CN109828365A - Mirau型超分辨率干涉显微物镜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜，利用干涉显微物镜实现亚纳米级轴向分辨率，利用微球透镜突破衍射极限，实现二维横向超分辨。本文提出将干涉显微物镜和微球透镜相融合的超分辨干涉显微物镜，在干涉显微物镜和待测样品之间加入微球透镜，优化设计参考平板、分光平板、显微物镜的参数，获得清晰的三维超分辨干涉条纹，实现三维高分辨率成像。本方法能够以简单的光学手段实现横向超分辨，获取待测微结构的三维高分辨信息，无需对样品进行复杂的标记处理，可以实现快速、无损的测量，具有很强的实用价值。

Description

Mirau型超分辨率干涉显微物镜

技术领域

本发明属于干涉显微测量领域，具体涉及一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜。

背景技术

现有的常用微纳观测手段按照成像机理主要分为：光学显微镜、扫描探针类显微镜和电子显微镜。与其他成像方式相比，光学显微镜具有实时、免标记、无损、简单方便、成本和维护费用低等优点，在人类探索微观世界方面发挥着不可替代的作用。但是由于衍射极限，光学显微镜的横向分辨率为波长的一半，横向分辨率最高仅为200 nm。无法满足人们对于微观结构观测的实际需求。英国曼彻斯特大学的王增波等人利用半径为2~9 μm的二氧化硅微球将可见光显微成像的分辨率提高到了50 nm左右，成功利用微球结合显微物镜实现了二维超分辨成像（Nature Communications, 2011, 2:218-0.）。

白光显微干涉技术利用宽带照明光的低相干特性，通过驱动干涉显微物镜的垂直扫描获取多幅干涉图，求解零光程差位置，实现对表面微观形貌的三维测量，轴向分辨率达到亚纳米量级。Mirau型干涉显微物镜是最常用的干涉显微物镜。常规的Mirau型干涉显微物镜是由显微物镜、分光平板以及参考平板组成，具有结构紧凑的优点。Mirau型干涉显微物镜的设计时，干涉方面，分光平板和参考平板采用相同材料和厚度（典型的材料为熔石英）；二维成像方面，利用显微物镜、分光平板和参考平板联合校正像差。但该技术的横向分辨率仍然受限于衍射效应，最高仅为200 nm。在保持亚纳米轴向高分辨率的同时，提升横向分辨率，对于三维成像十分重要。

将微球横向超分辨成像技术与干涉显微轴向高分辨技术相结合，是实现三维高分辨成像的一种有效手段。中国科学院王飞飞采用了两种方式进行三维高分辨成像：一种是将钛酸钡微球播撒在样品表面，再注入水，将微球浸没在水中，盖上盖玻片，然后使用Linnik型干涉显微物镜结合微球进行观测；另一种是将聚苯乙烯微球直接播撒在样品表面，使用Linnik型干涉显微物镜结合微球进行观测（Scientific Reports, 2016, 6(1):24703，基于微透镜的三维超分辨率干涉仪CN201510309193.3）。芬兰赫尔辛基大学的IvanKassamakov团队采用尼康50倍Mirau型干涉物镜结合微球实现了对于蓝光光盘的三维成像（Scientific Reports, 2017, 7(1):3683.）。

Linnik型干涉显微物镜属于分光路系统，结构不紧凑，为了实现垂直扫描，只能驱动参考反射镜微位移，这样的超分辨物镜结构不能在白光显微干涉仪上直接使用。此外，微球引入的光学成像像差没有消除。并且，使用时需要手动调节参考反射镜轴向位置，仅实现参考光路和测试光路在中心波长下的光程匹配。因此，该结构不能直接使用白光显微干涉仪的垂直扫描结构，需要控制驱动参考反射镜进行微位移，且像差欠校正，光程匹配困难，难以形成超分辨干涉显微物镜组件，不适合直接在商用白光显微干涉仪上使用。

芬兰赫尔辛基大学的Ivan Kassamakov团队直接使用常规Mirau型干涉显微物镜，通过调节分光平板与参考平板之间的间距抵消测试臂上微球透镜引入的光程差。该方法基于常规的干涉显微物镜，调节范围不足百微米，无法匹配大尺寸微球引入的光程。此方法只适用于小尺寸微球，获得的成像视场小。此外，没有校正微球透镜引入的成像像差、色散等问题。存在适用范围小、测量结果误差大等问题。

上述已完成的工作都是将微球直接播撒在待测样品表面，然后采用干涉显微物镜结合微球进行三维形貌测量。微球的播撒具有随机性，不是一种规范化的光学成像操作方式。而且采用浸液的方式存在易挥发的问题，观测时间短，实验可重复性差。制备微球透镜薄膜具有诸多优势：利用钛酸钡微球和PDMS膜结合，相比于其他低折射率微球，拥有着更高的放大倍率和成像质量，能够获得更大的视场；在浸没方式上，采用固体浸没的方式，避免了液体挥发的问题；微球透镜薄膜可以直接放置在样品表面，操作简单、便捷，能够在白光显微干涉仪上直接搭载使用，具有很高的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜，利用干涉显微物镜实现亚纳米级轴向分辨率，利用微球透镜薄膜突破衍射极限，实现二维横向超分辨，本发明将干涉显微物镜和微球透镜薄膜相融合的超分辨干涉显微物镜设计方法，实现三维高分辨率成像。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜，包括沿共光轴依次设置的显微物镜、参考平板、分光平板和微球透镜薄膜，微球透镜薄膜设置在待测样品的顶面，采用Mirau型干涉光路结构，由分光平板分光，参考平板位于参考臂上，微球透镜薄膜位于测试臂上；

照明光依次通过显微物镜、参考平板，在分光平板的分光平面处被分为两束，一束入射到参考平板的参考面返回，形成参考光，另一束经过微球透镜薄膜之后入射到待测样品返回，形成测试光；参考光和测试光在分光平板上重合后发生干涉，经参考平板和显微物镜后出射。

本发明与现有技术相比，其显著优点在于：

（1）本发明将微球透镜薄膜与干涉显微物镜想融合，打破了光学衍射极限对光学显微镜横向分辨率的限制，并利用白光干涉的原理获得高度信息，实现三维超分辨成像。

（2）本发明相比于微球结合Linnik型干涉显微物镜，结构更紧凑。在实际操作过程中，不需要调节参考臂和测试臂，操作简单。不会引入分光路产生的误差，受环境影响小，解决了抗干扰能力差的问题。相比于尼康50倍Mirau型干涉显微物镜，不需要调节分光平板的位置。而且能够适用于大尺寸微球，能够获得更大的成像视场。而且相比于这两种方式，本发明解决了微球引入的附加的球差、像差、色差等问题，测量结果更精确，测量误差更小。

（3）采用钛酸钡微球结合PDMS膜制作微球透镜薄膜，相比于其他低折射率微球，拥有着更高的放大倍率和成像质量，获得了更大的成像视场。而且采用固体浸没的方式，不仅获得了高折射率微球的超分辨现象（高折射率微球放置在空气中不存在超分辨现象），而且相比于液体浸没，不需要对样品进行复杂操作，观测结果不会随着浸没液体的挥发而改变，测量具有可重复性。操作方面，只需要将微球透镜薄膜直接放置在样品的表面，将优化设计后的Mirau型干涉显微物镜搭载在白光显微干涉仪上，按照白光显微干涉仪的常规操作方式即可获得待测微结构的三维结果，打破衍射极限的限制。操作简单，结构稳定，能够多次使用，便于在商用干涉仪上大范围应用。

（4）在成像时对环境无特殊要求，无需对样品进行复杂的标记，并且可以实现快速、非侵入、无损的三维超分辨成像，因此在纳米成像领域具有广阔的应用空间。

附图说明

图1为本发明Mirau型超分辨率干涉显微物镜的结构图。

图2为本发明的参数标注示意图。

图3为优化设计的50倍Mirau型超分辨干涉显微物镜在白光显微干涉仪上获得的干涉图。

图4为由图三的干涉图获得的样品表面形貌三维信息图。

图5为应用本发明Mirau型超分辨率干涉显微物镜进行干涉测量的装置图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

结合图1和图5，一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜，包括沿共光轴依次设置的显微物镜1、参考平板2、分光平板3和微球透镜薄膜4，微球透镜薄膜4设置在待测样品5的顶面，采用Mirau型干涉光路结构，由分光平板3分光，参考平板2位于参考臂上，微球透镜薄膜4位于测试臂上。

照明光9经过透镜11和分光镜10后，依次通过显微物镜1、参考平板2，在分光平板3的分光平面处被分为两束，一束入射到参考平板2的参考面返回，形成参考光，另一束经过微球透镜薄膜4之后入射到待测样品5返回，形成测试光；参考光和测试光在分光平板3上重合后发生干涉，经参考平板2和显微物镜1后出射，出射光经过分光镜10和透镜11后被图像采集系统8接收，根据图像采集系统8采集到的干涉条纹分析待测微结构的微观特性。

照明光为可见光宽光谱，设计时对于照明光源工作波长全谱段校正像差。

显微物镜1、参考平板2、分光平板3构成干涉显微物镜。

参考平板2中，靠近显微物镜1的面为参考面，即A面；在分光平板3中，靠近参考平板2的面为分光平面，即B面。

所述显微物镜1的放大倍数不小于10倍。

微球透镜薄膜4是指在高折射率微球表面涂上一层材料，实现对微球固体浸没所制成的薄膜。

在宽光谱照明光的中心波长λ₀下，分光平板3与微球透镜薄膜4光程之和等于参考平板2的光程。

微球透镜薄膜4在微球阵列表面涂覆上一层薄膜，结合图2，将微球阵列等效为微球平板7，薄膜等效为薄膜平板6。薄膜平板6的折射率为薄膜的折射率，薄膜平板6的厚度为微球透镜薄膜4厚度减去微球平板7的厚度；微球平板7的折射率为微球的折射率，微球平板7的厚度为微球的直径；在中心波长λ₀下，满足如下等式：

n₁t₁+h₁=n₂t₂+h₂+n₃t₃+n₄t₄

其中，n₁为参考平板1的折射率，n₂为分光平板2的折射率，t₁为参考平板1的厚度，t₂为分光平板2的厚度，h₁为参考平板1和分光平板2的间隔，h₂为分光平板2与薄膜平板6之间的间隔，t₃为薄膜平板6的厚度，n₃为薄膜平板6折射率，t₄为微球平板7的直径，n₄为微球平板7的折射率。

尽管通过优化控制参考平板2、分光平板3、薄膜平板6和微球平板7的厚度关系，实现了参考臂和测试臂在中心波长λ₀下等光程。但由于平板由不同材料制成，必然存在宽光谱情况下的非等光程，该非等光程无法校正，但可以通过控制微球透镜薄膜4的厚度使得宽波段干涉的非等光程对复原结果的影响较小。综合成像视场与成像质量，以及旋涂工艺与浸没效果，控制微球的直径在30~100 μm之间。鉴于旋涂工艺以及浸没效果，薄膜平板的厚度在50~200 μm之间。

为了解决微球透镜薄膜4引入的球差、色差等造成的成像质量下降问题，优化显微物镜，实现物镜、分光平板、参考平板、微球平板和薄膜平板在照明光宽谱段范围内联合校正像差。

微球透镜薄膜4中，薄膜平板6采用聚二甲基硅氧烷材料，微球平板7采用钛酸钡材料。

采用熔石英作为参考平板2和分光平板3的玻璃材料，参考平板2和分光平板3的厚度均在0.8 ~1.2 mm之间。

微球透镜薄膜4中的微球的直径在30~100 μm之间，薄膜平板6的厚度在50~200 μm之间。实施例一

在本实例中，我们采用口径50 μm钛酸钡微球阵列结合PDMS薄膜制作微球透镜薄膜4，具体制备方式已经在专利201610113464.2中公开。微球透镜薄膜4总厚度100 μm。根据中心波长下等光程的公式，确定参考平板2和分光平板3的厚度信息。分光平板3材料熔石英（折射率1.4606，阿贝数67.82）、厚度1mm，参考平板2材料熔石英（折射率1.4606，阿贝数67.82）、厚度1.132 mm，参考平板2和分光平板3的间距为3 mm，参考平板到微球透镜薄膜的距离为3 mm。

在本实例中，微球透镜薄膜4等效为微球平板6和薄膜平板7的叠加，微球平板5材料选择钛酸钡（折射率2.4109，阿贝数13.96）、厚度50 μm，薄膜平板7材料PDMS（折射率1.4333，阿贝数44.44）、厚度50 μm。在此基础上，优化显微物镜，实现物镜、分光平板、参考平板、微球透镜薄膜在照明光宽谱段范围内联合校正像差。

取一蓝光光盘，用剪刀剪出部分区域，去除表面的保护膜，露出周期为200 nm，间距为100 nm的平行条带，作为待测样品5。

将制作好的微球透镜薄膜4放置在待测样品5表面，将优化的50倍Mirau型干涉显微物镜搭载在白光显微干涉仪上。通过调节，获得蓝光光盘的干涉条纹，如图3所示。根据图3获得的干涉条纹，获得蓝光光盘的三维形貌，如图4所示。

Claims (8)

1.一种Mirau型超分辨率干涉显微物镜，其特征在于：包括沿共光轴依次设置的显微物镜（1）、参考平板（2）、分光平板（3）和微球透镜薄膜（4），微球透镜薄膜（4）设置在待测样品（5）的顶面，采用Mirau型干涉光路结构，由分光平板（3）分光，参考平板（2）位于参考臂上，微球透镜薄膜（4）位于测试臂上；

照明光（9）依次通过显微物镜（1）、参考平板（2），在分光平板（3）的分光平面处被分为两束，一束入射到参考平板（2）的参考面返回，形成参考光，另一束经过微球透镜薄膜（4）之后入射到待测样品（5）返回，形成测试光；参考光和测试光在分光平板（3）上重合后发生干涉，经参考平板（2）和显微物镜（1）后出射。

2.根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：参考平板（2）中，靠近显微物镜（1）的面为参考面；在分光平板（3）中，靠近参考平板（2）的面为分光平面。

3.根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：所述显微物镜（1）的放大倍数不小于10倍。

4.根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：在宽光谱照明光的中心波长λ₀下，分光平板（3）与微球透镜薄膜（4）光程之和等于参考平板（2）的光程。

5. 根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：微球透镜薄膜（4）在微球阵列表面涂覆上一层薄膜制得，将微球阵列等效为微球平板（7），薄膜等效为薄膜平板（6）；薄膜平板（6）的折射率为薄膜的折射率，薄膜平板（6）的厚度为微球透镜薄膜（4）厚度减去微球平板（7）的厚度；微球平板（7）的折射率为微球的折射率，微球平板（7）的厚度为微球的直径；在中心波长λ₀下，满足如下等式：

n₁t₁+h₁=n₂t₂+h₂+n₃t₃+n₄t₄

其中，n₁为参考平板1的折射率，n₂为分光平板（2）的折射率，t₁为参考平板1的厚度，t₂为分光平板（2）的厚度，h₁为参考平板1和分光平板（2）的间隔，h₂为分光平板（2）与薄膜平板（6）之间的间隔，t₃为薄膜平板（6）的厚度，n₃为薄膜平板（6）折射率，t₄为微球平板（7）的直径，n₄为微球平板（7）的折射率。

6.根据权利要求1或5所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：微球透镜薄膜（4）中，薄膜平板（6）采用聚二甲基硅氧烷材料，微球平板（7）采用钛酸钡材料。

7. 根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：采用熔石英作为参考平板（2）和分光平板（3）的玻璃材料，参考平板（2）和分光平板（3）的厚度均在0.8 ~1.2mm之间。

8. 根据权利要求1所述的Mirau型超分辨干涉显微物镜，其特征在于：微球透镜薄膜（4）中的微球的直径在30~100 μm之间，薄膜平板（6）的厚度在50~200 μm之间。