CN102967554B - 一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置及方法，适合于透射式和反射式显微镜。本发明装置中，扭曲向列型液晶偏振旋转器和检偏器置于荧光成像光路，扭曲向列型液晶偏振旋转器的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合；起偏器的起偏方向、检偏器的检偏方向和扭曲向列型液晶偏振旋转器入射光一侧的液晶分子排列方向三者平行。本发明方法是通过切换高低电平信号，分时控制扭曲向列型液晶偏振旋转器输出光的偏振状态，数码相机相应拍摄两个互相垂直偏振方向的被测样品荧光图像，最后计算出被测样品的荧光各向异性显微图像。本发明能够在提高荧光各向异性成像精度的前提下，充分利用数码相机的视场，简化系统结构，成本更低。

Description

一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置及 方法

技术领域

本发明涉及一种荧光各向异性显微成像的方法和仪器，特别是借助宽场透射式或反射式荧光显微镜，对材料、生物和化学样品进行荧光各向异性显微成像的装置及方法。

背景技术

荧光显微成像技术可以在生物样品的正常状态下，进行活体细胞的观察，最大程度地保持样品真实环境。荧光各向异性是由线偏振光激发荧光团，其荧光沿不同偏振方向的光强度变化的现象。在生物化学研究和应用中，对荧光标记的样品进行荧光各项异性分析，可以提供荧光分子所处局部环境的温度、PH值和运动扩散速度等信息。

荧光各向异性显微成像的原理如图1所示，线偏振光激发荧光样品产生荧光，通过两个成像通道分别拍摄与线偏振激发光偏振平行和垂直的荧光光强显微图像，计算合成给出荧光各向异性的显微图像。目前，荧光各向异性显微成像采用如图1所示的空间双通道、双光路结构。双通道指的是两个互相垂直偏振荧光的成像光路，双光路指两个光路在空间上是不相同的。该结构比较复杂，空间上不同光路常常导致光学系统的微小像差引起很大的病态矩阵计算误差。因此，目前的荧光各向异性显微成像的光学系统精度要求很高，系统复杂成本高。

近年来由于电子技术和材料技术的迅猛发展，出现了很多性能优异电控光学器件，扭曲向列型液晶偏振旋转器(liquid crystal twisted nematic polarizationrotator)就是典型代表之一。扭曲向列型液晶偏振旋转器用于调整光在传播过程中的偏振方向。当偏振光通过扭曲向列液晶时，光的偏振方向会因液晶中的分子的性质而旋转。如图2(a)所示，当液晶偏振旋转器两端的外接电压为低电平时，从液晶偏振旋转器射出光的偏振状态与入射光的偏振状态成90°夹角；如图2(b)所示，当液晶偏振旋转器两端的外接电压为高电平时，从液晶偏振旋转器射出光的偏振状态与入射光的偏振状态成0°夹角，不改变偏振状态。

发明内容

针对目前荧光各向异性显微成像系统的较为复杂，成像精度低等缺点，本发明提出一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置及方法，通过分时成像的方法，使两个偏振光成像系统共光路，减少因光学系统相差产生的病态矩阵计算误差，荧光各向异性成像的精度更高，同时系统结构简化，成本更低。

本发明提供了以下技术方案：

一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置，适合于透射式和反射式显微镜。所述的荧光各向异性显微成像装置依次包括激发光路：激发光源、透镜组、起偏器、激发滤波片、分光镜、物镜和荧光样品；成像光路：荧光样品、物镜、分光镜、发射滤波片、扭曲向列型液晶偏振旋转器、检偏器、数码相机。

1.所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于扭曲向列型液晶偏振旋转器和检偏器放置在成像光路。

2.所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于扭曲向列型液晶偏振旋转器的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合。

3.所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于起偏器的起偏方向、检偏器的检偏方向和扭曲向列型液晶偏振旋转器入射光一侧的液晶分子排列方向三者平行。

一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置的成像方法，其特征在于包括以下步骤：

1.激发光源发出的光通过透镜组转化为高斯光强分布，经起偏器、激发滤波片、分光镜后，由物镜聚焦于样品上；

2.样品发射的荧光经过物镜、分光镜、发射滤波片、扭曲向列型液晶偏振旋转器与检偏器后，在数码相机上成像；

3.计算机控制扭曲向列型液晶偏振旋转器的外接电压为高电平时，扭曲向列型液晶偏振旋转器的出射光不改变偏振状态，通过检偏器后，数码相机拍下一帧空间坐标为(x，y)荧光偏振图像I_||(x，y)；

4.计算机控制扭曲向列型液晶偏振旋转器的外接电压为低电平时，扭曲向列型液晶偏振旋转器的出射光偏振状态旋转90°，通过检偏器后，数码相机拍下一帧空间坐标为(x，y)的荧光偏振图像I_⊥(x，y)；

5.荧光各向异性显微图像为 $r(x,y)=\frac{I_{\left|\right|}(x,y)-I_{\⊥}(x,y)}{I_{\left|\right|}(x,y)+2I_{\⊥}(x,y)}.$

所述的方法，其特征在于所述步骤3、4的扭曲向列型液晶偏振旋转器每次切换高低压电平，数码相机分时拍下一帧图像。

本发明提出这种新型荧光各向异性显微成像装置和方法，优点是分时拍摄的偏振荧光显微图像；共光路，充分利用数码相机的整幅视场；装置不含运动光学元件，光学系统误差对于荧光各向异性图像的计算精度无影响，简化了结构。并且，将扭曲向列型液晶偏振旋转器放置在荧光成像通道，可以避免Magic角影响，减少偏振态串扰，提高偏振光成像精度。

附图说明

图1荧光各向异性的显微成像原理。

图2(a)液晶偏振旋转器两端的外接电压为高电平时，偏振光经过扭曲向列型液晶偏振旋转器后的旋转情况。

图2(b)液晶偏振旋转器两端的外接电压为低电平时，偏振光经过扭曲向列型液晶偏振旋转器后的旋转情况。

图3双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置的结构简图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：

本发明提出的双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置的结构如图3所示，依次包括：激发光源(1)、透镜组(2)、起偏器(3)、激发滤波片(4)、分光镜(5)、物镜(6)、样品工作台(7)、样品(8)、发射滤波片(9)、扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)、检偏器(11)、数码相机(12)、计算机(13)、高精度低纹波电流源(14)和控制电路(15)。

在本实施例中，样品(8)是罗丹明6G加90％甘油水溶液，激发光源(1)是高亮度LED。激发光源(1)发出的Lambertian分布的照明光强通过透镜组(2)转换为高斯光强分布，并接入反射式荧光显微镜。高斯光强分布的光源经起偏器(3)、激发滤波片(4)及分光镜(5)，被物镜(6)聚焦于荧光样品(8)上；样品荧光经过物镜(6)、分光镜(5)及发射滤波片(9)、扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)及检偏器(11)，在数码相机(12)的像平面上成像。数码相机(12)采用的是CCD相机。在数码相机(12)上拍摄的荧光偏振图像经过图像采集卡送入计算机(13)处理。

在本实施例中，扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)和检偏器(11)放置在成像光路。扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合。起偏器(3)的起偏方向、检偏器(11)的检偏方向和扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)入射光一侧的液晶分子排列方向三者平行。

当计算机(13)控制扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的外接电压为9伏时，出射光通过检偏器后，利用数码相机(12)拍下一帧空间坐标为(x，y)的荧光偏振图像I_||(x，y)；当计算机(13)扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的外接电压为0伏时，出射光通过检偏器(11)后，利用数码相机(12)拍下一帧空间坐标为(x，y)的荧光偏振图像I_⊥(x，y)，图像序列存储在计算机(13)。最后，计算得出罗丹明6G加90％甘油水溶液的荧光各向异性显微图像为：

$r(x,y)=\frac{I_{\left|\right|}(x,y)-I_{\⊥}(x,y)}{I_{\left|\right|}(x,y)+2I_{\⊥}(x,y)}.$

实验结果表明，罗丹明6G加90％甘油水溶液的荧光各项异性空间分布为r(x，y)＝0.35，均方根误差＜±0.001。

本发明提出这种新型荧光各向异性显微成像装置和方法，优点是分时拍摄的偏振荧光显微图像；共光路，充分利用数码相机的整幅视场；装置不含运动光学元件，光学系统误差对于荧光各向异性图像的计算精度无影响，简化了结构。并且，将扭曲向列型液晶偏振旋转器放置在荧光成像通道，可以避免Magic角影响，减少偏振态串扰，提高偏振光成像精度。

Claims (5)

1.一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置，适合于透射式和反射式显微镜，依次包括激发光路：激发光源(1)、透镜组(2)、起偏器(3)、激发滤波片(4)、分光镜(5)、物镜(6)和样品(8)；成像光路：样品(8)、物镜(6)、分光镜(5)、发射滤波片(9)、扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)、检偏器(11)、数码相机(12)；所述扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)和检偏器(11)置于成像光路。

2.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的回转中心与荧光成像光路的光轴中心重合。

3.根据权利要求1所述的荧光各向异性显微成像装置，其特征在于起偏器(3)的起偏方向、检偏器(11)的检偏方向和扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)入射光一侧的液晶分子排列方向三者平行。

4.一种双通道、单光路结构的荧光各向异性显微成像装置的成像方法，其特征在于包括以下步骤：

1)激发光源(1)发出的光通过透镜组(2)转化为高斯光强分布，经起偏器(3)、激发滤波片(4)、分光镜(5)后，由物镜(6)聚焦于样品(8)上；

2)样品(8)反射的荧光经过物镜(6)、分光镜(5)、发射滤波片(9)、扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)与检偏器(11)后，在数码相机(12)的像平面上成像；

3)计算机(13)控制扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的外接电压为高电平时，扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的出射光不改变偏振状态，通过检偏器(11)后，利用数码相机(12)拍下一帧空间坐标为(x，y)的荧光偏振图像I||(x，y)；

4)计算机(13)控制扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的外接电压为低电平时，扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)的出射光偏振状态旋转90°，通过检偏器(11)后，利用数码相机(12)拍下一帧空间坐标为(x，y)的荧光偏振图像I⊥(x，y)；

5)计算样品的荧光各向异性显微图为

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤3)、4)的扭曲向列型液晶偏振旋转器(10)每次切换高低电平，数码相机(12)分时拍下一帧图像。