WO2022054908A1 - イメージングフローサイトメーター - Google Patents

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WO2022054908A1
WO2022054908A1 PCT/JP2021/033328 JP2021033328W WO2022054908A1 WO 2022054908 A1 WO2022054908 A1 WO 2022054908A1 JP 2021033328 W JP2021033328 W JP 2021033328W WO 2022054908 A1 WO2022054908 A1 WO 2022054908A1
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imaging
flow path
cell
flow
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禎生 太田
昌士 鵜川
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国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to an imaging flow cytometer.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-152331 filed in Japan on September 10, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • a flow cytometry method that evaluates the characteristics of an observation object by irradiating the observation object flowing through the flow path with illumination light and measuring the light emitted, and a flow cytometer using this flow cytometry method have been used. It is known (for example, Patent Document 1).
  • fluorescence microscopes and imaging cytometers that evaluate fine particles such as cells and bacteria to be observed by images are known.
  • an imaging flow cytometer which is a kind of flow cytometer and captures morphological information of fine particles at high speed with a throughput equivalent to that of a conventional flow cytometer, is known (for example, Patent Document 2).
  • a measurement field exposed to illumination light is provided in the flow path, and cells pass through the measurement field. That is, the imaging flow cytometer captures a two-dimensional or three-dimensional image or measures cell space information corresponding to the image when it is scanned.
  • a multi-faceted optical microscope that irradiates cells to be observed with a band-shaped excitation light to obtain images of surfaces at different angles with respect to the irradiation surface irradiated with the excitation light and three-dimensional images of the observation object.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 the technique of Axial plane optical microscopic (APOM) is used (for example, Non-Patent Document 1).
  • APOM is a technique of a multifaceted optical microscope that directly captures a cross section parallel to the optical axis of an objective lens of an observation object without scanning.
  • the flow velocity of the fluid flowing through the flow path may vary in the width direction or the height direction of the flow path. If nothing is done, the position of the observation object will vary in the width direction or height direction of the flow path. As a result, the variation in the flow velocity generated in the flow path causes variation in the velocity (traveling direction and speed) of the observation object flowing in the channel, or rotation. As a result, even at the imaging position, the position or speed of the object to be measured in the direction perpendicular to the streamline direction may not be stable, or the object may rotate. Therefore, the imaging conditions may not be stable when scanning the observation object in the streamline direction.
  • the imaging conditions include the position, rotation, and velocity (traveling direction and velocity) of the observation object in the imaging process in the direction perpendicular to the streamline direction.
  • the present invention has been made in view of the above points, and provides an imaging flow cytometer capable of stabilizing imaging conditions when scanning an observation object flowing in a flow path in the streamline direction.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and one aspect of the present invention is a flow path through which an observation object is flowed, and the length in the width direction is longer than the length in the height direction.
  • the flow path an acoustic element that irradiates the flow path with a sound wave as a stationary wave, a light source that irradiates the flow path with illumination light, and the observation that has passed the position where the illumination light is irradiated.
  • the imaging unit and the imaging unit capture at least a line included in the cross section of the observation object in the streamline direction in which the observation object flows in the flow path.
  • An imaging flow cytometer including a scanning image generation unit that generates an image in which the observation object is scanned in the streamline direction based on a plurality of captured images obtained by imaging the lines in a time series. ..
  • the number of the standing wave nodes is one in the height direction, and the number of the standing wave nodes is 0 in the width direction. It is an individual.
  • the number of the standing wave nodes is one in the height direction, and the number of the standing wave nodes is one in the width direction. More than one.
  • a plurality of the observation objects aligned in the width direction are flowed in the flow path.
  • the imaging conditions can be stabilized when the observation object flowing in the flow path is scanned in the streamline direction.
  • FIG. 21 It is a figure which shows an example of the image which enlarged the area of the image shown in FIG. 21 which concerns on embodiment of this invention. It is a figure which shows an example of the image which projected the 3D image of the middle stage of cell division of the cell stained by DAPI which concerns on Example of this invention on the 2D plane. It is a figure which shows an example of the image which projected the 3D image of the late stage of cell division of the cell stained by DAPI which concerns on the Example of this invention on the 2D plane. It is a figure which shows an example of the region stained with DAPI in the 3D image which concerns on Example of this invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the configuration of the cell measurement system 1 according to the present embodiment.
  • the cell measurement system 1 includes an imaging flow cytometer 20, an analysis device 30, and a display unit 10.
  • the imaging flow cytometer 20 includes a flow path through which an observation object is flowed.
  • the case where the observation target is a cell will be described, but the observation target is not limited to the cell.
  • the observation object may be fine particles such as bacteria.
  • a fluorescence microscope or various microscopes that do not require fluorescence staining are used as the microscope used by the imaging flow cytometer 20 for observing the observation object.
  • the observation object is fluorescently stained.
  • various microscopes that do not require fluorescent staining are used for the imaging flow cytometer 20, the observation object is not fluorescently stained.
  • the various microscopes that do not require fluorescent staining include, for example, a bright-field microscope, a dark-field microscope, a phase-contrast microscope, a phase microscope, a light-scattering microscope, a Raman-scattered light microscope, and an absorption phase microscope.
  • Imaging flow cytometers that use a microscope that does not require fluorescent staining use label-free imaging technology that captures images of observation objects that are not fluorescently stained, allowing non-invasive observation of cells, bacteria, etc. can.
  • the imaging in which the imaging flow cytometer 20 observes the observation object is not limited to the above-mentioned one, and various types of imaging using visible light, electromagnetic waves other than visible light, heat, vibration waves, or the like may be used.
  • the imaging flow cytometer 20 produces a three-dimensional image of cells flowing through this flow path.
  • the analysis device 30 analyzes the three-dimensional image generated by the imaging flow cytometer 20. By analyzing the three-dimensional image, the analysis device 30 executes, for example, classification of the cells reconstructed as the three-dimensional image, or reading of various information about the cells.
  • the analysis device 30 is, for example, a personal computer (PC: Personal Computer).
  • the analyzer 30 is suitably used for non-destructive cell analysis.
  • the display unit 10 displays the three-dimensional image generated by the imaging flow cytometer 20 or the analysis result by the analysis device 30.
  • the display unit 10 includes, for example, a liquid crystal display and displays various images.
  • the image displayed on the display unit 10 includes a three-dimensional image of the cells generated by the imaging flow cytometer 20.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the functional configuration of the cell measurement system 1 of the present embodiment.
  • FIG. 2 shows an xyz coordinate system as a three-dimensional Cartesian coordinate system.
  • the x-axis direction is the width direction of the flow path 21.
  • the y-axis direction is the direction in which the cell CL in the flow path 21 is flowed.
  • Cell CL is flowed in the + y direction in the y-axis direction.
  • the z-axis direction is a direction orthogonal to the flow path 21 and is a height direction of the flow path 21.
  • the imaging flow cytometer 20 includes a flow path 21, an acoustic element 22, an imaging unit 23, a storage unit 25, and a three-dimensional image generation unit 26.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the configuration of the flow path 21 according to the present embodiment.
  • An object to be observed is flowed through the flow path 21.
  • the observation object flows together with the fluid flowing in the flow path 21.
  • a plurality of observation objects arranged in the width direction of the flow path 21 are flowed through the flow path 21.
  • Aligning a plurality of observation objects in the width direction means that the positions in the height direction are substantially equal among the observation objects, and the plurality of observation objects are arranged in a row in the width direction. Is.
  • the distance between adjacent observation objects may be arbitrary.
  • the positions of the flow paths 21 in the length direction are aligned among the plurality of observation objects.
  • the position of the flow path 21 in the length direction is such that at least one observation object is in the length direction with another observation object for the plurality of observation objects. It is preferable to have overlapping portions.
  • a plurality of cell CLs as observation objects are arranged and flowed in the flow path 21 in the width direction of the flow path 21.
  • one observation object may flow in the flow path 21.
  • the length FW in the width direction is longer than the length FH in the height direction.
  • the ratio of the length in the width direction to the length in the height direction of the flow path is very large, the flow velocity distribution in the width direction in the flow path becomes constant regardless of the position in the width direction (for example,). See Non-Patent Document 2).
  • the flow velocity distribution in the height direction changes greatly depending on the position in the height direction.
  • FIG. 4 shows an example of the flow velocity distribution in the width direction in the flow path 21.
  • the width direction length FW is longer than the height direction length FH, so that the flow velocity distribution in the width direction is the position in the width direction (x-axis direction) except for the vicinity of the wall of the flow path 21. It becomes almost constant regardless.
  • FIG. 5 shows an example of the flow velocity distribution in the height direction in the flow path 21.
  • the flow velocity distribution in the height direction changes greatly depending on the position in the height direction (z-axis direction).
  • the flow velocity in the height direction increases as the distance from the wall of the flow path 21 increases.
  • the flow velocity in the height direction becomes smaller as it is closer to the wall of the flow path 21. Therefore, the flow velocity in the height direction becomes maximum at the central position with respect to the position in the height direction (z-axis direction).
  • the flow velocity may vary in the height direction.
  • it may be the result of the flow velocity distribution in the height direction, but due to various other causes (for example, gravity), the positions of the plurality of cells CLs flowing in the flow path 21 in the height direction are originally (first). (From) It is scattered.
  • the velocities (traveling direction and velocity) of the plurality of cells CLs flowing in the flow path 21 can change or rotate, respectively. Therefore, the position or orientation of each of the plurality of cell CLs in the direction perpendicular to the streamline direction changes with respect to the imaging unit 23 in the process of imaging the plurality of cell CLs.
  • the cells pass through positions other than the positions imaged by the image pickup element 28 provided in the image pickup unit 23 among the plurality of cell CLs. There may be things. In that case, the number of cells per frame is reduced.
  • the position of the flow path 21 of the observation object in the height direction is aligned by using the sound wave AW by the acoustic element 22.
  • the acoustic element 22 is configured to include a transducer as an example.
  • FIG. 6 shows an example of how a plurality of cells CLs flowing in the flow path 21 are aligned in the height direction by the sound wave AW according to the present embodiment.
  • the acoustic element 22 irradiates the flow path 21 with a sound wave AW as a standing wave.
  • the wavelength of the sound wave AW is determined according to the height of the flow path 21.
  • Multiple cell CLs are aligned by sound effects so that they gather in the standing wave nodes of the sound wave.
  • Acoustic focusing is a method of concentrating an observation object on a standing wave node of a sound wave by an acoustic effect.
  • the sound wave AW emitted from the acoustic element 22 is, for example, an ultrasonic wave.
  • the sound wave AW emitted from the acoustic element 22 may be a sound wave having a frequency lower than that of the ultrasonic wave.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW is, for example, one in the height direction.
  • the position of the standing wave node of the sound wave AW is the position at the center of the height in the height direction of the flow path 21.
  • the wavelength of the sound wave AW is equal to the height of the flow path 21.
  • the plurality of cells CLs are arranged in a row at the center position of the height in the height direction according to the number of nodes of the standing wave of the sound wave AW being one in the height direction.
  • FIG. 6 shows, as an example, the pattern of the amplitude of the sound wave AW generated at the position near the cell CL1 among the plurality of cell CLs.
  • the standing wave of the sound wave AW also has a node at the center position of the height of the flow path 21 at other positions in the width direction of the flow path 21.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW is 0 in the width direction as an example. In other words, the sound wave AW does not form a standing wave in the width direction.
  • FIG. 7 shows an example of how a plurality of cell CLs flow through the flow path 21 when the acoustic element 22 does not irradiate the flow path 21 with the sound wave AW.
  • FIG. 7 shows a cross section at a time t1 in the length direction (y-axis direction) of the flow path 21.
  • the plurality of cells CLs-1 are cells having a high velocity flowing near the center in the width direction (x-axis direction) of the flow path 21 among the plurality of cell CLs.
  • the cells CLs-2 and CLs-3 are slow-moving cells that flow at a position away from the center in the width direction (x-axis direction) of the flow path 21 among the plurality of cell CLs.
  • the slow-velocity cells CLs-2 and CLs-3 flow upstream of the fast-velocity cells CLs-1 at time t1, and have not reached the position of the cross section shown in FIG. 7. Further, in the plurality of cell CLs, the positions of the flow paths 21 in the height direction (z-axis direction) are not aligned due to the flow velocity distribution in the height direction.
  • FIG. 8 shows an example of how a plurality of cell CLs flow through the flow path 21 when the number of nodes of the standing wave of the sound wave AW is 1 or more in the width direction.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW is 5 in the width direction.
  • the plurality of cells CLs are aligned with the position of the node in the width direction of the standing wave in the width direction by an acoustic effect.
  • the number of the plurality of cells CLs arranged in the width direction is equal to the number of standing wave nodes in the width direction. That is, the node of the standing wave in the width direction limits the number of a plurality of cell CLs arranged in the width direction.
  • the standing wave node limits the number of cells CLs arranged in the width direction, while the distance between adjacent cells of the cells CLs arranged in the width direction is a predetermined distance. The above can be done. Therefore, the standing wave node in the width direction can suppress the interaction between a plurality of cell CLs.
  • the number of a plurality of cell CLs arranged in the width direction is not limited by the number of the nodes.
  • the number of the plurality of cell CLs arranged in the width direction is limited by the size of the plurality of cell CLs and the width of the flow path 21.
  • the acoustic element 22 is provided at a position upstream of the position where the image pickup unit 23 is provided (in the ⁇ y axis direction) in the length direction of the flow path 21 and at a position separated from the position by a predetermined distance. Therefore, the standing wave due to the sound wave AW irradiated by the acoustic element 22 is generated at a position upstream (in the ⁇ y axis direction) from the position where the image pickup unit 23 is provided.
  • the imaging unit 23 is arranged at a position upstream of the position where the position variation or rotation occurs in the plurality of cells CLs once aligned. Therefore, the imaging unit 23 images a state in which a plurality of cell CLs are aligned in the height direction.
  • the distance between the acoustic element 22 and the image pickup unit 23 in the length direction of the flow path 21 is short enough to maintain the alignment of a plurality of observation objects due to the acoustic effect of the sound wave AW by the acoustic element 22.
  • the acoustic element 22 is provided on the upstream side (-y-axis direction) of the position where the image pickup unit 23 is provided in the length direction of the flow path 21, and is provided at a position separated from the position by a predetermined distance. The appearance of the acoustic element 22 is not reflected in the image captured by the image pickup unit 23.
  • the image pickup unit 23 includes a light source 27, an objective lens OG, an image pickup element 28, a first optical element L1, a second optical element L2, a third optical element L3, and a control unit 200.
  • the light source 27 irradiates the flow path 21 with the band-shaped illumination light LS. Specifically, the light source 27 irradiates the flow path 21 with band-shaped coherent light.
  • the band-shaped illumination light LS is a band-shaped illumination light by narrowing down the coherent light.
  • the band-shaped illumination light is coherent light having a width longer than the diameter of the sample in the x-axis direction and adjusted to a thickness shorter than the diameter of the sample in the y-axis direction.
  • the light source 27 irradiates the flow path 21 with the band-shaped illumination light LS via the dichroic mirror M1 and the objective lens OG.
  • the illumination light LS may be coherent light or incoherent light.
  • the illumination light LS irradiated by the light source 27 is, for example, coherent light.
  • the light source 27 irradiates the flow path 21 with the illumination light LS via the dichroic mirror M1 and the objective lens OG.
  • the position where the illumination light LS of the flow path 21 is irradiated is also described as an irradiation position.
  • the cell CL that has passed through this irradiation position emits light L when irradiated with the illumination light LS.
  • excitation light is used as the illumination light LS
  • the cell CL emits light when fluorescent molecules are excited by the illumination light LS which is the excitation light.
  • the light generated by this light emission is fluorescence, and the light L is this fluorescence.
  • the imaging unit 23 images the cell CL that has passed the position where the illumination light LS is irradiated.
  • the image pickup unit 23 captures the light L from the cell CL that has passed the position where the illumination light LS is irradiated.
  • the imaging unit 23 images a cross section of the cell CL.
  • a certain cross section is a surface on which the cell CL emits light L by the illumination light LS.
  • a cross section is a plane that intersects the direction in which the cell CL flows through the flow path 21.
  • the configuration of the optical system for imaging a certain cross section of the cell is disclosed in, for example, US Patent Application Publication No. 2015/0192767 and US Pat. No. 8,582,203.
  • the imaging unit 23 may measure the spatial information of the cell CL. Further, depending on the type of imaging in which the imaging flow cytometer 20 observes the observation object, the imaging unit 23 may use visible light, electromagnetic waves other than visible light, heat, vibration waves, or the like for measurement or imaging. ..
  • the objective lens OG collects the light L from the cell CL.
  • the objective lens OG is an objective lens arranged at a position where the irradiation position is in focus. In the following description, the position where the focus is on the irradiation position is also referred to as the focal position FP.
  • the objective lens OG may be a dry objective lens or an immersion objective lens.
  • the immersion objective lens is an oil immersion lens, a water immersion lens, or the like.
  • the light collected by the objective lens OG is imaged in the image sensor 28 via the first optical element L1, the second optical element L2, and the third optical element L3.
  • the light focused by the objective lens OG is imaged as an image VRI via the first optical element L1.
  • This image VRI is an image of a cross section of the cell CL with respect to the plane including the x-axis direction and the z0-axis direction.
  • the z0 axis is the direction in which the band-shaped illumination light LS focused by the objective lens OG is incident on the cell CL.
  • the direction in which the band-shaped illumination light LS is incident on the cell CL is inclined by a predetermined angle with respect to the z-axis direction. That is, the z0 axis is tilted by a predetermined angle with respect to the z axis.
  • the image pickup element 28 takes an image VRI through the second optical element L2 and the third optical element L3.
  • FIG. 9 is a diagram showing a cross section of the cell CL imaged by the image sensor 28.
  • FIG. 9A is a diagram showing the positional relationship between the illumination light LS and the cell CL.
  • the illumination light LS emitted from the light source 27 is emitted in the z0 axis direction.
  • FIG. 9B is a view of the cell CL seen from FIG. 9A as seen from the y-axis direction.
  • the illumination light LS spreads in a band shape in the z0 axis direction and the x-axis direction.
  • FIG. 9C is a diagram showing the positional relationship between the image pickup device 28 and the image VRI which is an image of a cross section of the cell CL.
  • the image sensor 28 and the image VRI are parallel to each other.
  • the image pickup device 28 images the image VRI from a direction perpendicular to the image VRI (that is, the direction of the optical axis of the second optical element L2 and the third optical element L3 shown in FIG. 2).
  • the image sensor 28 images a cross section of the cell CL.
  • the image pickup device 28 is, for example, a camera in which pixels are arranged in the vertical direction and the horizontal direction.
  • the image pickup device 28 can acquire only the light intensity of the pixel array in the region where the image is formed among the pixels arranged in the vertical direction and the horizontal direction.
  • the image pickup element 28 when N rows of pixels are arranged in the vertical direction and N columns of pixels are arranged in the horizontal direction, the light of the pixel rows of the central M rows (M is a number smaller than N) in the vertical direction is arranged. Get only strength.
  • the image sensor 28 acquires only the light intensity of M ⁇ N pixels. As a result, the image sensor 28 acquires the light intensity of the pixel array in the area where the image is not formed, as compared with the image sensor which acquires the light intensity of both pixels in the area where the image is not formed. It is possible to shorten the time to do. Further, it is possible to shorten the image processing time for generating an captured image based on the intensity of the light acquired from the image pickup device 28. As a result, the image sensor 28 can acquire an image at high speed.
  • the image sensor 28 may be a camera that acquires the light intensity of both pixels in the region where the image is formed and the region where the image is not formed.
  • FIG. 10 shows an example of a pixel sequence in a region where an image is formed in the image sensor 28.
  • Each of the plurality of images VRI is an image of each of the plurality of cells CLs.
  • the plurality of cells CLs are aligned in the height direction of the flow path 21 by irradiating the flow path 21 with a standing wave sound wave AW. Therefore, the image pickup device 28 images a plurality of cell CLs in a state where the plurality of cell CLs are arranged in a row in the width direction.
  • the number of observation objects per frame can be increased as compared with the case where the observation objects are not aligned in a row in the height direction.
  • the image pickup device 28 is an image pickup device composed of sCMOS (Scientific CMOS; CMOS for scientific measurement) or the like.
  • sCMOS Stientific CMOS; CMOS for scientific measurement
  • the sCMOS can take an image at a higher speed and with better image quality than a conventional CCD or an image pickup device composed of CMOS.
  • the image sensor 28 supplies the captured image to the image acquisition unit 24.
  • the control unit 200 includes, for example, a CPU, a GPU (Graphics Processing Unit), an FPGA (field-programmable gate array), and the like, and performs various operations and information exchange.
  • the control unit 200 includes an image acquisition unit 24 as its functional unit.
  • the image acquisition unit 24 acquires an captured image from the image pickup device 28.
  • the image acquisition unit 24 stores the image captured from the image sensor 28 in the storage unit 25 as a cross-sectional image PIC.
  • the cross-sectional image PIC is stored in the storage unit 25 in the order in which the images are taken.
  • the three-dimensional image generation unit 26 generates a three-dimensional image of the cell CL based on a plurality of cross-sectional image PICs obtained by the imaging unit imaging the cross-sectional CS of the cell CL in time series.
  • the three-dimensional image of the cell CL is an image in which the cell CL is scanned in the streamline direction, which is the direction in which the cell CL flows through the flow path 21.
  • the three-dimensional image generation unit 26 acquires a plurality of cross-sectional image PICs from the storage unit 25.
  • the three-dimensional image generation unit 26 generates a three-dimensional image of the cell CL based on a plurality of cross-sectional image PICs acquired from the storage unit 25.
  • the three-dimensional image generation unit 26 is coupled in the order in which the cross-sectional image PICs are imaged in the ⁇ y axis direction.
  • This cross-sectional image PIC is an image obtained by capturing the above-mentioned surface LP.
  • FIG. 11 is a diagram showing the order in which the three-dimensional image generation unit 26 joins the cross-sectional image PICs.
  • FIG. 11A is a diagram showing an example of the correspondence between the cross section of the cell CL and the cross-sectional image.
  • Cell CL moves in the + y-axis direction.
  • the imaging unit 23 captures n cross-sectional image PICs from the cross-sectional CS1 to the cross-sectional CSn of the cell CL in this order in chronological order.
  • N in the cross section CSn is an integer of 1 or more.
  • the storage unit 25 stores from the cross-sectional image PIC1 of the cross-section CS1 to the cross-sectional image PICn of the cross-section CSn.
  • FIG. 11B is a diagram showing the order in which the three-dimensional image generation unit 26 combines the cross-sectional image PIC1 to the cross-sectional image PICn.
  • the three-dimensional image generation unit 26 couples the cross-sectional image PICs in the order in which they are imaged in the ⁇ y axis direction. This is because the cell CL moves in the + y-axis direction. The order of binding is changed according to the movement direction of the cell CL.
  • FIG. 11B shows an XYZ coordinate system as a three-dimensional Cartesian coordinate system. This XYZ coordinate system is a coordinate system of a three-dimensional image generated by the three-dimensional image generation unit 26.
  • the three-dimensional image generation unit 26 combines the cross-sectional image PICn from the cross-sectional image PIC1 in a state where the XYZ coordinate system and the xyz coordinate system are associated with each other. Specifically, the three-dimensional image generation unit 26 combines the X direction and the x direction in the same direction. The three-dimensional image generation unit 26 combines the Y-axis direction and the y-axis direction in the same direction. The three-dimensional image generation unit 26 is coupled with the Z-axis direction and the z-axis direction in the same direction. Further, the three-dimensional image generation unit 26 generates a three-dimensional image of the cell CL by sequentially binding the cross-sectional image PICn from the cross-sectional image PIC1 in the ⁇ Y axis direction.
  • FIG. 12 is a flow chart showing an example of the operation of the imaging flow cytometer 20.
  • the operation procedure shown here is an example, and the operation procedure may be omitted or added.
  • Step S10 The acoustic element 22 irradiates the flow path 21 with a sound wave AW.
  • the image sensor 28 always captures an image of the focal position FP.
  • the image acquisition unit 24 acquires a signal from the image sensor 28.
  • the signal is a signal indicating the cross-sectional image PIC described above.
  • Step S30 The image acquisition unit 24 determines whether or not there is a change in the signal acquired from the image pickup element 28. Specifically, the image acquisition unit 24 stores a pre-detection signal, which is a signal in a state where the cell CL is not flowing in the flow path.
  • the image acquisition unit 24 compares the pre-detection signal with the signal acquired from the image sensor 28.
  • the image acquisition unit 24 determines that there is no change in the signal when there is no predetermined difference between the pre-detection signal and the signal acquired from the image sensor 28.
  • the image acquisition unit 24 determines that there is a change in the signal when there is a predetermined difference between the pre-detection signal and the signal acquired from the image sensor 28.
  • Step S30; NO When the image acquisition unit 24 determines that there is no change in the signal, the image acquisition unit 24 repeats the process from step S10.
  • Step S30; YES When the image acquisition unit 24 determines that there is a change in the signal, the image acquisition unit 24 stores the signal acquired from the image pickup device 28 in the storage unit 25 as a cross-sectional image PIC (step S40).
  • Step S50 The image acquisition unit 24 acquires a signal from the image sensor 28.
  • Step S60 The image acquisition unit 24 determines whether or not the cross section of the cell CL has been imaged based on the signal acquired from the image sensor 28. Specifically, when the pre-detection signal and the signal acquired from the image pickup device 28 have a predetermined difference, the image acquisition unit 24 determines that the cross section of the cell has not been imaged. If there is no predetermined difference between the pre-detection signal and the signal acquired from the image pickup device 28, the image acquisition unit 24 determines that the cross section of the cell has been imaged.
  • Step S60 When the image acquisition unit 24 determines that the cross section of the cell has not been imaged, the process is repeated from step S40. (Step S60; YES) When the image acquisition unit 24 determines that the cross section of the cell has been imaged, the process of step S70 is executed.
  • Step S70 The three-dimensional image generation unit 26 acquires a plurality of cross-sectional image PICs from the storage unit 25.
  • the three-dimensional image generation unit 26 generates a three-dimensional image by combining a plurality of cross-sectional image PICs acquired from the storage unit 25.
  • Step S80 The three-dimensional image generation unit 26 causes the display unit 10 to display the generated three-dimensional image.
  • the imaging flow cytometer 20 ends the process.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of a bright-field image in which a plurality of cells are captured from the height direction (z-axis direction) of the flow path 21 according to the present embodiment.
  • FIG. 13 (a) is a bright field image when the sound wave AW is not irradiated
  • FIG. 13 (b) is a bright field image when the sound wave AW is irradiated.
  • the bright-field image a plurality of cells are imaged with contrast (brightness) according to the position in the height direction (z-axis direction).
  • contrast contrast
  • a glass capillary having a height of 200 micrometers and a width of 2 mm is used as the flow path 21.
  • a suspension containing 1 ⁇ 107 fluorescently stained cells per milliliter is flowed through the flow path 21 at a flow rate of 10 microliters per minute.
  • FIG. 14 is a diagram showing an example of a fluorescence image in which a plurality of cells are imaged on a surface inclined by a predetermined angle from the height direction according to the present embodiment.
  • the surface inclined by a predetermined angle from the height direction is the surface LP described in FIG.
  • FIG. 14 (a) is a fluorescence image when the sound wave AW is not irradiated
  • FIG. 14 (b) is a fluorescence image when the sound wave AW is irradiated.
  • the image pickup result shown in FIG. 14 is obtained by imaging 20 frames per second using 800 ⁇ 2,560 pixels corresponding to the region where the image is formed among the pixels of the image pickup device 28. As shown in FIG.
  • FIG. 15 is a cross-sectional image taken at different times of the plane (plane LP) inclined by a predetermined angle from the height direction according to the present embodiment.
  • the cross-sectional image shown in FIG. 15 is captured at 720 frames per second. In this imaging, only the pixels used for imaging the region corresponding to the height of 36 micrometers in the vertical direction among the pixels of the image sensor 28 are used for the height of the flow path 21 of 200 micrometers. ..
  • FIG. 16 is a diagram showing an example of a three-dimensional image reconstructed from the cross-sectional image shown in FIG. FIG.
  • FIG. 16 is a three-dimensional image reconstructed from an image of 600 frames with respect to an image of a cross section captured at 720 frames per second.
  • 1921 cells are imaged over 833 milliseconds.
  • the throughput corresponds to the imaging of 2305 cells per second.
  • FIG. 17 is an image of a cross section in the x-direction and the y-direction.
  • FIG. 18 is an enlarged view of each region (region R1, region R2, region R3, region R4) of the cross-sectional image shown in FIG. 17 according to the present embodiment.
  • FIG. 19 is a diagram showing an example of the functional configuration of the cell measurement system 1a of the second embodiment.
  • the cell measurement system 1a differs from the first embodiment described above in that it generates a two-dimensional image.
  • the imaging flow cytometer 20a includes a flow path 21, an acoustic element 22, an imaging unit 23a, a storage unit 25, and a two-dimensional image generation unit 26a.
  • the image pickup unit 23a includes a light source 27b, an objective lens OG, an image pickup element 28, a first optical element L1, a second optical element L2, a third optical element L3, and a control unit 200.
  • the image pickup unit 23a is a line scan camera.
  • the line scan camera acquires the detected light intensity for a row of pixels arranged in the vertical or horizontal direction of the image sensor 28.
  • the image pickup unit 23a takes an image of a line included in the cross section of the observation object in time series. This line is one of the lines included in a group of lines when the cross section is regarded as a group of lines in a certain direction.
  • a photodetection device such as a linear array type photomultiplier tube (PMT) or a part of pixels of an sCMOS camera is used.
  • the two-dimensional image generation unit 26a generates a two-dimensional image in which the observation object is scanned in the streamline direction based on the images of a plurality of lines captured by the image pickup unit 23a in time series.
  • FIG. 20 is a diagram showing the order in which the two-dimensional image generation unit 26a joins the line image PLC.
  • FIG. 20A is a diagram showing an example of the correspondence between the line included in the cross section of the cell CL and the line image.
  • Cell CL moves in the + y-axis direction.
  • the imaging unit 23 images n line image PLCs in chronological order for the lines included in each of the cross sections CS1 to the cross section CSn of the cell CL.
  • N in the cross section CSn is an integer of 1 or more.
  • the storage unit 25 stores from the line image PLC1 of the line included in the cross section CS1 to the line image PLCn of the line included in the cross section CSn.
  • FIG. 20B is a diagram showing the order in which the two-dimensional image generation unit 26a combines the line image PLC1 to the line image PLCn.
  • the two-dimensional image generation unit 26a couples the line image PLCs in the order in which they are imaged in the ⁇ y axis direction.
  • FIG. 20B shows an XYZ coordinate system as a three-dimensional Cartesian coordinate system.
  • the XY coordinate system which is a two-dimensional coordinate system including the X-axis and the Y-axis included in the XYZ coordinate system, is a coordinate system of a two-dimensional image generated by the two-dimensional image generation unit 26a.
  • the two-dimensional image generation unit 26a combines the line image PLCn with the line image PLCn in a state where the XY coordinate system and the x-axis and the y-axis of the xyz coordinate system are associated with each other. Specifically, the two-dimensional image generation unit 26a is coupled with the X direction and the x direction in the same direction. The two-dimensional image generation unit 26a is coupled with the Y-axis direction and the y-axis direction in the same direction. Further, the two-dimensional image generation unit 26a generates a two-dimensional image of the cell CL by sequentially binding the line image PLCn from the line image PLC1 in the ⁇ Y axis direction.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a include the flow path 21, the acoustic element 22, the light source 27, the image pickup units 23, 23a and 23b, and the scanning image generation unit (scanning image generation unit). It includes a three-dimensional image generation unit 26 and a two-dimensional image generation unit 26a).
  • the flow path 21 is a flow path through which the observation object (cell CL in the above-described embodiment) is flowed, and the length in the width direction (length FW in the width direction in the above-described embodiment) is in the height direction. It is longer than the length (in the above-described embodiment, the length in the height direction FH).
  • the acoustic element 22 irradiates the flow path 21 with a sound wave AW as a standing wave.
  • the light sources 27 and 27b irradiate the flow path 21 with the illumination light LS and the illumination light LSb.
  • the imaging units 23, 23a, and 23b measure or image an observation object (cell CL in the above-described embodiment) that has passed through a position where the illumination light LS and the illumination light LSb are irradiated, thereby measuring or imaging the observation object (described above).
  • at least a line included in the cross-sectional CS of the observation object (cell CL in the above-described embodiment) in the streamline direction in which the cell CL) flows through the flow path 21 is imaged.
  • the scanning image generation unit (three-dimensional image generation unit 26, two-dimensional image generation unit 26a) has a plurality of captured images (described above) obtained by the imaging units 23, 23a, 23b taking images of the lines included in the cross-sectional CS in time series.
  • a three-dimensional image two-dimensional image of cell CL
  • the streamline direction is the direction in which the observation object (cell CL in the above-described embodiment) flows through the flow path 21.
  • the speed (traveling direction and speed) of the observation object varies in the process of imaging the observation object, and the observation object. Since it is possible to suppress the rotation of the image by an acoustic effect, the imaging conditions can be stabilized.
  • the imaging conditions include the position, rotation, and velocity of the observation object in the imaging process in the direction perpendicular to the streamline direction.
  • the observation object since the observation object is scanned in the streamline direction to generate a scanned image, the observation object is imaged in the process perpendicular to the streamline direction of the observation object. If the position, rotation (direction of the observation object), or speed in any direction changes, the observation object cannot be scanned in the streamline direction.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a it is possible to prevent the observation object from passing through a position other than the position to be imaged in the height direction of the flow path 21 due to the acoustic effect, so that the image pickup can be performed.
  • the pixel sequences of the image pickup element 28 provided in the unit 23 only the pixel array corresponding to a specific position in the height direction of the flow path 21 can be used for imaging.
  • the observation object is in the height direction of the flow path 21. If the image passes through a position other than the position to be imaged, the image of the observation object itself cannot be obtained.
  • the imaging unit 23 is a camera, and there is a limit on the imaging speed, that is, the number of frames that can be imaged per unit time. Therefore, in the imaging flow cytometers 20 and 20a, unless the flow velocity of the fluid flowing through the flow path 21 is kept low, the number of times of imaging in the flow direction with respect to the image pickup target is reduced, and the resolution is lowered. That is, in the imaging flow cytometers 20 and 20a, the desired flow velocity is determined according to the imaging unit 23. Conventionally, hydrodynamic focusing has been known in order to stabilize the position of the observation object in the height direction of the flow path 21.
  • the flow velocity of the fluid flowing through the flow path 21 becomes faster than before the hydrodynamic focusing, and the flow velocity is not stable. Further, since the flow velocity corresponding to the image pickup unit becomes too high than the desired flow velocity, the resolution in the flow direction of the image to be imaged is lowered. In the imaging flow cytometers 20 and 20a, unlike the hydrodynamic focusing in which the flow velocity becomes high, imaging is possible without changing the flow velocity from the desired flow velocity due to the acoustic effect.
  • the above-mentioned imaging conditions can be stabilized when the observation object flowing in the flow path is scanned in the streamline direction, and imaging that generates a scanned image stably and at high speed is possible. It becomes.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW is one in the height direction of the flow path 21, and the sound wave AW is in the width direction of the flow path 21.
  • the number of standing wave nodes in is 0.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW is 0 in the width direction of the flow path 21, so that the number of nodes is in the width direction of the flow path 21.
  • the number of cells CLs arranged is not limited by the number of the nodes.
  • the number of nodes of the standing wave of the sound wave AW may be one in the height direction, and the number of nodes of the standing wave of the sound wave AW may be one or more in the width direction of the flow path 21.
  • the number of standing wave nodes of the sound wave AW may be two or more in the height direction of the flow path 21.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a according to the above-described embodiment in the flow path 21, a plurality of observation objects arranged in the width direction of the flow path 21 (a plurality of cell CLs in the above-described embodiment). Is shed.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a according to the above-described embodiment can increase the number of observation objects per frame as compared with the case where one observation object is flowed through the flow path 21, and thus the number of observation objects per unit time can be increased.
  • both throughput and the signal-to-noise ratio can be achieved at the same time. Achieving both throughput and signal-to-noise ratio means increasing the measurement time per cell and increasing the signal-to-noise ratio by measuring many cells at the same time when measuring at the same throughput. Is to let. Further, in the imaging flow cytometers 20 and 20a according to the above-described embodiment, since the plurality of observation objects are arranged in a row in the width direction of the flow path 21, the image is imaged as the image pickup element 28 provided in the image pickup unit 23.
  • an image sensor that acquires only the light intensity of the pixel array in the region where the image is formed.
  • the light intensity of the pixel row in the region where an image is not formed other than the position where a plurality of observation objects are aligned is not acquired, so that the image is captured. It is possible to shorten the time for image processing to generate.
  • the present invention is not limited to this.
  • Three-dimensional information or another imaging technique that captures three-dimensional information or two-dimensional information by imaging a cross section of an observation object flowing through a flow path may be used.
  • the illumination light does not have to be band-shaped, and the illumination light does not have to be inclined with respect to the height direction of the flow path.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a are based on a three-dimensional image or a two-dimensional image in which the observation object imaged by the imaging flow cytometers 20 and 20a according to the above-described embodiment is scanned in the streamline direction. You may sort the observation object. Sorting is to sort a predetermined observation object from the observation objects flowing through the flow path 21. This predetermined observation object may be selected in advance by the user.
  • Sorting is the selection and removal of predetermined cells from the observation objects.
  • the imaging flow cytometers 20 and 20a include information indicating the morphology of cells selected in advance by the user, and information indicating the morphology of cells contained in the streamline-scanned three-dimensional image or the two-dimensional image. By comparing the cells, it is determined whether or not the cells are to be sorted, and the cells are sorted. In the imaging flow cytometers 20 and 20a, the flow velocity of the fluid flowing through the flow path 21 is sufficiently slow with respect to the time required for determining the sorting target and sorting.
  • cell C1 which is a human leukemia cell (K562 cell) in mitosis, was analyzed as an observation target.
  • Cell C1 is stained with the antimitotic protein MPM-2 and DAPI.
  • a suspension containing the stained cells C1 at a concentration of about 1 ⁇ 10 7 cells per milliliter was used.
  • the suspension was flowed through a flow path 21 provided in the imaging flow cytometer 20 at a flow rate of 10 microliters per minute.
  • FIG. 21 is an image obtained by projecting a three-dimensional image of the cell C1 generated as a result of observation by the imaging flow cytometer 20 with the imaging flow cytometer 20 under the above experimental conditions onto a two-dimensional plane (xy plane).
  • the image shown in FIG. 21 is an image in which images of a plurality of cross sections included in a three-dimensional image having different positions in the z direction are superimposed and displayed.
  • 1248 cells C1 are reconstructed as a three-dimensional image. From the three-dimensional image shown in FIG. 21, 60 cells C1 were determined to be MPM-2 positive in this population.
  • the images contained in the regions R11, R12, R13, and R14 are images of cells C1 in prophase, metaphase, anaphase, and telophase, respectively.
  • the images of the cells contained in the regions R11, R12, and R14, respectively, are the images of the cells C1 stained with DAPI.
  • the image of the cells contained in region R13 is an image of cells C1 stained with MPM-2.
  • FIG. 22 shows an enlarged image of each of the area R11, the area R12, the area R13, and the area R14.
  • FIGS. 23 and 24 show images of a three-dimensional image of cell C1 stained with DAPI projected onto a two-dimensional plane for each of the metaphase and anaphase of cell division.
  • 23 (A), (B), and (C) are images of middle-stage cells C1 projected on the xy plane, the yz plane, and the xz plane, respectively.
  • 24 (A), (B), and (C) are images of late cell C1 projected on the xy plane, the yz plane, and the xz plane, respectively.
  • FIGS. 24 (B) and 24 (C) it is possible to confirm the division of chromosomes in the images projected on the yz plane and the xz plane of the late cell C1.
  • the divided chromosomes are overlapped and imaged, and it is difficult to confirm the chromosome division from the image.
  • the image projected on the xy plane shown in FIG. 24 (A) is an image corresponding to a two-dimensional image obtained by conventional two-dimensional imaging.
  • conventional two-dimensional imaging it was difficult to generate an image that can discriminate even the cell cycle such as metaphase plate and chromosome division depending on the orientation of the cell.
  • the position of the chromosome in the z direction could be identified as shown in FIGS. 24 (B) and 24 (C).
  • the imaging flow cytometer 20 can perform three-dimensional imaging including the z direction, it is possible to generate a three-dimensional image capable of discriminating up to the cell cycle such as metaphase plate and chromosome division.
  • images of the xy, yz, and xz planes are not sufficient to identify the arrangement of chromosomes to determine the end of cell division. It will be described with reference to FIGS. 25 to 27 that the arrangement of chromosomes may be identified by changing the direction in which the three-dimensional image is projected.
  • FIG. 25 shows an example of a region stained by DAPI in a three-dimensional image generated by the imaging flow cytometer 20.
  • the cell C1 is a metaphase cell of cell division.
  • FIG. 25 shows the x-axis, y-axis, and z-axis.
  • the directions indicated by the x-axis, y-axis, and z-axis correspond to the directions indicated by the coordinate axes of the xyz coordinate system shown in FIG. 1, for example.
  • FIG. 25 shows the x-axis, the y-axis, and the z-axis, as well as the ⁇ 1 axis, the ⁇ 2 axis, and the ⁇ 3 axis.
  • the ⁇ 1 -axis, ⁇ 2 -axis, and ⁇ 3 -axis are coordinate axes obtained by rotating the x-axis, y-axis, and z-axis based on the eigenvectors obtained by principal component analysis.
  • the unit vectors indicating the directions of the ⁇ 1 axis, the ⁇ 2 axis, and the ⁇ 3 axis are [-0.54, 0.82, 0.20] and [0.710.310] in the original xyz coordinate system, respectively. .63] and [0.45, 0.48, -0.75].
  • FIG. 26 is a two-dimensional image when the region shown in FIG. 25 is projected onto a plane by rotating the axes from the x-axis, y-axis, and z-axis to the ⁇ 1 -axis, ⁇ 2 -axis, and ⁇ 3 -axis. ..
  • FIG. 27 (A), (B), and (C) show two-dimensional images projected on each of the ⁇ 1 ⁇ 2 plane, the ⁇ 1 ⁇ 3 plane, and the ⁇ 2 ⁇ 3 plane, respectively.
  • FIG. 27 (A) the arrangement of chromosomes can be identified.
  • the imaging flow cytometer 20 Since the imaging flow cytometer 20 generates a three-dimensional image, it is possible to select the direction in which the three-dimensional image is projected onto the two-dimensional image in order to identify the structure of the observation object. It is possible to select the projection direction because the imaging flow cytometer 20 is generating a three-dimensional image. When a two-dimensional image or a two-dimensional image for each of a plurality of predetermined directions is generated, it is not possible to select the projection direction at the stage of analysis after the image is generated.
  • FIG. 28 shows the result of analyzing a three-dimensional image for a range wider than the range captured by the image shown in FIG. 21 described above.
  • a three-dimensional image of cells C1 in an order of 105 flowing through the flow path 21 is generated by the imaging flow cytometer 20.
  • the cell C1 is stained with MPM-2 or DAPI.
  • images of 408,937 cells C1 were detected with a total imaging time of 286 seconds.
  • the image shown in FIG. 28 is an image obtained by projecting a three-dimensional image of 1% of the whole cells C1 stained with MPM-2 and DAPI onto a two-dimensional plane (xy plane). It is an image projected on the xy plane.
  • the image shown in FIG. 28 is an image in which images of a plurality of cross sections included in a three-dimensional image having different positions in the z direction are superimposed and displayed.
  • the scale bar indicates a length of 100 micrometers.
  • FIG. 29 is a scatter plot showing the results of the analysis.
  • MPM-2 positive cells C1 were selected.
  • Region R20 shows selected MPM-2 positive cells C1.
  • the number of DAPI-stained regions within cell C1 was counted.
  • two DAPI-stained areas were measured.
  • FIG. 30 is a two-dimensional image in which a three-dimensional image of two DAPI-stained areas is projected onto an xy plane. From the image shown in FIG. 30, it was determined to be in the late or late stage of cell division.
  • FIG. 31 (A) shows a two-dimensional image in which a three-dimensional image of one DAPI-stained area is projected onto a plane.
  • the plane on which the three-dimensional image is projected is selected so that the directions of the long axis and the short axis of the DAPI-stained area coincide with the vertical direction and the horizontal direction, respectively.
  • FIG. 31B shows a two-dimensional image in which a three-dimensional image of one DAPI-stained area is projected onto the xy plane. The two-dimensional image shown in FIG.
  • the two-dimensional image shown in FIG. 31 (B) is an image corresponding to two-dimensional imaging.
  • the DAPI-stained region shown in FIG. 31 (B) has a larger aspect ratio than the DAPI-stained region shown in FIG. 31 (A).
  • FIG. 32 shows the comparison result.
  • FIG. 32 shows a histogram showing the distribution of aspect ratios in the DAPI region for a plurality of cells.
  • Histogram H1 shows the aspect ratio obtained from the image obtained by three-dimensional imaging.
  • Histogram H2 shows the aspect ratio obtained from the image corresponding to the two-dimensional imaging. From FIG. 32, it can be seen that the aspect ratio of the image corresponding to the two-dimensional imaging tends to be excessively calculated as compared with the image obtained by the three-dimensional imaging.
  • the imaging flow cytometer 20 enables such three-dimensional imaging.
  • Each of the above-mentioned devices has a computer inside.
  • the process of each process of the above-mentioned apparatus is stored in a computer-readable recording medium in the form of a program, and the process is performed by the computer reading and executing this program.
  • the computer-readable recording medium means a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory, or the like.
  • the computer program may be distributed to the computer via a communication line, and the computer receiving the distribution may execute the program.
  • the above program may be for realizing a part of the above-mentioned functions.
  • a so-called difference file difference program
  • difference program difference program

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Abstract

イメージングフローサイトメーターは、観測対象物が流される流路であって、幅方向の長さが高さ方向の長さよりも長い流路と、前記流路に対して音波を定在波にして照射する音響素子と、前記流路に対して照明光を照射する光源と、前記照明光が照射される位置を通過した前記観測対象物を計測または撮像することにより、前記観測対象物が前記流路を流れる方向である流線方向についての前記観測対象物の断面に含まれる線を少なくとも撮像する撮像部と、前記撮像部が前記線を時系列に撮像して得られる複数の撮像画像に基づいて、前記観測対象物が前記流線方向に走査された画像を生成する走査画像生成部と、を備える。

Description

イメージングフローサイトメーター
　本発明は、イメージングフローサイトメーターに関する。
　本願は、２０２０年９月１０日に、日本に出願された特願２０２０－１５２３３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、流路を流れる観測対象物に照明光を照射して発せられる光を測定することによって観測対象物の特徴を評価するフローサイトメトリー法や、このフローサイトメトリー法を用いたフローサイトメーターが知られている（例えば、特許文献１）。また、観測対象物となる細胞・細菌等の微粒子を画像によって評価する蛍光顕微鏡やイメージングサイトメーターが知られている。
　加えて、フローサイトメーターの一種で、従来のフローサイトメーターと同等のスループットで微粒子の形態情報を高速に撮像するイメージングフローサイトメーターが知られている（例えば、特許文献２）。イメージングフローサイトメーターでは、流路中に照明光の当たる計測野が設けられ、細胞が計測野を通り抜ける。つまりイメージングフローサイトメーターでは、スキャンされる際に、二次元または三次元画像の撮像、または画像に相当する細胞空間情報の計測を行う。
　また、観測対象物となる細胞に帯状の励起光を照射して、この励起光が照射される照射面に対して異なる角度の面の画像や、観察対象物の３次元画像を得る多面光学顕微鏡が知られている（例えば、特許文献３及び特許文献４）。特許文献４に記載の多面光学顕微鏡では、Ａｘｉａｌ　ｐｌａｎｅ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＡＰＯＭ）の技術が用いられている（例えば、非特許文献１）。ＡＰＯＭとは、走査を行うことなく観測対象物の対物レンズの光軸に対して平行な断面を直接撮像する多面光学顕微鏡の技術である。
特許第５５３４２１４号公報 米国特許第６２４９３４１号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０１９２７６７号明細書 米国特許第８５８２２０３号明細書
Ｔｏｎｇｃａｎｇ　Ｌｉ、Ｓａｄａｏ　Ｏｔａ、Ｊｅｏｎｇｍｉｎ　Ｋｉｍ、Ｚｉ　Ｊｉｎｇ　Ｗｏｎｇ、Ｙｕａｎ　Ｗａｎｇ　、Ｘｉａｏｂｏ　Ｙｉｎ、Ｘｉａｎｇ　Ｚｈａｎｇ、「Ａｘｉａｌ　ｐｌａｎｅ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年１２月１日、４巻、７２５３号 Ｄａｎｕｔａ　Ｍ．　Ｂｕｋｏｗｓｋａ、Ｌａｄｉｓｌａｖ　Ｄｅｒｚｓｉ、Ｓｚｙｍｏｎ　Ｔａｍｂｏｒｓｋｉ、Ｍａｃｉｅｊ　Ｓｚｋｕｌｍｏｗｓｋｉ、Ｐｉｏｔｒ　Ｇａｒｓｔｅｃｋｉ、Ｍａｃｉｅｊ　Ｗｏｊｔｋｏｗｓｋｉ、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｅｖｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ｊｏｉｎｔ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、「Ｏｐｔｉｃｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓ」、ＯＳＡ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１３年１０月１日、２１巻、２０号、ｐ．２４０２５－２４０３８
　上述したようなイメージングサイトメーターでは、流路を流れる流体の流速は、流路の幅方向、あるいは高さ方向についてばらつきが生じ得る。また、何もしなければ、観測対象物の位置は流路の幅方向、あるいは高さ方向についてばらついてしまう。その結果、流路に生じた流速のばらつきによって、流路を流れる観測対象物の速度（進行方向と速さ）のばらつき、あるいは回転が起こってしまう。その結果、撮像位置においても測対象物の流線方向に垂直な方向についての位置あるいは速度が安定しない、あるいは対象物が回転してしまうことがあった。そのため、観測対象物を流線方向に走査する場合に撮像条件が安定しない場合があった。撮像条件には、撮像過程における観測対象物の流線方向に垂直な方向における位置、回転、及び速度（進行方向と速さ）が含まれる。
　本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、流路を流れる観測対象物を流線方向に走査する場合に撮像条件を安定させることができるイメージングフローサイトメーターを提供する。
　本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、本発明の一態様は、観測対象物が流される流路であって、幅方向の長さが高さ方向の長さよりも長い流路と、前記流路に対して音波を定在波にして照射する音響素子と、前記流路に対して照明光を照射する光源と、前記照明光が照射される位置を通過した前記観測対象物を計測または撮像することにより、前記観測対象物が前記流路を流れる方向である流線方向についての前記観測対象物の断面に含まれる線を少なくとも撮像する撮像部と、前記撮像部が前記線を時系列に撮像して得られる複数の撮像画像に基づいて、前記観測対象物が前記流線方向に走査された画像を生成する走査画像生成部と、を備えるイメージングフローサイトメーターである。
　また、本発明の一態様は、上記のイメージングフローサイトメーターにおいて、前記高さ方向について前記定在波の節の数は１個であり、前記幅方向について前記定在波の節の数は０個である。
　また、本発明の一態様は、上記のイメージングフローサイトメーターにおいて、前記高さ方向について前記定在波の節の数は１個であり、前記幅方向について前記定在波の節の数は１個以上である。
　また、本発明の一態様は、上記のイメージングフローサイトメーターにおいて、前記流路には、前記幅方向に整列された複数の前記観測対象物が流される。
　本発明によれば、流路を流れる観測対象物を流線方向に走査する場合に撮像条件を安定させることができる。
本発明の第１の実施形態に係る細胞測定システムの構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞測定システムの機能構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る流路の構成の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る流路における幅方向の流速分布の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る流路における高さ方向の流速分布の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る音波によって流路を流れる複数の細胞が高さ方向について整列される様子の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る音響素子が音波を流路に照射していない場合に複数の細胞が流路を流れる様子の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る音波の定在波の節の数が幅方向について１以上である場合に複数の細胞が流路を流れる様子の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る撮像素子が撮像する細胞の断面の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る撮像素子において像が結像される領域の画素列の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る３次元画像生成部が断面画像を結合する順番の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るイメージングフローサイトメーターの動作の一例を示す流れ図である。 本発明の第１の実施形態に係る流路の高さ方向から複数の細胞が撮像された明視野画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る高さ方向から所定の角度だけ傾いた面において複数の細胞が撮像された蛍光画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る高さ方向から所定の角度だけ傾いた面が異なる時刻において撮像された断面画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る３次元画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係るｘ方向とｙ方向についての断面の画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る断面画像の各領域の拡大図の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞測定システムの機能構成の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る２次元画像生成部が線画像を結合する順番の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る細胞の３次元画像を２次元平面（ｘｙ平面）に射影した画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る図２１に示した画像の領域を拡大した画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係るＤＡＰＩによって染色された細胞の細胞分裂の中期の３次元画像を２次元平面に射影した画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係るＤＡＰＩによって染色された細胞の細胞分裂の後期の３次元画像を２次元平面に射影した画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る３次元画像のうちＤＡＰＩによって染色された領域の一例を示す図である。 本発明の実施例に係るｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれに射影した場合の２次元画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る座標軸を主成分分析によって得られた座標軸へと回転させた場合の２次元画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る広い範囲の３次元画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係るＭＰＭ－２及びＤＡＰＩの強度を解析した結果を示す散布図の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る２つのＤＡＰＩ染色された領域の３次元画像がｘｙ平面に射影された２次元画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る１つのＤＡＰＩ染色された領域の３次元画像が平面に射影された２次元画像の一例を示す図である。 本発明の実施例に係る３次元イメージングによる画像と２次元イメージングに相当する画像とでＤＡＰＩ領域のアスペクト比を比較した結果の一例を示す図である。
（第１の実施形態）
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳しく説明する。図１は、本実施形態に係る細胞測定システム１の構成の一例を示す図である。
　細胞測定システム１は、イメージングフローサイトメーター２０と、解析装置３０と、表示部１０とを備える。イメージングフローサイトメーター２０は、観測対象物が流される流路を備える。なお、本実施形態では、観測対象物が細胞である場合について説明するが、観測対象物は細胞に限られない。観測対象物は、細菌等の微粒子であってもよい。
　イメージングフローサイトメーター２０が観測対象物を観察するために用いる顕微鏡には、蛍光顕微鏡、あるいは蛍光染色を必要としない各種の顕微鏡が用いられる。イメージングフローサイトメーター２０に蛍光顕微鏡が用いられる場合、観測対象物は蛍光染色される。イメージングフローサイトメーター２０に蛍光染色を必要としない各種の顕微鏡が用いられる場合、観測対象物は蛍光染色されない。蛍光染色を必要としない各種の顕微鏡とは、例えば、明視野顕微鏡、暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、位相顕微鏡、光散乱顕微鏡、ラマン散乱光顕微鏡、吸収位相顕微鏡などである。蛍光染色を必要としない顕微鏡を用いるイメージングフローサイトメーターでは、蛍光染色されていない観測対象物の画像を撮像するラベルフリーイメージングの技術が用いられ、細胞、細菌等を非侵襲的に観察することができる。イメージングフローサイトメーター２０が観測対象物を観察するイメージングは、上述したものに限られず、可視光、可視光以外の電磁波、熱、あるいは振動波などによる各種のイメージングが用いられてよい。
　イメージングフローサイトメーター２０は、この流路を流される細胞の３次元画像を生成する。解析装置３０は、イメージングフローサイトメーター２０が生成した３次元画像を解析する。解析装置３０は、３次元画像を解析することによって、例えば、当該３次元画像として再構築された細胞の分類、あるいは当該細胞についての各種の情報の読み取りを実行する。解析装置３０は、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ：Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）である。解析装置３０は、非破壊の細胞解析に好適に用いられる。
　表示部１０は、イメージングフローサイトメーター２０が生成した３次元画像、あるいは解析装置３０による解析結果を表示する。表示部１０は、例えば、液晶ディスプレイを備えており、さまざまな画像を表示する。この表示部１０に表示される画像には、イメージングフローサイトメーター２０が生成する細胞の３次元画像が含まれている。
［イメージングフローサイトメーター２０の機能構成］
　次に、図２を参照して、イメージングフローサイトメーター２０の機能構成について説明する。
　図２は、本実施形態の細胞測定システム１の機能構成の一例を示す図である。図２には、３次元直交座標系として、ｘｙｚ座標系を示す。本実施形態において、ｘ軸方向は、流路２１の幅方向である。また、ｙ軸方向が流路２１における細胞ＣＬが流される方向である。細胞ＣＬは、ｙ軸方向の＋ｙ方向に流される。ｚ軸方向は、流路２１と直交する方向であって、流路２１の高さ方向である。
　イメージングフローサイトメーター２０は、流路２１と、音響素子２２と、撮像部２３と、記憶部２５と、３次元画像生成部２６とを備える。
　ここで図３から図８を参照し、流路２１、及び音響素子２２について説明する。図３は、本実施形態に係る流路２１の構成の一例を示す図である。流路２１は、観測対象物が流される。観測対象物は、流路２１を流れる流体と共に流れされる。本実施形態では、流路２１には、流路２１の幅方向に整列された複数の観測対象物が流される。
　複数の観測対象物が幅方向に整列されるとは、高さ方向の位置が複数の観測対象物相互間において略等しくされて、複数の観測対象物が幅方向に１列に配置されることである。隣り合う観測対象物同士の間隔は任意であってよい。複数の観測対象物が幅方向に整列されている場合、流路２１の長さ方向についての位置は、複数の観測対象物相互間において揃っていることが好ましい。複数の観測対象物が幅方向に整列されている場合、流路２１の長さ方向についての位置は、複数の観測対象物について、少なくとも、ある観測対象物が他の観測対象物と長さ方向について重なり合う部分を有していることが好ましい。図３に示す例では、流路２１には、観測対象物として複数の細胞ＣＬｓが、流路２１の幅方向に整列されて流されている。
　なお、流路２１には、１つの観測対象物が流されてもよい。
　流路２１では、幅方向長さＦＷは高さ方向長さＦＨよりも長い。ここで、流路の幅方向の長さの高さ方向の長さに対する比率が非常に大きい場合、流路内における幅方向の流速分布は、幅方向の位置によらず一定となる（例えば、非特許文献２を参照）。一方、この場合、高さ方向の流速分布は、高さ方向の位置によって大きく変化する。
［流速分布について］
　図４に、流路２１における幅方向の流速分布の一例を示す。流路２１では、幅方向長さＦＷは高さ方向長さＦＨよりも長いために、幅方向の流速分布は、流路２１の壁の付近を除いて、幅方向（ｘ軸方向）の位置によらずほぼ一定となる。
　図５に、流路２１における高さ方向の流速分布の一例を示す。流路２１では、高さ方向の流速分布は、高さ方向（ｚ軸方向）の位置によって大きく変化する。ここで高さ方向の流速は、流路２１の壁から遠いほど大きくなる。一方、高さ方向の流速は、流路２１の壁に近いほど小さくなる。したがって、高さ方向の流速は、高さ方向（ｚ軸方向）の位置について中央の位置で最大となる。
　このように流路２１では、高さ方向について流速のばらつきが生じ得る。ここで高さ方向の流速分布の結果としてもあり得るが、他の色々な原因（例えば、重力）によっても、流路２１を流れる複数の細胞ＣＬｓの高さ方向についての位置は元から（最初から）ばらついている。その結果、高さ方向の流速分布によって、流路２１を流れる複数の細胞ＣＬｓはそれぞれ、速度（進行方向と速さ）が変化し得る、あるいは回転し得る。それらのため、複数の細胞ＣＬｓそれぞれについて流線方向に垂直な方向における位置、あるいは向きが、複数の細胞ＣＬｓを撮像する過程において撮像部２３に対して変化してしまう。
　また、複数の細胞ＣＬｓそれぞれについて流線方向に垂直な方向における位置がばらついた場合、複数の細胞ＣＬｓのうち撮像部２３に備えられる撮像素子２８によって撮像される位置以外の位置を通過してしまうものがある場合がある。その場合、１フレームあたりの細胞の数が少なくなってしまう。
　イメージングフローサイトメーター２０では、音響素子２２による音波ＡＷを用いて観測対象物の流路２１の高さ方向の位置を揃える。音響素子２２は、一例として、トランスデューサを含んで構成される。
　図６に、本実施形態に係る音波ＡＷによって流路２１を流れる複数の細胞ＣＬｓが高さ方向について整列される様子の一例を示す。音響素子２２は、流路２１に対して音波ＡＷを定在波にして照射する。音波ＡＷの波長は、流路２１の高さに応じて決まる。
　複数の細胞ＣＬｓは、音響効果によって音波の定在波の節に集まるように整列される。音響効果によって音波の定在波の節に観測対象物を集中させる方法を音響フォーカシングという。音響素子２２から照射される音波ＡＷは、例えば、超音波である。なお、音響素子２２から照射される音波ＡＷは、超音波より低い周波数の音波であってもよい。
　本実施形態では、音波ＡＷの定在波の節の数は、一例として、高さ方向について１個である。音波ＡＷの定在波の節の位置は、流路２１の高さ方向について高さの中央の位置である。音波ＡＷの波長は、流路２１の高さに等しい。
　複数の細胞ＣＬｓは、音波ＡＷの定在波の節の数が高さ方向について１個であることに応じて、高さ方向について高さの中央の位置に１列に整列されている。図６では、一例として、複数の細胞ＣＬｓのうち細胞ＣＬ１の付近の位置に生じている音波ＡＷの振幅のパターンを示している。音波ＡＷの定在波は、流路２１の幅方向の他の位置についても、同様にして流路２１の高さの中央の位置に節をもつ。
　一方、音波ＡＷの定在波の節の数は、一例として、幅方向について０個である。換言すれば、音波ＡＷは幅方向については定在波を形成しない。
　比較のために、図７に、音響素子２２が音波ＡＷを流路２１に照射していない場合に複数の細胞ＣＬｓが流路２１を流れる様子の一例を示す。図７では、流路２１の長さ方向（ｙ軸方向）についてのある時刻ｔ１におけるある断面が示されている。複数の細胞ＣＬｓ－１は、複数の細胞ＣＬｓのうち流路２１の幅方向（ｘ軸方向）について中央付近を流れる速度の速い細胞である。細胞ＣＬｓ－２、ＣＬｓ－３は、複数の細胞ＣＬｓのうち流路２１の幅方向（ｘ軸方向）について中央から離れた位置を流れる速度の遅い細胞である。速度の遅い細胞ＣＬｓ－２、ＣＬｓ－３は、時刻ｔ１において、速度の速い細胞ＣＬｓ－１よりも上流を流れており、図７に示す断面の位置には到達していない。
　また、複数の細胞ＣＬｓでは、流路２１の高さ方向（ｚ軸方向）についての位置が、高さ方向の流速分布のために揃っていない。
　また、上述したように、本実施形態では、音波ＡＷの定在波の節の数は、幅方向について０個である場合の一例について説明するが、これに限られない。音波ＡＷの定在波の節の数が幅方向について１個以上であってもよい。図８に、音波ＡＷの定在波の節の数が幅方向について１以上である場合に複数の細胞ＣＬｓが流路２１を流れる様子の一例を示す。図８では、一例として、音波ＡＷの定在波の節の数は幅方向について５個である。複数の細胞ＣＬｓは、音響効果によって、幅方向について、定在波の幅方向の節の位置に整列する。
　幅方向について定在波の節がある場合、流路２１を流れる複数の細胞ＣＬｓは、幅方向について当該節の位置を流れる。そのため、幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数は、幅方向についての定在波の節の数と等しくなる。つまり、幅方向について定在波の節は、幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数を制限してしまう。
　なお、幅方向について定在波の節は、幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数を制限する一方で、幅方向に並べられた複数の細胞ＣＬｓの隣り合う細胞同士の距離を所定の距離以上とすることができる。そのため、幅方向について定在波の節は、複数の細胞ＣＬｓ同士が相互作用してしまうことを抑制できる。
　一方、本実施形態では、音波ＡＷの定在波の節の数は幅方向について０個であるため、幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数は、当該節の数によっては制限されない。本実施形態では、幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数は、それら複数の細胞ＣＬｓの大きさと流路２１の幅とによって制限される。
　図２に戻り、音響素子２２が備えられる位置について説明する。
　音響素子２２は、流路２１の長さ方向について撮像部２３が備えられる位置よりも上流側（－ｙ軸方向）であって、当該位置から所定の距離だけ離れた位置に備えられる。したがって、音響素子２２が照射する音波ＡＷによる定在波は、撮像部２３が備えられる位置よりも上流側（－ｙ軸方向）の位置において生じる。
　音波ＡＷによって高さ方向について整列された複数の細胞ＣＬｓは、音波ＡＷが照射される位置を通過すると、下流側においてやがては流速分布の影響を受ける。つまり、一度整列された複数の細胞ＣＬｓには、音波ＡＷが照射される位置の下流側において、位置のばらつき、あるいは回転が生じ得る。イメージングフローサイトメーター２０では、撮像部２３は、一度整列された複数の細胞ＣＬｓに位置のばらつき、あるいは回転が生じる位置よりも上流側の位置に配置される。したがって、撮像部２３は、複数の細胞ＣＬｓが高さ方向について整列された状態を撮像する。
　このように、音響素子２２と撮像部２３との流路２１の長さ方向についての距離は、音響素子２２による音波ＡＷの音響効果による複数の観測対象物の整列が持続する程度に短い。
　なお、音響素子２２は、流路２１の長さ方向について撮像部２３が備えられる位置よりも上流側（－ｙ軸方向）であって、当該位置から所定の距離だけ離れた位置に備えられるため、音響素子２２の外観が撮像部２３が撮像する画像に映り込んでしまうことはない。
　撮像部２３は、光源２７と、対物レンズＯＧと、撮像素子２８と、第１光学素子Ｌ１と、第２光学素子Ｌ２と、第３光学素子Ｌ３と、制御部２００とを備える。
　光源２７は、流路２１に対して帯状の照明光ＬＳを照射する。具体的には、光源２７は、流路２１に対して帯状のコヒーレント光を照射する。帯状の照明光ＬＳとは、コヒーレント光を絞ることにより、帯状にした照明光である。帯状にした照明光とは、ｘ軸方向に試料の径よりも長い幅をもち、ｙ軸方向に試料の径よりも短い厚みに調整されたコヒーレント光である。本実施形態では、光源２７は、ダイクロイックミラーＭ１と、対物レンズＯＧとを介して、流路２１に対して帯状の照明光ＬＳを照射する。なお、照明光ＬＳは、コヒーレント光であっても、インコヒーレント光であってもよい。本実施形態では、光源２７が照射する照明光ＬＳは、一例として、コヒーレント光である。
　光源２７は、ダイクロイックミラーＭ１と、対物レンズＯＧとを介して、流路２１に対して照明光ＬＳを照射する。
　以下の説明では、流路２１の照明光ＬＳが照射される位置のことを、照射位置とも記載する。この照射位置を通過した細胞ＣＬは、照明光ＬＳが照射されると光Ｌを発する。例えば、細胞ＣＬが蛍光染色されている場合、照明光ＬＳとして励起光が用いられ、細胞ＣＬは、励起光である照明光ＬＳによって蛍光分子が励起されることにより発光する。この発光による光は蛍光であり、光Ｌとはこの蛍光である。
　撮像部２３は、照明光ＬＳが照射される位置を通過した細胞ＣＬを撮像する。撮像部２３は、一例として、照明光ＬＳが照射される位置を通過した細胞ＣＬからの光Ｌを撮像する。これにより、撮像部２３は、細胞ＣＬのある断面を撮像する。ここで、ある断面とは、照明光ＬＳによって細胞ＣＬが光Ｌを発した面である。言い換えると、ある断面とは、細胞ＣＬが流路２１を流れる方向と交差する面である。なお、この細胞のある断面を撮像する光学系の構成は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１９２７６７号明細書及び米国特許第８５８２２０３号明細書などに開示される構成である。またなお、撮像部２３は、細胞ＣＬの空間情報を計測してもよい。またなお、イメージングフローサイトメーター２０が観測対象物を観察するイメージングの種類に応じて、撮像部２３は、可視光、可視光以外の電磁波、熱、あるいは振動波などを計測または撮像に用いてよい。
　対物レンズＯＧは、細胞ＣＬからの光Ｌを集光する。対物レンズＯＧとは、照射位置に焦点があう位置に配置される対物レンズである。以下の説明では、照射位置に焦点が合う位置のことを焦点位置ＦＰとも記載する。なお、対物レンズＯＧは、ドライ対物レンズあっても、液浸対物レンズであってもよい。液浸対物レンズとは、油浸レンズ、あるいは水浸レンズなどである。
　対物レンズＯＧによって集光された光は、第１光学素子Ｌ１と第２光学素子Ｌ２と第３光学素子Ｌ３とを介して、撮像素子２８において結像される。この一例では、対物レンズＯＧによって集光された光は、第１光学素子Ｌ１を介して像ＶＲＩとして結像される。この像ＶＲＩは、ｘ軸方向とｚ０軸方向とを含む面についての細胞ＣＬの断面の像である。ここでｚ０軸とは、対物レンズＯＧによって集光された帯状の照明光ＬＳが細胞ＣＬに入射する方向である。帯状の照明光ＬＳが細胞ＣＬに入射する方向は、ｚ軸方向に対して所定の角度だけ傾いている。つまり、ｚ０軸はｚ軸に対して所定の角度だけ傾いている。撮像素子２８は、像ＶＲＩを、第２光学素子Ｌ２及び第３光学素子Ｌ３を介して撮像する。
［断面について］
　ここで、図９を参照して、撮像素子２８が撮像する細胞ＣＬの断面の一例について説明する。
　図９は、撮像素子２８が撮像する細胞ＣＬの断面を示す図である。図９（ａ）は、照明光ＬＳと、細胞ＣＬとの位置の関係を示す図である。光源２７から照射される照明光ＬＳは、ｚ０軸方向に照射される。
　図９（ｂ）は、図９（ａ）から見た細胞ＣＬを、ｙ軸方向から見た図である。照明光ＬＳは、ｚ０軸方向とｘ軸方向とに帯状に広がる。細胞ＣＬは流路２１を流されることにより、この帯状に広がった照明光ＬＳを通過する。ここで、図９（ａ）に示す照明光ＬＳの幅Ｗ１は、図９（ｂ）に示す照明光ＬＳの幅Ｗ２よりも狭い。具体的には、幅Ｗ１は、２～３μｍである。
　図９（ｃ）は、撮像素子２８と細胞ＣＬの断面の像である像ＶＲＩとの位置関係示す図である。撮像素子２８と像ＶＲＩとは平行である。撮像素子２８は、像ＶＲＩに垂直な方向（つまり、図２に示した第２光学素子Ｌ２、及び第３光学素子Ｌ３の光軸の方向）から像ＶＲＩを撮像する。
　図２に戻り、イメージングフローサイトメーター２０の構成の説明を続ける。
　撮像素子２８は、細胞ＣＬの断面を撮像する。ここで、撮像素子２８は、一例として、縦方向及び横方向に画素が配列されたカメラである。撮像素子２８は、縦方向及び横方向に配列された画素のうち、像が結像される領域の画素列の光の強さのみを取得することができる。例えば、撮像素子２８は、縦方向にＮ行、横方向にＮ列の画素が配列されている場合に、縦方向について中央のＭ行（ＭはＮより小さい数）分の画素列の光の強さのみを取得する。つまり、撮像素子２８は、Ｍ×Ｎ個の画素の光の強さのみを取得する。これにより、撮像素子２８は、像が結像されない領域との両方の画素の光の強さを取得する撮像素子と比較して、像が結像されない領域の画素列の光の強さを取得する時間を短縮することができる。また、撮像素子２８から取得した光の強さに基づいて、撮像画像を生成する画像処理の時間を短縮することができる。これにより、撮像素子２８は、高速に像を取得することができる。
　なお、撮像素子２８は、像が結像される領域と、像が結像されない領域との両方の画素の光の強さを取得するカメラであってもよい。
　図１０に、撮像素子２８において像が結像される領域の画素列の一例を示す。複数の像ＶＲＩそれぞれは、複数の細胞ＣＬｓそれぞれの像である。上述したように、複数の細胞ＣＬｓは、定在波である音波ＡＷが流路２１に照射されることによって、流路２１の高さ方向について整列されている。そのため、撮像素子２８は、複数の細胞ＣＬｓが幅方向について１列に整列された状態で複数の細胞ＣＬｓを撮像する。イメージングフローサイトメーター２０では、フレーム当たりの観測対象物の数を、観測対象物が高さ方向について１列に整列されていない場合に比べて多くできる。
　本実施形態では、撮像素子２８は、ｓＣＭＯＳ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＣＭＯＳ；科学計測用ＣＭＯＳ）などから構成される撮像素子である。ｓＣＭＯＳは、従来のＣＣＤや、ＣＭＯＳによって構成される撮像素子よりも、高速かつ画質よく撮像することができる。
　撮像素子２８は、撮像した撮像画像を、画像取得部２４に対して供給する。
　制御部２００は、例えばＣＰＵや、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｇａｔｅ　ａｒｒａｙ）などを備えており、種々の演算や情報の授受を行う。制御部２００は、画像取得部２４を、その機能部として備える。
　画像取得部２４は、撮像素子２８から撮像画像を取得する。画像取得部２４は、撮像素子２８から取得した撮像画像を、断面画像ＰＩＣとして、記憶部２５に記憶させる。記憶部２５には、断面画像ＰＩＣが撮像された順に記憶される。
　３次元画像生成部２６は、前記撮像部が細胞ＣＬの断面ＣＳを時系列に撮像して得られる複数の断面画像ＰＩＣに基づいて、細胞ＣＬの３次元画像を生成する。細胞ＣＬの３次元画像は、細胞ＣＬが流路２１を流れる方向である流線方向に細胞ＣＬが走査された画像である。３次元画像生成部２６は、記憶部２５から複数の断面画像ＰＩＣを取得する。３次元画像生成部２６は、記憶部２５から取得した複数の断面画像ＰＩＣに基づいて、細胞ＣＬの３次元画像を生成する。具体的には、３次元画像生成部２６は、断面画像ＰＩＣが撮像された順に－ｙ軸方向に向かって結合する。この断面画像ＰＩＣは、上述した面ＬＰを撮像した画像である。
　ここで、図１１を参照して、３次元画像生成部２６が断面画像ＰＩＣを結合する順番について詳細に説明する。
　図１１は、３次元画像生成部２６が断面画像ＰＩＣを結合する順番を示す図である。
　図１１（ａ）は、細胞ＣＬの断面と断面画像と対応関係の一例を示す図である。
　細胞ＣＬは、＋ｙ軸方向に向かって移動する。撮像部２３は、細胞ＣＬの断面ＣＳ１から断面ＣＳｎまでのｎ枚の断面画像ＰＩＣを、この順に時系列に撮像する。断面ＣＳｎのｎとは、１以上の整数である。
　記憶部２５には、断面ＣＳ１の断面画像ＰＩＣ１から、断面ＣＳｎの断面画像ＰＩＣｎまでが記憶される。
　図１１（ｂ）は、３次元画像生成部２６が断面画像ＰＩＣ１から断面画像ＰＩＣｎまでを結合する順番を示す図である。３次元画像生成部２６は、断面画像ＰＩＣが撮像された順に－ｙ軸方向に向かって結合する。これは、細胞ＣＬが＋ｙ軸方向に移動するためである。なお、結合の順番は、細胞ＣＬの移動方向に応じて変更する。
　図１１（ｂ）には、３次元直交座標系として、ＸＹＺ座標系を示す。このＸＹＺ座標系は、３次元画像生成部２６が生成する３次元画像の座標系である。３次元画像生成部２６は、このＸＹＺ座標系と、ｘｙｚ座標系とを対応付けた状態で、断面画像ＰＩＣ１から断面画像ＰＩＣｎを結合する。具体的には、３次元画像生成部２６は、Ｘ方向と、ｘ方向とを同じ方向にして結合する。３次元画像生成部２６は、Ｙ軸方向とｙ軸方向とを同じ方向にして結合する。３次元画像生成部２６は、Ｚ軸方向とｚ軸方向とを同じ方向にして結合する。また、３次元画像生成部２６は、断面画像ＰＩＣ１から断面画像ＰＩＣｎを順に、－Ｙ軸方向に結合することにより、細胞ＣＬの３次元画像を生成する。
［イメージングフローサイトメーター２０の動作の概要］
　次に、図１２を参照して、イメージングフローサイトメーター２０の動作手順の概要について説明する。
　図１２は、イメージングフローサイトメーター２０の動作の一例を示す流れ図である。なお、ここに示す動作手順は、一例であって、動作手順の省略や動作手順の追加が行われてもよい。
（ステップＳ１０）音響素子２２は、流路２１に対して音波ＡＷを照射する。
（ステップＳ２０）撮像素子２８は、常に焦点位置ＦＰの像を撮像する。画像取得部２４は、撮像素子２８から信号を取得する。信号とは、上述した断面画像ＰＩＣを示す信号である。
（ステップＳ３０）画像取得部２４は、撮像素子２８から取得した信号に変化があるか否か判定する。具体的には、画像取得部２４には、流路を細胞ＣＬが流されていない状態の信号である検出前信号が記憶される。画像取得部２４は、検出前信号と、撮像素子２８から取得した信号とを比較する。具体的には、画像取得部２４は、検出前信号と撮像素子２８から取得した信号とが、所定の差が無い場合には、信号に変化が無いと判定する。画像取得部２４は、検出前信号と撮像素子２８から取得した信号とが、所定の差がある場合には、信号に変化があると判定する。
（ステップＳ３０；ＮＯ）画像取得部２４は、信号に変化が無いと判定する場合には、ステップＳ１０から処理を繰り返す。
（ステップＳ３０；ＹＥＳ）画像取得部２４は、信号に変化があると判定する場合には、撮像素子２８から取得した信号を、断面画像ＰＩＣとして、記憶部２５に記憶させる（ステップＳ４０）。
（ステップＳ５０）画像取得部２４は、撮像素子２８から信号を取得する。
（ステップＳ６０）画像取得部２４は、撮像素子２８から取得した信号に基づいて、細胞ＣＬの断面を撮像し終えたか判定する。具体的には、画像取得部２４は、検出前信号と撮像素子２８から取得した信号とが、所定の差がある場合には、細胞の断面を撮像し終えていないと判定する。画像取得部２４は、検出前信号と撮像素子２８から取得した信号とが、所定の差が無い場合には、細胞の断面を撮像し終えたと判定する。
（ステップＳ６０；ＮＯ）画像取得部２４は、細胞の断面を撮像し終えていないと判定する場合には、ステップＳ４０から処理を繰り返す。
（ステップＳ６０；ＹＥＳ）画像取得部２４は、細胞の断面を撮像し終えたと判定する場合には、ステップＳ７０の処理を実行する。
（ステップＳ７０）３次元画像生成部２６は、記憶部２５から複数の断面画像ＰＩＣを取得する。３次元画像生成部２６は、記憶部２５から取得した複数の断面画像ＰＩＣを、結合することにより、３次元画像を生成する。
（ステップＳ８０）３次元画像生成部２６は、生成した３次元画像を表示部１０に表示させる。イメージングフローサイトメーター２０は、処理を終了する。
　ここで図１３及び図１４を参照し、実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０による音響効果について説明する。
　図１３は、本実施形態に係る流路２１の高さ方向（ｚ軸方向）から複数の細胞が撮像された明視野画像の一例を示す図である。図１３（ａ）は、音波ＡＷが照射されていない場合の明視野画像であり、図１３（ｂ）は、音波ＡＷが照射された場合の明視野画像である。明視野画像において、複数の細胞は、高さ方向（ｚ軸方向）の位置に応じたコントラスト（明るさ）によって撮像されている。図１３に示す撮像結果では、流路２１として高さが２００マイクロメートル、幅が２ミリメートルのガラス毛細管が用いられている。流路２１には、蛍光染色された複数の細胞を１ミリリットル当たり１×１０７個含む懸濁液が毎分１０マイクロリットルの流速で流される。
　図１３（ａ）に示すように、音波ＡＷが照射されていない場合、複数の細胞はコントラストがばらついており、流路２１の高さ方向（ｚ軸方向）の位置、及び速度がばらついている。また、音波ＡＷが照射されていない場合、複数の細胞には撮像過程において回転してしまったことが確かめられている。一方、図１３（ｂ）に示すように、音波ＡＷが照射された場合、複数の細胞はコントラストがばらついておらず、流路２１の高さ方向（ｚ軸方向）の位置及び速度がばらついておらず、かつ回転もみられなかった。
　図１４は、本実施形態に係る高さ方向から所定の角度だけ傾いた面において複数の細胞が撮像された蛍光画像の一例を示す図である。高さ方向から所定の角度だけ傾いた面とは、図９において説明した面ＬＰである。図１４（ａ）は、音波ＡＷが照射されていない場合の蛍光画像であり、図１４（ｂ）は、音波ＡＷが照射された場合の蛍光画像である。図１４に示す撮像結果は、撮像素子２８の画素のうち像が結像される領域に対応する８００×２５６０個の画素を用いて毎秒２０フレームの撮像が行われたものである。
　図１４（ａ）に示すように、音波ＡＷが照射されていない場合、複数の細胞は重力のために流路２１の高さ方向について中央よりも底に近い領域を流れている。一方、図１４（ｂ）に示すように、音波ＡＷが照射された場合、複数の細胞は流路２１の高さ方向について中央を流れている。
　ここで図１５から図１８を参照し、イメージングフローサイトメーター２０による細胞の３次元画像の撮像結果（イメージング）について説明する。
　図１５は、本実施形態に係る高さ方向から所定の角度だけ傾いた面（面ＬＰ）が異なる時刻において撮像された断面画像である。図１５に示す断面画像は、毎秒７２０フレームで撮像が行われている。この撮像では、流路２１の高さが２００マイクロメートルに対して、撮像素子２８の画素のうち縦方向について３６マイクロメートルの高さに対応する領域の撮像に用いられる画素のみが用いられている。
　図１６は、図１５に示す断面画像から再構成された３次元画像の一例を示す図である。図１６は、毎秒７２０フレームで撮像された断面の画像について、６００フレームの画像から再構成された３次元画像である。図１６に示す３次元画像では、１９２１個の細胞が８３３ミリ秒をかけて撮像されている。スループットとして、毎秒２３０５個の細胞が撮像されたことに対応する。
　図１７は、ｘ方向とｙ方向についての断面の画像である。図１８は、本実施形態に係る図１７に示した断面画像の各領域（領域Ｒ１、領域Ｒ２、領域Ｒ３、領域Ｒ４）の拡大図である。
（第２の実施形態）
　次に、図１９を参照して、イメージングフローサイトメーターの第２の実施形態について説明する。なお、上述した第１の実施形態と同一の構成及び動作については、同一の符号を付してその説明を省略する。
　図１９は、第２の実施形態の細胞測定システム１ａの機能構成の一例を示す図である。細胞測定システム１ａは、２次元画像を生成する点において、上述した第１の実施形態と異なる。
　イメージングフローサイトメーター２０ａは、流路２１と、音響素子２２と、撮像部２３ａと、記憶部２５と、２次元画像生成部２６ａとを備える。
　撮像部２３ａは、光源２７ｂと、対物レンズＯＧと、撮像素子２８と、第１光学素子Ｌ１と、第２光学素子Ｌ２と、第３光学素子Ｌ３と、制御部２００とを備える。
　撮像部２３ａは、ラインスキャンカメラである。ラインスキャンカメラは、撮像素子２８の縦方向又は横方向に並んだ１列の画素列について、検出された光の強さを取得する。撮像部２３ａは、観測対象物の断面に含まれる線を時系列に撮像する。この線は、断面をある方向について線の集まりとみなした場合に、当該集まりに含まれるいずれかの線である。撮像素子２８としては、例えば、リニアアレイ型の光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ　Ｔｕｂｅ）などの光検出素子、あるいはｓＣＭＯＳカメラの一部の画素が用いられる。
　２次元画像生成部２６ａは、撮像部２３ａが時系列に撮像した複数の線の画像に基づいて、観測対象物が流線方向に走査された２次元画像が生成する。
　ここで、図２０を参照して、２次元画像生成部２６ａが線画像ＰＬＣを結合する順番について詳細に説明する。
　図２０は、２次元画像生成部２６ａが線画像ＰＬＣを結合する順番を示す図である。
　図２０（ａ）は、細胞ＣＬの断面に含まれる線と線画像と対応関係の一例を示す図である。
　細胞ＣＬは、＋ｙ軸方向に向かって移動する。撮像部２３は、細胞ＣＬの断面ＣＳ１から断面ＣＳｎまでにそれぞれ含まれる線についてｎ枚の線画像ＰＬＣを、この順に時系列に撮像する。断面ＣＳｎのｎとは、１以上の整数である。
　記憶部２５には、断面ＣＳ１に含まれる線の線画像ＰＬＣ１から、断面ＣＳｎに含まれる線の線画像ＰＬＣｎまでが記憶される。
　図２０（ｂ）は、２次元画像生成部２６ａが線画像ＰＬＣ１から線画像ＰＬＣｎまでを結合する順番を示す図である。２次元画像生成部２６ａは、線画像ＰＬＣが撮像された順に－ｙ軸方向に向かって結合する。
　図２０（ｂ）には、３次元直交座標系として、ＸＹＺ座標系を示す。このＸＹＺ座標系に含まれるＸ軸とＹ軸とからなる２次元座標系であるＸＹ座標系は、２次元画像生成部２６ａが生成する２次元画像の座標系である。２次元画像生成部２６ａは、このＸＹ座標系と、ｘｙｚ座標系のうちｘ軸とｙ軸とを対応付けた状態で、線画像ＰＬＣ１から線画像ＰＬＣｎを結合する。具体的には、２次元画像生成部２６ａは、Ｘ方向と、ｘ方向とを同じ方向にして結合する。２次元画像生成部２６ａは、Ｙ軸方向とｙ軸方向とを同じ方向にして結合する。また、２次元画像生成部２６ａは、線画像ＰＬＣ１から線画像ＰＬＣｎを順に、－Ｙ軸方向に結合することにより、細胞ＣＬの２次元画像を生成する。
［実施形態のまとめ］
　以上に説明したように、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａは、流路２１と、音響素子２２と、光源２７と、撮像部２３、２３ａ、２３ｂと、走査画像生成部（３次元画像生成部２６、２次元画像生成部２６ａ）とを備える。
　流路２１は、観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）が流される流路であって、幅方向の長さ（上述した実施形態において、幅方向長さＦＷ）が高さ方向の長さ（上述した実施形態において、高さ方向長さＦＨ）よりも長い。
　音響素子２２は、流路２１に対して音波ＡＷを定在波にして照射する。
　光源２７、２７ｂは、流路２１に対して照明光ＬＳ、照明光ＬＳｂを照射する。
　撮像部２３、２３ａ、２３ｂは、照明光ＬＳ、照明光ＬＳｂが照射される位置を通過した観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）を計測または撮像することにより、観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）が流路２１を流れる方向である流線方向についての観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）の断面ＣＳに含まれる線を少なくとも撮像する。
　走査画像生成部（３次元画像生成部２６、２次元画像生成部２６ａ）は、撮像部２３、２３ａ、２３ｂが断面ＣＳに含まれる線を時系列に撮像して得られる複数の撮像画像（上述した実施形態において、断面画像ＰＩＣ、線画像ＰＬＣ）に基づいて、観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）が流線方向に走査された画像（上述した実施形態において、細胞ＣＬの３次元画像、細胞ＣＬの２次元画像）を生成する。流線方向は、観測対象物（上述した実施形態において、細胞ＣＬ）が流路２１を流れる方向である。
　この構成により、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａは、観測対象物が撮像される過程において、観測対象物の速度（進行方向と速さ）がばらついてしまうこと、観測対象物が回転してしまうことを音響効果によって抑制できるため、撮像条件を安定させることができる。撮像条件には、撮像過程における観測対象物の流線方向に垂直な方向における位置、回転、及び速度が含まれる。実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、観測対象物を流線方向に走査して走査画像を生成するため、観測対象物が撮像される過程において、観測対象物の流線方向に垂直な方向における位置、回転（観測対象物の向き）、あるいは速度が変化してしまうと、観測対象物を流線方向に走査できなくなってしまう。
　また、実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、音響効果によって観測対象物が流路２１の高さ方向ついて撮像される位置以外の位置を通過ししてしまうことを抑制できるため、撮像部２３に備えられる撮像素子２８の画素列のうち流路２１の高さ方向の特定の位置に対応する画素列のみを用いて撮像を行うことができる。撮像部２３に備えられる撮像素子２８の画素列のうち流路２１の高さ方向の特定の位置に対応する画素列のみを用いて撮像を行う場合、観測対象物が流路２１の高さ方向ついて撮像される位置以外の位置を通過ししてしまうと、観測対象物の像自体が得られなくなってしまう。
　また、上述したように撮像部２３は、カメラであり、撮像速度限界、つまり単位時間当たりに撮像可能なフレーム数に限界が存在する。そのため、イメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路２１を流れる流体の流速を低く抑えなければ、撮像対象に対して流れ方向の撮像回数が減り、解像度が落ちることになる。つまり、イメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、撮像部２３に応じて所望の流速は決まっている。
　従来、観測対象物が流路２１の高さ方向についての位置を安定させるために、流体力学的フォーカシングが知られている。複数の流路を備えて、流体力学的フォーカシングを行う場合、流路２１を流れる流体の流速が、流体力学的フォーカシングを行う前に比べて速くなってしまい、流速が安定しない。また、撮像部に応じた流速が所望の流速よりも高くなりすぎるために撮像される像の流れ方向の解像度が低下してしまう。イメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流速が速くなってしまう流体力学的フォーカシングとは異なり、音響効果によって流速を所望の流速から変化させることなく撮像が可能である。
　イメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路を流れる観測対象物を流線方向に走査する場合に上述した撮像条件を安定させることができ、安定してかつ高速に走査画像を生成するイメージングが可能となる。
　また、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路２１の高さ方向について音波ＡＷの定在波の節の数は１個であり、流路２１の幅方向について音波ＡＷの定在波の節の数は０個である。
　この構成により、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路２１の幅方向について音波ＡＷの定在波の節の数は０個であるため、流路２１の幅方向に並べられる複数の細胞ＣＬｓの数は、当該節の数によっては制限されない。
　なお、高さ方向について音波ＡＷの定在波の節の数が１個であり、流路２１の幅方向について音波ＡＷの定在波の節の数が１個以上とされてもよい。
　なお、流路２１の高さ方向について音波ＡＷの定在波の節の数は、２個以上とされてもよい。
　また、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路２１には、流路２１の幅方向に整列された複数の観測対象物（上述した実施形態において、複数の細胞ＣＬｓ）が流される。
　この構成により、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａは、流路２１に１個の観測対象物が流される場合に比べてフレーム当たりの観測対象物の数を多くできるため、単位時間当たりに、流路２１に１個の観測対象物が流される場合に比べて多い数の観測対象物の走査画像を生成できる。実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、スループット（単位時間当たりに計測可能な細胞の個数）と信号対ノイズ比を両立させることができる。スループットと信号対ノイズ比を両立させるとは、同じスループットで計測した際に、各瞬間で同時にたくさんの細胞を計測することによって、細胞当たりに掛けられる計測時間を増加させ、信号対ノイズ比を増加させることである。
　また、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、複数の観測対象物は流路２１の幅方向に１列に整列されているため、撮像部２３に備えられる撮像素子２８として像が結像される領域の画素列の光の強さのみを取得する撮像素子を採用することが好適である。そのような撮像素子では、流路２１の高さ方向について、複数の観測対象物が整列されている位置以外の像が結像されない領域の画素列の光の強さは取得されないため、撮像画像を生成する画像処理の時間を短縮することができる。
　なお、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａにおいては、帯状の照明光ＬＳが用いられる場合の一例について説明したが、これに限られない。流路を流れる観測対象物の断面を撮像して３次元情報、または２次元情報を撮像する他のイメージング技術が用いられてもよい。照明光は帯状でなくてもよいし、照明光は、流路の高さ方向に対して傾いていなくてもよい。
　なお、上述した実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０、２０ａにおいて撮像される観測対象物が流線方向に走査された３次元画像、または２次元画像に基づいて、イメージングフローサイトメーター２０、２０ａは観測対象物のソーティングをしてもよい。ソーティングとは、流路２１を流される観測対象物のうちから、所定の観測対象物を分取することである。この所定の観測対象物は、ユーザーによって予め選択されていればよい。
　ここでソーティングについて説明する。例えば、観測対象物として所定の細胞と、ゴミや他の細胞などの所定の細胞とは異なる物とが、流路２１に流されることがある。観測対象物のうちから所定の細胞を選択して取り出すことが、ソーティングである。
　つまり、イメージングフローサイトメーター２０、２０ａは、ユーザーによって予め選択された細胞の形態を示す情報と、流線方向に走査された３次元画像、または２次元画像に含まれる細胞の形態を示す情報とを比較することにより、ソーティング対象の細胞か否かを判定し、分取する。
　イメージングフローサイトメーター２０、２０ａでは、流路２１を流れる流体の流速は、ソーティング対象の判定、及び分取に要する時間に対して、十分に低速である。
（実施例）
　以下では、上述した第１の実施形態に係るイメージングフローサイトメーター２０を用いて細胞の３次元画像の生成（イメージング）を実施した例について説明する。
　本実施例では、観測対象物として、有糸分裂期のヒトの白血病細胞（Ｋ５６２細胞）である細胞Ｃ１を解析した。細胞Ｃ１は、抗有糸分裂性のタンパク質であるＭＰＭ－２と、ＤＡＰＩとによって染色されている。当該染色された細胞Ｃ１を１ミリリットル当たり約１×１０７個の濃度で含む懸濁液を用いた。当該懸濁液を、毎分１０マイクロリットルの流量でイメージングフローサイトメーター２０に備えられる流路２１に流した。
　図２１は、上記の実験条件でイメージングフローサイトメーター２０によって８５７ミリ秒間の観察の結果、生成された細胞Ｃ１の３次元画像を２次元平面（ｘｙ平面）に射影した画像である。図２１に示す画像は、３次元画像に含まれるｚ方向の位置が異なる複数の断面の画像が、重ねて表示された画像である。
　図２１に示す３次元画像には、１２４８個の細胞Ｃ１が３次元画像として再構築されている。図２１に示す３次元画像から、この母集団において６０個の細胞Ｃ１がＭＰＭ－２陽性であると判定された。ＤＡＰＩによって染色された細胞Ｃ１の３次元画像の解析によって、３４個の細胞Ｃ１が細胞分裂の前期、１０個の細胞Ｃ１が中期、２個の細胞Ｃ１が後期であり、２組の細胞Ｃ１が終期であること判定された。
　図２１において、領域Ｒ１１、領域Ｒ１２、領域Ｒ１３、及び領域Ｒ１４にそれぞれ含まれる画像は前期、中期、後期、及び終期それぞれの細胞Ｃ１の画像である。領域Ｒ１１、領域Ｒ１２、及び領域Ｒ１４にそれぞれ含まれる細胞の画像は、ＤＡＰＩによって染色された細胞Ｃ１の画像である。領域Ｒ１３に含まれる細胞の画像は、ＭＰＭ－２によって染色された細胞Ｃ１の画像である。図２２に、領域Ｒ１１、領域Ｒ１２、領域Ｒ１３、及び領域Ｒ１４それぞれを拡大した画像を示す。
　図２３及び図２４に、ＤＡＰＩによって染色された細胞Ｃ１の３次元画像を２次元平面に射影した画像を、細胞分裂の中期及び後期のそれぞれについて示す。図２３（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）はそれぞれ、ｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれに射影された中期の細胞Ｃ１の画像である。図２４（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）はそれぞれ、ｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれに射影された後期の細胞Ｃ１の画像である。ここで図２４（Ｂ）、及び（Ｃ）から、後期の細胞Ｃ１のｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれに射影された画像について、染色体の分裂を確認することができる。一方、図２４（Ａ）に示した後期の細胞Ｃ１のｘｙ平面に射影された画像では、分裂した染色体同士が重なって撮像されており、当該画像から染色体の分裂を確認することは難しい。
　図２４（Ａ）に示したｘｙ平面に射影された画像は、従来の２次元イメージングによって得られる２次元画像に相当する画像である。従来の２次元イメージングでは中期板や染色体の分裂などの細胞周期まで判別可能な画像として生成することは、細胞の向きによっては難しかった。一方、イメージングフローサイトメーター２０による３次元イメージングによれば、図２４（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、染色体のｚ方向の位置が識別することができた。このように、イメージングフローサイトメーター２０では、ｚ方向も含めた３次元イメージングが可能であるため、中期板や染色体の分裂などの細胞周期まで判別可能な３次元画像を生成することができる。
　ここで細胞Ｃ１のうちいくつかの細胞では、ｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれの平面の画像では、細胞分裂の終期を判定するために染色体の配置を識別するために十分ではない。図２５から図２７を参照し、３次元画像を射影する方向を変更することによって染色体の配置を識別できるようになる場合があることについて説明する。
　図２５は、イメージングフローサイトメーター２０によって生成された３次元画像のうちＤＡＰＩによって染色された領域の一例を示す。当該細胞Ｃ１は、細胞分裂の中期の細胞である。図２５には、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸が示されている。これらのｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸それぞれが示す方向は、例えば、図１に示したｘｙｚ座標系の座標軸それぞれが示す方向に対応する。図２５には、ｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸とともに、λ１軸、λ２軸、λ３軸が示されている。λ１軸、λ２軸、λ３軸は、主成分分析によって得られる固有ベクトルに基づいてｘ軸、ｙ軸、及びｚ軸が回転されて得られた座標軸である。なお、λ１軸、λ２軸、λ３軸それぞれの方向を示す単位ベクトルはそれぞれ、元のｘｙｚ座標系において［－０．５４，０．８２，０．２０］、［０．７１０．３１０．６３］、及び［０．４５，０．４８，－０．７５］である。
　図２５に示す領域を、ｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面それぞれに射影した場合、図２６に示す２次元画像が得られる。図２６（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）に示すように、ｘｙ平面、ｙｚ平面、及びｘｚ平面の２次元画像では、染色体の配置を識別することは難しい。
　図２７は、図２５に示す領域を、軸をｘ軸、ｙ軸、ｚ軸からλ１軸、λ２軸、λ３軸へと回転させて、平面に射影した場合の２次元画像である。図２７（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）はそれぞれ、λ１λ２平面、λ１λ３平面、λ２λ３平面それぞれに射影された２次元画像を示す。図２７（Ａ）では、染色体の配置が識別可能となっている。
　イメージングフローサイトメーター２０では、３次元画像を生成しているため、観測対象物の構造を識別するために３次元画像を２次元画像に射影する方向を選択することができる。射影する方向を選択することは、イメージングフローサイトメーター２０が３次元画像を生成しているために可能である。２次元画像や、予め決められた複数の方向それぞれについての２次元画像を生成する場合には、画像を生成した後に解析する段階において、射影する方向を選択することはできない。
　図２８に、上述した図２１に示した画像で撮像された範囲よりも広い範囲について３次元画像を解析した結果を示す。図２８では、流路２１を流れる１０５個のオーダーの個数の細胞Ｃ１の３次元画像がイメージングフローサイトメーター２０によって生成されている。当該細胞Ｃ１は、ＭＰＭ－２またはＤＡＰＩによって染色されている。得られた３次元画像では、２８６秒の合計撮像時間で４０８９３７個の細胞Ｃ１の画像が検出された。図２８に示す画像では、ＭＰＭ－２及びＤＡＰＩによって染色された細胞Ｃ１の全体の１パーセントの３次元画像を２次元平面（ｘｙ平面）に射影した画像である。ｘｙ平面に射影された画像である。図２８に示す画像は、３次元画像に含まれるｚ方向の位置が異なる複数の断面の画像が、重ねて表示された画像である。スケールバーは、１００マイクロメートルの長さを示す。
　まず、細胞Ｃ１それぞれについてのＭＰＭ－２及びＤＡＰＩの強度を解析した。図２９は、当該解析の結果を示す散布図である。当該解析によって、ＭＰＭ－２陽性の細胞Ｃ１が選別された。領域Ｒ２０は、選別されたＭＰＭ－２陽性の細胞Ｃ１を示す。
　次に、領域Ｒ２０において、細胞Ｃ１内においてＤＡＰＩ染色された領域の数が計測された。当該計測の結果、２つのＤＡＰＩ染色された領域が計測された。図３０は、２つのＤＡＰＩ染色された領域の３次元画像がｘｙ平面に射影された２次元画像である。図３０に示す画像から細胞分裂の後期または終期であることが判別された。
　１つのＤＡＰＩ染色された領域しかもたない細胞Ｃ１については、当該領域のアスペクト比を３次元画像から算出した。図３１（Ａ）に、１つのＤＡＰＩ染色された領域の３次元画像が平面に射影された２次元画像を示す。図３１（Ａ）では、ＤＡＰＩ染色された領域の長軸と短軸とのそれぞれの向きが垂直方向と水平方向とそれぞれ一致するように、３次元画像が射影される平面が選択されている。
　比較のために図３１（Ｂ）に、１つのＤＡＰＩ染色された領域の３次元画像がｘｙ平面に射影された２次元画像を示す。図３１（Ｂ）に示す２次元画像は、２次元のイメージングを行うイメージングフローサイトメトリーによって生成される２次元画像を模したものである。つまり図３１（Ｂ）に示す２次元画像は、２次元イメージングに相当する画像である。
　図３１（Ｂ）に示すＤＡＰＩ染色された領域では、図３１（Ａ）に示すＤＡＰＩ染色された領域に比べてアスペクト比が大きくなっている。
　図３１（Ａ）に示すような３次元イメージングによる画像から算出されたアスペクト比と、図３１（Ｂ）に示すような２次元イメージングに相当する画像から算出されたアスペクト比とを比較した。図３２に比較結果を示す。図３２では、複数の細胞についてＤＡＰＩ領域のアスペクト比の分布を示すヒストグラムが示されている。ヒストグラムＨ１は、３次元イメージングによる画像から得られたアスペクト比を示す。ヒストグラムＨ２は、２次元イメージングに相当する画像から得られたアスペクト比を示す。図３２から、２次元イメージングに相当する画像では、３次元イメージングによる画像に比べてアスペクト比が過大に算出される傾向があることがわかる。当該傾向は、２次元イメージングでは、３次元イメージングに比べて次元が少ないことが原因であると考えられる。したがって、細胞の構造のプロファイルを正確に得るためには、高いスループットでの３次元イメージングが有用であると考えられる。イメージングフローサイトメーター２０は、そのような３次元イメージングを可能とする。
　以上、本発明の実施形態を、図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更を加えることができる。
　なお、上述の各装置は内部にコンピュータを有している。そして、上述した装置の各処理の過程は、プログラムの形式でコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記憶されており、このプログラムをコンピュータが読み出して実行することによって、上記処理が行われる。ここでコンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等をいう。また、このコンピュータプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータが当該プログラムを実行するようにしてもよい。
　また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよい。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
２０、２０ａ…イメージングフローサイトメーター、２１…流路、２２…音響素子、２７、２７ｂ…光源、２３…撮像部、２６…３次元画像生成部、２６ａ…２次元画像生成部、ＣＬ…細胞、ＬＳ、ＬＳｂ…照明光、ＡＷ…音波、ＰＩＣ…断面画像、ＰＬＣ…線画像

Claims (4)

  1. 　観測対象物が流される流路であって、幅方向の長さが高さ方向の長さよりも長い流路と、
    　前記流路に対して音波を定在波にして照射する音響素子と、
    　前記流路に対して照明光を照射する光源と、
    　前記照明光が照射される位置を通過した前記観測対象物を計測または撮像することにより、前記観測対象物が前記流路を流れる方向である流線方向についての前記観測対象物の断面に含まれる線を少なくとも撮像する撮像部と、
    　前記撮像部が前記線を時系列に撮像して得られる複数の撮像画像に基づいて、前記観測対象物が前記流線方向に走査された画像を生成する走査画像生成部と、
    　を備えるイメージングフローサイトメーター。
  2. 　前記高さ方向について前記定在波の節の数は１個であり、前記幅方向について前記定在波の節の数は０個である
    　請求項１に記載のイメージングフローサイトメーター。
  3. 　前記高さ方向について前記定在波の節の数は１個であり、前記幅方向について前記定在波の節の数は１個以上である
    　請求項１に記載のイメージングフローサイトメーター。
  4. 　前記流路には、前記幅方向に整列された複数の前記観測対象物が流される
    　請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のイメージングフローサイトメーター。
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