，从而打破了分辨率的极限，从而获得了较高的分辨率成像。非直观算法的基本原理主要是利用光的偏振信息进行成像，对于各向异性的样品进行成像，通过利用线性双折射的物理模型，获得多幅不同偏振态下的光强信息，通过光强表达式，可以通过利用计算傅里叶级数系数的方法，获得我们所需要的参数，从而获所需要的参数图。
除了可以将计算出来的位相差，偏振方位角等参数进行成像，还可以利用通过Mueller矩阵计算出的Stokes参量进行参数成像，如下式所示：
式中，Idp是像素点所在每幅图的平均光强信息，δ是相位差，是方位角，S0、S1、S2、S3是Stokes的四个参数。
综上，本发明通过在普通的金相显微镜的改造，增加了非荧光非直观光波参数成像的核心部件，通过多次测量不同偏振态下的光强图，反演计算获得分辨率比原光强图更好的效果图，同时由于非直观算法对于散射光更加的敏感。相对于传统的光学成像方法具有分辨率高的优势，相较于传统的基因检测光学显微成像器械具有成本低，速度快，无需染色的优势。

Claims (5)

1.一种DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，其特征在于，包括依次连接的计算机(1)、电机驱动器(2)和金相显微镜模块，所述金相显微镜模块包括黑白CCD相机(3)、检偏器(4)、波片(5)、微型电机(6)和起偏器(7)，其中起偏器(7)设置于金相显微镜的灯室(8)前，该起偏器(7)在微型电机(6)的控制下进行旋转，微型电机(6)在电机驱动器(2)的驱动下工作，所述电机驱动器(2)在计算机(1)的控制下工作，起偏器(7)的前方设置分束镜(10)，金相显微镜的物镜(9)与黑白CCD相机(3)之间设置一个波片(5)，波片(5)与黑白CCD相机(3)之间设置检偏器(4)，所述分束镜(10)同时位于波片(5)与金相显微镜的物镜(9)之间，黑白CCD相机(3)与计算机(1)连接，将检测到的信息传输给计算机(1)；
金相显微镜的灯室(8)发出的光线通过起偏器(7)调制后由分束镜(10)反射后通过金相显微镜的物镜(9)照射到试样(11)上，经试样反射后的光线依次通过金相显微镜的物镜(9)、分束镜(10)、波片(5)、检偏器(4)后由黑白CCD相机(3)采集。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，其特征在于，所述微型电机(6)采用伺服电机，伺服电机控制速度可在0-20°/s范围内变动，位置精度至少为0.02°。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，其特征在于，所述起偏器(7)与检偏器(4)均可透过可见光波段的光。
4.根据权利要求1所述的DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置，其特征在于，所述波片(5)为1/4波片。
5.一种基于权利要求1所述DNA纳米球非荧光非直观显微成像装置的DNA纳米球非荧光非直观显微成像方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1、将未经染色处理的DNA微阵列作为试样(11)置于金相显微镜的载物台上；
步骤2、打开金相显微镜的灯室(8)对载物台上的DNA微阵列进行照明，利用黑白CCD相机(3)获得一幅光强图片，作为未被处理的原始图像并输入计算机(1)；
步骤3、通过电机驱动器(2)驱动微型电机(6)控制起偏器(7)进行周期性的转动，并且通过黑白CCD相机(3)采集图像，获得多幅光强图并输入计算机(1)；
步骤4、计算机(1)根据输入的光强图确定光强图的相位差和方位角；
步骤5、利用步骤4所得相位差、方位角的值分别形成灰度图像，所述灰度图像中每点的灰度值代表相位差或方位角的大小，对不同颜色进行赋值形成假彩色图像，调整成像的对比度获得DNA微阵列中DNA纳米球的相位差非直观图像、方位角非直观图像；
步骤6、根据相位差、方位角，通过Mueller矩阵确定Stokes参量并进行Stokes参数非直观成像；
所采用的公式为：
式中，Idp是像素点所在每幅图的平均光强信息，δ是相位差，是方位角，S0、S1、S2、S3是Stokes参量的四个参数。
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"相干检测偏振共焦扫描显微成像技术";唐志列 等;《应用激光》;20000630;第20卷(第3期);第111页至第114页 *

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CN106526823A (zh) 2017-03-22

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