CN109307472B - 基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置及方法 - Google Patents

基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置及方法 Download PDF

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    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods

Abstract

本发明公开了基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置及方法，涉及微尺度透明体测试技术领域。提供一种通过附加相位片的设置以获取四种不同离焦程度下的相位体图像并根据这些图像计算SPEC参数以确定相位体相对于成像系统物镜在光轴方向上的位置的方法，实现透明相位体三维空间位置的实时测量。本发明通过在光路中增加可旋转相位片，无需采用光路的机械运动来实现光路的调节，提升系统的稳定性。采用直接计算方式，不需要迭代优化过程，计算过程简单。

Description

基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置及方法
技术领域
本发明涉及微尺度透明体测试技术领域，特指一种通过附加相位片后的四次测量以实现透明体相对于透镜的位置测量系统及方法，其适用于所测量的微尺度透明体相对于背景介质具有不同折射率的透明体在光轴方向的位置的测量。
背景技术
物体的三维位置信息是确定物体运动变化规律的基础数据，在生物学、物理学、化学、机械工程及信息等领域扮演着重要的角色，其中的微尺度透明体(以细胞为代表)三维位置的测量是生物学研究的基础。
目前，为了实现微尺度透明体测量，学术界一般采用荧光靶定探测和相位显微成像方法。对于通常的测试对象——细胞而言，荧光靶定探测需要荧光粉与细胞作用，这可能影响细胞的生命过程，最终导致测量结果与真实细胞运动变化过程之间的误差。相位显微成像方法能实现细胞厚度分布数据的获取且对相位体特性影响较小，近年来得到广泛重视，但在相位体光轴位置数据获取方面，传统的相位显微成像方法操作较复杂，需要对成像系统进行机械调整或通过数值计算实现数值聚焦(P.Langehanenberg,B.Kemper,D.Dirksen,and G.von Bally.Autofocusing in digital holographic phase contrastmicroscopy on pure phase objects for live cell imaging.Applied Optics,2008,47:D176-D182)。采用机械调整以获取相位体位置的方式容易影响成像系统的稳定性；而通过数值计算的方式需要一个复杂的尝试迭代优化过程。在相位体位置确定的过程中，一个关键是采用合理的衡量相位体离焦程度的参数。目前已有的衡量离焦程度的参数与成像系统参数、成像背景以及成像物的关系复杂，难以建立离焦程度参数与离焦距离之间的确定关系，所以难以通过这些参数的绝对量来衡量成像物的离焦程度，需要首先建立离焦程度参数与离焦距离之间的关系曲线，再将测量计算结果与关系曲线进行比较以确定成像物的离焦程度(在光轴方向上相对于物镜的位置)。已有的研究结果(P.Langehanenberg,B.Kemper,D.Dirksen,and G.von Bally.Autofocusing in digital holographic phasecontrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.AppliedOptics,2008,47:D176-D182)表明，权重谱分析参数(Weighted spectral analysis，SPEC)具有较理想的性能(稳定性好、可运行范围宽、对比度大、适应范围广)，最适合作为相位体的离焦程度衡量参数。通过文献的数据还可以看出，SPEC参数具有较好的对称性，且其随离焦程度的变化在小范围内可近似为线性。利用SPEC参数的这些特征可根据实验数据快速确定成像相位体与物镜之间的相对位置关系(离焦程度)。
为此，本发明拟通过附加相位片的设置以获取四种不同离焦程度下的相位体图像并根据这些图像计算SPEC参数以确定相位体相对于成像系统物镜在光轴方向上的位置。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过附加相位片的设置以获取四种不同离焦程度下的相位体图像并根据这些图像计算SPEC参数以确定相位体相对于成像系统物镜在光轴方向上的位置的方法，实现透明相位体三维空间位置的实时测量。
本发明按下述技术方案实现：
基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置：在Mach-Zehnder(马赫增德尔)光路成像系统的物光臂的物镜与样品池间设置用于调整成像系统中样品与物镜之间的光程可转动相位片。
上述装置中，所使用的成像系统是Mach-Zehnder光路成像系统，其由光源、分光镜、物光臂光路和参考臂光路、合束镜、CCD(电荷耦合器件)构成，光源选用具有相干性的激光器，物光臂光路由分光镜、反射镜、样品池、相位片、物镜、合束镜构成，用以产生携带样品光学相位信息的物光束，参考臂光路由分光镜、反射镜和合束镜构成，用以产生与物光束干涉而呈现特定衍射图的参考光束。
上述装置中，可转动相位片位置是在成像系统的物镜与样品池之间。
上述装置中，可转动相位片是具有四种不同厚度区域的光学玻璃平板，其材料折射率记为n，取值范围为1.3<n<1.6，相位片的四种不同厚度的区域按厚度从薄到厚的顺序布置，对应的相位片的厚度记为t1，t2，t3和t4，相位片厚度的取值范围为0.3mm<t1<1.5mm，4Mmm<t2-t1<10M mm，4M mm<t3-t2<10M mm，4M mm<t4-t3<10M mm，其中M为物镜放大倍率，相位片中心具有转动轴。
上述装置中，成像系统的物平面是由物镜焦距f、CCD与物镜间的光程差v来决定，成像系统的物平面到物镜之间的光程差u满足1/f＝1/u+1/v。
上述装置中，获取相位体的衍射图是通过CCD来实现。
基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量方法，是：转动相位片使相位片的不同厚度区域置于光路中以调整成像系统中样品与物镜之间的光程，在相位片的四个不同厚度区域置于光路中时获取相应的四幅相位体的衍射图；通过一定的相位恢复方法对这些衍射图进行处理来获取相应的相位图；通过傅里叶变换计算四幅相位图的SPEC(权重谱分析参数)参数；将计算获取的SPEC参数和相位片的厚度信息代入到计算公式中即可计算出相位体相对于物镜的距离。
上述方法中，获取衍射图之前，首先移动样品池，使样品池范围处于经相位片调制后的成像系统的成像范围之内。
上述方法中，样品池范围处于经相位片调制后的成像系统的成像范围之内是在使用最薄的相位片时成像系统的物平面高于样品池的上壁面，在使用最厚的相位片时成像系统的物平面低于样品池的下壁面。
上述方法中，可转动相位片的不同厚度区域置于光路中可通过电机驱动相位片的转动轴旋转来实现。
上述装置中，可转动相位片的不同厚度区域置于光路中可使样品与物镜之间的光程分别增加t1×(n-n0)，t2×(n-n0)，t3×(n-n0)，t4×(n-n0)，其中n0为空气的折射率，记相位片引起的相对光程变化为z1＝0，z2＝z1+(t2-t1)×(n-n0)，z3＝z2+(t3-t2)×(n-n0)，z4＝z3+(t4-t3)×(n-n0)。
上述方法中，获取相位图可通过对获取的衍射图进行微分相位恢复方法来实现(参考Basanta Bhaduri and Gabriel Popescu.Derivative method for phaseretrieval in off-axis quantitative phase imaging.OPTICS LETTERS 2012,37:1868-1870.)。
上述方法中，计算相位图的SPEC参数是根据以下公式实现，
Figure BDA0001779664470000031
其中F()为傅里叶变换，采用快速傅里叶变换实现，快速傅里叶变换前首先对图像进行离散处理，离散单元尺寸为Δx×Δy，g(x,y)为相位图，μ，ν为频谱空间，频谱截止频率为μth＝1/Δx，νth＝1/Δy。
上述方法中，计算的SPEC参数是针对相位片的四种不同厚度的区域按厚度从薄到厚的顺序获取4幅相位图计算的，分别记为SPEC1，SPEC2，SPEC3，SPEC4。
上述方法中，计算出相位体相对于物镜的距离是首先计算成像系统的像平面相对位置，再将成像系统的像平面相对位置代入到相位体相对于物镜的距离计算公式计算得到。
上述方法中，成像系统的像平面相对位置按下述公式实现，当|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|这三个参数中|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000032
当|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000033
当|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4>SPEC1，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000034
其他情况，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000035
上述方法中，相位体相对于物镜的距离计算公式为1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z。
上述方法中，光轴方向的最大测试范围是(t4-t1)×(n-n0)。
本发明具有如下技术优势：
通过在光路中增加可旋转相位片，无需采用光路的机械运动来实现光路的调节，提升系统的稳定性。
采用直接计算方式，不需要迭代优化过程，计算过程简单。
附图说明
图1成像系统光路；
图2相位片示意图；
图3相位图示意图；
图4SPEC参数随相对光程的变化规律示意图；
图5测试案例1；
图6测试案例2；
图7测试案例3；
图8测试案例4；
1激光器，2分光镜，3反射镜，4物光臂光路，5样品池，6可旋转相位片，7物镜，8合束镜，9CCD，10反射镜，11参考臂光路。
具体实施方式
下面结合图1-图8说明本发明提出的具体工艺的实施细节和工作情况。
成像系统光路示意图如附图1所示，图中应包括激光器1，分光镜2，物光臂光路4，反射镜3，样品池5，可旋转相位片6，物镜7，参考臂光路11，反射镜10，合束镜8和图像采集CCD9。从激光器发出的激光分光后部分经物光臂光路携带样品厚度信息并通过物镜进行成像，部分经参考臂光路后在合束镜处与经过物光臂光路的光束合束，产生干涉条纹，最终在成像系统像平面的CCD上形成衍射图，由CCD记录下来以备传输到计算机进行后续处理。
成像系统中所使用的相位片如附图2所示，材质为光学玻璃，具有四种不同厚度的区域，厚度分别为t1，t2，t3和t4。
在进行样品测试前，移动样品池，使样品池范围处于经相位片调制后的成像系统的成像范围之内，即在使用最薄的相位片时成像系统的物平面高于样品池的上壁面，在使用最厚的相位片时成像系统的物平面低于样品池的下壁面，通过在样品池上下壁面设定标记点进行成像予以考察，在厚度为t1的相位片区域置于光路中时，移动样品池使上壁面的标记点在CCD上清晰成像，再将厚度为t4的相位片区域置于光路中，往下移动样品池使下壁面的标记点在CCD上清晰成像，而后在整个测试过程中保持样品池位置不变。
测试时，当厚度为t1的相位片区域置于光路中时，通过CCD获取样品的衍射图，通过对获取的衍射图进行微分相位恢复方法来获取其相位图，记为相位图1，如附图3所示。当相位片厚度为t2，t3和t4的区域置于光路中时采取同样的处理方式分别获取相位图2，相位图3和相位图4。并对几种情况确定相位片引起的相对光程变化为z1＝0，z2＝z1+(t2-t1)×(n-n0)，z3＝z2+(t3-t2)×(n-n0)，z4＝z3+(t4-t3)×(n-n0)。
对获取的相位图1，相位图2，相位图3和相位图4采用以下公式通过MATLAB计算SPEC参数：
Figure BDA0001779664470000051
其中F()为傅里叶变换，采用快速傅里叶变换实现，快速傅里叶变换前首先对图像进行离散处理，离散单元尺寸为Δx×Δy，g(x,y)为相位图，μ，ν为频谱空间，频谱截止频率为μth＝1/(2Δx)，νth＝1/(2Δy)。
计算相邻测试点形成的直线斜率的绝对值|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|。比较三个绝对值的大小以确定计算成像系统的像平面相对位置所适用的公式。当|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000052
当|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000053
当|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4>SPEC1，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000054
其他情况，成像系统的像平面相对位置为
Figure BDA0001779664470000055
根据计算获得的成像系统的像平面相对位置为计算相位体相对于物镜的距离，计算公式为1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z。
下面以典型的SPEC参数随相对光程的变化规律(附图4)为例说明不同计算公式的实施方式。其中1/(1/f-1/v)取值为10mm，t1×(n-n0)取值为0.5mm，这些参数在实施时将实验系统参数代入到以上计算公式中计算获得。
实施例1(|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|最大的情况，附图5)
(t2-t1)×(n-n0)，(t3-t2)×(n-n0)和(t4-t3)×(n-n0)分别取值为145μm，147μm，150μm。根据相位图计算获取的参数：SPEC1＝1810，z1＝0；SPEC2＝1580，z2＝145μm；SPEC3＝1795，z3＝292μm；SPEC4＝1985，z4＝442μm。计算的相邻测量点形成的直线斜率的绝对值：|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|＝1.586，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|＝1.463和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|＝1.267。判断出|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|最大，确定成像系统的像平面相对位置计算所使用的公式为
Figure BDA0001779664470000061
根据公式计算出z＝150.73μm。再根据公式1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z计算相位体相对于物镜的距离为9.65073mm。
实施例2(|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|最大的情况，附图6)
(t2-t1)×(n-n0)，(t3-t2)×(n-n0)和(t4-t3)×(n-n0)分别取值为157μm，144μm，150μm。根据相位图计算获取的参数：SPEC1＝1960，z1＝0；SPEC2＝1770，z2＝157μm；SPEC3＝1500，z3＝301μm；SPEC4＝1860，z4＝451μm。计算的相邻测量点形成的直线斜率的绝对值：|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|＝1.210，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|＝1.875和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|＝2.4。判断出|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|最大，确定成像系统的像平面相对位置计算所使用的公式为
Figure BDA0001779664470000062
根据公式计算出z＝285.25μm。再根据公式1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z计算相位体相对于物镜的距离为9.78525mm。
实施例3(|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4>SPEC1的情况，附图7)
(t2-t1)×(n-n0)，(t3-t2)×(n-n0)和(t4-t3)×(n-n0)分别取值为144μm，150μm，156μm。根据相位图计算获取的参数：SPEC1＝1770，z1＝0；SPEC2＝1500，z2＝144μm；SPEC3＝1860，z3＝294μm；SPEC4＝2010，z4＝450μm。计算的相邻测量点形成的直线斜率的绝对值：|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|＝1.875，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|＝2.4和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|＝0.962。判断出|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4>SPEC1，确定成像系统的像平面相对位置计算所使用的公式为
Figure BDA0001779664470000063
根据公式计算出z＝128.25μm。再根据公式1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z计算相位体相对于物镜的距离为9.62825mm。
实施例4(|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4<SPEC1的情况，附图8)
(t2-t1)×(n-n0)，(t3-t2)×(n-n0)和(t4-t3)×(n-n0)分别取值为160μm，146.2μm，150.8μm。根据相位图计算获取的参数：SPEC1＝2010，z1＝0；SPEC2＝1840，z2＝160μm；SPEC3＝1630，z3＝306.2μm；SPEC4＝1760，z4＝457μm。计算的相邻测量点形成的直线斜率的绝对值：|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|＝1.063，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|＝1.436和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|＝0.862。判断出|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4<SPEC1，确定成像系统的像平面相对位置计算所使用的公式为
Figure BDA0001779664470000064
根据公式计算出z＝336.35μm。再根据公式1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z计算相位体相对于物镜的距离为9.83635mm。

Claims (2)

1.基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量装置，其特征在于：在Mach-Zehnder(马赫增德尔)光路成像系统的物光臂的物镜与样品池间设置用于调整成像系统中样品与物镜之间的光程可转动相位片；
所使用的成像系统是Mach-Zehnder光路成像系统，其由光源、分光镜、物光臂光路和参考臂光路、合束镜、CCD(电荷耦合器件)构成，光源选用具有相干性的激光器，物光臂光路由分光镜、反射镜、样品池、相位片、物镜、合束镜构成，用以产生携带样品光学相位信息的物光束，参考臂光路由分光镜、反射镜和合束镜构成，用以产生与物光束干涉而呈现特定衍射图的参考光束；
可转动相位片位置是在成像系统的物镜与样品池之间；
可转动相位片是具有四种不同厚度区域的光学玻璃平板，其材料折射率记为n，取值范围为1.3<n<1.6，相位片的四种不同厚度的区域按厚度从薄到厚的顺序布置，对应的相位片的厚度记为t1，t2，t3和t4，相位片厚度的取值范围为0.3mm<t1<1.5mm，4M mm<t2-t1<10M mm，4M mm<t3-t2<10M mm，4M mm<t4-t3<10M mm，其中M为物镜放大倍率，相位片中心具有转动轴；
成像系统的物平面是由物镜焦距f、CCD与物镜间的光程差v来决定，成像系统的物平面到物镜之间的光程差u满足1/f＝1/u+1/v；
获取相位体的衍射图是通过CCD来实现；
可转动相位片的不同厚度区域置于光路中可使样品与物镜之间的光程分别增加t1×(n-n0)，t2×(n-n0)，t3×(n-n0)，t4×(n-n0)，其中n0为空气的折射率，记相位片引起的相对光程变化为z1＝0，z2＝z1+(t2-t1)×(n-n0)，z3＝z2+(t3-t2)×(n-n0)，z4＝z3+(t4-t3)×(n-n0)。
2.基于附加相位片的微尺度透明体离焦距离测量方法，其特征在于按照下述步骤进行：转动相位片使相位片的不同厚度区域置于光路中以调整成像系统中样品与物镜之间的光程，在相位片的四个不同厚度区域置于光路中时获取相应的四幅相位体的衍射图；通过一定的相位恢复方法对这些衍射图进行处理来获取相应的相位图；通过傅里叶变换计算四幅相位图的SPEC(权重谱分析参数)参数；将计算获取的SPEC参数和相位片的厚度信息代入到计算公式中即可计算出相位体相对于物镜的距离；
获取衍射图之前，首先移动样品池，使样品池范围处于经相位片调制后的成像系统的成像范围之内；
样品池范围处于经相位片调制后的成像系统的成像范围之内是在使用最薄的相位片时成像系统的物平面高于样品池的上壁面，在使用最厚的相位片时成像系统的物平面低于样品池的下壁面；
可转动相位片的不同厚度区域置于光路中可通过电机驱动相位片的转动轴旋转来实现；
获取相位图可通过对获取的衍射图进行微分相位恢复方法来实现；
计算相位图的SPEC参数是根据以下公式实现，
Figure FDA0002570571230000021
其中F()为傅里叶变换，采用快速傅里叶变换实现，快速傅里叶变换前首先对图像进行离散处理，离散单元尺寸为Δx×Δy，g(x,y)为相位图，μ，ν为频谱空间，频谱截止频率为μth＝1/Δx，νth＝1/Δy；
计算的SPEC参数是针对相位片的四种不同厚度的区域按厚度从薄到厚的顺序获取4幅相位图计算的，分别记为SPEC1，SPEC2，SPEC3，SPEC4；
计算出相位体相对于物镜的距离是首先计算成像系统的像平面相对位置，再将成像系统的像平面相对位置代入到相位体相对于物镜的距离计算公式计算得到；
成像系统的像平面相对位置按下述公式实现，当|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|，|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|和|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|这三个参数中|(SPEC2-SPEC1)/(z2-z1)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure FDA0002570571230000022
当|(SPEC4-SPEC3)/(z4-z3)|最大时，成像系统的像平面相对位置为
Figure FDA0002570571230000023
当|(SPEC3-SPEC2)/(z3-z2)|最大且SPEC4>SPEC1，成像系统的像平面相对位置为
Figure FDA0002570571230000024
其他情况，成像系统的像平面相对位置为
Figure FDA0002570571230000025
相位体相对于物镜的距离计算公式为1/(1/f-1/v)-t1×(n-n0)+z；
光轴方向的最大测试范围是(t4-t1)×(n-n0)。
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